Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

moniresistenssin (MDR) on suuri ongelma onnistuneen syöpien hoidossa. Ihmisen ABCG2, jäsen ATP-sitova kasetti kuljettaja superperheen, on keskeisessä asemassa MDR ja tärkeä tehtävä suojella syövän kantasoluja. Knockout on ABCG2 ei ollut ilmeisiä haitallisia vaikutuksia hiirillä. Siten ABCG2 on ihanteellinen kohde kehittämiseksi kemiallis-herkistäjiä parempaan hoitoon lääkkeille vastustuskykyiset syöpien ja auttaa poistamaan syövän kantasoluja.

Methods /alustavia tuloksia

Käyttäen järkevä seulonta edustajista kemiallista yhdistettä kirjasto, olemme löytäneet uuden estäjä ABCG2, PZ-39 (N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide), että on kaksi tilaa toimia estämällä ABCG2 aktiivisuutta ja nopeuttamalla sen lysosomifuusio riippuvaa hajoamista. PZ-39 ei ole vaikutusta ABCB1 ja ABCC1 välittämän lääkevuoto-, vastus, ja niiden ilmaisun, mikä osoittaa, että se voi olla ominaisia ​​ABCG2. Analyysit analogisen yhdisteet osoittivat, että farma- PZ-39 bentsotiatsoli liittyy triatsiinirenkaan selkäranka.

Päätelmä /merkitys

Toisin kuin aiemmin tunnettu ABCG2 transporter estäjät, PZ-39 on novel kaksi-mode toimintaa estämällä ABCG2 aktiivisuutta, akuutti vaikutus, ja nopeuttamalla lysosomifuusio riippuvaisten hajoamista, krooninen vaikutus. PZ-39 on potentiaalisesti arvokas koetin rakenne-toiminta tutkimukset ABCG2 ja lyijy yhdiste kehittämiselle terapeuttisten kohdistamista ABCG2 välittämää MDR in monimuotoiset syövän kemoterapiassa.

Citation: Peng H, Dong Z, Qi J, Yang Y, Liu Y, Li Z, et al. (2009) romaani Kaksi tila-Vt estäjä ABCG2-välitteisen Moniresistenssi liikenne- ja Resistance in Cancer Chemotherapy. PLoS ONE 4 (5): e5676. doi: 10,1371 /journal.pone.0005676

Editor: Paul Cobine, Auburn University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 maaliskuu 2009; Hyväksytty: 01 toukokuu 2009; Julkaistu: toukokuu 24, 2009

Copyright: © 2009 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health myöntää R01 CA120221 ja R01 CA113384. ZD ja YY tuettiin osittain jonka NRSA T32 DK07519 ja T32 HL07910 National Institutes of Health, vastaavasti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

moniresistenssin (MDR) on suuri ongelma onnistuneen syöpien hoidossa. Yli-ilmentyminen joidenkin jäsenten ABC (ATP-sitova kasetti) transporter superperheen on ehdotettu aiheuttavan MDR. P-glykoproteiini (MDR1 /ABCB1), monilääkeresistenssiin proteiini 1 (MRP1 /ABCC1), ja rintasyöpä resistance protein (BCRP /ABCG2) ovat kolme suurta ABC kuljettajat, jotka ovat merkittäviä toimijoita kliinisessä kehittämisessä MDR [1]. Yksi näistä jäsenistä, ABCG2 jonka ajatellaan olevan olemassa ja toimivat homo-oligomeereja 8-12 alayksiköiden [2], [3], [4], on myös ollut mukana pelata rooleja suojella syövän kantasoluja, jolloin lääke kestävyys ja epäonnistuminen syövän kemoterapia [5]. Syöpälääke substraatteja ABCG2 sisältyvät, mutta eivät rajoitu yleisesti käytettyjä syöpälääkkeitä, kuten adriamysiinin, mitoksantroni, ja topotekaania. Itse asiassa viimeaikaiset kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen ABCG2 sekä aikuisten ja lasten leukemian korreloi erittäin hyvin huono ennuste (katsaus katso [6]). Knockout on ABCG2 ei ollut ilmeisiä haitallisia vaikutuksia kehitykseen, biokemia, ja elämän hiirillä [7]. Kaikki nämä aikaisemmat havainnot tekevät ABCG2 ihanteellinen kohde kehittämiseksi kemiallis-herkistäjiä parempaan hoitoon lääkkeille vastustuskykyiset syöpien ja viittaavat siihen, että estämällä ABCG2 todennäköisesti aiheuttaa mitään sivuvaikutuksia, jos estäjä on nimenomaan ABCG2.

Verrattuna tunnettu lääkeresistenssin aiheuttavia ABC kuljettajat kuten ABCB1 ja ABCC1, ABCG2 löydettiin suhteellisen äskettäin ja siten, muutamia spesifisiä inhibiittoreita ABCG2 on raportoitu. Eräs tunnettujen erityisten ABCG2 estäjien on voimakas mykotoksiinien Fumitremorgin C (FTC) erittää

Aspergillus fumigatus

[8], [9]. Kuitenkin neurotoksisuus FTC rajoittaa sen terapeuttista potentiaalia. Analogit FTC, kuten Ko132 ja Ko143, on kehitetty alhainen myrkyllisyys [10], mutta ei vielä tiedetä, tehokkaita kliinisissä tutkimuksissa. Lisäksi muut inhibiittorit ABCG2 on raportoitu [11], [12]. Kuitenkin, nämä aineet, kuten GF120918, näyttävät puuttuvan spesifisyys, koska niiden vaikutus ABCB1 ja /tai ABCC1 [13], [14]. On selvää, tarkempia ABCG2 estäjiä tarvitaan tulevan kehityksen mahdollisia kemiallis-herkistävät aineet paremmin hoitoon lääkkeille vastustuskykyiset syöpiä.

Tässä artikkelissa, me raportoimme löytö uusi erityinen ABCG2 estäjä, PZ-39 (N- ( 4-kloorifenyyli) -2 – [(6 – {[4,6-di (4-morfolinyyli) -1,3,5-triatsin-2-yyli] amino} -1,3-bentsotiatsol-2-yyli) sulfanyyli ] asetamidi), joka on paljon tehokkaampi kääntää ABCG2-välitteisen lääkeresistenssin ja vähemmän sytotoksinen viljeltyjä soluja verrattuna FTC. PZ-39 näyttää olevan kaksi tilaa toimia aiheuttamalla ABCG2 hajoamisen (krooninen) lisäksi estämällä sen aktiivisuuden (akuutti). Samanlainen vaikutus kolmen PZ-39 liittyvien yhdisteiden paljasti rakenteellinen pohja suunnittelun tehokkaampi erityisiä ABCG2 estäjiä tulevaisuudessa.

Tulokset

vaikutus yhdisteen PZ-39 mitoksantronilla kertymistä

käyttäen järkevä seulonta edustajista eri luokkiin pieni molekyyli yhdiste kirjaston tiedot (www.specs.net) mahdollisia inhibiittorit ABCG2 välittämän lääkevuoto- tunnistimme yhdiste, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide) jossa bentsotiatsoli liittyy triatsiinirenkaan selkäranka, (nimeltään PZ-39 jälkeen, ks. 1), joka radikaalisti päinvastaiseksi mitoksantronilla kertymistä MCF7 /AdVp3000 solut, jotka yli-express ABCG2. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, PZ-39 tehostettu mitoksantroni kertymistä MCF7 /AdVp3000 mutta ei vanhempien herkkä MCF7-solut, jotka eivät tuota ABCG2, viittaa siihen, että ABCG2-välitteinen lääkevuoto- on estetty. Koska MCF7 /AdVp3000 soluja myös yli-ilmentävät muihin ABC kuljettajat kuten ABCC3 lisäksi ABCG2 [15], PZ-39 voi estää ABC kuljettajat muut kuin ABCG2, mikä lisää mitoksantronia kertymistä. Suoraan testata, PZ-39 estää ABCG2 teimme samanlaiset tutkimukset käyttäen ABCG2-transfektoituja vakaa HEK293 (HEK293 /ABCG2) soluihin [3]. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, pre-inkubointi solujen PZ-39 tehostettu solunsisäisen mitoksantronilla kertymistä HEK293 /ABCG2 muttei vektorin transfektoiduissa ohjaus (HEK293 /Vec) soluja. Siten PZ-39 todennäköisesti estää ABCG2 välittämän mitoksantronia ulosvirtausta. Kuviot. 2A ja 2B osoittavat myös, että PZ-39 3,3 uM saavuttaa samantasoista vaikutus kuin spesifistä ABCG2 estäjä FTC 10 uM, mikä viittaa siihen, että PZ-39 voi olla ~ 3 kertaa tehokkaampi kuin FTC.

PZ -39, N-(4-chlorophenyl)-2-[(6-{[4,6-di(4-morpholinyl)-1,3,5-triazin-2-yl]amino}-1,3-benzothiazol-2-yl)sulfanyl]acetamide, ja sen analogit C6, C8 ja E2 kaikki sisältävät bentsotiatsoli liittyy triatsiinirenkaan selkäranka. Kolme ehjä renkaat on merkitty A, B ja C.

A ja B, mitoksantroni kerääntymistä MCF7 tai sen lääkeresistenttejä alalinja MCF7 /AdVp3000 (A) ja HEK293-solut transfektoitiin vektorilla tai ABCG2 (B) sen jälkeen 30 minuutin inkuboinnin läsnä ollessa tai ilman PZ-39 (3,3 uM) tai FTC: n (10 uM). Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (* P 0,05; ** P 0,01 verrattuna DMSO ajoneuvo). C ja D, annosvaste PZ-39 ja FTC palauttamisessa mitoksantronilla kerääntymisen ABCG2-transfektoiduissa HEK293-soluissa. Paksu viiva näyttää tason mitoksantronia kertymistä vektori-transfektoiduissa HEK293, toimii kontrollina.

tutkimiseksi edelleen tehoa PZ-39 ABCG2, annosvasteen vaikutus PZ-39 on mitoksantronilla kertyminen HEK293 /ABCG2 solut määritettiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, solunsisäinen mitoksantroni taso kasvoi PZ-39 annoksesta riippuvalla tavalla. 3.3 uM, PZ-39 täysin kunnostettu solunsisäisen mitoksantronilla tasolla HEK293 /ABCG2 soluja. FTC, toisaalta, saavutettu samantasoista vaikutus vain 10 uM (Fig. 2D), joka tukee väitettä, että PZ-39 on voimakkaampi kuin FTC (katso edellä).

herkistyminen lääkeresistenssin by PZ-39

tutkia mahdollisuuksia käyttää PZ-39 kuin kemiallis-herkistävä of ABCG2 välittämän lääkeresistenssi, vaikutus PZ-39 lääkevaste HEK293 /ABCG2 solut määritettiin poissa tai läsnäolo 0,1 uM mitoksantronia joka yksin tuotti ~ 10% solun tappaminen. Kuten on esitetty kuviossa. 3A ja 3B, PZ-39 ei ole sytotoksinen HEK293 /ABCG2 soluihin ja sen IC

50 ei ole mitattavissa pitoisuusalueella käytetään taas IC

50 FTC on ~24 uM. IC

50 PZ-39 ja FTC tarvitaan herkistää mitoksantronilla vastus on -15 nM ja ~387 nM. Teho indeksi PZ-39 arvioidaan olevan 1600 kun taas FTC on vain ~62 (taulukko 1).

A ja B, teho indeksi PZ-39 verrattuna FTC peruutettaessa mitoksantronia vastus . HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ilman tai 0,1 uM (IC

10) mitoksantroni puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina PZ-39 (A) tai FTC: n (B), minkä jälkeen SRB-määrityksellä. Tiedot ovat edustava neljästä itsenäisestä kokeesta. C ja D, herkistyminen indeksi PZ-39 (C) verrattuna FTC (D) HEK293 /ABCG2 soluja. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla mitoksantronin puuttuessa tai läsnä ollessa eri pitoisuuksina PZ-39 ja sen jälkeen SRB-määrityksellä. Tiedot ovat edustava neljästä itsenäisestä kokeesta. E, monilääke herkistyminen indeksi PZ-39 huumeisiin valittujen MCF7 /AdVp3000 soluja. MCF7 /AdVp3000 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla adriamysiini (ADR), kamptotesiinin (CPT), tai mitoksantronia (MX): n läsnä ollessa DMSO: ssa (vehikkeli), 200 nM PZ-39, tai FTC seuraa SRB-määrityksellä. Herkistyminen indeksi laskettiin IC

50 mitoksantronin puuttuessa tai läsnä PZ-39 tai FTC. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta.

tutkimiseksi edelleen estoaktiivisuus PZ-39 ABCG2 vaikutukset PZ-39 mitoksantronilla sytotoksisuutta HEK293 /ABCG2 solut arvioitiin, kun läsnä on kolme eri pitoisuuksia PZ-39 (50, 200, ja 500 nM) tai vehikkelikontrollilla (0,1% DMSO). Kuten on esitetty kuviossa. 3C, PZ-39 50 nm vähensi IC

50 mitoksantronin kanssa herkistyminen indeksi 0,4 (taulukko 2). 500 nm: ssä, herkistymisestä indeksi PZ-39 on 0,04 kun taas FTC: n samana pitoisuutena on 0,26 (Fig. 3d ja taulukko 2). Nämä tulokset osoittavat, että PZ-39 on erittäin voimakas uusi ABCG2 estäjä.

tutkia, PZ-39 voi kääntää ABCG2 välittämää monilääkeaineresistenssin on lääkkeille vastustuskykyiset tasyöpäsolulinja, käytimme huumeisiin valitut MCF7 /AdVp3000 soluihin ja testattiin kaksi syöpälääkettä substraattien ABCG2 adriamysiini ja camptothecin. Kuten on esitetty kuviossa. 3E, PZ-39 200 nm: ssä rajusti vastus MCF7 /AdVp3000 adriamysiiniresistenssiä ja kamptotesiiniä, samanlainen mitoksantroni, kun taas ohjaus FTC osoitti paljon vähemmän herkistymisen, mikä on kaikkien kolmen lääkeaineen verrattuna PZ-39 samana pitoisuutena.

Kaksi toimintatavat

ymmärtää mekanismia PZ-39 toimintaa estämällä ABCG2 välittämän huumeiden kuljetusta, ensin tutkittiin kinetiikka PZ-39 eston käyttäen eristetty nurinpäin kalvovesikkeleiden [16] . Päätimme muutoksen mitoksantroni otto kun läsnä on eri pitoisuuksia PZ-39. Kuten näkyy Lineweaver-Burk-kuvaaja (kuvio. 4A), Km ja Vmax mitoksantronin liikenteen puuttuessa PZ-39 arvioitiin olevan 2,3 uM ja 455 pmol /mg proteiinia, vastaavasti. Vaikuttaa siltä, ​​että sekä Km ja Vmax mitoksantronin liikenteen on vähentynyt, kun läsnä on PZ-39, jonka arvioitu Ki ~0.52 uM, mikä viittaa siihen, että PZ-39 käyttäytyy seka-tyypin inhibiittori mitoksantronin liikenteen [17]. Koska se oli alun perin myös arveltu, että jotkut estäjät kilpailla ATP-sitoutumiskohdan ABCG2 kuljettaja, teimme toisessa kokeessa käyttämällä ATP: vaihteleva substraattina. Kuten on esitetty kuviossa. 4B, sekä Km ja Vmax mitoksantronin liikenteen myös muuttunut PZ-39. Siten meidän tutkimus osoitti, että prosessi mitoksantronia liikenteen ja ATP: n sitoutuminen voi estyä PZ-39, jossa on sekoitettu tyyppi mekanismi. Todennäköistä, PZ-39 sitoutuu eri sivuston ABCG2 sekä mitoksantroni ja ATP, eikä kilpaileva estäjä joko yksi niistä.

Inside-out solukalvon vesikkelit HEK293 /ABCG2 soluja inkuboitiin 0,6, 1,2 , ja 1,8 uM [

3H] mitoksantronilla (A) tai 0,1, 0,2, 0,5, 1, ja 5 mM ATP sekä 0,6 uM [

3H] mitoksantronilla (B) poissa tai läsnä eri pitoisuuksina PZ-39 37 ° C: ssa 5 min, jota seurasi määritys mitoksantronin oton. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.

Seuraavaksi testasimme, mikäli PZ-39 mahdollisesti estää ABCG2 oligomerointi koska ABCG2 on ehdotettu toimia homodimeerinä tai korkeampien oligomeerien ja oligomerointi voidaan käyttää kohteena terapeuttisena lääkkeenä kehittäminen [2], [3]. Tätä tarkoitusta varten, samanaikainen immunosaostus kaksi differentiaalisesti koodattu ABCG2 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [2] sen jälkeen 6 tunnin hoidon PZ-39 3,3 uM. Ei kuitenkaan vaikutusta PZ-39 ABCG2 samanaikainen immunosaostus havaittiin (täydentävä Fig. S1), mikä viittaa siihen, että PZ-39 ei vaikuta ABCG2 oligomerointikatalysaattorin.

tutkia edelleen mekanismi PZ-39 vaikutus ABCG2, suoritimme western blot-analyysi ABCG2 ilmaisun jälkeen, PZ-39 hoitoa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, vakaan tilan tason ABCG2 proteiinin rajusti väheni 1 päivä sen PZ-39 hoitoa. Mutta se oli vain marginaalinen lasku 2 tunnin kuluttua PZ-39 hoitoa. Kuten edellä on kuvattu, PZ-39 kykeni inhiboimaan ABCG2-välitteistä mitoksantroni ulosvirtaus lääkkeille vastustuskykyiset solut 1 tunnin inkuboinnin jälkeen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että PZ-39 voi olla kaksi toimintatapoja inhiboimalla (akuutti vaikutus) ja lauseke (krooninen vaikutus) sekä ABCG2 ja vastaa meidän havainto, että PZ-39 on noin 3 kertaa parempi kuin FTC huumeiden kertymistä määrityksessä ( akuutti vaikutus), mutta noin 7 kertaa voimakkaampi huume herkistymistä määrityksessä (krooninen vaikutus).

, vaikutus PZ-39 ABCG2 vakiotasolleen. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin DMSO ajoneuvon tai 3,3 uM PZ-39 eri aikoja ja korjattu western blot-analyysi ABCG2 ilmaisua. B, vaikutus PZ-39 ABCG2 vakauteen. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ensin sykloheksimidillä (5 ug /ml), minkä jälkeen lisättiin 3,3 uM PZ-39: n tai DMSO eri aikoina ja ne kerättiin western blot -analyysillä. C, puoliintumisaika ABCG2. ABCG2 tasoilla western blot esitetyn B määritettiin käyttämällä Scion Image ja ajan funktiona hoidon. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± S.D neljä kokeiluja. D, vaikutus PZ-39 5D3 värjäytymistä ABCG2. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ilman (ohut viiva) tai (paksu viiva) DMSO ajoneuvon, 10 uM PZ-39: n tai FTC: n, mitä seurasi värjäys monoklonaalisella vasta-aineella 5D3 ja virtaussytometria-analyysi. E, vaikutus FTC ABCG2 ilme. HEK293 /ABCG2-soluja käsiteltiin 10 uM FTC eri aikoja ja ne kerättiin western blot-analyysi ABCG2 ilmaisua. F, vaikutus bafilomysiini

1 ja MG-132 PZ-39 aiheuttama ABCG2 hajoamista. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin 3 uM PZ-39 puuttuessa tai läsnä 10 nM bafilomysiini

1 tai 2 uM MG-132 eri aikoja ja korjattu western blot-analyysi ABCG2 ilmaisua. GAPDH käytettiin latauskontrollina kaikissa western blot-analyysit.

Voit selvittää kroonisen vaikutuksen PZ-39 ABCG2 ilme on mRNA-tasolla, suoritimme reaaliaikaisen RT-PCR-analyysillä MCF7 /AdVp3000 ja HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin PZ-39 eri kertaa jopa 3 päivää. Mitään merkittävää muutosta löytyi ABCG2 mRNA-tasolla seuraavat PZ-39 hoito joko solulinjassa (katso täydentävää Fig. S2). Siten PZ-39 tuskin vaikuttaa ABCG2 ilmaus sen mRNA tasolla. Seuraavaksi me arveltu, että mekanismi PZ-39 estoa olisi posttranskriptionaalisella prosessi ja tutkinut mahdollisuuden PZ-39 voi kiihdyttää hajoamista ABCG2. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, HEK293 /ABCG2 soluja esikäsiteltiin sykloheksimidillä, joka vaikuttaa estämällä pidentymisen aikana proteiinisynteesiä, ja sen jälkeen käsittelemällä PZ-39 useita kertoja määrittää ABCG2 hajoamisnopeuden. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, menetys ABCG2 käsitellyissä soluissa yhdistelmä PZ-39 ja sykloheksimidillä oli paljon nopeampi kuin ohjaus hoitoa ilman PZ-39. Puoliintumisaika on ABCG2 läsnäollessa PZ-39 arvioidaan olevan -5 tuntia katsoo, että on vakaa joiden arvioitu puoliintumisaika ~54 tuntia kontrolliryhmän (kuvio. 5C). Siten PZ-39 todennäköisesti kiihdyttää hajoamista ABCG2 proteiinia.

vaikutus PZ-39 ABCG2 konformaatioon ja vakautta

nopeutettu hajoaminen ABCG2 by PZ-39 voi johtua, että PZ -39 indusoi konformaatiomuutos ja kohdistaa ABCG2 hajoamiselle. Sen määrittämiseksi, onko PZ-39 mahdollisesti aiheuttaa konformationaalisia muutoksia ABCG2, käytimme monoklonaalinen vasta-aine 5D3, joka on raportoitu aikaisemmin sitoutuvan ABCG2 solun pinnalla helpommin, kun läsnä on ABCG2 estäjien johtuu oletettavasti estäjän aiheuttama konformaatiomuutoksia [12] , [18]. Kuten on esitetty kuviossa. 5D, PZ-39 aiheutti lisääntymisen 5D3 värjäys, mikä viittaa mahdolliseen konformationaalisen muutoksen ABCG2 kun PZ-39 sitoutumisen. FTC myös lisääntynyt 5D3 värjäytymistä odotetusti. Kuitenkin, se ei vaikuta tasoon ABCG2 (Fig. 5E), mikä viittaa siihen, että konformaation muutoksen aiheuttama FTC ja PZ-39 voi olla erilainen. On raportoitu äskettäin, että kaksi erillistä väyliä olemassa hajoamista villityypin ja mutantti ABCG2 proteiinit [19]. Vaikka villityypin ja oikein-taitettu proteiini hajoaa lysosomeihin mutantti ja väärin laskostuneen proteiinin on mukana ubikitiinistä välittämän proteiinin hajoamista proteasomien. Täsmentämiseksi mekanismi PZ-39 aiheuttama ABCG2 hajoamista, käytimme bafilomysiini

1, estäjä proteiinien hajoaminen lysosomeihin, ja MG-132, proteosomin estäjä. Kuten on esitetty kuviossa. 5F, co-solujen käsittely bafilomysiini

1 ja PZ-39 inhiboi PZ-39 aiheuttama ABCG2 hajoamista kun taas yhteistyössä hoito MG-132 ja PZ-39 ei, mikä osoittaa, että PZ-39 aiheuttama ABCG2 hajoamista todennäköisesti lysosomien riippuvaista. Yhdessä voimme päätellä, että PZ-39 aiheuttaa konformaation muutoksen of ABCG2 ja tavoitteet sen normaalin hajoamisen lysosomeihin.

vaikutus PZ-39 ABCB1- tai ABCC1 välittämä lääkeaineen kuljetuksen

spesifisyyden määrittämiseksi PZ-39, testasimme vaikutus PZ-39 toisaalta kahden tärkeän ABC kuljettajat hyvin tunnettu MDR, ABCB1 ja ABCC1. Vaikutus PZ-39 ABCB1 ja ABCC1-välitteinen väheneminen solunsisäisessä adriamysiinin kertymiseen testattiin käyttämällä MCF7-solut transfektoitiin samalla ABCB1 (BC19) [20] ja HEK293-solut transfektoitiin samalla ABCC1 (HEK293 /ABCC1) [16], [21 ]. Löysimme mitään vaikutusta PZ-39 toimintaa koskevat ABCB1 ja ABCC1 alenevassa adriamysiini kertymistä (katso täydentävää Fig. S3A). Olemme myös löytäneet mitään vaikutusta PZ-39 on vakaassa tilassa proteiinin taso ABCB1 ja ABCC1 3 päivän kuluttua hoidon (Fig. S3B). Siten todennäköisesti PZ-39 on nimenomaan ABCG2 näiden kolmen tunnettuja MDR aiheuttavia ABC kuljettajat, joiden uskotaan esittävän tärkeitä rooleja kliinisessä lääkeresistenssin.

vaikutus PZ-39 analogeja on ABCG2

Ymmärtääksemme paremmin farma- PZ-39, me kiinni 3 analogit PZ-39 huumeiden kertymisestä ja kestävyys määritykset käyttämällä HEK293 /ABCG2 soluja verrattuna PZ-39. Nämä analogit (C6, C8, ja E2) on kaikilla sama ehjä renkaat A, B ja C, kuten PZ-39, mutta eri sivuryhmien (Fig. 1). Kaikki kolme analogit oli samankaltainen aktiivisuus kuin PZ-39 tehostamisessa mitoksantronilla kertymistä (Fig. 6A) ja herkistävä mitoksantronilla vastus HEK293 /ABCG2 (Fig. 6B). Määritettävä krooniset vaikutus näiden analogien on ABCG2 ilmaisun, teimme western blot-analyysi hoidon jälkeen C6, C8, ja E2 eri aikoja jopa 3 päivää. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, kaikki kolme analogit aiheuttanut vähentynyt ilmentyminen ABCG2. Lisäksi kaikki nämä analogit aiheutti myös konformaatiomuutoksia ABCG2 samanlainen PZ-39 (Fig. 6D). Siten todennäköisesti bentsotiatsoli liittyy triatsiinirenkaan selkäranka voi olla ytimen rakenne sitoutumisesta ja estämällä ABCG2 toiminta ja vakautta.

, vaikutukset PZ-39 ja sen analogi yhdisteet (3 uM) on mitoksantronia kertyminen HEK293 /ABCG2 soluja. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. kolminkertaisten kokeissa. B, herkistyminen indeksi PZ-39 ja niihin liittyviä yhdisteitä HEK293 /ABCG2 soluja. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla mitoksantronin puuttuessa tai läsnä oli 50 nM PZ-39, C6, C8, ja E2 seuraa SRB-määrityksellä. Herkistyminen indeksi laskettiin IC

50 mitoksantronin puuttuessa tai läsnä yhdisteen estäjiä. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. neljästä itsenäisestä kokeesta. C, vaikutus valittujen PZ-39 ja niihin liittyvien yhdisteiden ABCG2 vakiotasolleen. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin DMSO ajoneuvon tai 3 uM PZ-39, C6, C8, tai E2 eri aikoja ja ne kerättiin western blot-analyysi ABCG2 ilmaisua. D, vaikutus PZ-39 ja niihin liittyvien yhdisteiden 5D3 värjäytymistä ABCG2. HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ilman (ohut viiva) tai (paksu viiva) DMSO ajoneuvon, 10 uM PZ-39: n tai siihen liittyvien yhdisteiden C6, C8, ja E2 seurasi värjäys monoklonaalisella vasta-aineella 5D3 ja virtaussytometria-analyysi.

keskustelu

tässä tutkimuksessa selvitettiin uusi voimakas spesifinen estäjä ihmisen ABCG2, PZ-39, mahdollisena terapeuttisena aineena herkistää lääkeresistenssin syövän kemoterapiassa. PZ-39 sisältää bentsotiatsoli liittyy triatsiinirenkaan selkäranka. Sen vaikutusmekanismi näyttää olevan kahdessa eri tilassa; sekamuotoinen esto huumeiden liikennetehtävään ja nopeutetun lysosomifuusio riippuvaa hajoamista ABCG2. PZ-39 ei ole sytotoksinen itselleen IC

50 24 uM ollessaan hyvin voimakas herkistettäessä MDR syöpäsolujen yli-ilmentävät ABCG2.

Monet aiemmin raportoitu ABCG2 estäjät olla laaja-alaista ABC transporter tavoitteita. ABCG2 estäjä GF120918, esimerkiksi, itse asiassa estää ABCB1 toiminto voimakkaammin kuin ABCG2. Tähän asti hyvin harvoja yhdisteitä on tunnistettu spesifisiä inhibiittoreita ABCG2. Yksi tällainen esimerkki on myrkytön FTC johdannainen, Ko143. Se on tehokkaampi kuin muut FTC analogit, eikä sillä ole myrkyllisyyttä hiirillä 10-50 mg /kg suun kautta annos [10]. Äskettäin kaksi flavone yhdisteiden, 6-prenylchrysin ja tectochrysin, on osoitettu olevan spesifinen ABCG2 ja ei ole vuorovaikutusta havaittiin joko ABCB1 tai ABCC1 [22]. Käyttämällä tehoseulonnan, Henrich ym. löysivät useita yhdisteitä, joilla on samanlaisia ​​tai vähemmän estävää aktiivisuutta verrattuna FTC [11], [12]. Kuitenkin, mikään näistä raportoitu erityisiä ABCG2 estäjiä on testattu kliinisesti.

Verrattuna joihinkin menneisyyden spesifistä ABCG2 inhibiittorit, kuten FTC, uuden yhdisteen PZ-39 on kolme erottuva etuja. Ensinnäkin, PZ-39 on paljon tehokkaampi kuin FTC estämisessä ABCG2 toiminto. Vuonna lääkkeen kertymistä määritys, PZ-39 saavutettiin selvästi samantasoista eston 3,3 uM verrattuna FTC 10 uM. Solujen eloonjääminen määrityksessä, PZ-39 500 nM pystyi herkistää ABCG2 välittämää mitoksantronilla vastus indeksillä 0,04 taas FTC samana pitoisuutena on herkistyminen indeksi 0,26, ~ 7-kertainen ero. Toiseksi, PZ-39 on hyvin alhainen sisäinen sytotoksisuus in vitro ( 24 uM), mutta sen teho-indeksi on paljon parempi kuin FTC (1600 vs. 62). Siten ikkuna terapeuttisen indeksin PZ-39 voivat olla suuria. Ihanteellinen kemiallis-herkistävä on se, että sen ei pitäisi olla toksinen itsessään. On selvää, PZ-39 täyttää tämän vaatimuksen in-vitro -tutkimuksissa. Kuitenkin tulevaisuudessa tutkimuksia tarvitaan arvioimaan myrkyllisyyden PZ-39 eläinmalleissa. Kolmanneksi, PZ-39 näyttää olevan kaksi toimintatavat. Lisäksi sen kyky estää ABCG2 aktiivisuutta, PZ-39 kiihdyttää myös sen lysosomiin riippuvainen hajoamista. Tämä toinen toimintatapa on erottuva luonne ja lisää selvästi tehoa PZ-39 ABCG2 mahdollisesti kierrätetyn käyttämällä PZ-39. Tämä luonto ei ole raportoitu mistään edellinen tiedossa ABC transporter estäjiä.

Kaksi toimintatavat tekevät PZ-39 erittäin mielenkiintoinen, romaani, ja lupaava ABCG2 estäjä lisähyödyntämisen. Ensimmäisessä moodissa akuutti vaikutus ABCG2 toiminto, PZ-39 näyttää kohdistaa sekamuotoinen inhibitio lääkeaineen oton määritystä. PZ-39 voi vuorovaikutuksessa ABCG2 suoraan, mutta ne eivät näy kilpailla suoraan mitoksantronilla tai ATP: n sitoutuminen. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan tunnistamaan PZ-39 sitoutumiskohtiin in ABCG2. Toisessa moodissa, PZ-39 näyttää nopeuttaa ABCG2 hajoamista lysosomeihin, krooninen vaikutus. On mahdollista, että sitoutuminen PZ-39 aiheuttaa konformaatiomuutoksen ABCG2 joka kohdistuu sen hajoamista lysosomeihin. Se on, kuitenkin, huomionarvoista, että sitoutuminen FTC aiheuttaa myös ABCG2 konformaation muutoksen, mutta se ei ole nopeuttaa ABCG2 hajoamista. Tämä havainto viittaa siihen, että konformaation muutoksen aiheuttama PZ-39: n ja FTC voi olla erilainen. Aiemmin on havaittu, että kysteiini mutantti ABCG2 hajoaminen tapahtuu proteosomin taas normaali hajoamista villityypin ABCG2 on kautta lysosomiin [19], joilla on puoliintumisaika ~37 t [23]. On myös havaittu, että agonisti-indusoitua hajoamista β

2-adrenergisen reseptorin on kautta lysosomiin mahdollisesti parantaa endosytoosin [24]. On houkuttelevaa ehdottaa, että sitoutuminen PZ-39 ABCG2 pystyy nopeuttamaan endosytoosin ja kaupan solun pinnan ABCG2 lysosomeihin varten hajoamista. Laaja pyrkimyksiä arvioida enempää hypoteesia ovat parhaillaan käynnissä laboratoriossamme.

analogit PZ-39, C6, C8 ja E2 kanssa samaa perustekniikkaa rakenteen kaikki näytä toimivan käyttäen samaa menetelmää kuin PZ-39. On selvää, lisätutkimuksia tarvitaan testata enemmän analogeja PZ-39 enemmän muutoksia ydin bentsotiatsoli liittyy triatsiinirenkaan selkäranka ja valottaa rakenteen ja tehokkuuden suhteen PZ-39 ABCG2 eston. Kuitenkin havainnot tästä tutkimuksesta osoittavat selvästi, että PZ-39 voi toimia lyijy yhdiste edelleen suunnittelulla ja tarkempia ABCG2 estäjiä parempaan hoitoon lääkkeille vastustuskykyiset ihmisen syövistä monimuotoiset terapiassa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Monoklonaalinen vasta-aine BXP-21 vastaan ​​ABCG2, anti-Myc ja anti-HA vasta-aineet olivat peräisin ID Labs, Cell Signaling, ja Roche, vastaavasti. Monoklonaaliset antigody vastaan ​​Pgp, C219, oli ystävällinen lahjoitus tri Victor Ling (British Columbia Cancer Center, Vancouver, Kanada). Monoklonaalinen vasta-aine MRP, MRPr1, hankittiin Kamiya Biomedical Company. Biotiini-konjugoitu 5D3-vasta-aine ja fykoerytriini-streptavidiinia konjugaatit olivat eBiosciences. Kaikki elektroforeesi reagenssit, proteiinipitoisuus määritys kit, betonielementit polyakryyliamidigradienttigee- geelejä ja polyvinyylideenifluoridit kalvot ostettiin Bio-Rad. FTC, adriamysiini, mitoksantroni, kamptotesiini, DTT: tä, sulforodamiini B (SRB), ja Triton X-100 olivat peräisin Sigmalta. Proteiini-G PLUS-agaroosi ja SYBR Green PCR Master Mix olivat Santa Cruz Biotechnology and Applied Biosystems, vastaavasti. LipofectAMINEa Plus ja G418 olivat Invitrogen. Soluviljelyelatusainetta IMEMiin, DMEM, ja [

3H] mitoksantronilla olivat BioSource International, Media Tech., Ja Moravek Biochemical, vastaavasti. PZ-39 ja kolme niihin liittyviä yhdisteitä ostettiin silmälasit. Kaikki muut kemikaalit olivat molekyylibiologian luokan Sigma tai Fisher Scientific.

Soluviljely, lysaatti, ja kalvo valmisteet

Ihmisen rintasyöpä MCF7 (ATCC) ja sen johdannainen linjat BC19 (a lahja Julie Horton National Institute of Environmental Health Sciences) ja MCF7 /AdVp3000 (lahja Susan Bates National Cancer Institute), HEK293 /ABCC1, HEK293 /vektori, HEK293 /ABCG2 viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [2], [16 ], [20], [25]. Lysaattia valmistelu suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [25]. Solukalvot valmistettiin täsmälleen samalla tavalla kuin aiemmin kuvattu [16], ja lopullinen membraanit suspendoitiin uudelleen STB (250 mM sakkaroosi, 150 mM NaCl, 10 mM Tris /HCl, pH 7,5).

Western blot , immunosaostus ja virtaussytometria

Western blot, immunosaostus ja virtaussytometria analyysi lääkkeen kertymisen suoritettiin täsmälleen kuten aikaisemmin on kuvattu [2], [3]. Määrittää mekanismi ABCG2 hajoamisen, HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin ensin 10 nM bafilomysiini

1 tai 2 uM MG132 24 tuntia ja sen jälkeen vielä käsittely 3 uM PZ-39 eri aikoina. Solulysaatit kerättiin sitten western blot-analyysi ABCG2. Määrittämään puoliintumisaika ABCG2, HEK293 /ABCG2 soluja käsiteltiin 5 ug /ml sykloheksimidiä, 3 uM PZ-39, tai molemmat eri aikoina ja sen jälkeen keräämällä solulysaattien western blot-analyysi ABCG2 ilmaisua. Muutoksen määrittämiseksi vasta-aineen 5D3 värjäystä hoidon jälkeen estäjien, HEK293 /ABCG2 soluja inkuboitiin 10 uM PZ-39, C6, C8, E2, tai FTC 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ennen kuin biotiinikonjugoitu 5D3-vasta-ainetta (1: 100 laimennos) lisättiin ja inkuboitiin 2 tunnin ajan. Sitten solut pestiin 3 kertaa ja niitä inkuboitiin fykoerytriini-streptavidiini 30 minuuttia, mitä seurasi pesu 3 kertaa ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Reaaliaikainen RT-PCR ja Sytotoksisuusmääritvs

RNA uuttamalla ja reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Sekvenssit ABCG2-alukkeet ovat 5′-GGCTTTCTACCTGCACGAAAACCAGTTGAG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ATGGCGTTGAGACCAG-3′ (taaksepäin). Sekvenssit GAPDH-alukkeet ovat 5’-AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3’ (taaksepäin). Suhteellinen ABCG2 RNA taso (2

ACt) käsiteltiin estäjillä ilmaistiin prosentteina ohjaus (läsnä ollessa 0,1% DMSO), jossa ACt (kynnys sykli) = (CT

ABCG2-CT

GAPDH ).

Sytotoksisuus määritettiin käyttämällä SRB kolorimetristä määritystä kuten aiemmin on kuvattu [25]. Vaikutus yhdisteen estäjien lääkeresistenssin määritettiin altistamalla solut konsentraatioalueella syöpälääkkeiden, kuten mitoksantroni puuttuessa tai läsnä erilaisia ​​konsentraatioita estäjää. Teho ja herkistymistä indeksi estäjien laskettiin seuraavasti:

Drug keskittymisen ja kuljettaa kineettinen analyysi

Drug kertymistä määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16], [26] joitakin muutoksia. Lyhyesti, 10

6-soluille esi-inkuboitiin eri pitoisuuksien PZ-39, FTC, tai ajoneuvon ohjaus (0,1% DMSO) kanssa 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen lisättiin 20 uM mitoksantronin ja inkuboitu 30 min.