Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Tutkiakseen biologisen toiminnan HOXB5 ihmisen virtsarakon syöpä ja tutkia onko HOXB5 3′-UTR SNP (1010A /G), joka sijaitsee alueella microRNA-7 sitoutumiskohdan, korreloi kliinisiä piirteitä virtsarakon syöpä.

Methods

Expression of HOXB5 35 ihmisen virtsarakon syövän kudoksissa ja 8 solulinjoissa tutkittiin käyttäen reaaliaikaista PCR ja immunohistokemia. Seuraavaksi tutkimme biologista funktiota HOXB5

in vitro

käyttäen solujen lisääntymistä, muuttoliike ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset. Bioinformatiikan, SNP (1010A /G) havaittiin sijaitsevat microRNA-7 sitoutumiskohta 3′-UTR HOXB5. Reaaliaikainen PCR käytettiin testaamaan HOXB5 ilmaisun vaikuttaa eri alleelit. Lopuksi monimuuttuja regressioanalyysimme käytettiin määrittämään suhdetta SNP (1010A /G) taajuus ja kliiniset ominaisuudet 391 tapauksissa.

Tulokset

HOXB5 oli usein yli-ilmentynyt sekä virtsarakon syöpä kudoksia ja solulinjoja. Esto HOXB5 tukahdutetaan kasvaimia synnyttävän toiminnon syöpäsoluja. Seuraavaksi osoitettiin, että SNP-kohdan (1010A /G), joka sijaitsee microRNA-7 sitoutumiskohta 3′-UTR HOXB5, voisi vaikuttaa HOXB5 ilmentymistä virtsarakon syövän pääasiassa ero sitova aktiivisuus mikroRNA-7 ja SNP-liittyviä mRNA vakautta. Lopuksi osoitti myös taajuuden 1010G genotyypin oli suurempi syövän ryhmässä verrattuna normaaleihin kontrolleihin ja korreloi riskin korkealuokkaisesta ja korkean vaiheessa.

Johtopäätös

HOXB5 yli-ilmennetään virtsarakon syöpä . MiRNA-sitova SNP (1010A /G) joka sijaitsee 3′-UTR HOXB5 liittyy geenien ilmentyminen ja saattaa olla lupaava ennustetekijä virtsarakon syövän.

Citation: Luo J, Cai Q, Wang W Huang H, Zeng H, hän W, et al. (2012) MicroRNA-7 Binding Site polymorfismi HOXB5 Johtaa Differential gene expression in virtsarakon syövän. PLoS ONE 7 (6): e40127. doi: 10,1371 /journal.pone.0040127

Editor: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, Italia

vastaanotettu: 21 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 1 kesäkuu 2012; Julkaistu: 29 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Luo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (81071688, 30972983, 81172431, 91029742), Guangdong Natural tiedesäätiö (07117366, 6104605), Yat-Scholarship nuorten tutkijoiden (for Tianxin Lin), kliininen Key Project of Public Health Ministry (for Jian Huang), ja ohjelma New Century Excellent Talents in University (NCET-10-0852, sillä Tianxin Lin). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

virtsarakon syöpä on yleisin urologiset kasvaimen Kiinassa [1]; kuitenkin, mekanismeja virtsarakon syöpä kasvaimien syntyyn ei ole hyvin kuvattu. Tiedot osoittavat, että suurin osa virtsarakon syöpien aiheuta syöpää aiheuttaville aineille, jotka vahingoittavat DNA: ta. Herkkyys siirtymäkauden epiteelin n mikroympäristölle voi olla tärkeä tekijä aikana tuumorigeneesin [2]. Onkogeenien ja tuumorisuppressoreita on myös raportoitu tärkeitä rooleja virtsarakon syöpään [3]. Äskettäin geneettisiä muutoksia kuten SNP, deleetiot, insertiot, ja muutokset DNA kopioluvun on todettu olevan mukana virtsarakon syövän syntymistä.

homeobox (HOX) on sarja noin 180 nukleotidin sisällä geenejä, jotka koodaavat proteiini kutsuttu alue homeodomain. Tutkimukset osoittivat, että HOX-geenit muodostavat peräti 0,1-0,2% koko selkärankaisten genomin [4]. HOX-geenit ovat erittäin konservoituneita valtavien evoluution etäisyydet ja koodata ydin- proteiineja, jotka toimivat transkriptiotekijät (TF) normaalin elimen kehitys [5]. Viime vuosina, HOX-geenin perhe on myös liitetty ihmisen sairauksien erityisesti syöpien. Esimerkiksi menetys HOXA5 rintasyövässä [6], yli-ilmentyminen HOXA10 akuutin myelooisen leukemian (AML) [7], geenin mutaatiot HOXD4 munuaisten ja paksusuolen syöpä [8] ja yliekspressio HOXC4 ihmisen virtsarakon syöpä [ ,,,0],9] on raportoitu. HOXB5 (NM_002147.3), joka sijaitsee ihmisen kromosomissa 17, on jäsen HOX-geenin perhe, joka on mukana normaalin keuhkojen ja suoliston kehittäminen hiiren ja ihmisen [10]. HOXB5 on raportoitu liittyvän ihmisen sairauksia kuten AML [11], synnynnäinen kystinen adenomatoidiseen epämuodostuma (CCAM) [12] ja bronkopulmonaalinen sitominen (BPS) [13]. Myös HOXB5 geenin havaittiin olevan erittäin ilmaistaan ​​munasarjasyövän, ja sen katsottiin olevan tärkeä potentiaalisten kohteiden hoidossa munasarjasyöpä [14]. Biologinen toiminta HOXB5 urologisten karsinoomia ei ole raportoitu. Pilottitutkimuksessa, huomasimme, että HOXB5 oli usein yli-ilmentynyt ihmisen virtsarakon syövän kudoksissa ja solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että se voi olla ehdokkaana onkogeenin virtsarakon syöpään.

Viimeisten kymmenen vuoden aikana osallistuminen MikroRNA (miRNA) ihmisen syövissä on tutkittu laajasti. MiRNA tukahduttaa ilmentyminen kohde-mRNA: n sitoutumisen 3′-transloimaton alue (3′-UTR) mRNA. Ihmisen virtsarakon syövän, miRNA oli osoitettu olevan tärkeitä tekijöitä aikana tuumorigeneesiä. Aikaisemmassa tutkimuksessa raportoimme että miRNA-143 ja miRNA-125b toimi tuumorisuppressoreilla ihmisen virtsarakon syövän [15], [16]. Toisessa tutkimuksessa todettiin, että miR-7 alassäädetty virtsarakon syöpä ja voi tukahduttaa kasvaimen kasvua estämällä kasvutekijän reseptorin ilmentymisen ja huonontamalla antiapoptoottinen Akt-reitin [17].

Yhden nukleotidin polymorfismit (SNP), yleisin muoto geneettisen vaihtelun ihmisen genomissa, edistää ihmisen eri fenotyyppejä. SNP: t on liitetty moniin ihmisen sairauksiin, erityisesti syöpiin. Viime vuosina, SNP: t sijaitsevat miRNA-sitoutumiskohdan, joka miRNA kohde (jota kutsutaan myös miRNA-sitovia SNP) on todettu olevan tärkeitä aikana tuumorigeneesiä. Aiemmassa tutkimuksessa ryhmämme ehdotti, että SNP (1805C /T) MIR-181 sitoutumiskes- Mel-18-geeni liittyi joitakin kliinisiä piirteitä eturauhassyövän [18]. Pilottitutkimuksessa, löysimme mahdollinen miRNA-sitova SNP (1010A /G) 3′-UTR HOXB5 geeni käyttäen NCBI SNP tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) ja miRbase (https://www.mirbase.org/).

tässä tutkimuksessa osoitimme, että HOXB5 geeni oli yli-ilmentynyt ja toimi onkogeenin ihmisen virtsarakon syöpä. Olemme myös löytäneet SNP (1010 A /G) 3′-UTR HOXB5 geenin, joka on sisällä miRNA-7 sitoutumiskohta. Olemme osoittaneet, että tämän SNP voi vaikuttaa ilmentämiseen HOXB5 pääasiassa häiritsemällä toimintaa miRNA-7 ja SNP liittyvät mRNA: n stabiilisuuteen; Lisäksi taajuus 1010G genotyypin oli suurempi syövän ryhmässä verrattuna normaaleihin kontrolleihin, ja havaittiin korreloivan riski korkealuokkaisesta ja korkea vaiheessa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus osallistumista polymorfismien miRNA sitoutumiskohta HOXB5 ihmisen virtsarakon syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudokset

391 virtsarakon syövän potilasta otettiin tutkimukseen. Tutkimus hyväksyi Institute Research Ethics, Sun Yat-sen University, Kiina. Tietoon perustuva suostumus on kirjoitettu ja saatu kaikista potilaista tutkimuksessamme. Kaikki potilaat olivat ensisijainen virtsarakon syövät; ei aikaisempi hoito ei ollut tehty ennen leikkausta. Syöpä näytteet saatiin potilailta, joille tehtiin resektio virtsarakon syöpä. Näytteet kerättiin vuosina 2007 ja 2010 laitoksella urologian, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Kiina ja Department of Urology, Southwest Hospital, Chongqing, Kiina. Kaikki virtsarakon näytteet välittömästi jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Histologia kudosten oli arvioitu riippumattomasti kahdella patologien, ja kliinisessä vaiheessa virtsarakon syöpä määritettiin käyttämällä 2002 kasvaimen solmu-etäpesäke (TNM) luokitusjärjestelmä.

Solulinjat ja Cell Culture

käytetyt solulinjat tutkimuksessamme saatiin American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA); ne sisältävät T24, 5637, TCCSUP, HT-1376, UM-UC-3, J82, RT4, EJ ja SV40-transformoitu munuais- 293T. Soluja viljeltiin kostutetussa ilmakehässä 5% CO2, 37 ° C: ssa, ja kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT, USA). T24 viljeltiin McCoyn 5a keskipitkän (muutettu); 5637 viljeltiin RPMI 1640-alustassa; J82, UM-UC-3, TCCSUP ja HT-1376 viljeltiin Eaglen minimum essential keskipitkän (EMEM) (Hyclone); ja RT4, EJ ja SV40-transformoitu munuaisen 293T viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Hyclone).

RNA uuttaminen ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA uutettiin potilaista ”virtsarakkonäytteet tai solulinjoja käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) valmistajan protokollan. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qPCR) tehtiin käyttäen SYBR green määritys (TaKaRa Biotechnology, Dalian, Kiina) on Rochen LightCycler-480 koneen (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa). qPCR suoritettiin seurasi: ensimmäinen Esidenaturaatio vaihe 30 sekuntia 95 ° C: ssa, minkä jälkeen vahvistus 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 20 sekunnin ajan, sulamiskäyräanalyysillä suoritettiin lopussa. Kaikki reaktiot tehtiin 20 ul: n reaktiotilavuudessa kolmena kappaleena. Ilmaisu taso HOXB5 arvioitiin käyttämällä vertailevaa Ct menetelmällä. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Käytetyt alukkeet HOXB5 olivat: sense, 5′-TGAAGCACAGGGTTATAACGACCA-3 ’, antisense, 5′-GCAGCGGGATCCCTGTAAGA-3’; ja GAPDH alukkeet olivat: sense, 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ’, antisense, 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’.

immunohistokemia

Parafiini-upotettu, formaliinilla kiinnitetyt kudokset leikattiin osaksi 5-pm osassa asetetaan polylysiini-pinnoitettu dia, parafiini ksyleenillä, vedettömät käyttäen lajitellut etanolia, sammutettiin endogeenisen peroksidaasin 0,3% vetyperoksidia ja käsiteltyjen antigeenin haku mikroaaltokuumennuksella 10 mM sitraattipuskurilla (pH 6,0) . Leikkeitä inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli HOXB5 kanin polyklonaalista vasta-ainetta (1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA). Immunovärjäys suoritettiin käyttämällä ChemMate ™ DAKO EnVision ™ Detection Kit (DakoCytomation, Glostrup, Tanska), mikä johti ruskean sakan antigeenin päällä. Sen jälkeen, leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) ja joka on asennettu vedettömässä kiinnitysväliaine. Ensisijainen vasta-aine on jätetty pois negatiivisista kontrolleista.

Western Blot

Proteiini uutettiin virtsarakon syöpä kudoksia ja solulinjoja, kuten on kuvattu [19]. Lyhyesti, 30 ug proteiinia kustakin näytteestä erotettiin elektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatti polyakryyliamidigeelillä ennen kuin se siirretään polyvinylideenifluoridia kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA) 2 tuntia. Sitten membraanit blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa käyttäen 5% naudan seerumin albumiinia (BSA), ja inkuboitiin TBST: ssä (Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa 0,05% Tween), joka sisältää kanin polyklonaalista IgG2a anti-HOXB5 (1:1000, Abcam) tai GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) yli yön 4 ° C: ssa. Membraanit inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani-immunoglobuliinin (1:5000, Cell Signaling Technology) sekundaarisena vasta-aineena ja sitten visualisoidaan käyttäen kaupallista ECL (Pierce, Rockford, IL, USA).

Cell transfektion si-HOXB5 ja miRNA-7

siRNA: t on suunniteltu HOXB5 ja miRNA-7 jäljittelee transfektoitiin virtsarakon syövän solujen T24, 5637 ja TCCSUP käyttäen Lipofectamine-RNAiMAX (Invitrogen). Käytetyt sekvenssit si-HOXB5 olivat sense: 5′-GGAUGGACCUCAGCGUCAATT-3 ’, antisense: 5′-UUGACGCUGAGGUCCAUCCTT-3′; Mir-7 jäljittelee, sense: 5’-CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA-3 ’, antisense: 5′-UAUGGCAGACUGUGAUUUGUUG-3′; ja negatiivinen kontrolli, sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Kaikki RNA oligoribonukleotidejä ostettiin Genepharma (Shanghai, Kiina). Yksi päivä ennen transfektiota 2 x 10

5-solut ympättiin kuuden kuoppalevylle. Seuraavana päivänä, kun solut saavuttivat 70-80% konfluenssin, ne transfektoitiin RNA: n lopullinen konsentraatio oli 100 nM mukaan Lipofectamine-RNAiMAX protokollan. Transfektiotehokkuus mitattuna qPCR oli 70% T24, 72%: iin 5637 ja 75% TCCSUP (tuloksia ei ole esitetty).

proliferaatiomääritystä

Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat T24, 5637 ja TCCSUP maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa yksi päivä ennen transfektiota. Transfektion jälkeen siRNA: illa (100 nM) tai negatiivisena kontrollina 24 tunnin ajan, solut kerättiin ja maljattiin 96-kuoppaisille levyille solujen elinkelpoisuuden arviointi käyttäen CCK8 määritystä (Cell Counting Kit-8) (Dojindo Laboratories, Japani) mukaan protokollan [20].

In vitro

Cell migraatiokokeessa

Kun virtsarakon syövän solulinjoissa T24, 5637 ja TCCSUP transfektoitiin si-HOXB5 (100 nM) tai epäspesifinen kontrolli (NC) siRNA: ssa 24 tuntia, solut kerättiin ja suspendoitiin 100 ul: aan seerumia ja sitten päällystetty (1 x 10

4-solut) ylempään osastoon Transwell levyjen (Corning, NY, USA ). Transwell-insertit asetettiin sitten alempaan osastoon 24-kuoppalevylle, joka sisälsi 600 ui alustaa, jossa on 20% FBS: ää, kuten kemoterapia-houkutinta. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkubointijakson jälkeen solut jäljellä yläpinnalla kalvon poistettiin ja solut alemmalla pinnalla oli vahvistettu 100% metanolissa 30 minuutin ajan, mitä seurasi värjäys 0,1% kristalliviolettia, liuos 30 minuutin ajan. Soluissa, jotka värjäytyivät violetti määriteltiin positiivinen ja kuvat otettiin käyttäen mikroskooppia (10 x) (Olympus, Center Valley, PA, USA).

pesäkemuodostusta

Kun transfektio si -HOXB5 (100 nM) tai NC-siRNA: ssa 24 tuntia, ihmisen virtsarakon syövän solujen T24, 5637 ja TCCSUP kerättiin ja laitettiin tuoretta kuuden kuoppalevylle (500 solua T24, ja 1000-solujen 5637 ja TCCSUP). Soluja viljeltiin noin 2 viikkoa, jolloin muodostuu pesäkkeitä. Pesäkkeet kiinnitettiin 100% metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20% metanolissa 15 minuutin ajan. Pesäkkeitä muodostavien tehokkuus laskettiin pesäkkeiden /päällystetty solua x 100%.

Bioinformatics

NCBI SNP tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) käytettiin löytää SNP: iden sijaitsee 3′-UTR HOXB5 geenin. Neljä julkisesti saatavilla algoritmeja, PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), TargetScan (https://www.targetscan.org/), Miranda (https://www.microrna.org/) ja DIANA microT (https://diana.pcbi.upenn.edu/) käytettiin ennustaa, ihmisen miRNA in miRbase (https://www.mirbase.org/) voivat sitoutua 3′-UTR HOXB5. MiRNA että ennustettiin ainakin 2 algoritmeja sitoa hyväksyttiin ehdokkaiksi jatkotutkimuksiin. MRNA: n sekundaarirakenne ennustustyökalun MFOLD (https://mfold.rna.albany.edu/) käytettiin ennustamaan sekundaarinen rakenne HOXB5 mRNA. Pieni minimaalinen vapaa energia (MFE) osoittaa korkea vakaus ennustettu mRNA toissijainen rakenne.

Luciferase Reporter Assay

Rakennamme lusiferaasireportterista plasmideja kanssa HOXB5 3′-UTR-fragmentti, joka sisälsi oletetun sitova sivustoja ehdokas miRNA ja jatkokloonattiin heidät psiCHECK-2 Vector (Promega, Madison, WI, USA) tuottamaan psiCHECK-2-3′-UTR-WT-plasmidi. Mutantti HOXB5 3′-UTR synnytettiin käyttäen fuusio-PCR-menetelmällä, ja sitten se myös subkloonattiin psiCHECK-2 Vector tuottamiseksi psiCHECK-2-3′-UTR-MUT-plasmidin. DNA-sekvenssianalyysi, käytettiin varmistamaan sekvenssin Muodostimme plasmidit.

lusiferaasireportterigeenin määritys, HEK-293T-solut (2 x 10

4), asetettiin 24-kuoppaisen levyn yksi päivä ennen transfektiota. Seuraavana päivänä 0,5 ug joko psiCHECK-2-3′-UTR-WT tai psiCHECK-2-3′-UTR-MUT, ja joko miRNA tai negatiivisen kontrollin kotransfektoitiin HEK-293T-soluissa käyttäen Iipofectamine2000 ( Invitrogen). Määritykset suoritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Havaittu lusiferaasiaktiivisuutta käyttäen GloMax-Multi Detection System (Promega). Renilla lusiferaasi signaalit normalisoitiin sisäisen tulikärpäsen lusiferaasi transfektion ohjaus. Transfektiot tehtiin kolminkertaisina itsenäisestä kokeesta.

DNA Extraction ja HOXB5 Genotyyppausanalyysiin

Yhteensä DNA uutettiin potilaan virtsarakon syövän näytteitä ja solulinjoissa käyttämällä QIAamp reagenssia (QIAGEN, Germantown, MD , USA) valmistajan protokollan. HOXB5 genotyypitys suoritettiin käyttäen DNA-sekvensoinnilla määrityksessä. 334 bp: n DNA-fragmentti, joka sisältää SNP-kohdan 3′-UTR HOXB5 geeni monistettiin genomisesta DNA: sta. PCR-alukkeiden käytettiin, eteenpäin 5′-GCGCATGAAGTGGAAGAAGG-3 ’, käänteinen 5′-TTGGGACAAGCAGAAGGGAG-3’. Monistettu DNA-fragmentti sekvensoitiin käyttämällä GENESCAN-ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

mittaaminen Expression of HOXB5 mRNA

HOXB5 mRNA-tasolla mitattiin 3 virtsarakon syöpä solulinjoja (5637, J82 ja RT4) ja 13 virtsarakon syöpä kudoksiin. Aluekohtaisia ​​Taqman oli suunniteltu havaitsemaan SNP 3′-UTR HOXB5 mRNA. CDNA: solulinjojen ja syövän kudoksissa tehtiin qPCR ja fluoresenssin (VIC varten 1010A, FAM ja 1010G) mitattiin käyttäen LightCycler 480 Probes Master (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa).

Genominen DNA myös erotettu solulinjoista ja syövän kudoksissa kuten edellä. Sisäisenä kontrollina, qPCR suoritettiin sen määrittämiseksi, genomisen DNA: n tasot HOXB5 käyttäen samaa aluekohtainen Taqman.

HOXB5 mRNA Half-life

qPCR käytettiin myös mittaamaan puoli -Life on HOXB5 mRNA. 1 x 10

6 T24 ja TCCSUP virtsarakon syövän solut maljattiin 10 cm: n maljaa yksi päivä ennen aktinomysiini D (5 ug /ml), joka inhiboi geneettisen transkription, lisättiin soluihin. Käsittelyn jälkeen aktinomysiini D, solut lysoitiin käyttäen TRIzol eri ajankohtina, 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h ja 48 h. Kokonais-RNA uutettiin ja HOXB5 mRNA-tasolla kvantitoitiin qPCR käyttäen Taqman-määritys aikaisemmin kuvatulla tavalla.

tilasto

Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään kolmesta erillisestä kokeesta . Erot ryhmien välillä analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä, kun vain kaksi ryhmää verrattiin, tai jonka yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), kun enemmän kuin kaksi ryhmää verrattiin. Ikävakioitu kerroinsuhde (AOR) ja 95%: n luottamusväli (CI) suhde HOXB5 3′-UTR genotyyppi taajuuksia ja kliinisiä tai histologisia piirteitä määritettiin monimuuttuja regressioanalyysimme SPSS 17.0 iän pitää tekijänä . Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä p 0,05.

Tulokset

HOXB5 oli yli-ilmentynyt ihmisen virtsarakon syövän sissa ja solulinjoissa

RNA eristettiin 35 virtsarakon syöpäpotilailla ja 8 virtsarakon syövän solulinjat ja ilmentymistä HOXB5 mitattiin qPCR. Kuten kuviossa 1A on esitetty, on 35 näytettä, 23 (-70%) oli korkeampi ilmentyminen HOXB5 verrattuna normaaliin viereiseen kudokseen (NAT). Ilmentyminen HOXB5 kasvoi myös 6 8 virtsarakon syövän solulinjoissa (TCCSUP, 5637, T24, RT4, HT-1376, ja J82) kuin normaalissa virtsarakossa soluissa (kuvio 1 B). Immunohistokemialliset tutkimukset käyttäen HOXB5-spesifisen vasta-aineen vahvisti, että ilmaus HOXB5 on suurempi virtsarakon syövän kudoksissa kuin normaalissa virtsarakossa kudoksissa (kuvio 1C). Kuitenkin, ei ole korrelaatiota ilmentymisen HOXB5 ja kasvaimen tai vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen HOXB5 voi olla yhteinen joissakin virtsarakon syövän kudoksissa ja solulinjoissa.

. Expression of HOXB5 35 virtsarakon syövän kudoksissa suhteessa normaaliin viereisiin kudoksiin (NAT). Sarakkeet edellä X-akselilla osoittavat yliekspressio HOXB5; ne alapuolella X-akseli osoittaa alaspäin ilmentymä HOXB5 suhteessa NAT. B. ilmentäminen HOXB5 kahdeksassa virtsarakon syövän solulinjat suhteessa normaaliin virtsarakon soluihin. Sarakkeet edellä X-akselilla osoittavat yliekspressio HOXB5; nämä alla X-akselin osoittavat alas-ilmentymisen HOXB5 suhteessa normaaleihin soluihin. Kertamuutoksia 1 katsottiin olevan positiivinen. C. HOXB5 ilmentyminen ensisijainen siirtymäkauden solujen virtsarakon syöpä kudoksiin havaitaan immunohistokemiallisesti. C1 ja C2, virtsarakon syöpä kudoksiin, G2 laatu. C3, Virtsarakon syöpä kudos, G3 laatu. C4, Normaali virtsarakkokudos. Kaikki kuvat ovat × 100. Värjäys: ruskea, HOXB5.

HOXB5 edistää solujen lisääntyminen ja muutto Virtsarakon syövän solut

Huomasimme, että HOXB5 oli yli-ilmentynyt virtsarakon syövän kudoksissa ja solulinjoissa, mikä osoittaa, että HOXB5 voi toimia onkogeenin. Tutkia kasvaimia synnyttävän toiminnon HOXB5, transfektoimme si-HOXB5 ja NC siRNA osaksi T24, 5637 ja TCCSUP soluja. 48 tuntia transfektion jälkeen, joka on CCK8 määritys osoitti, että solujen kasvu oli merkittävästi vähentynyt si-HOXB5 transfektoitiin ryhmissä verrattuna NC-ryhmään tai mock ryhmä (Lipofectamine vain) (kuvio 2A, p 0,05). Huomasimme myös, että siirtyminen kyky si-HOXB5 transfektoiduissa soluissa oli merkitsevästi esti verrattuna NC ryhmän tai mock ryhmää (kuvio 2B). Nämä tulokset osoittivat, että HOXB5 voi edistää solujen lisääntymistä ja migraatiota virtsarakon syövän solujen, sopusoinnussa rooli onkogeenin.

. Leviämisen virtsarakon syövän solulinjoista T24, 5637 ja TCCSUP. CCK8 määritystä käytettiin tutkimaan solujen kasvua virtsarakon syövän soluissa. B. Migration virtsarakon syövän solulinjoista. Vasen sarake, si-HOXB5 transfektoitujen ryhmä; oikea palsta, NC siRNA transfektoitu ryhmä. Kaikki kuvat ovat x 10. Värjäys: violetti, muuttoliike soluja. C. Pesäkkeenmuodostusta (C1) ja pesäkkeitä muodostavat tehokkuus (C2) virtsarakon syövän solujen transfektion jälkeen si-HOXB5 tai NC siRNA. Pesäkkeitä muodostavien hyötysuhde = pesäkkeitä /kullattu solua x 100%. * P 0,05, ** p 0,01. NC, epäspesifinen kontrolli. MOCK, Lipofectamine vain.

si-HOXB5 vaimentaa kyky muodostaa klooneja

in vitro

tutkimaan edelleen mahdollista roolia HOXB5 kasvainten synnyssä, tutkimme vaikutus HOXB5 kolonioiden muodostumista syöpäsolujen

in vitro

. Kolme virtsarakon syöpäsolulinjoista (T24, 5637 ja TCCSUP) transfektoitiin si-HOXB5 tai NC-duplex, ja annettiin kasvaa hyvin alhaisen tiheyden (500 solua T24, 1000 solua 5637 ja TCCSUP) noin 14 päivää. Erityisesti, si-HOXB5 esti sekä koko ja lukumäärä, kyky virtsarakon syövän solujen muodostamaan pesäkkeitä (kuvio 2 C1). Lisäksi si-HOXB5 transfektoidut solut osoittivat alempi pesäkkeitä muodostavien tehokkaammin kuin NC-transfektoiduissa soluissa (kuvio 2 C2, p 0,01). Nämä tiedot edelleen tuettava kasvaimia synnyttävän vaikutuksen HOXB5 virtsarakon syövän soluissa.

SNP-1010A /G sijaitsee miRNA-7 Binding Site HOXB5 3′-UTR

Löysimme SNP rs9299 ( 1010 A /G) sijaitsee 3′-UTR HOXB5 geenin käyttäen NCBI SNP-tietokantaan. HOXB5 myös ennustettu olevan yksi kohdegeenien miRNA-7 mukainen 3 eri systeeminen Bioinformatiikkaohjelmistojen jota käytimme, ja SNP (1010 A /G) sijaitsi miRNA-7 sitoutumiskohta (kuvio 3A) .

. HOXB5 oli ennustettu välittömänä kohteena miR-7 Miranda, PicTar ja TargetScan. B. Luciferase analyysi HEK-293T-soluissa. WT, villityypin. MUT, mutantti tyyppi. C. Vaikutus miR-7 ilmentymisen vaikutus ilmentymisen tasot endogeenisen HOXB5 in T24, 5637 ja TCCSUP soluja. Endogeeninen HOXB5 mRNA ja proteiini tasot analysoitiin qPCR (C1) ja Western blot (C2) vastaavasti. p-aktiini, sisäistä valvontaa. ** P 0,01 verrattuna NC transfektanttien. NC, epäspesifinen kontrolli.

validoimiseksi HOXB5 bona fide tavoite miR-7, ihmisen HOXB5 3′-UTR-fragmentti, joka sisältää joko villityypin tai mutantti-miR-7-sitoutuva sekvenssi on subkloonattiin alavirtaan Renilla lusiferaasireportterigeenin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus reportteri, joka sisältää villityypin HOXB5 3′-UTR suppressoi merkittävästi, kun miR-7 kotransfektoitiin (p 0,01). Sen sijaan, lusiferaasiaktiivisuus reportteri, joka sisälsi mutantti-miR-7-sitoutumiskohta oli lähes ennallaan (p 0,05) (kuvio 3B).

edelleen tutkia säätely HOXB5 ilmentymisen miR-7, transfektoimme miR-7 matkii ja NC soluun linjojen T24, 5637 ja TCCSUP. 48 tunnin jälkeen tarkastelimme HOXB5 mRNA ja proteiini tasot käyttäen qPCR ja western blot. Huomasimme, että HOXB5 mRNA ja proteiini-tasot alas-säännelty miR-7 transfektoiduissa ryhmissä verrattuna NC ryhmien (kuva 3 C1 C2).

Nämä tulokset osoittivat, että miR-7 voi säädellä HOXB5 ilme sekä post-transkription ja mRNA-tasot.

SNP 1010A /G vaikuttaa HOXB5 Expression

tutkimiseksi vaikuttaa SNP 1010A /G ilmaisun HOXB5 selvitimme mRNA-tasoja ja HOXB5 varten 1010A ja 1010G-alleelien heterotsygoottisessa GA genotyyppi virtsarakon syöpä kudosten (13 tapausta) ja solulinjoissa (5637, RT4 ja J82), käyttäen Taqman-määritys edellä kuvatulla tavalla. Olemme havainneet, että ilmaus HOXB5 mRNA kanssa 1010G alleeli oli huomattavasti korkeampi kuin mRNA kanssa 1010A alleeli sekä syövän kudoksissa ja solulinjoissa (kuvio 4A1 ja A2). Ilmaisulla suhde 1010G ja 1010A genomisessa DNA näistä heterotsygoottinen syöpäkudosten ja solulinjat olivat samanlaisia ​​(kuva 4B1 ja B2). Nämä tulokset osoittivat, että 1010A /G SNP on HOXB5 3′-UTR vaikuttaa ilmentymisen HOXB5 mRNA.

A1. Expression of mRNA kunkin alleelin heterotsygoottisessa GA genotyyppi solulinjoissa (5637, RT4 ja J82) ja kudokset (13 tapausta). A2. Expression of mRNA (Mean) kunkin alleelin heterotsygoottisessa GA genotyyppi solulinjoissa ja kudoksissa. Y-akselilla, ilmentyminen HOXB5 mRNA. Ct: sykli kynnys, lasketaan Realtime-PCR kone. B1. Expression of heterotsygoottisen genomisen DNA: n sisäisenä kontrollina. B2. Expression of heterotsygoottisen genomista DNA: ta (keskimääräinen) sisäisenä kontrollina. Y-akselilla, ilmentymistä genomista DNA: ta. *** P 0,001.

eri alleelit vaikuttavat mRNA vakaus- ja HOXB5 eksressoitumistasojen

ennustaa mahdollisia mekanismeja miten 1010A /G SNP tuloksia ero HOXB5 ekspressiotasot, me käytetään mRNA: n sekundaarisen rakenteen ennuste työkalu MFOLD ennustaa sekundaarinen rakenne mRNA: iden kanssa A ja G-alleelit. Olemme havainneet, että ennustettu vähän vapaata energiaa (MFE) sekundäärisen rakenteen mRNA: n G-alleeli oli alhaisempi kuin mRNA: n kanssa A-alleelin (-5,4 vs -3,0). Tämä tulos osoitti, että rakenne mRNA kanssa G-alleelin voi olla vakaampi kuin että mRNA kanssa A-alleelin (kuvio 5A).

lähemmin mikä alleeli (A tai G) Siirretään lisää vakautta mittasimme mRNA puoliintumisajan, koska on osoitettu, että vakaan tilan mRNA liittyy läheisesti mRNA puoliintumisaika [21]. Tutkimme puoliintumisaika HOXB5 mRNA homotsygoottinen T24 ja TCCSUP virtsarakon syövän solujen (GG T24 ja AA TCCSUP) käsittelyn jälkeen aktinomysiini D, käyttäen qPCR. Tulokset osoittivat, että puoliintumisaika HOXB5 mRNA soluissa, joilla oli GG-genotyyppi oli 3,5-kertainen (11 h) kuin mRNA puoliintumisaika (3,4 h) solut AA genotyyppi (kuvio 5B), mikä osoittaa, että mRNA: n G-alleeli oli stabiilimpi kuin mRNA: n A-alleeli. Tämä erilainen vakaus kaksi mRNA: t voivat olla mahdollisia mekanismi, joka selittää eri vaikutus SNP on HOXB5 ilme.

. Sekundaarirakenteiden HOXB5 mRNA ennustaa MFOLD. Vähäinen vapaa energia (MFE) voi heijastaa mRNA vakautta. B. puoliintumisaika HOXB5 mRNA T24 (GG-genotyyppi) ja TCCSUP (AA genotyyppi) soluja. Puoliintumisaika varten mRNA kanssa G-alleelin oli noin 11 tuntia, ja noin 3,7 tuntia A-alleelin. C. HOXB5 ilmentymistaso transfektion jälkeen miR-7 suhteessa NC vuonna 5637 soluissa (GA genotyyppi). Sekä A ja G-alleelien mRNA transfektoitu miR-7 näytteillä alassäätöä suhteessa NC ryhmään. Taso HOXB5 mRNA kanssa A-alleelin laski enemmän kuin mRNA kanssa G-alleelin. D. Luciferase analyysi HEK-293T-soluissa miR-7-aktiivisuus. Vector, psiCHECK-2 Vector. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

The Binding Activity of miR-7 eri alleelien mRNA vaikuttaa HOXB5 Expression taso

transfektoitu miR-7 on virtsarakon syövän solulinja (5637), jossa heterotsygoottinen GA genotyyppi 48 tuntia ja mitattiin HOXB5 mRNA-tasolla käyttäen Taqman-määritys. Havaitsimme, että yli-ilmentyminen miR-7 voisi merkittävästi estää ilmentymisen taso HOXB5 mRNA verrattuna NC ryhmä? Mielenkiintoista on, että ilmentymisen taso HOXB5 mRNA: n A-alleeli laski huomattavasti enemmän kuin taso mRNA: n G-alleelin (kuvio 5C) osoittaen, että sitoutuminen miR-7 on HOXB5 mRNA: n A-alleeli oli suurempi kuin mRNA: n G-alleelin.

validoida hypoteesia, toteutimme lusiferaasianalyysissä. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudeksi tukahdutettiin paljon enemmän reportteri sisältävä 1010A transfektoitu miR-7 kuin sisältävä 1010G alleelin (kuvio 5D). Nämä tulokset osoittivat, että sitovaa aktiivisuutta miR-7 joko 1010A tai 1010G alleeli voi olla toinen tärkeä mekanismi, joka osallistuu eri HOXB5 ekspressiotasot vaikuttaa SNP.

Yhdistys välinen 1010A /G HOXB5 genotyyppi taajuus ja virtsarakon syövän

Seuraavaksi tutkimme yhdistyksen välillä 1010A /G HOXB5 genotyypin taajuus ja kliiniset piirteet virtsarakon syöpään. DNA uutettiin 391 virtsarakon syöpä vahvistettiin patologien, sekä 391 normaalia valvontaa, ja SNP (1010A /G) genotyyppien jokaisesta näytteestä analysoitiin. Huomasimme, että G-alleelin (AG + GG) genotyypit liittyy riski korkealuokkaisesta (luokka 2 ja 3, AOR = 4,25, p 0,001, taulukko 1) ja korkea vaiheen (T2-T4, lihas invasiivisia tyyppi, AOR = 2,25, p = 0,003, taulukko 2) syöpiä vastaan ​​huono laatu (Grade1) ja matalan vaiheen (T1, ei-lihas- invasiivisia tyyppi) syöpiä. Osoitimme myös, että tiheys G genotyyppien (AG + GG) oli suurempi virtsarakon syövän ryhmässä verrattuna normaaliin säätimet (AOR = 1,48, p = 0,017) (taulukko 3).