Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on tappavin gynekologinen sairaus naisten Yhdysvaltain. Cancer Genome Atlas Network tunnistettu p53 mutaatioita 96% korkealaatuisesta vakavien munasarjojen karsinoomat, mikä osoittaa sen keskeinen rooli. Lisäksi transformoivan kasvutekijän beta (TGF) reitti on huonosti eri pahanlaatuisia kasvaimia, kuten munasarjasyöpää. Tässä tutkimuksessa selvitettiin, miten ilmentyminen villin tyypin, mutantti tai puuttuminen p53 muuttaa munasarjasyövän soluvasteen TGFli signalointi, samoin kuin vastaus munasarjojen pinnan epiteeli munanjohtimeen epiteelin TGF. Vain munasarjasyöpä soluja, jotka ilmentävät villityyppistä p53: a oli kasvua inhiboi TGF, kun taas munasarjasyövän solut, jotka oli mutantti tai null p53 ei ollut. TGF muuttoliikkeelle p53 null SKOV3- soluja, joita ei havaittu SKOV3- solujen vakaa ilmentyminen mutantin p53 R273H. Knockdown villityyppisen p53 on OVCA 420 munasarjasyöpäsoluja parannettu soluvaelluksen vastauksena TGF. Lisääntynyt proteiinin ilmentymistä DKK1 ja TMEPAI, kaksi pro-invasiivisen geenien lisääntynyt ilmentyminen myöhäisessä vaiheessa metastaattinen munasarjasyöpä, havaittiin p53 Knockdown ja null-solut, kun taas solut, jotka ilmentävät stabiilisti mutantti p53 osoittanut alempi DKK1 ja TMEPAI induktio. Expression of mutantti p53 tai menetys p53 luvalla leviämisen munasarjasyövän solulinjoissa läsnä ollessa TGFp; kuitenkin, solut, jotka ilmentävät mutantti p53 näytteille vähennetään muuttoliikettä ja vähentynyt proteiinipitoisuus tasot DKK1 ja TMEPAI.

Citation: Ó hAinmhire E, Quartuccio SM, Cheng W, Ahmed RA, kuningas SM, Burdette JE (2014) Mutation tai tappio p53 Differentially Muuttaa TGFli Toiminta munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (2): e89553. doi: 10,1371 /journal.pone.0089553

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 syyskuu 2013; Hyväksytty: 21. 2014; Julkaistu: 20 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Burdette et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain avustusta Liz Tilberis Munasarjojen Cancer Research Fund L /T /UIC /0.1.2011, Vahlteich palkinnon UIC College of Pharmacy ja American Cancer Society Research Scholar Grant Illinois Division RSG-12-230-01-TBG . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on viidenneksi suurin syy syövän kuolemaan ja kaikkein vaarallisin gynecologic tauti keskuudessa Yhdysvalloissa naiset. Vuonna 2013, arviolta 22240 tapauksissa munasarjasyöpä on diagnosoitu, jolloin 14030 kuolemantapausta [1]. Korkea kuolleisuus johtuu siitä, että yli 60% munasarjojen syöpiä diagnosoidaan, kun tauti on levinnyt kaukaisiin paikkoihin. Kun etäpesäkkeitä, viiden vuoden pysyvyys laskee alle 30% [1]. Tehottomuus diagnoosi johtuu pääasiassa ei ymmärretä Alkutapahtumien ja mekanismit etenemisen jotka aiheuttavat munasarjasyöpä, muutamia varhaisen havaitsemisen strategioita [2]. Tärkeää on, jos munasarjasyöpä on diagnosoitu aikaisemmin, eloonjäämisluvut voi olla niinkin korkea kuin 90% [1]. Nämä tilastot kuvaavat perustavanlaatuinen tarve ymmärtää paremmin varhain mekanistinen tapahtumia munasarjasyöpä, joka auttaa varhaisempaan diagnosointiin ja parempaan ennusteeseen potilailla.

Kasvain p53 on yleisimmin mutatoitunut geeni kaikista ihmisen syövistä [2] . p53 on transkriptiotekijä, joka ohjaa monia solun toimintoja, kuten solusyklin, apoptoosin, ja vasteena DNA-vauriolle [3]. Useimmat

TP53

mutaatiot ovat missensemutaatioita, jossa yhden nukleotidin emästä substituutio johtaa joko toimintahäiriön tai puuttumisen takia p53 toiminnan [4]. Nämä mutaatiot johtavat lisääntynyt leviäminen, invaasio ja etäpesäkkeiden monissa syövissä [5]. Cancer Genome Atlas Network (CGAN) tunnistettu p53 olevan mutatoitunut jopa 96% kemoterapiaa kestäviä, laadukkaat vakavien munasarjasyöpiä, mikä osoittaa keskeinen rooli p53 mutaatioiden serous munasarjasyöpä [6]. Lisäksi International Agency for Research Cancer (IARC)

TP53

tietokanta osoittaa, että yleisimmät p53-mutaatio serous munasarjasyövän on arginiini histidiini muuntaminen aminohappotähteestä 273 (R273H) sisällä DNA: ta sitovan domeenin , jonka osuus 8% kaikista p53 mutaatioita [7]. Mutant p53 R273H on raportoitu olevan rooli edistämisessä rinta- ja keuhkosyövän etäpesäke [8], [9] lisäämällä maahanmuuttoa ja invaasio.

Toinen tärkeä signalointireitin, joka on muokattu munasarjasyövän on Transforming Growth Factor Beta-reitin (TGFli) [10]. TGF on superperheen peptidin kasvutekijöitä, jotka säätelevät kasvua, erilaistumista, apoptoosin, ja muuttoliike [10]. TGF-signaalit sitoutumalla perheen seriini /treoniini-kinaasi-kalvo reseptoreihin, jotka fosforyloivat loppupään molekyylejä, ennen kaikkea Smad: ien 2 ja 3 [11]. Aktivoinnin jälkeen nämä Smad kompleksit siirtyvät tumaan ja vuorovaikutuksessa erilaisten yhteistyössä aktivaattorit ja repressoreja moduloida Smad säädelty transkriptio [11], [12]. TGF tärkeä rooli indusoimisessa kasvun pysähtymisen normaaleissa munasarjan soluissa [13]. Joissakin syöpäsoluja, TGFp indusoi apoptoosia ja solusyklin pysähtymisen, kun taas muissa syöpäsoluissa se menettää kyvyn aiheuttaa kasvun pysähtymisen ja voi sen sijaan edistää solujen invaasiota [10]. Se voi myös olla rooli chemoresistance pitkälle serous munasarjasyöpiä [14]. Ydin TGFli koulutusjakson komponenttien TGFp reseptorit, ja Smad proteiinit, harvoin mutatoitunut tai hävinnyt munasarjasyöpä [5], mikä viittaa siihen, että häiriöitä TGFp reitin tapahtuu muilla mekanismeilla.

Koska p53 ja Smad: ien ovat molemmat transkriptiotekijät, p53 kykenee vuorovaikuttamaan Smad: ien muuttamiseksi sekä p53 ja TGFp-signalointireitteihin [4]. Smad: ien voi muodostaa transkription kompleksin p53: n kanssa indusoi geenejä, jotka edistävät solusyklin pysähtymiseen, kuten p21: [4]. Smad: ien ja p53 sitoutuvat oman reagoiva elementtejä edistäjiä TGFp reagoivan geenejä synergisesti aktivoida tai tukahduttaa transkriptio [4]. Itse asiassa, se on osoitettu, että p53 vaaditaan TGF-indusoidun solusyklin pysähtymisen [4]. Lisäksi mutantti p53 R273H kumoaa TGFli aiheuttaman solusyklin pysähtymiseen ja edistää metastaattinen käytös estämällä p63 Rintasyövän soluissa [8]. Näissä soluissa, mutantti p53 /Smad kompleksi estää p63-välitteisen transkription johtaa hyökkäyksen läsnä onkogeenisten Ras [8].

Koska suuri prosenttiosuus p53 mutaatioiden munasarjan kasvaimissa [6] ja viime näyttöä siitä, että p53 ja Smad: ien vuorovaikutuksessa säännellä etäpesäke -rintakarsinoomasolujen [8], rooli mutantti p53 vastauksena TGFli signalointia munasarjasyövän tutkittiin. p53 ja TGFp ovat sekaantuneet moniin syöpiin, kuten rinta- ja keuhkosyöpä omaan [15], [16] ja konsertti [8]. Rinta- ja keuhkosyöpää, mutantti p53 vuorovaikutuksessa Smad: ien muuttamiseksi transkriptio geenien, jotka säätelevät etäpesäke [8], mutta vähän tiedetään miten p53 ja TGFp vuorovaikutuksessa munasarjasyöpä. Tarvittavat tekijät kasvun ja etäpesäkkeiden rinta-, keuhko- ja paksusuolen syöpä voi olla tarpeen munasarjasyöpä, mikä johtaa kudoksen erityisiä vaikutuksia mutantti p53 signaloinnin [17]. Kaksi geeniä (

TMEPAI

ja

DKK1

) tutkittiin perustuen niiden merkitys etäispesäkkeiden munasarjasyöpä.

TMEPAI

on TGFli aiheuttama negatiivinen säätelijä [18] ja se osallistuu TGFli aiheuttama etäpesäke Rintasyövän solulinjoissa [18], mutta ei ole koskaan raportoitu sovitettava säädellä p53 ja Smad: ien.

DKK1

on estäjä Wnt signalointia, joka on usein yliaktiivista metastaattisen munasarjasyövän, ja se liittyy huonoon ennusteeseen [19]. Maspiini, anti-metastaattinen proteiini, valittiin myös se on perustettu sääntelyn p53 ja Smad: ien [20]. Nykyinen tutkimuksessa arvioitiin, onko ilmaus yksi yleisimmistä p53 mutaatioita munasarjasyöpä (R273H) muuttaa soluvasteen Smad signalointi moduloida solujen lisääntymisen ja muuttoliike.

Materiaalit ja menetelmät

Cell kulttuuri

Kaikki reagenssit saatiin Life Technologies (Carlsbad, CA) ellei toisin mainita. OVCA 420, OVCA 429, ja OVCA 432 ovat solulinjat, jotka on aiemmin julkaistu [21], [22], kun taas OVCAR5 solut ovat saatavilla National Cancer Institute (NCI) osana NCI60 kasvainsolulinjaa syöpälääkkeen näytön [ ,,,0],23]. OVCA 420, OVCA 429, OVCA 432, ja OVCAR5 soluja (lahja tri Gustavo Rodriguez ja Dr. Teresa Woodruff Northwestern University) ylläpidettiin Minimum Essential Media (MEM), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1 % L-glutamiinia, 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, 1% natriumpyruvaattia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. OVCAR3-solut saatiin ATCC: ltä (Manassas, VA), ja ylläpidetään samaa materiaalia kuin edellä, lukuun ottamatta lisäravinteen 20% FBS: ää. SKOV3- solut hankittiin ATCC: stä ja ylläpidettiin McCoyn 5A on täydennetty 2,3 g /l natriumkarbonaattia, 10% FBS: ää, ja 1% penisilliini /streptomysiiniä.

Stable solulinjat valittiin käyttäen antibiooteille vastustuskykyisten plasmideja, jotka sisältävät geenin kiinnostaa. SKOV3- solut stabiilisti ilmentävät mutantti p53 R273H [24] (Addgene, plasmidi: 16439, lahjoitti Dr. Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) valittiin käyttäen 500 ug /ml G418: aa (Gemini bio-tuotteet, West Sacramento , CA) ja ylläpidetään SKOV3 väliaineessa, joka sisälsi 200 ug /ml G418: aa. OVCA 420 solut, jotka ilmentävät p53-shRNA tai salattu shRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) valittiin käyttäen 4 ug /ml puromysiiniä (Sigma-Aldrich) ja pidettiin 1 ug /ml puromysiiniä. p53 villityypin plasmidista [24] hankittiin Addgene (Addgene plasmidi: 16434, lahjoitti Dr. Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD).

Normaali ikuisti ihmisen munasarjan pinnan epiteelisolujen ( menettää tavallisesti 80) olivat lahja tri Nelly Auersperg yliopistossa Vancouver ja niitä ylläpidettiin 50% v /v Medium 199 ja 50% v /v MCDB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 15% FBS, 1% L-glutamiinia, 1% penisilliiniä /streptomysiiniä, ja 0,055% epiteelin kasvutekijä (EGF, PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ) [25]. Normaali ihmisen munanjohtimen erittävien epiteelisolujen (FTSEC) oli lahja tri Ronny Drapkin Harvard University ja pidettiin 50% v /v DMEM ja 50% v /v F-12 (Mediatech, Manassas, VA), 1% L-glutamiinia, 1% penisilliiniä /streptomysiiniä, ja 2% Ultroser G (Pall Corporation, Port Washington, NY) [26]. Hiiren munasarjojen pinnan epiteelisolujen (Mose) eristettiin C57BL /6-hiiristä ja hiiren munanjohtimien epiteelisolut (Mtec) eristettiin CD1-hiirille, kuten aikaisemmin on kuvattu [27]. Viljellyt solut pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa.

lusiferaasianalyysissä

Solut maljattiin tiheydellä 25000 kuoppaa kohti 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Solut transfektoitiin 0,05 ug /kuoppa ekspressiokonstruktin sisältävät Smad sitova osa promoottorin lusiferaasigeenin käyttäen Mirus TransIT LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Smad reagoiva elementti plasmidi sisältää CAGA sekvenssin toistuvat kaksitoista kertaa ylävirtaan lusiferaasigeenin (lahjoitus tri Aris Moustakas Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Ruotsi). Plasmideja ilmentyminen villin tyypin p53: n tai mutantti-p53 R273H plasmidit transfektoitiin soluihin 0,05 ug /ml. Solut transfektoitiin 24 tunnin seerumin kasvatusalustaan. Sitten solut pestiin PBS: llä ja käsiteltiin TGFp 1 10 ng /ml (Sigma Aldrich) 24 tunnin ajan. SB-431542 (Selleck Chemicals, Houston, TX) käytettiin pitoisuutena 5 uM kaikkien Lusiferaasimäärityksiä. Protokolla ja SBE-lusiferaasi transfektiotehokkuudet normalisoituivat ja ajaa kuten aiemmin on kuvattu [28]. Normaalin solun lusiferaasin aktiivisuus mitattiin käyttämällä Synergy Mx (BioTek, Winooski, VT).

Proliferaatiomääritys

sulforodamiini B (SRB) määrityksiä käytettiin määrittämään solutiheyteen. Soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan, joissa TGF (20 ng /ml), jota seurasi kolorimetrisellä määrityksellä, kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Solujen eloonjääminen laskettiin vertaamalla absorbanssiarvot välillä käsitelty ja kontrollikuoppiin. Tausta vähennettiin mittaamalla absorbanssi 0,1 mM Tris-base yksin.

Virtaussytometria

OVCA 420, OVCA 432, ja SKOV3-solut maljattiin T25-pulloihin 24 h ennen käsittelyä. Alustassa, joka sisälsi TGF (20 ng /ml) tai liuotinta ohjaus lisättiin ja inkuboitiin 48 tunnin ajan. Käsittelyn jälkeen solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää, kiinnitettiin sitten 4 ml: aan 70% etanolia, ja säilytettiin -20 ° C: ssa yön yli. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä ja värjättiin 500 ul: propidiumjodidilla (PI) liuosta [50 ug /ml PI, 90 yksikköä RNaasi A, 0,1% Triton X-100, 4 mmol /l sitraattipuskuria, 10 mM polyetyleeniglykoli (PEG ) 4000]. Soluja inkuboitiin PI liuosta 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa ennen kuin se käsiteltiin 500 ui PI suolaliuosta (1 mg /ml PI, 0,1 ml 10% Triton X-100, 4 M NaCl-liuosta, 10 mM PEG 4000) . Virtaussytometrianalyysin tehtiin Beckman Coulter Elite ESP (Miami, FL), jossa on vähintään 30000 yksittäisiä tapahtumia reaktiota kohden. Aineisto analysoitiin Mod-fit ohjelmisto (Verity Software House, Inc., Topsham, ME).

Western blot-analyysi

Solut maljattiin 50.000 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyillä, transfektoitu sopivilla plasmideilla 0,05 ug /ml, ja sitä käsiteltiin TGFp 1 (10 ng /ml) 24 tunnin ajan. Indusoimaan p53 ilmaista, sisplatiini (Fisher Scientific, NC9343338) käsittely suoritettiin 125 uM: ssa kaksi tuntia. Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä (Pierce, Rockford, IL). Solulysaatti (30 ug) analysoitiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosalle. Sitten blotit blokattiin 5% maitoa TBS-T ja tutkittiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla. Käytetyt vasta-aineet olivat ihmisen p53 (# 9282), p21 (# 9247), maspiini (# 9117), cdc2 (# 9112) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA), jonka pitoisuus on 1:1000; DKK1 (H-120) ja hiiren p21 (F-5) (Santa Cruz Technology, Inc, Santa Cruz, CA) käytettiin pitoisuutena 1:200; TMEPAI 2A12 (Abnova, Taipei, Tiawan) käytettiin pitoisuutena 1:500; ja aktiini (Sigma-Aldrich), jonka pitoisuus on 1:1000. Anti-hiiren ja kanin HRP-kytketty toisen asteen (Cell Signaling Technology, Inc.) käytetään kaikissa blotit, jonka pitoisuus on 1:1000.

Haavan paranemista määrityksessä

Solut maljattiin 50.000 solua kuoppaa kohti 24-kuoppalevylle ja inkuboitiin yön yli. Yhtenäinen haava syntyi yksisolukerroksen käyttäen pipetin kärkeä. Soluja pestiin ja käsiteltiin TGFp 1 (20 ng /ml) heti naarmuuntumista. Kuvia otettiin 0, 24, ja 48 tunnin jälkeen raapiminen, ja alue tyhjästä analysoitiin ImageJ ohjelmisto (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Prosenttia sulkeminen mitattiin verrattuna 0 h ja taita muutos määritettiin prosenttia sulkemisesta käsiteltyjen verrattuna hoitamattomiin.

Eläimet, elinviljelyssä ja immunohistokemia (IHC) B

Eläimet saatiin, käsiteltiin, ja sijoitettu kuten aiemmin on kuvattu [27]. Munasarjojen ja munanjohtimien leikeltiin ja sitä viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [30], [31]. Kasvualustaan ​​muodostui alfa-MEM (Invitrogen), ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen), jossa oli 0,1% DMSO: ta, 20 ng /ul TGF, 5 uM SB431542 (TGF-estäjä) tai 20 ng /ul TGF plus 5 uM SB431542 lisätään käsittelyolosuhteet. TGF liuotettiin veteen, mutta 0,1% DMSO: ta, lisättiin TGFp yksinään edellytys kontrolloida SB431542 liuotinta. Bromideoksiuridiinia (BrdU, Sigma, 10 uM) lisättiin elatusaineeseen 24 tuntia ennen kudoksen kiinnitys. Kudokset preparoitiin parafiini leikkuu ja immunohistokemia valmistui kuten aiemmin on kuvattu [27].

leviämisen kuvantamisen

Kuvaus suoritettiin käyttäen Nikon E600 mikroskooppi, jossa on DS-Ri1 digitaalikamera ja NIS elementit Software (Nikon Instruments, Melville, NY). ImageJ käytettiin määrittämään solujen lisääntymistä. Prosentuaalinen leviämisen laskettiin jakamalla epiteelisolujen värjäystä positiivisia BrdU kokonaismäärällä epiteelisolujen.

Ethics selvitys

Kaikki eläimet käsiteltiin mukaisesti National Institutes of Health suuntaviivojen että hoito ja käyttö Laboratory Animals ja vakiintuneiden institutionaalisten eläinten käytön ja hoidon protokolla University of Illinois at Chicago. Protokolla hyväksyttiin Animal Care komitean University of Illinois at Chicago (protokolla numero: A08-250). Eläimiä pidettiin lämpötilassa ja kevyt kontrolloidussa ympäristössä (12 h valo, 12 h pimeä) ja toimitettiin ruokaa ja vettä halun. Kaikki hiiret lopetettiin CO

2 inhalaatiolla, jota seuraa kaula sijoiltaan.

Tilastolliset analyysit

Kaikki arvot esitetään keskiarvona ± keskivirhe. ANOVA seurasi Tukeyn moninkertainen vertailu testejä käytettiin arvioimaan eroja koe- ja kontrolliryhmissä. Haavan paranemista määrityksessä parillista t-testiä käytettiin analysoitaessa ohjaus ja käsitellään kustakin solulinjasta, kun taas pariton t-testiä käytettiin verrattaessa käsiteltyjen ryhmien kahden eri solulinjoissa. p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

TGFli indusoi kasvun pysähtymisen munasarjasyöpäsoluja ilmentävät villityyppistä p53

paremmin ymmärtää rooli p53 munasarjasyöpään kuusi tunnettu munasarjasyövän solulinjoissa analysoitiin p53-ilmentymistä (Fig. 1a). OVCA 420 ja 429-solut ilmentävät pieniä määriä p53-proteiinin, sopusoinnussa raportteja, että niillä on villityyppisen p53: n [32]. Johtuen nämä alhaiselle tasolle, sisplatiinihoitoon synnyttämiseen käytettiin ja vahvistaa p53 ilmentymistä OVCA 429 (Fig. S1). SKOV3 ja OVCAR5 eivät osoittaneet p53-proteiinin ilmentyminen, kuten on sopusoinnussa aiempaan toteamukseen luokiteltu ne p53 null [7]. Sen sijaan, OVCA 432, ja OVCAR3 esillä runsaasti p53-proteiinin ilmentyminen johtuen R277H ja R248Q mutaatioita, vastaavasti (taulukko S1) [7].

(a) Western blot -analyysi munasarjasyövän solulinjoissa, jotka osoittavat niiden p53 status. Aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) Kuusi munasarjasyövän solulinjoissa (OVCA 420, 429, SKOV3, OVCAR 5, OVCA 432, ja OVCAR 3), sekä neljä ensisijainen, ei-syöpä solulinjoja (Mose, Mtec, IOSE80, ja FTSEC) käsiteltiin tai ilman TGF (10 ng /ml) käyttäen SBE-luc-plasmidin. ANOVA suoritettiin erikseen kertaiseksi induktio (TGF) ja taita tukahduttamisen (estäjä ja TGFp + estäjä) analysoida merkitystä kuin käsittelemättömän. Data esitetty keskiarvona ± SEM, * p≤0.05.

arvioida, miten p53: n ilmentyminen moduloi solujen kyky vastata Smad signalointia, lusiferaasi määritystä käytettiin sen määrittämiseksi, mitkä solut reagoivat TGF indusoimaan Smad transkriptio (Fig. 1b). Kaikki testatut solulinjat, paitsi OVCAR5, osoitti TGFp-välitteisen transkription, jotka voisivat tukkia SB431542, joka on TGFp-inhibiittori (tuloksia ei ole esitetty).

Seuraavaksi vaikutus TGFp on ei-syöpä kantasolujen tutkittiin. Koska munasarjojen pinnan epiteeli (OSE) ja munanjohtimen epiteelin (TEC) voi aiheuttaa munasarjasyöpä [33], vastaus näiden normaaleihin soluihin TGF tutkittiin. Voidakseen seurata signalointi alavirtaan TGFp, SBE-lusiferaasi määritykset suoritettiin normaali 2D hiiren OSE (Mose) ja hiiren TEC (Mtec) solut sekä ihmisen kuolemattomaksi OSE (IOSE80) ja ihmisen munanjohtimen epiteelin (FTSEC). OSE ja TEC solujen merkittävästi vastasi Smad välittämää transkriptio aiheuttama TGFli sekä hiiren ja ihmisen solulinjoissa (Fig. 1b). Mose solut vastasivat korkeampaa kertaiseksi aktivointi (21-kertainen) reportteri kuin Mtec soluja (7-kertaiseksi). p53 ilmentymistä Mose oli edellisessä vahvistetaan olevan villityypin [27], [34]. Mtec solut käyttäytyi kuin villityypin vasteena sisplatiinin (Fig. S2), kun taas IOSE80 ja FTSEC olivat toiminnallisesti null p53 vuoksi kuolemattomaksi SV40.

Näiden tulosten pohjalta, kolme solulinjoja (OVCA 420 , OVCA 432, ja SKOV3) valittiin edelleen analysoida vaikutuksia TGFp jakautumiseen. Nämä solulinjat käsiteltiin TGF (20 ng /ml) 48 tunnin ajan ja solusyklin etenemisen tutkittiin käyttäen virtaussytometriaa. TGF indusoi G

0 /G

1 solusyklin pysähtymisen OVCA 420 (Fig. 2a). OVCA 432-solut, jotka ilmentävät mutantti p53, ei kasvua pidätti TGF hoitoon (Fig. 2b). Lopuksi TGFp ei aiheuttanut solusyklin pysähtymisen SKOV3- soluissa, vaan vähensi solujen G

0 /G

1 (Fig. 2c).

(a-c) OVCA 420, OVCA 432, ja SKOV3-solulinjoja käsiteltiin 20 ng /ml TGF