PLoS ONE: MicroRNA geenejä ja niiden Target 3′-alueet ovat harvoin somaattisesti mutatoitunut Munasarjojen Cancers
tiivistelmä
MikroRNA ovat keskeisiä säätelijöitä geenien ilmentymistä ja on osoitettu muuttuneen ilmentymisen erilaisia syöpä tyypit, mukaan lukien epiteelin munasarjasyöpä. MiRNA-toiminto on useimmiten saavutetaan sitoutumisen 3′-transloitumattoman alueen kohdeproteiinin koodaavan geenin. Mutaatio seulonta käyttäen massiivisesti-rinnakkaissekvensointijärjestelmät 712 miRNA geenien 86 munasarjasyövän tapauksissa tunnistaa vain 5 muuntunut miRNA geenejä, joista kukin on eri asia. Yksi mutaatio sijaitsi kypsä miRNA, ja kolme mutaatiota ennustettiin muuttaa sekundaarinen rakenne miRNA transkriptin. Seulonta 3′-alueen 18 ehdokkaan syövän tunnistettujen geenien yksi mutaatio kussakin
AKT2
,
EGFR
,
ERRB2
ja
CTNNB1
. Toiminnallinen vaikutus näistä mutaatioista on epäselvä, koska ilmaisu tietoja saatavilla
AKT2
ja
EGFR
ei osoittanut lisäystä geenitranskriptikuvion. Mutaatiot miRNA geenien ja 3′-alueet ovat siten harvinaisia munasarjasyöpää.
Citation: Ryland GL, Bearfoot JL, Doyle MA, Boyle SE, Choong DYH, Rowley SM, et al. (2012) MicroRNA geenejä ja niiden Target 3′-alueet ovat harvoin somaattisesti mutatoitunut munasarjasyöpiä. PLoS ONE 7 (4): e35805. doi: 10,1371 /journal.pone.0035805
Editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat
vastaanotettu: 29 tammikuu 2012; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2012; Julkaistu: 20 huhtikuu 2012
Copyright: © 2012 Ryland et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat Victorian Breast Cancer Research Consortium, Australia, ja Australian National Health ja Medical Research Council (NHMRC). GLR tukee Australian jatko palkinnon. Australialainen munasarjasyöpä Study Group tukivat Yhdysvaltain armeijan Medical Research ja Materiaalilaitoksen Esikunta alle DAMD17-01-1-0729, The Cancer neuvosto Tasmania, The Cancer Foundation Länsi-Australian ja NHMRC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
MikroRNA (miRNA), luokka pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylejä, on tärkeä sääntelyn rooleja erilaisissa solureiteillä lukien proliferaatio, erilaistuminen, vanhenemista ja aineenvaihdunta [1]. Tämä asetus on saavutettu osittain komplementaarinen kuoret kanssa 3′-alue (3′-UTR) kohde-lähetti-RNA (mRNA) [1] – [3], sekä 5′-transloimaton alue tai koodaus alueet mRNA, jotka ovat sittemmin hajoavat tai transkription jälkeen vaiennetaan [4] – [6]. Kertyvät näyttöä nyt osoittaa, että miRNA ilmaisu ei ole täydellistä syövän [7], joka johtaa olettamusta, että muutokset miRNA polkuja voi olla tärkeä askel aloittamiseen ja eteneminen maligniteetti. Sopusoinnussa tämän hypoteesin on havainto, että miRNA geenit ovat usein lokalisoitu genomialuetta yleisesti muuttunut syövän, kuten minimaalinen alueet poistetaan, Heterotsygotian menetys ja vahvistus sekä hauras sivustoja [8] – [10]. Mutaatio on vaihtoehtoinen mekanismi miRNA sääntelyn purkamista syövän ympäristössä, jolloin mutaatio voi muuttaa miRNA transkriptio, käsittelyä tai miRNA-mRNA vuorovaikutusta. Tämä mekanismi kuvasi ensimmäisenä Calin
et al.
[8], joka tunnistaa ituradan vaihtelu
HSA-miR-16-1
joka oli yhdistetty herkkyys krooninen lymfaattinen leukemia. Sen jälkeen, ituradan polymorfismien miRNA-geenit on liittynyt alttiutta muihin syöpätyyppeihin [11]. Huolimatta olettamusta, että miRNA voivat toimia perinteisen onkogeenien tai tuumorisuppressorien, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että somaattinen mutaatio miRNA ovat harvinaisia ja ne, jotka on ilmoitettu osoittaa vähän vaikutusta miRNA toimintaa [10], [12] – [14] . Kuitenkin suurin osa näistä tutkimuksista ovat suosineet kandidaattigeeni lähestymistavan ja tähän mennessä, un-puolueellinen arvion esiintyminen somaattisten muutosten miRNA geenien tahansa syöpätyypin puuttuu.
Analogisesti mutaatiot ilmenevät miRNA siemen alueet, mutaatiot ilmenevät kohde-mRNA-sekvenssi voi muuttaa sitovaa ja myöhemmät miRNA-riippuvaista geenin ilmentymisen säätelyyn. Vaikka ituradan solumuutokset miRNA sitoutumiskohdat 3′-UTR voi myötävaikuttaa syöpään alttiuteen [11], [15] – [17], raportit somaattisten mutaatioiden esiintyy vastaavassa tilanteessa on rajoitettu yhteen tapausselostus [13] ja on vielä olla tutkittu laajoissa kasvain ikäluokat. Jos somaattiset mutaatiot eivät tapahdu miRNA sitoutumiskohdista, se merkitsisi aiemmin tuntemattomassa geneettinen mekanismi repression tai aktivaation syöpään liittyvän mRNA.
Aberrant miRNA aktiivisuus liittyy usein patogeneesiin ja etenemiseen epiteelin munasarjasyöpä yleisin muoto munasarjojen maligniteetti. MiRNA profilointi tutkimuksissa johdonmukaisesti tarkkailla maailmanlaajuinen vaiennettu miRNA ilmaisun munasarjakasvainten, joka on osaltaan osittain genomista menetys ja epigeneettiset muutokset [10], [18] – [22]. Samoin ilmaus monia tunnettuja ja otaksuttu syöpä geenien väärin säädellystä munasarjasyövän, esimerkiksi
BRCA2
, joille vain osa havaitun menetyksen ilmaisun voidaan katsoa mutaatio, ja promoottori metylaatio ei noudateta [ ,,,0],23]. Aikaisemmin olemme osoittaneet, että taajuus somaattisten mutaatioiden 10 syöpää sekaantunut miRNA on alhainen ovarioiden [24]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme laajentaa tätä analyysia kattavasti luonteenomaiset somaattiset mutaatiot 712 miRNA geenien käyttäen massiivisesti rinnakkaisen suunnattu uudelleen sekvensointi. Lisäksi olemme seulotaan 3′-UTR 18 ehdokkaan syövän geenien kanssa tavoitteena on tunnistaa somaattisten mutaatioiden, jotka muuttavat ennustettu miRNA sitoutumiskohtia. Vaikka nämä geenit ovat usein sekaantuneet kasvaimia prosessissa, koodaus mutaatioita, metylaatio tai kopioluvun muutoksia vain osuus osajoukon ilmaisun erot nähdään munasarjojen kasvaimia.
Tulokset ja keskustelu
Somaattiset mutaatiot kohdistaminen microRNA geenit harvinaisia tapahtumia munasarjakasvaimia
sen tutkimiseksi, mutaatioita miRNA geenit edistävät muuttunut miRNA toimintaa munasarjasyövän, 86 ensisijainen epiteelin munasarjojen kasvaimia arvioitiin somaattisten mutaatioiden genomialuetta vastaa esiastetta tai kypsä miRNA sekvenssit. Kliiniset ominaisuudet näistä tapauksista on esitetty taulukossa S1. Kohdennettu seuraavan sukupolven sekvensoinnin avulla arvioitiin 712 miRNA geenien selityksineen vuonna Sanger miRNA tietokannan (versio 13.0, maaliskuu 2009). Seuraavat tiedot linjaus, 95% kohdennettujen emäksiä sisällä 712 miRNA geenit oli vähintään 10-kertainen järjestyksessä kattavuus, ja vastaava keskimääräinen kattavuus 92-kertaiseksi. Suodatus poistaa ituradan variantit havaitaan vastaaviin normaaleihin lymfosyyttien DNA ja validointi tavanomaisilla sekvensoinnilla tunnistettiin somaattisia mutaatioita 5 miRNA geeneistä:
HSA-miR-10a
,
HSA-miR-622
,
HSA-miR-767-5p
,
HSA-miR-888
ja
HSA-miR-1280
(kuvio 1). Kaiken somaattiset mutaatiot havaittiin 6% (5/86) kasvaimissa ja alle 1% (5/712) ja miRNA geenien analysoitu ilman miRNA geenien toistuvasti kohteena mutaatio. Yhdenmukaisia aiempien raporttien mutaatiot kypsä miRNA olivat melko harvinaisia; vain yksi mutaatio sijaitsi kypsän alueen
HSA-miR-767-5p
(mutta ulkoinen siemenen alue), kun taas loput neljä tapahtunut esiasteen hiusneula. Tämä data on yhtäpitävä aikaisempien pienemmissä tutkimuksissa viittaa siihen, että somaattiset mutaatiot miRNA geenit ovat epätavallisena tapahtumana Tuumorinäytteissä [8], [12], [14], [24], [25].
kasvain spesifisiä mutaatioita on merkitty mustat palkit suhteessa kypsään microRNA (valkoinen laatikko) ja esiaste microRNA (harmaa laatikko) sekvenssit. Sijainnit mutaatioiden raportoidaan suhteessa seuraavien edeltäjä microRNA selostukset:
HSA-miR-10a
NR_029608.1;
HSA-miR-622
NR_030754.1;
HSA-miR-767-5p
NR_030409.1;
HSA-miR-888
NR_030592.1;
HSA-miR-1280
NR_031703.1.
Mirna biogeneesin on monivaiheinen prosessi aloitetaan RNA-polymeraasi II-välitteisen transkription, jota seuraa RNaasi III riippuvaisen trimmaus osaksi hiusneula väli- ja myöhemmin pilkkominen toimivaksi kypsä miRNA [1], [26]. Tämä prosessi on riippuvainen jaksoryhmittymät ja RNA sekundaarisen rakenteen elementit ensisijainen ja esiaste miRNA-molekyylit [26]. Sinänsä mutaatiot syntyvät esiaste alueet voivat muuttaa RNA sekundaarirakenteissa ja siten estää jalostamista kypsä miRNA. Sen määrittämiseksi, onko RNA rakenteelliset muutokset voivat johtua somaattisten miRNA mutaatiot tunnistetaan, käytimme RNAfold ohjelmaa [27] ennustaa vakain sekundaarirakenteen sekä villityypin ja mutantti-sekvenssit. Konformaatiomuutoksiin oli ennustettu mutantti
HSA-miR-622
,
HSA-miR-767-5p
ja
HSA-miR-1280
(kuva S1). Kuitenkin konformaatiomuutoksia ennustettu
in silico
harvoin merkitse fysiologista vaikutusta [12] ja funktionaalinen seuraus mutaatioista tunnistettu täällä vaatii lisätutkimuksia, joissa
in vitro
määrityksissä.
toisin kuin usein havainto kasvaimeen vaihtelut vaikuttavat aktivoinnin tai tukahduttamisen proteiinia koodaavan geenien syöpää, nämä havainnot osoittavat, että somaattiset mutaatiot miRNA geenit aikana epätavallisena tapahtumana munasarja- synnyssä ja lisää kertyy todisteita useista kasvain tyypit viittaa siihen, että miRNA harvoin väärin säädellystä tällä mekanismilla. Koska suuri määrä mRNA tavoitteita ennusti yhden miRNA ja moninaiset roolit ennakoidut kohdegeenien, mitään somaattinen mutaatio miRNA geenin (ja erityisesti esiintyvien siemenen sekvenssi) vaikuttavat todennäköisesti monia biologisia polkuja [2], [3], joista osa voi olla mukana ylläpitää solun homeostaasin. Näin ollen vaikka somaattisesti mutatoitunut miRNA geeni muuttunut mRNA ilmentymisen vaikuttaa positiivisesti kasvain säilymiseen, on todennäköistä, että siellä olisi useampia geeniekspression muutoksia, jotka eivät olisi edistä kasvainsolun eloonjäämistä. Toisaalta tietyissä tilanteissa, mRNA: n transkription repression voi aiheuttaa toiminta useiden miRNA [28], ja siten, muuttuneen toiminnan yhden miRNA voi olla riittämätön johtaa biologisen vaikutuksen. Lopuksi on yhä enemmän tunnustettu, että miRNA muutoksia havaittu syövän kudoksissa voi esiintyä toissijainen vikoja osien miRNA koneet, kuten transkriptiotekijät ja chromatin remontin säätelevien geenien miRNA transkriptio sekä komponenttien miRNA posttranskriptionaalisella asetuksen [29 ], [30]. Ovarioiden,
DICER1
ja
EIF2C2
(Argonaute2) DNA kopiomäärä voitot on havaittu 24,5% ja 51,5% kasvaimista vastaavasti [9] ja mediaani kokonaiselinaika vähenee naisilla, joiden kasvaimet ovat pienemmät
DICER1
ja
DROSHA
mRNA ilmaisun [31]. Lisätutkimuksia tarvitaan vahvistaa, että on tärkeää muutoksia näihin ja muihin komponentteihin miRNA biogeneesin väylän patogeneesissä munasarjasyöpä.
Somaattiset mutaatiot kohdistaminen 3′-alueet ovat harvinaisia tapahtumia munasarjakasvainten
tutkimaan mahdollisuutta, että somaattiset mutaatiot ilmenevät 3′-UTR syövän geenien muuttaa olemassa miRNA sitoutumiskohta, ja siten merkitsevät uutta mekanismia poikkeavan mRNA: n geenin ilmentymistä syövän, me sekvensoitiin 3′-UTR-alueet 11 onkogeenien (
AKT2
,
BRAF
,
CCNE1
,
CTNNB1
,
EGFR
,
ErbB2
,
FGF1
,
KRAS
,
MYC
,
PIK3CA
ja
RAB25
) kohdennettuja uudelleenjärjestely-in 86 munasarjojen kasvaimia. Kun kyseessä on onkogeenin, kumoaminen on miRNA sidoskohdan voi sallia sääntelemättömien onkogeenin ilmentymisen. Lisäksi 3′-UTR 7 tuumorisuppressorigeeneille (APT) (
BRCA1
,
BRCA2
,
CDKN2A
,
PTEN
,
RB1
,
SPARC
ja
TP53
) on myös sekvensoitiin arvioida yleisyydestä somaattisista mutaatioista, jotka tuottavat
de novo
miRNA sitoutumiskohta ja tulos in TSG alassäätöä. Nämä geenit ovat tunnustettu Cancer Gene Census olevan syy osallisena munasarjakasvain kehittämiseen joko somaattisen mutaation, geenimonistuksen tai poistamista [32].
FGF1
,
RAB25
ja
SPARC
valittiin perustuen niiden osoitettiin toiminnallista roolia munasarjasyöpä [33] – [37]. 3′-UTR sekvensoitiin 108-kertaisesti tarkoittaa kattavuus ja yli 99%: n kohdennettujen emäkset näillä alueilla katettiin 10 tai enemmän sekvenssin lukee. Kasvain-mutaatioita oli harvoin tunnistettu 3′-UTR munasarjasyövän näytteet: 4/86 kasvainnäytteet kukin tunnistettu mutaatio johonkin neljästä eri onkogeenien (
AKT2
,
CTNNB1
EGFR
ja
erbB2
) (taulukko 1), jossa ei ole mutaatioita havaittu 7 APT tutkittu.
In silico
miRNA tavoite Ennustusalgoritmien mukaan mutatoidut lokuksen
AKT2
,
CTNNB1
ja
ErbB2
voi esiintyä alueella ennustetun miRNA sitova sivusto, jossa kaksi mutaatiota, c. * 538T A (
CTNNB1
) ja c. * 460g C (
ErbB2
) vaihdot, ennustetaan esiintyä siemen jono
HSA-miR-630
ja
HSA-miR-640
sitova vastaavasti. RNA ilmentymisen profilointi oli käytettävissä näytteiden mutaatioita
AKT2
ja
EGFR
ja osoittanut, että transkriptin tasot näiden geenien ei muuttunut näytteiden somaattisten 3′-UTR mutaatiot suhteessa muihin kasvain näytettä samasta munasarjojen alatyypin (kuva S2).
Vaikka tiedetään, että miRNA voi myös antaa transkription repression toimin 5′-UTR mRNA tavoite, tämä tutkimus tarjoaa alustavaa näyttöä siitä, että somaattiset mutaatiot muuttamalla miRNA sitoutumiskohtien 3′-UTR yleisin syöpä geenit ovat harvinaisia epiteelin munasarjojen kasvaimia. Tehokas translaation hiljentäminen voi vaatia synergistisen toiminnan miRNA useisiin kohtiin poikki UTR, joko yhden perheen MikroRNA tai yhdistämällä liity MikroRNA, ja siten yhden somaattiset mutaatiot tunnistettiin tässä todennäköisesti riitä vaientaa vastaaviin transkriptio [28] , [38]. Somaattiset mutaatio esiintyvyys 3′-UTR alueilla ehdokas syövän geenien sekven- oli 1,43 mutaatioita per Mb. Vertailun vuoksi mutaatio esiintyvyys proteiinia koodaavat alueet tunnettujen syövän geenien tässä kasvain kohortissa on 570,57, 183,60 ja 32,63 mutaatioiden per Mb varten
TP53
,
KRAS
ja
PIK3CA
vastaavasti, kun taas arvioitu mutaation esiintyvyys koodaus exome on 2,4 mutaatiota per Mb ovarioiden [23]. Näin ollen on todennäköistä, että alhainen mutaation 3’UTRs verrattuna eksonit osoittaa, että suurin osa mutaatioiden 3′-säätelyalueita, jotka identifioidaan tässä esiintyy sivullisen tapahtumia kasvaimen solujen kehitystä.
Yhteenvetona, somaattiset mutaatiot miRNA geenit harvoin munasarjakasvaimia ja ovat siten todennäköisesti selittää muuttuneen miRNA aktiivisuuden havaittu tässä kasvaimen tyyppi. Lisäksi tarjoamme alustavaa näyttöä siitä, että valinta somaattisten mutaatioiden 3′-UTR ehdokas syövän geenien, joka olisi n oletetaan häiritä miRNA riippuvainen geenisäätelyn, ei todennäköisesti edustavat yhteistä mekanismia muuttunutta mRNA: n ilmentymisen munasarjojen kasvaimia.
Materiaalit ja menetelmät
Ethics selvitys
Karttuminen ja käyttö potilaan aineistoa tätä tutkimusta varten hyväksyttiin seuraavalla Human Research Ethics valiokunnat: Southampton Hospital Human Research eettiselle toimikunnalle, Peter MacCallum Cancer Centre Human Research Ethics komitea, Queensland Institute of Medical Research Human Research Ethics komitea, University of Melbourne Human Research Ethics komitea, Westmead sairaala Human Research Ethics komitea. Kaikki henkilöt antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen käytöstä niiden kudoksen tutkimukseen. Hanke hyväksynyt Peter MacCallum Cancer Centre Human Research Ethics Committee (hyväksyntä # 09/29).
Munasarjojen kasvain kohortti
86 ensisijainen epiteelin munasarjojen kasvain otettiin kudosnäytteet läpi Peter MacCallum Cancer Center Tissue Bank, Australia munasarjasyöpä Study tai potilailla, sairaaloihin etelä-Englannissa [39]. Kaikki kasvaimen DNA-näytteet microdissected varmistaa suurempi kuin 80% epiteelisolujen komponenttia. Tämä kasvain kohortti käsitti seoksen vakavien (n = 45), endomet- (n = 28), mucinous (n = 7) ja selkeä solujen (n = 6) alatyyppejä. Yhteensopiva perifeerisen veren näytteitä kerättiin myös kaikki potilaita, joilla on tuumorin keräämistä ja käytettiin lähteenä ituradan DNA.
soveltuva alue tunnistamisen suunnattu seuraavan sukupolven sekvensointi
3′-UTR 18 proteiinia koodaavan geenit valittiin somaattisen mutaation seulontaan. Genome koordinaatit valituille 3′-UTR tunnistettiin perustuen niitä selityksin vuonna Ensembl tietokannassa (release 54) seuraaville selostukset:
AKT2
(ENST00000392038),
BRAF
(ENST00000288602)
CCNE1
(ENST00000262643),
CTNNB1
(ENST00000349496),
EGFR
(ENST00000275493 ja ENST00000344576),
erbB2
(ENST00000269571),
FGF1
(ENST00000359370),
KRAS
(ENST00000256078),
MYC
(ENST00000259523 ja ENST00000377970),
PIK3CA
(ENST00000263967),
RAB25
(ENST00000361084),
BRCA1
(ENST00000309486),
BRCA2
(ENST00000380152),
CDKN2A
(ENST00000304494),
PTEN
(ENST00000371953),
RB1
(ENST00000267163),
SPARC
(ENST00000231061) ja
TP53
(ENST00000269305). Genominen koordinaatit ihmisen esiaste miRNA saatiin Sanger-instituutin miRBase (release 13,0, maaliskuu 2009) [40], [41], mukaan lukien 548 yksittäiset miRNA geenejä sekä 164 miRNA sisällä 62 miRNA klustereita. Kaikki koodaus eksonit
TP53
,
KRAS
ja
PIK3CA
olivat mukana sekvenssianalyysillä.
Kirjasto valmistelu ja kohde rikastamiseen
200 ng kasvain tai vastaaviin normaaleihin lymfosyytin DNA fragmentoidaan satunnaisesti noin 200 bp (Covaris, Woburn, MA) ja lopussa korjaus- ja A-pyrstön suoritettiin Illumina genomisen DNA-kirjaston valmistamiseksi protokollan (Illumina, San Diego, CA). Tämän jälkeen DNA ligoitiin yksi 7 mukautetun multiplexing adapterit yhteensopiva Illumina yhden pää sekvensointi. Indeksoitu DNA-näytteet yhdistettiin yhtä ennen PCR rikastamiseen. Kaikkien käytettävien reagenssien aikana kirjaston valmistelu saatiin New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA). Boutique eksonin talteenotto (SureSelect, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) käytettiin erikseen rikastamiseksi valittu 3′-UTR-alueet, miRNA ja koodaus eksonit syövän geenien genomisten DNA-kirjastojen ennen seuraavan sukupolven sekvensointi. Sieppauskoettimien suunniteltiin käyttäen oletusparametrejä toimittamalla genomista koordinaatit ja eArray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Liuoshybridisaatio, pesu, eluutio ja monistus suoritettiin mukaisesti suosittelemaa menetelmää.
Somaattiset mutaatiot analyysi Illumina GAIIx sekvensointi ja kapillaarielektroforeesilla
Target rikastetun DNA-kirjastot sekvensoitiin Illumina GAIIx, tuottaa 75 ep yhden pään sekvenssi lukee. Kuva-analyysi ja pohja calling suoritettiin käyttäen genomista analysaattorin Pipeline v1.6. Sequence lukee rinnastettiin ihmisen viite genomin (GRCh37 /hg19 kokoonpano) käyttämällä BWA ja loput unmapped lukee olivat linjassa Novoalign ohjelmistojen [42]. Tätä seurasi paikallisten uudelleensuuntausta kanssa GATK [43]. Pistemutaatiot ja insertioita /deleetioita (indeleitä) tunnistettiin käyttäen GATK ja Dindel [44] vastaavasti ja selityksin tiedoilla Ensembl release 56. Vain mutaatiot miRNA selostukset selityksin in miRBase katsottiin lisäanalyysiä.
pistemutaatiot ja indeleitä tunnistettiin somaattisia muutoksia vain, kun (
i
) variantti ei kutsuttu sovitetussa normaalissa näytteessä tai tunnistettu ituradan muutos toisessa kasvain /normaali pari (
ii
) variantti ei nähty 2%: ään sovitetun normaalissa näytteessä seuraava manuaalinen tarkastus järjestyksessä lukee käyttämällä Integrated Genomics Viewer [45] (
iii
) variantti tunnistettiin vähintään neljä ainutlaatuista järjestyksessä lukee jossa on vähintään kaksi kartoitus eteenpäin ja kaksi kartoitus päinvastaisessa suunnassa.
Kaikki mutaatioita, jotka täyttivät edellä mainitut kriteerit alistettiin validointi tavanomaisilla PCR-monistus ja kaksisuuntaisen kapillaarielektroforeesilla annetun ABI3130 Genetic Analyser käyttämällä BigDye Terminator v3 0,1 sekvensointi kemia (Applied Biosystems, Foster City, CA).
tunnistaminen miRNA-sitoutumiskohtien
TargetScan (release 5.2) [46], mikrokosmos Targets (versio 5) [40 ], DIANA-MicroT (versio 3.0) [47], [48] ja Miranda (release elokuu 2010) [49] ennustavan algoritmeja käytettiin sen määrittämiseksi, somaattiset mutaatiot havaitaan mRNA 3’UTRs tapahtui miRNA sitoutumiskohtia. MirSVR pisteet kynnyksen alle -0,1 ja vähintään taitto energian pisteet kynnystä pienempi tai yhtä suuri kuin -16 kcal /mol käytettiin Miranda algoritmia. Oletus parametrejä käytettiin kaikille muille algoritmeja.
tukeminen Information
Kuva S1.
Ennustettu sekundaarinen rakenne muuttuu seurauksena somaattisten mutaatioiden miRNA selostukset. Aikuinen sekvenssit varjostaa ja mutatoitunut pohja nuolenpää osoittaa (a)
HSA-miR-622
, (b)
HSA-miR-1280
ja (c)
HSA -miR-767-5p
. Esiaste miRNA sekvenssi plus 50 emäsparin reunustavien esiaste 5′- ja 3 ’päissä käytettiin ennustamaan toisen rakenne pienin vapaa energia, jonka RNAfold ohjelmassa [29] avulla oletusparametrit.
Doi: 10,1371 /journal. pone.0035805.s001
(PDF) B Kuva S2.
AKT2
ja
EGFR
mRNA: n ekspressio ei muutu, kun läsnä on 3′-transloimaton alue somaattisista mutaatioista suhteessa muihin munasarjojen näytettä samasta alatyypin. (A)
AKT2
ilmentyminen endomet- kasvaimissa, kuten näyte P1768 jossa
AKT2
c. * 892C T somaattinen mutaatio (merkitty punaisella). mRNA: n ilmentymisen profilointi tiedot on saatu Tothill
et al.
[50].
AKT2
ilmaisun anturi asetetaan 225471_s_at ja 226156_at näkyvät. (B)
EGFR
ilmentyminen endomet- kasvaimissa, kuten näyte IC151 jossa
EGFR
c. * 101C G somaattinen mutaatio (merkitty punaisella). mRNA ilmaisu profilointitiedot saatiin Ramakrishna
et al.
[51]. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0035805.s002
(PDF) B Taulukko S1.
Kliinisten tekijöiden munasarjakasvaimia sekvensoitiin somaattisten mutaatioiden microRNA geenien ja ehdokas 3′-alueilla.
doi: 10,1371 /journal.pone.0035805.s003
(XLS) B
Kiitokset
Kiitämme yhteistyötä toimielinten Australiassa osallistuvat Australian Munasarjojen Cancer Study (AOCS). Olemme myös tunnustaa panos AOCS tutkimuksen sairaanhoitajien, tutkimusavustajia Kaikki kliiniset ja tieteelliset yhteistyökumppanit ja kiittää kaikkia naisia, jotka osallistuivat AOCS. Jäsenet Australian munasarjasyövän Study Group, yhteistyökumppanit ja sairaalat osallistuvat AOCS löytyvät https://www.aocstudy.org.
Australian munasarjasyöpä Study Group: David Bowtell (Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia), Georgia Chenevix-Trench (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Adele Green (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Penny Webb (Queensland Institute of Medical Research, Brisbane, Queensland, Australia), Anna DeFazio (Westmead Institute for Cancer Research, Westmead Millennium Institute, Westmead, New South Wales, Australia), Dorota Gertig (Victorian Kohdunkaulan Sytologia Registry, Carlton South, Victoria, Australia).