Krooninen sairaus

tiivistelmä

kromosomi 8q24 on yleisimmin monistettu alue useiden syöpätyyppien, ja tyypillinen pituus vahvistus viittaa siihen, että se voi kohdistaa ylimääräisiä geenejä

MYC

. Tutkia roolit geenien useimmin sisältyy 8q24 monistuksia, olemme analysoineet suhde kopiomäärä muutokset ja geeniekspressio kolmet kohdun limakalvon syöpiä (N = 252); ja glioblastooma, munasarja-, ja rintasyöpiä profiloidaan TCGA. Niistä geenit viereisen

MYC

, ilmentymisen bromodomain sisältävän geenin

ATAD2

on eniten liittyy vahvistus. Bromodomain sisältäviä geenejä ovat sekaantuneet välittäjinä MYC transkription toiminta, ja jopa

ATAD2

ilmentyminen tiiviimmin geenien ilmentymisen tiedetään voimistuvan MYC kuin oli

MYC

itse. Amplifikaatioita 8q24, geenien ilmentymisen alavirtaan MYC, ja yli-ilmentyminen

ATAD2

ennusti huono tulos ja nousi perusasteelta etäpesäkeleesioita. Knockdovvn

ATAD2

ja

MYC

seitsemässä kohdun limakalvon ja 21 rintasyövän solulinjat osoittivat, että solulinjat, jotka olivat riippuvaisia ​​MYC myös riippui ATAD2. Nämä samat solulinjat olivat myös herkin histonideasetylaasi (HDAC) estäjä Trichostatin-A Kuten aiemmissa tutkimuksissa tunnistaa bromodomain sisältäviä proteiineja kohteina hidastumisprosentti HDAC-inhibiittorit. Tuloksemme osoittavat korkea ATAD2 ilme on merkki aggressiivisen kohdun limakalvon syöpiä, ja ehdottaa erityisiä estäjät ATAD2 voi olla terapeuttista käyttöä näissä ja muissa MYC-riippuvaisten syöpien.

Citation: Raeder MB, Birkeland E, Trovik J, Kråkstad C, Shehata S, Schumacher S, et ai. (2013) Integrated Perimän analyysi 8q24 Amplification endometriumin Syövät Tunnistaa

ATAD2

välttämättömänä

MYC-

Riippuu Syövät. PLoS ONE 8 (2): e54873. doi: 10,1371 /journal.pone.0054873

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu: 28 syyskuu 2012; Hyväksytty: 17 joulukuu 2012; Julkaistu: 05 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Raeder et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki : Helse Vest Grants 990172 (MBR), 911351, 911624, ja 911626 (HBS); Bergenin yliopisto; Norja Cancer Society; Toimikunta Norjan Avustukset 205404 ja 193373 (HBS); National Cancer Institute (K08CA122833 ja U54CA143798); ja V Foundation Scholarship (RB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

endometriumin karsinooma on yleisin lantion gynekologiset maligniteetti, jossa on elinikäinen riski naisten 2-3% [1]. Noin 75% kasvaimista rajoittuvat kohdun corpus diagnoosin ja ovat resekoitu. Kuitenkin 15% -20% näistä kasvaimista taudin uusiutumiseen. Nämä kasvaimet ja kasvaimet, jotka ovat metastaattinen at esitys, vastaavan huonosti kemoterapiaa tai sädehoitoa ja ovat yleensä kohtalokas [1], [2].

On tarve uusille merkkiaineita tunnistaa potilaat, joilla on suuri riski taudin uusiutumisen sekä kehittää uusia hoitomuotoja potilaille, joilla on etäpesäkkeitä [3], [4]. Valitettavasti tutkimus näiden tavoitteiden voimakkaasti aliedustettuina endometriumsyöpään verrattuna muihin syöpätyyppeihin, kuten rinta- ja munasarjasyövän hoitoon. Yksi lähestymistapa on tunnistaa geenien, kun muuttaa somaattiset geneettisiä tapahtumia, ajaa syövän etenemiseen. Nämä muutokset voivat sitten toimia markkereita aggressiivinen syöpien ja geenit voivat toimia mahdollisina terapeuttisina kohteina.

Yleisimmät polttoväli vahvistus endometriumin syöpä on 8q24 [5]. Todellakin, 8q24 on yleisimmin monistettu alue useiden syöpätyyppien [6], ja tämä vahvistus on negatiivinen prognostinen markkeri useita syöpiä [7]. Vaikka

MYC

on todennäköinen kohde [6], vaikutukset monistustuloksille endometriumin syöpä ei ole koskaan leikeltiin. Itse asiassa on mahdollista, että se on kohdistettu useiden geenien, kuten on esitetty monistuksia muualla syövän genomin [8]. Esimerkiksi viereisen geenin,

ATAD2

, on havaittu olevan co-säädin

MYC

ja yli-ilmentyminen

ATAD2

on liitetty huonoon ennusteeseen rinta- , keuhko-, ja eturauhasen syöpiä [9], [10], [11].

tutkia roolia 8q24 monistuman endometriumsyöpään integroivien genomista analyysien primaarinen ja metastaattinen kohdun limakalvon syöpiä kattavia kliinisiä tietoja, ja tunnistaa

ATAD2

ylimääräisenä tavoite 8q24 vahvistus näissä syövissä. Tunnistamme kopioluku voitto

ATAD2

säätelijänä

ATAD2

ilme, esittämään ensimmäisen datan yhdistävät

ATAD2

yliekspressio on

MYC

aktivointia, ja tarjota funktionaalinen data viittaa ATAD2 terapeuttisena tavoite MYC-riippuvaisten syöpien.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kerääminen kohtukarsinooma esivaaleissa ja etäpesäkkeitä tätä tutkimusta oli hyväksymä Norja tietosuojaviranomainen (961478-2), Norja Social Sciences Data Services (15501) ja ”Regional Research Ethics.

komitean lääketieteen, Länsi Norja” (viite 052,01). Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

Patient Series

kohtukarsinooma esivaaleissa ja etäpesäkkeitä kerättiin saaneilla potilailla Haukelandin yliopistollisen sairaalan, Norja kuten aiemmin on kuvattu [5]. Kasvaimet kerättiin ensisijaisen tutkimuksen ja qPCR validointi sarja jäädytettiin välittömästi resektiota; kasvaimet kerätään kalat olivat formaliinilla ja parafiiniin. Potilaita seurattiin alkutuotannosta leikkauksesta lokakuuhun 2010 asti tai kuoleman. Copy-numero profiilit ensisijaisen tutkimuksen sarja, ja ekspressioprofiileja (Agilent 21 k ja 22 k oligoarrays) osajoukosta 57 kasvaimia, julkaistiin aiemmin [5].

RNA Analysis

RNA uutettiin ja hybridisoitiin Agilent 44K paneelit (tuotenro G4112F) valmistajan ohjeiden ja kuten aikaisemmin on kuvattu [5]. Signaali-intensiteettien arvioitiin käyttäen BRB-ArrayTools (National Cancer Institute, USA). Taulukot olivat erä mediaani normalisoitu.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA: sta käyttäen Suuren kapasiteetin RNA cDNA sarjat (Applied Biosystems). Expression of

ATAD2

ja

MYC

määritettiin käyttäen TaqMan-geenin ilmentymisen määrityksissä Hs00204205 ja Hs00905030 vastaavasti (Applied Biosystems), ja kaikki näytteet ajettiin mikrofluidilaitetta korttia kohden valmistajan instructuions, käyttämällä GAPDH-Hs99999905_m1 kuin endogeeninen ohjaus. Näytteet ajettiin kolmena kappaleena ja analysoidaan RQ manager (Applied Biosystems).

FISH

kudossiruina (TMA), joka edustaa korkein-luokan alueet kussakin kasvaimen valmistettiin aiemmin raportoitu [12] ja käsiteltiin 56 ° C: ssa yön ajan ennen hybridisaatiota. FISH suoritettiin käyttäen MYC Spectrum Orange FISH koetinpakkauksen ja kromosomi luettelointi anturi 8 (CEP8) (Vysis) mukaan valmistajan ohjeiden, kuten aiemmin raportoitu [13]. Counting suoritettiin alueilla optimaalisen kudospilkkoutumisasteisiin eikä päällekkäisiä ytimeksi. Probe ja ohjaussignaalit laskettiin 40-60 solujen alueilla optimaalisen kudospilkkoutumisasteisiin eikä päällekkäisiä ytimeksi. Amplifikaatiot pisteytettiin kun MYC /CEP8 suhde oli 1.0.

TCGA Validation Dataset

näytetty tason 3 datan TCGA data portaalin marras-joulukuussa 2010. rintasyöpä saimme geenien ilmentyminen tietoja 279 kasvaimia ja 24 normaalin valvonnan (Agilent 244K lauseke paneelit), ja copy-numero 176 kasvaimista (Affymetrix SNP 6,0 Arrays). Munasarjasyövän saimme geenin ilmentymistä (Agilent 244K lauseke paneelit) ja copy-numero (Agilent 1M paneelit) dataa 514 ja 489 kasvaimia, vastaavasti. Sillä glioblastooma saimme geenien ilmentyminen tietoja 385 kasvaimia ja 10 normaalin valvonnan (Affymetrix U133A paneelit) ja kopioi-numeron tietoja 261 kasvaimista (Agilent 244K paneelit).

elinkykyyn

Lentivirusvektorit koodaus shRNAs spesifinen

ATAD2

,

MYC

, ja tarkastukset

GFP

,

LACZ1

, ja

LACZ2

(taulukko S1) saatiin RNAi Consortium. Lentivirukselle tuotettiin transfektoimalla 293T-solut, jotka koodaavat kunkin shRNA (5 ug) kanssa pakkausten koodaavien plasmidien PSPAX2 ja PDM2.G käyttämällä Fugene HD (Roche). Lentivirus sisältävä supernatantti kerättiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen, yhdistettiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Solut infektoitiin polybreeniä sisältävässä väliaineessa, sentrifugoitiin 1000 g: ssä 30 minuutin ajan, ja jotka on valittu puromysiiniä (2,5 ug ml

-1), alkaen 24 h infektion jälkeen.

Cancer solulinjat saatiin ATCC: ltä , DSMZ, ECACC ja HSRRB ja kasvatettiin mukaan toimittajan ohjeiden (Taulukko S2). Solujen elinkykyisyys sen jälkeen, kun RNAi mitattiin 96-kuoppaisilla levyillä. Kahdeksaan kuoppaan ympättiin soluja infektoitiin käyttäen 01:30 viruslaimennoksista sisältävien kunkin shRNA. Puolet kuopista tehtiin puromysiiniselektion, ja solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen Cell-ainetiitteri Glo (Promega) viikkoa myöhemmin. Arvot Kustakin neljänä otettiin keskiarvo; ”Harha” kuopat suljettiin jos rinnakkaisten kuoppien oli SD /keskiarvo 0,2 ja ilman hyvin paransi varianssi. Keskimääräinen ATAD2- ja MYC- hiusneula-arvot normalisoitiin keskiarvo arvot GFP-ohjaus.

määrittämiseksi Trichostatin A herkkyys, Trichostatin A (Sigma) (0,040-10 uM) ja ajoneuvon (DMSO) ohjaus lisättiin kutakin kolmea kuoppiin, jotka sisältävät kustakin solulinjasta 96-kuoppaisilla levyillä. Solujen elinkyky määritettiin 72 tunnin kuluttua käyttämällä Cell-ainetiitteri Glo (Promega).

immunoblottauksella

Solut pestiin PBS: llä, kerättiin, hajotettiin käyttäen RIPA lyysipuskuria proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit, ja sentrifugoitiin 16.000 x g. Supernatantti sekoitettiin 4X SDS-näytepuskuria, keitettiin 7 minuuttia, ja suoritettiin SDS-PAGE 4-12% gradienttigeeleillä. Blotit vasta-aineilla ATAD2 (HPA029424, Sigma), MYC (sc-764, Santa Cruz) ja aktiini (sc-1615, Santa Cruz).

Tilastot

Molecular tiedot olivat liittyvä kliiniseen fenotyyppiin käyttäen Pearsonin χ

2 tai kaksipuolinen Studentin t-testillä tarvittaessa. Käytimme monimuuttuja lineaarista regressioanalyysiä ennustamiseen

ATAD2

ekspressiotasoja. Yhden ja usean selviytymisen analyysit suoritettiin log rank ja Mantel-Cox menetelmiä, vastaavasti. ”MYC signalointi voimaa” ja geeniekspressiotasot esitettiin Z-score.

Tulokset

Arvio

MYC

tavoitteeksi on 8q24 Amplification

Laaja biologiset tiedot tukevat

MYC

kuten onkogeenin [14], ja 8q24, kätkeminen

MYC

, on yleisin monistettu alue useiden syöpätyyppien [6]. Kuitenkin merkitys MYC aktivaation kohdun limakalvon syöpä on pääosin tuntematon.

Me tehdään integroidun analyysin kopioluvun ja ekspressiotietojen etsimään todisteita siitä, että

MYC

on tavoite 8q24 vahvistus endometriumin syöpä. Arvioimme ekspressiotietojen sarjasta 82 kohdun limakalvon syöpien saatu yhdessä County Norjassa, jossa vastaava genominlaajuisten kopioluvun tietoja 70 kasvaimista ( ”ensisijainen tutkimus sarja”). Kuusitoista näiden kasvainten (23%) oli 8q24 vahvistusta. Useimmat näistä Amplifikaatiot matalan tason, vaihtelevat jopa kopio-numero 4.7. Me validoitu tuloksemme neljä muuta aineistoja. Kaksi näistä ovat näytteiden genominlaajuisten ilmentymisen profilointiin: ”sisäinen validointi sarja” josta meillä tuotetaan tietoja 40 ensisijaisen ja 19 metastaattinen kohdun limakalvon syöpiä rekrytoidaan samalla alueella Norjassa, ja ”ulkopuolisen validointi sarjassa” edustaa aiemmin julkaistu lauseke profiileja 111 kasvaimista [5]. Kaksi muuta validointi sarjaa edustavat näytteet analysoitiin keskittynyt määrityksissä a ”qPCR sarjan” 162 näytettä ja ”FISH sarja” 399 näytettä. Potilaiden ominaisuudet ja histopatologista muuttujat kaikille sisäiset aineistot on esitetty taulukossa S3.

Huomasimme, että molemmat

MYC

ja geenien voimistuvan MYC olivat yli-ilmennetään kohdun limakalvon syöpiä 8q24 monistumista suhteessa kohdun limakalvon syövät ilman sitä (p = 0,047 ja p = 0,0078, vastaavasti) (kuvat 1 a-b). Käytimme aiemmin julkaistu luettelo 68 geenien havaittiin voimistuvan MYC useiden konteksteissa ja määrityksiä (taulukko S4; www.myccancergene.org) [15] ja teki niiden yli-ilmentyminen ( ”MYC signalointi voimaa”) käyttäen GSEA [16]. Testasimme myös viisi muuta MYC aktivointi allekirjoitukset saatu ”Gene Set Enrichment Database”, mikä aktivointi MYC eri yhteyksissä. Neljä näistä ilmaistiin korkeammalla tasolla kohdun limakalvon syöpiä 8q24 vahvistus (Kuva S1a).

(a)

MYC

ilmaisun ja (b) MYC signalointi ovat molemmat lisääntynyt kohdun limakalvon syöpiä 8q24 vahvistusta. (C) Vaihtelut

MYC

ilmaisun vain selittää pienen osan vaihtelusta MYC signalointi. Lineaarisovitusta näkyvät punainen, keltainen ja vihreä ensisijaisen tutkimuksen sarja, sisäinen validointi sarja, ja ulkoinen validointi sarja, vastaavasti. (D) pituudet liitetyt jotka sisältävät

MYC

ovat huomattavasti odotettua suurempi verrattuna monistukset havaittiin toisaalla näissä syövissä. (E) joukossa 26 geenit 8q24 huippu vastaaviin ekspressiotietojen, ilmaus

ATAD2

on voimakkaimmin ja merkitsevästi yhteydessä vahvistusta. Siniset palkit osoittavat prosentin kasvu geenien ilmentyminen ja punaiset pylväät esittävät p-arvot. Merkitys kynnys on Bonferronin korjattu useita hypoteeseja. (F) ilmentyminen

ATAD2

korreloi voimakkaasti MYC signalointi voimaa. Lineaarisovitusta näkyvät paneelissa c.

Kuitenkin vaihtelut

MYC

ilme itse vain selittää pienen osan vaihtelut MYC signalointi vahvuus (R2 = 0,11, p = 0,002 ) (Kuva S1B). Saimme samalla heikkoja tuloksia sisäisten ja ulkoisten validointi aineistot (R2 = 0,00, p = 0,34 ja R2 = 0,06, p = 0,012, vastaavasti, kuvio S1B). Kaikissa kolmessa aineistoja, vaihtelut MYC ilmaisun vain osuus 5% vaihtelujen MYC signalointi vahvuus (R2 = 0,05, kuva 1c).

Lisäksi 8q24 monistukset ovat pidempiä kuin tyypillinen jakauma vahvistus kokoja endometriumin syöpä (p = 0,0021) (kuvio 1 c), ja yleensä liittyy useita geenejä. Siksi arveltu, että 8q24-monistukset voidaan kohdistaa muita geenejä, joista osa voi toimia lisäämällä MYC signaloinnin. Tunnistaa nämä, arvioimme kaikki 26 geenit huippu alueella amplifikaatiokier- 8q24 josta meillä oli ekspressiotietojen tunnistaa geenejä, joiden ilmentyminen korreloi voimakkaimmin vahvistus.

ilmentäminen

ATAD2

korreloi voimakkaasti 8q24 monistaminen ja MYC Signaling

Expression of

ATAD2

oli vahvemmin yhteydessä monistamiseen 8q24 kuin oli ilmaus minkään muun geenin huippu alueella vahvistus (p-arvo = 2.77E-06) (kuvio 1 d). Neljä muuta geenejä,

NDUFB9

,

DERL1

,

FAM91A1

, ja

WDR67,

merkittävästi voimistuvan 8q24 vahvistusta, vaikkakin heikommin kuin

ATAD2

.

Expression of

ATAD2

myös korreloi MYC signalointi voimaa voimakkaammin kuin oli ilmaus minkään muun geenin 8q24 huippu alueella (R2 = 0,48, p 0,001; Kuva 1e, kuva S1B). Todellakin, yhdistyksen välillä

ATAD2

ilmaisun ja MYC signalointi voimaa havaittiin jopa kesken näytteitä ilman 8q24 vahvistusta (R2 = 0,48, p 0,001). Korrelaatio

ATAD2

ilmaisun ja MYC signalointi lujuus oli yli kaksi kertaa niin vahva kuin seuraavaksi eniten merkitsevää yhteyttä geeni (

NDUFB9

) ja vahvempi kuin

MYC

itse ( R2 = 0,05, kuvio 1c).

ATAD2

ei ole yksi 68 geenien MYC aktivointi allekirjoitus, ja meidän tietomme

MYC

ei ole havaittu ekspression modu-

ATAD2

[15]. Kuitenkin ATAD2 aiemmin havaittiin sitoutuvan MYC ja E-box-alueen, useiden MYC kohdegeenien, ja ATAD2 tasot havaittiin olevan rajoittava MYC-riippuvaisen transkription [9].

Sekä genominlaajuisten validointi sarja oli myös korrelaatio MYC signalointi ja

ATAD2

lauseke (R2 = 0,54, p 0,001 ja R2 = 0,45, p 0,001 sisäisen ja ulkoisen validointi sarja, vastaavasti) ja suhteellinen puute korrelaatio jossa

MYC

lauseke (R2 = 0,00, p = 0,33 ja R2 = 0,06, p = 0,012, kuviot 1f ja S1B). Expression of

ATAD2

myös korreloi neljä viisi ylimääräistä allekirjoitukset MYC aktivoinnin, ja korreloivat voimakkaammin allekirjoituksista kuin teki ilmentymä

MYC

itse (taulukko 1). Viimeinen allekirjoitus ei osoittanut yhdessä

ATAD2

tai

MYC

ilme.

monistaminen 8q24 ja ilmentäminen

ATAD2

, mutta ei MYC Näihin liittyy tauti eteni

Niistä 70 kohdun limakalvon syöpien osalta olimme genominlaajuisten SNP array data, 8q24 vahvistus nähtiin lisääntynyt ilman taudin etenemistä (p = 0,024) ja lisääntynyt riski tautikohtaisia kuolema (p = 0,043). Monistaminen 8q24 oli yleisintä kuin endomet- (p = 2.98E-05) ja korkea-asteen kasvaimet (p = 2.90E-08) (taulukko S5), ominaisuudet myös liittyy aggressiiviseen syöpiin [17].

vahvistaneet 8q24 vahvistus on yhteydessä huonoon ennusteeseen käyttämällä FISH itsenäisessä sarjassa 399 kohdun limakalvon syöpiä. Kaksikymmentä syöpiä (5%) ilmeni kohonneita 8q24 copy-numerot suhteessa kromosomin 8 centromere (kuvio 2a). Nämä liittyivät 64% 5 vuoden pysyvyys, vs. 85% syöpien ilman 8q24 vahvistusta (p 0,001) (kuvio 2b). Samanlainen malli havaittiin uusiutumisen elinaika (p = 0,001). Monistaminen 8q24 liittyi myös korkea levinneisyysaste (p = 0,003), ei-endomet- histologinen alatyyppi (p 0,001), ja korkea laatu (p 0,001) (taulukko S5).

FISH antureista vastaan ​​8q24 (punainen) ja kromosomin 8 centromere (vihreä) on ensisijainen kasvain ja pariksi etäpesäkkeitä esittävät monistamista vain jälkimmäisessä (a) (b) Niistä 399 potilasta arvioitiin FISH, joilla 8q24 monistuksissa on huonompi tulos. Vuonna ensisijainen tutkimuksessa sarja, kasvaimia korkeimpia kvartiileihin (c)

ATAD2

ilmaisun ja (d) MYC signalointi vahvuus oli myös lisääntynyt riski tautikohtaisia ​​kuolema. (E) estrogeenireseptorinegatiivinen (ER-) kasvaimista

ATAD2

ilmentymistä parhaaseen neljännekseen myös liittyy suuri riski tautikohtaisia ​​kuolema; riski oli paljon pienempi keskuudessa estrogeenireseptoripositiiviset (ER +) kasvaimista

ATAD2

ilmaisun alakvartiili. (F)

ATAD2

ilmaisun ja (g) MYC signalointi ovat korkeammat joukossa etäpesäkkeitä kuin ensisijainen kasvaimia sisäisen validointiprosessin sarjassa.

Korkea ilmaus

ATAD2

ja MYC signalointi myös liittyy lisääntynyt riski syövän etenemisessä (p = 0,003 ja p = 0,015, tässä järjestyksessä), syöpä-erityisiä kuolema (p = 0,004 ja p = 0,001) (kuviot 2c-d), ja muut huono ennuste ominaisuuksia .

ATAD2

ilme oli suurempi kuin endomet-, korkea-asteen ja ER syöpäkasvain (p 0,001, p 0,001 ja p = 0,02 vastaavasti; taulukko S6); korkea MYC signalointi liittyi huonosti eriytetty (p = 0,0016) ja ei-endomet- (p 0,001) syöpiä. Expression of

ATAD2

negatiivisesti myös ekspressioon liittyviä

ESR1

(R2 = 0,10, p = 0,005). Vastaavasti ennen tutkimukset ovat osoittaneet, että

ATAD2

ilmaisu on suurempi kolminkertainen negatiivinen rintasyöpä kasvaimia [18] ja on vaimentua estrogeenin soluviljelmissä [19].

Itse

ATAD2

ilme oli itsenäinen ennustaja tautispesifisten kuolema (riskisuhde = 1,83, p = 0,027) ja sairauden etenemiseen (riskisuhde = 1,62, p = 0,011) säätämisen jälkeen ER tila. ER-syöpäkasvain ylä-neljännekseen

ATAD2

ilme olivat erityisen tappava (HR = 4,1, p = 0,002; Kuva 2e).

vahvistivat nämä tulokset arvioimalla

ATAD2

ilmentyminen kvantitatiivinen PCR ja ER tila immunohistokemiallisesti meidän qPCR validointi sarjan 162 ylimääräistä kasvaimia. Näistä ER-syöpäkasvain ylä-neljännekseen

ATAD2

ilmaisu liittyi vielä pahemmin kuin perusrokotussarjan (HR = 6,8, p 0,001) (kuvio S1c). Korkea

ATAD2

ilmaisu myös pysyi liittyy lisääntynyt riski tautikohtaisia ​​kuolema (p = 0,0043) ja lyhyempi ilman taudin etenemistä (p = 0,016). Säätämisen jälkeen ER tila,

ATAD2

ilmaus edelleen ennustaa taudin aiheuttamaa kuolemaa (HR = 1,86, p = 0,018), mutta vain tiettyjä kehityssuuntia kohti yhdessä sairauden etenemiseen (riskisuhde = 1,31, p = 0,11). Expression of

ATAD2

kasvoi myös korkea-asteen (p 0,001), ei-endomet- (p = 0,005), ja ER-syöpäkasvain (p = 0,02) (taulukko S6).

sen sijaan

MYC

ilmaisua ei liittynyt etenemisen tai riski tautikohtaiset kuoleman joko ensisijainen tutkimus sarja (p = 0,07 ja p = 0,68 vastaavasti) tai qPCR validointi sarja (p = 0,53 ja p = 0,28 vastaavasti). Korkea ilmaus

MYC

liittyi korkealuokkaisesta molemmissa sarjoissa (p 0,001 ja p = 0,02, vastaavasti), ja ei-endomet- kudosnäytteistä ensisijaisen tutkimuksessa sarja (p = 0,03) (taulukko S6) .

etäpesäkkeitä esiintyy myös enemmän 8q24 vahvistus,

ATAD2

ilmaisun, ja

MYC

signalointi voimaa kuin ensisijainen kasvaimia. Suhteessa ensisijainen kasvaimia, metastaaseja näytteillä 2,4 × korkeampia polttovälin 8q24 monistuksen FISH (14,3%; p 0,007). Niistä 399 potilaasta FISH sarja, 49 oli pariksi ensisijainen ja etäpesäkkeitä. Viisi näistä näytteistä (10%), ei esiintynyt 8q24 vahvistusta ensisijaisen mutta hankittu sen etäpesäkkeitä. Vain yksi näyte (2%) oli päinvastainen kuvio. Tutkia

ATAD2

ilmaisun ja MYC signalointi, vertasimme myös 42 primaarikasvaimia kanssa 19 etäpesäkkeitä meidän sisäinen validointi sarjassa. Molemmat

ATAD2

ilmaisun ja MYC signalointi voimaa olivat korkeammat etäpesäkkeitä (p = 0,002 ja 0,004 vastaavasti, kuva 2 f-g), joihin kuuluvat muun 8 potilaalla on pariksi ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä (p = 0,01 ja 0,05 vastaavasti) .

laajentaminen Muut syöpätyyppeihin ja Normaali Tissue

tutki myös 8q24 vahvistus liittyy lisääntynyt

ATAD2

ilmaisunvapautta muissa syöpätyyppeihin. Tarkemmin, käytimme tiedot 514 munasarjasyöpiä, 279 rintasyöpiä, ja 385 glioblastomas The Cancer Genome Atlas [20], [21]. Näihin sisältyy lauseke tietoja viereiseen normaaliin kudokseen 24 rintasyöpiä ja 10 glioblastoomissa. 8q24 monistukset havaittiin 72% (n = 126) ja rintasyöpiä, 74% (n = 364) ja munasarjojen syöpien, ja 10% (n = 27) glioblastoomat.

ATAD2

oli co-monistettiin samalle tasolle kuin

MYC

lähes kaikilla kasvaimet (kuten se oli keskuudessa limakalvon syöpiä, Kuva S1D-g).

Expression of

ATAD2

korreloi 8q24 vahvistus kaikissa kolmessa syöpätyyppeihin (R2 = 0,47, 0,11 ja 0,36 ja rintasyöpiä, glioblastoomat, ja munasarjojen syöpien vastaavasti; p 0,001 kaikissa tapauksissa, taulukko S7), ja oli 2,6 × ja 2,5 × korkeampi joukossa syöpiä suhteessa normaaliin kudokseen rintasyövän ja glioblastooma, vastaavasti (p 0,001 kummassakin tapauksessa).

MYC

ilmaisu korreloi vähemmän voimakkaasti 8q24 vahvistus kaikissa kolmessa syövän tyypit (R2 = 0,12, 0,07 ja 0,10 rintasyöpiä, glioblastoomat, ja munasarjojen syöpien vastaavasti; p 0,001 kaikissa tapauksissa).

MYC

ilmentyminen rintasyöpiä oli yllättävän puolet normaalin kudoksen (p 0,001); glioblastoma se oli korkeampi tekijällä 3,5 (p 0,001).

ATAD2

ilmentyminen korreloi myös MYC signalointia kaikissa kolmessa syöpätyypeissä (R2 = 0,11, 0,21, ja R2 = 0,31, vastaavasti rintasyöpiä, glioblastoomat, ja munasarjojen syöpien; p 0,001 kaikissa tapauksissa), ja sen korreloivat voimakkaammin MYC signalointi vahvuus kuin

MYC

ilme oli (R 2 = 0,10, p 0,001; R2 = 0,09, p 0,001 ja R2 = 0,02, p = 0,003 kolmessa syöpätyyppejä).

ATAD2

Expression korreloi

E2F

Gene Expression ja

ATAD2

Kopioi numero on additiivisia

tutki myös vaikuttavien eri E2F, estrogeeni, ja kopioi numero ATAD2 ilme.

ATAD2

promoottorialue sisältää sitoutumiskohdat useita E2F proteiineja ja edellinen toiminnalliset tiedot ovat osoittaneet, että E2F kasvaa

ATAD2

ilmentymistä soluviljelmässä [9], [22];

ATAD2

on myös aiheuttama estrogeenin [23]. Meidän data, ilmaus jokainen

E2F

transkriptiotekijä liittyi

ATAD2

ilmaus, mutta vain sisällyttämällä

E2F1

,

E2F2

ja

E2F8

parantaneet sovi mallin ennustamaan

ATAD2

lausekkeen

ATAD2

copy-numero ja

ESR1

ilme. Ilmentymistasojen näiden kolmen geenin korreloivat voimakkaasti, ja olemme keskittyneet

E2F1

.

Huomasimme, että

ATAD2

kopioluvun,

ESR1

ilmaisun ja

E2F1

ilmaisu selitti 77% vaihtelu

ATAD2

ilmentymistä kohdun limakalvon syöpä, ja kukin ennustaja muuttujia pysyi merkitsevästi yhteydessä

ATAD2

ilmaisun oikaistu malli (kuvio 3a ja taulukko S7). Huomasimme myös, että

ATAD2

copy-numero ja

E2F

ilmaisu itsenäisesti ennustivat

ATAD2

ilmentyminen rintasyövässä, munasarjasyöpä ja glioblastooma (kuva 3b-d ja taulukko S7) .

ESR1

, jota vähemmän voimakkaasti yhteydessä

ATAD2

ilmaisua, oli merkittävä oikaistun mallissa ainoastaan ​​kohdun limakalvon syövän (p = 0,016) ja glioblastooma (p 0,001), eikä munasarjojen tai rintasyöpä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kopio-määrä

ATAD2

on tärkeä tekijä

ATAD2

ilmentymisen jopa yhteydessä solun muiden sääntelymekanismeja.

(a) Kohdun limakalvon syöpä (b) rintasyöpä, (c) munasarjasyöpä, ja (d) glioblastooma. Keltaiset pisteet edustavat näytteet ja sininen kilpi on ennustettu 3-D fit. Vihreä ja punainen linjat ovat etäisyyttä ennustetun kunnossa ja todellisen havaintoja näytteiden ylä- ja alapuolella 3D-fit levy, vastaavasti.

Riippuvuus

MYC

ennustaa Riippuvuus

ATAD2

ja vastaus HDAC estäjät vuonna Endometrial- ja Breast Cancer Cells

edellä esitetyt tulokset johtivat meidät oletuksen, että

ATAD2

ilmaisun edistää MYC signalointi ja että kohdun limakalvon syövän solut, jotka riippuvat

myc

olisivat myös riippuvaisia ​​

ATAD2

. Mittasimme vaikutus kannattavuuteen shRNA knockdowns on

ATAD2

ja

MYC

seitsemässä endometriumsyöpään solulinjoissa. Käytimme kaksi shRNAs vastaan ​​kunkin geenin, valitaan ne, jotka esillä suurin vähennys proteiinin ilmentymisen keskuudessa kuusi ja kolme shRNAs seulotaan

ATAD2

ja

MYC

(kuvio 4a, b).

Western blotit (a) ATAD2 ja (b) MYC osoittavat laajuus knockdown kuusi shRNAs vastaan ​​

ATAD2

ja kolme shRNAs vastaan ​​MYC, vastaavasti. ATAD2 kokeet suoritettiin KLE soluissa ja MYC kokeet suoritettiin TE9 infektoitujen solujen GFP-ohjaus ja MYC vektoreita. Myöhemmät kokeet käyttää

ATAD2

shRNAs A- ja E, ja MYC shRNAs a ja b. Vähennykset solujen elinkelpoisuuden joukossa seitsemän endometriumsyöpään solulinjoja (c) ja 21 rintasyövän solulinjoissa (d) korreloivat voimakkaasti jälkeen knockdovvn ATAD2 tai MYC jälkeen knockdovvn MYC ja hoidon HDAC estäjä Trichostatin-A (1,25 uM) ( e-f).

knockdovvn joko

ATAD2

tai

MYC

johti korreloi pienenemistä elinkelpoisuuden poikki seitsemän solun kohdun limakalvon syövän linjojen (R2 = 0,70 , p = 0,020, kuvio 4c). Kahdessa tapauksessa havaitsimme yli 75% vähennykset elinkelpoisuutta. Emme löytäneet yhdistyksen välillä ilmaus

ATAD2

tai

MYC

tai 8q24 kopioluvun ja herkkyys

ATAD2

tai

MYC

knockdown.

Nämä tulokset viittaavat siihen, MYC riippuvaiset syövät muun tyyppisiä voi olla riippuvainen ATAD2. Ei laskun proliferaatiossa oli aiemmin nähty

ATAD2

Knockdown in TIG3-T- tai U2OS soluissa [9]. Kun testasimme suurempi paneeli 21 rintasyövän linjat, me kuitenkin vahvisti vahvan korrelaation lasku elinkyky knockdovvn ATAD2 tai MYC (R2 = 0,61, p 0,001; Kuva 4d).

Järjestö välinen riippuvuus

MYC

ja

ATAD2

ehdottaa ATAD2 terapeuttisena tavoite

MYC

-riippuvaisella syöpiä. Kun taas

MYC

on pitkään ollut tunnettu onkogeeni, kliininen lähestymistapoja estää MYC signalointi ei ole vielä onnistunut. Histonideasetylaasi (HDAC) estäjät, kuitenkin, on osoitettu epäsuorasti estää bromodomain sisältävät proteiinit, kuten ATAD2 [24].

Käytimme Connectivity Map [25] yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka ovat allekirjoittaneet anticorrelated kanssa MYC signalointi allekirjoitus. Niistä 1309 pienten molekyylien edustaa Connectivity Map, allekirjoitus HDAC estäjä Trichostatin-A eniten anticorrelated kanssa MYC signalointi allekirjoitus. (P-arvo 0,00001; Taulukko S8). Olemme myös tuotti allekirjoituksen aggressiivisen taudin ensisijainen tutkimuksen sarja, käyttäen 50 eniten yli- ja ilmaisi geenien potilailla etäpesäkkeitä verrattuna potilaisiin ilman etäpesäkkeitä. Löysimme Trichostatin-A allekirjoitus oli myös eniten anticorrelated tämän allekirjoitus aggressiivinen tauti, sidottu allekirjoitukset neljän muiden molekyylien (p 0,00001; Taulukko S8).

toiminnallisesti vahvistaa suhdetta Trichostatin-A ja MYC riippuvuus, testasimme kaikki kohdun limakalvon syövän ja rintasyövän solulinjoissa kasvun inhibition Trichostatin-A ja vertasimme tuloksia

MYC

knockdown. Trichostatin-A esti kasvua samassa solulinjoissa, jotka olivat riippuvaisia ​​

MYC

sekä kohdun limakalvon (R2 = 0,74, p = 0,013; Kuva 4e), ja rintasyövän solulinjoissa (R2 = 0,31,