Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kiertävä soluttoman DNA (cfDNA) plasmassa on osoittanut potentiaalia biomarkkerina vuonna erilaisia ​​syöpiä ja siitä voi tulla merkitystä lähde kasvainten mutaation havaitsemiseen. Tavoitteet Tutkimuksemme tavoitteena oli luoda normaalin cfDNA kohortin terveiden yksilöiden ja vertaa sitä neljä kohortteja metastaattisen kolorektaalisyövän (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) potilasta. Tutkimme myös ennusteen arvioinnissa on cfDNA ja analysoinut kasvainspesifistä

KRAS

mutaatioita plasmassa.

Methods

Tutkimus oli prospektiivinen biomarkkereiden arvioinnin neljän peräkkäisen vaiheen II tutkimukset, mukaan lukien 229 potilasta kemoterapiaa tulenkestävä metastasoituneen kolorektaalisyövän ja 100 terveillä henkilöillä. Plasma saatiin EDTA verinäytteestä, ja kokonaismäärä DNA alleelien ja

KRAS

mutatoituja alleeleja arvioitiin käyttämällä in-house ARMS-qPCR kuten aikaisemmin on kuvattu.

Tulokset

mediaani cfDNA tasot olivat korkeampia metastasoitunutta kolorektaalisyöpää kontrolleihin verrattuna (p 0,0001). ROC-analyysi paljasti AUC 0,9486 (p 0,00001). Tiedot osoittivat heikentynyt OS noustessa lähtötilanteen cfDNA sekä silloin, kun luokittelemalla potilaista kvartiileihin cfDNA ja matalan tai korkean cfDNA ryhmiin ylemmässä normaalin kontrolliryhmän (mediaani OS 10.2 (8,3-11,7) ja 5,2 (4,6-5,9 ) kuukautta, vastaavasti, HR 1,78, p = 0,0006). Monimuuttuja-analyysi vahvisti riippumattoman ennusteen arvioinnissa on cfDNA (HR 1,5 (95% CI 1,3-1,7) kullekin kasvu cfDNA neljännekseen). Yleinen yksimielisiksi

KRAS

mutaatioita plasmassa ja kudoksessa oli korkea (85%).

Johtopäätökset

Nämä tiedot vahvistavat ennustetekijöiden arvo cfDNA mittaus plasmassa ja hyödyllisyys mutaation havaitseminen esitettävällä menetelmällä.

Citation: Spindler KLG, Pallisgaard N, Andersen RF, Brandslund I, Jakobsen A (2015) Circulating Vapaa DNA biomarkkerina ja lähde mutaatio Detection in metastasoituneen kolorektaalisyövän. PLoS ONE 10 (4): e0108247. doi: 10,1371 /journal.pone.0108247

Academic Editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, Kiina

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 27 elokuu 2014; Julkaistu: 13 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Spindler et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Rahoitus: Tämä Tutkimuksen rahoittivat jonka Research Counsil Vejle Hospital ja Tryg fondenin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen kerääminen ja analysointi, desicion julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Metastasoitunut peräsuolen syöpä (metastasoitunutta kolorektaalisyöpää) omistaa huono ennuste ja viimeaikaisista parannuksista huolimatta kestävyys hoito on edelleen merkittävä haaste. Etsintä parempia valintakriteerejä hoito ja uudet mahdollisesti tehokas hoito-ohjelmat kemoterapia-resistenttejä on kiinnittänyt paljon huomiota viime vuosikymmenen aikana. Näihin kuuluu uusien aineiden tunnistaminen geneettisiä muutoksia vastaavan vastuksen ja etsiä biomarkkereita ohjausta hoidon aikana.

läsnäolo verenkierrossa soluttoman DNA (cfDNA) määrää veressä on todettu yli 60 vuotta sitten [1]. Se on aktiivisesti vapautuu normaalia ja kuolleen solujen apoptoosia aiheuttaville ja nekrotisoiva prosesseja, kuten myös monimutkaiset vuorovaikutukset kasvain ja vieressä ei-tuumorisoluissa [2-5]. Cell-free DNA voidaan havaita seerumista, plasmasta ja muiden kehon nesteiden [6], mutta mekanismit vapauttaa verenkiertoon ja alkuperä DNA ovat kaukana täysin ymmärretty. Lisäselvityksiä tarvitaan tehdä luotettavaa eroa pahanlaatuisten kasvaa ja ei-syöpä vaihtelut cfDNA.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että taso cfDNA on lisääntynyt sekä syöpäpotilailla [7-8] ja eri ei- pahanlaatuisia patologisia tiloja verrattuna terveisiin yksilöihin. Kuitenkin viime meta-analyysi osoitti ristiriitaisia ​​tuloksia [9]. Perustamisesta normaalitasolle on siis ennakkoehtona lisätutkimuksia mahdollista roolia cfDNA diagnostisena merkki, sekä sen hyödyllisyys varhaiseen toteamiseen uusiutumista.

Soluvapaitakin DNA on myös pidetty potentiaali prognostinen merkkiaine lopputulos erilaisissa syövissä [10]. Viime aikoina olemme raportoitu että cfDNA pidettiin ennusteen arvioinnissa potilailla metastasoituneen kolorektaalisyövän [11-13]. Suuri määrä cfDNA alleelien plasmassa johdonmukaisesti korreloi huonon yleisen (OS) meidän hoidetuilla potilailla thirdline kemoterapiaa metastasoituneen kolorektaalisyövän, kun taas potilaat, joilla on alhainen pitoisuus plasmassa cfDNA oli pidempi mediaani. Tarkastaminen nämä tulokset suurempi ikäluokat ovat erittäin tärkeitä määriteltäessä kliininen potentiaalia cfDNA.

Lisäksi sen potentiaalia diagnostiikkatyökaluna sekä varoituksia merkki, cfDNA on myös arvokas lähde havaitsemiseksi kasvain mutaatioiden ääreisverenkiertoa syöpäpotilaiden [14-16]. Vuonna metastasoituneen kolorektaalisyövän, on korkea taajuus

KRAS

mutaatioita, jotka ovat vastuussa resistenssin laajalti käytetty monoklonaalisia vasta-aineita, joiden tavoitteena on EGFR [17]. Molecular analyysi genomisen muutoksia suoritetaan yleensä arkistomateriaalia kasvainkudoksen, mutta on ollut huolissaan siitä, että tämä lähestymistapa ei ole riittävästi otettu huomioon taudin biologiaa aloitettaessa kohdennettujen EGFR terapian, joka on usein useiden vuosien päädiagnoosina ja /tai leikkaus. Lisäksi toistuvat koepalat eivät ole mahdollisia käytännön ja eettisistä syistä. Siksi käyttö cfDNA havaitsemiseksi näiden kasvainspesifisiä mutaatiot voivat olla houkutteleva lisä paremmin potilaan valinnan kohdennettuja hoitomuotojen tulevaisuudessa.

käytettävien menetelmien DNA: n kvantifiointiin ovat vaihdelleet eri aikoina, jotka vaihtelevat yksinkertaisista qPCR menetelmiä monimutkaisiin säteilevä teknologioita ja syvä seuraavan sukupolven sekvensointi [18,5]. Herkkyys ja spesifisyys analyysi ovat parantuneet paljon taittuu, koska alussa tutkimukset, mutta käyttötarkoitukset eri näytteenotto- materiaaleja ja menetelmiä cfDNA kvantifiointiin lisäksi ristiriidassa raportointia, ovat vaikeuttaneet pätevä tulosten vertailun eri tutkimuksissa. Viimeaikaiset edistysaskeleet teknisiä menetelmiä ovat antaneet meille mahdollisuuden kehittää erittäin herkkä qPCR menetelmä kvantifioida cfDNA Plasmanäytteissä, mikä on myös mahdollista laboratoriossa. Tämä on antanut meille mahdollisuuden tutkia biomarkkereiden potentiaalia cfDNA suuressa kohortissa syöpäpotilaiden ja terveillä verrokeilla.

tavoitteet Tämän tutkimuksen tavoitteena oli luoda normaalin cfDNA kohortin terveiden yksilöiden ja verrata tätä cfDNA alue kanssa neljästä eri ikäluokat sairastavista potilaista metastasoituneen kolorektaalisyövän. Lisäksi olemme tavoitteena oli validoida prognostinen arvo hoitoa edeltävälle tasolle ja cfDNA ja analysoida kasvaimen erityisiä

KRAS

mutaatioita plasmassa.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimuksen suunnittelu

yhteensä 100 terveiden ihmisten ja 229 metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilaat tutkittiin. Tutkimus suoritettiin mahdollisena biomarkkereiden tutkimuksen neljän peräkkäisen vaiheen II ja biologisten merkkiaineiden tutkimukset: setuksimabi tutkimus [11,20] mukaan TIRASMUS (ClinicalTrials.gov tunniste; NCT00827684, [12], PG (ClinicalTrials.gov tunniste; NCT01109615 [ ,,,0],13] ja GemCap (ClinicalTrials.gov tunniste; NCT01472770, [32] tutkimuksista on Syöpätautien, Vejle sairaala, Tanska, huhtikuusta 2005 marraskuussa 2012. Kaikkien neljän vaiheen II tutkimuksissa oli mukana potilaita, joilla kemoterapia tulenkestävää tautiin ja biologisten merkkiaineiden keräys oli prospektiivisesti suoritettu.

ensisijainen päätepiste oli korrelaatio cfDNA OS, toissijainen elinaika ilman taudin etenemistä (PFS) ja arviointi eroa terveiden verrokkien ja metastasoituneen kolorektaalisyövän potilaiden lisäksi korrelaatio kasvaimen KRAS (tKRAS) ja plasma KRAS (pKRAS) havaitseminen. tiedot esitetään mukaan REMARK ohjeiden.

Potilaat

kriteereillä kokeissa olivat samanlaisia: histopatologisesti varmistettu vaihe IV metastasoituneen kolorektaalisyövän, hoidon epäonnistuminen altistumisen jälkeen flouropyrimidine, oksaliplatiinia ja irinotekaania, merkintä kolmannen tai neljännen linjan hoidossa, ECOG-toimintakykyluokka (PS) 0-2, ja riittävä elintoiminnot.

KRAS

ja

BRAF

asema määräytyy sisällyttämistä TIRASMUS ja PG tutkimuksissa mutta ei Setuksimabi tai GemCap tutkimuksia.

RECIST versio 1.1 ja NCI-CTCAE version 4.0 olivat käytetään tutkia tutkittavien ominaisuuksien GemCap ja PG tutkimuksia, kun taas aikaisemmissa tutkimuksissa RECIST versio 1.0 ja NCI-CTCAE version 3.0 käytettiin.

Kaikki potilaat edellyttäen allekirjoitettu tietoinen suostumus ennen tutkimuksen alkaessa ja sääntely- ja etiikka komiteoiden (Tanskan lääkevirasto ja Maakunnan Tieteellinen eettisen komitean Southern Tanska) hyväksyi tutkimukset ennen alkamista. Kliiniset tutkimukset tehtiin noudattaen hyvää kliinistä suuntaviivoja antaman kansainvälisen konferenssin yhdenmukaistaminen ja Helsingin julistuksen.

Hoito

setuksimabi Study.

hoito käsitti irinotekaania (350 mg /m

2) kolmen viikon välein, viikoittain 250 mg /m

2 setuksimabin (aloitusannos oli 400 mg /m

2), kunnes etenemiseen tai kestämättömien haittavaikutusten. Response arviointi suoritettiin joka kolmannen syklin hoidon.

TIRASMUS.

Potilaat saivat hoidon mTOR-estäjä temsirolimuusia 25 mg joka viikko etenemiseen saakka. Tämän jälkeen potilaat hoidettiin yhdistelmähoidolla, joka käsittää puolikuukausijulkaisu irinotekaania (180 mg /m

2) ja viikoittain temsirolimuusille etenemiseen saakka tai hyväksyttävää myrkyllisyyttä. Response arviointi suoritettiin 6 viikon välein.

PG.

Potilaat saivat pemetreksedi- (aluksi 500 mg /m

2 q3w) + gemsitabiini (1250 mg /m

2, päivää 1 ja 8), kunnes etenemiseen tai kestämättömien haittavaikutusten. Response arviointi suoritettiin joka kolmannen syklin hoidon.

GemCap.

Potilaat saivat kapesitabiinia (2000 mg /m

2, päivät 1-7, q2w) yhdistettynä gemsitabiinin (1000 mg /m

2, päivä 1) etenemiseen saakka tai hyväksyttävää myrkyllisyyttä, ja vaste arvioitiin 12 viikon välein.

terve kontrolliryhmä

terve yksilö kohortti valittu Diabetes Biopankkiverkosto Vejle (hyväksymä Tanskan tietosuojavirasto (lehden nro. 2006-53-1385) ja Tanskan tieteellisen komitean (hanke ID S-20080097)).

Yksilöt valittiin perustuen ikäryhmissä, ja The National tanskalainen potilas rekisteri avattiin ICD-10 koodit varmistaa vähän merkittäviä yhteistyön sairastuvuus (ICD-10 C, D, I ja M-koodit). Tietoinen suostumus saatiin kunkin yksittäisen käytön verinäytteiden, ja tutkimus hyväksytty maakunnan tiede- eettinen komitea Etelä-Tanskan tästä ylimääräisestä markkerin analyysiä.

otanta Translaatiotutkimuksen tutkimuksiin

kokoelma primaarituumorin kudosten ja verinäytteitä translaatiotutkimuksen on tavanomainen käytäntö tutkimuksista meidän osastolla. Tietoon perustuvan suostumuksen, esikäsittely otettiin verinäytteet ennen ensimmäistä hoitosyklin aikana. Menetelmät kvantifiointiin cfDNA ja mutatoitunut

KRAS

alleelien plasmassa on aiemmin kuvattu [11], ja tietoja alukkeiden ja koettimien ovat saatavilla verkossa. Plasma saatiin verinäytteistä, EDTA-putkiin ja sentrifugoitiin 2000

g

10 min 2 tunnin kuluessa keräämisestä, ennen kuin se varastoidaan -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kaikki näytteet analysoitiin, sokkoutettu tutkimus päätepisteet.

DNA: n puhdistus

DNA puhdistettiin 1 ml plasmaa käyttäen QIAsymphony virus /bakteerit midi-kit on QIAsymphony robotin (Qiagen), mukaan valmistajan ohjeiden. DNA eluoitiin 110 ul. AVE puskuri, joka oli mukana sarjasta.

Soluvapaitakin DNA: n kvantifiointiin

tason määrittämiseksi cfDNA, määrä peptidylprolyl isomeraasi A (syklofiliinistä A) geeni (gCYC, Hugo geeni lyhenne PPIA) mitattiin in-house qPCR määritys kuten kuvattu [11]. Kokeet ajettiin dublicates tai kolmena rinnakkaisena ja 5 ui DNA: ta käytettiin kussakin 25 ul PCR-reaktioon. Kunkin PCR-allas genomista DNA: ta sisällytettiin positiivisena kontrollina ja veden negatiivisena kontrollina. Ansioluettelo gCYC perustuva määritys positiiviseen kontrolliin altaan määritettiin 19%. Veden tarkastukset ovat aina negatiivisia.

pohja- ja koettimia talon gCYC suunniteltiin käyttäen OLIGO 7 -ohjelmisto (Molecular Biology Insights Inc, Cascade, CO) (saatavana verkossa, sekvenssi hakunumero NG_029697.1). Forward-aluketta sijaitsee introni 1-2, koetin eksonin 2 ja reverse-aluketta intronissa 2-3 (Forward ACATGGGTACTAAGCAACAAAATAAG, Reverse CACAATTGGAACATCTTTGTTAAAC, Probe Fam-TTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCA-Tamra). BLAST Haku suoritettiin eikä epäspesifistä tavoitteita ennustettiin. Analyysi qPCR tietojen tehtiin käyttämällä SDS ohjelmistoa ver. 2.2.2 ja Cq-arvot määritettiin käyttäen automaattista lähtötilanteen asetusta ja kiinteä kynnys 0,2. Kvantifiointi cfDNA tehtiin laskemalla kopioluku

gCYC

alleelit kuin 10

y-leikkaus (gCYC) -mean Cq (gCYC) /kaltevuus (gCYC) ja normalisoida tämä plasman tilavuus.

KRAS mutaation havaitsemiseen ja kvantifiointiin

KRAS

analyysi arkistointia kasvainkudoksen välillä FFPE suoritettiin Setuksimabi tutkimuksessa FDA-hyväksytty

KRAS

DXS kit (Qiagen), kuten aiemmin on raportoitu. Kasvaimen näytteitä TIRASMUS, PG ja GemCap tutkimuksissa analysoitiin validoidun talon määrityksessä. In-house määritykset perustuvat Amplification Refractory Mutation System-Kvantitatiivinen PCR (ARMS-qPCR) menetelmät ja havaitsee 6 mutaatiot

KRAS

kodoni 12 (Gly12Ala, Gly12Arg, Gly12Asp, Gly12Cys, Gly12Ser, ja Gly12Val) ja yksi mutaatio kodonissa 13 (Gly13Asp). Alukkeita ja koettimia talon

KRAS

määrityksiä sekä

KRAS

mutaatio ohjaus PCR-fragmentit, suunniteltiin käyttäen OLIGO 7 -ohjelmisto (Molecular Biology Insights Inc, Cascade, CO) ( saatavilla verkossa, sekvenssi hakunumero NW_001838052.1). Määritys sijaitsee eksonissa 2. KRAS-geenin. -Analyysi suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Vertailu kahden menetelmän mutaation havaitsemiseksi kasvainkudoksessa on julkaistu aiemmin ja osoitti täydellistä sopimus [19] ja standardi käyrät ovat saatavilla verkossa materiaali [11]. Havaitsemisen herkkyys vaihteli 0,03% -0,001% riippuen mutaatio havaitaan, 12asp (1/200000, 0,0005%), 12Cys (1/200000, 0,0005%), 12ser 1/7000, 0,0143%), 13asp 1 /3000, 0,0333%), 12ala (1/100000, 0,0010%), 12val (1/200000, 0,0005%), 12arg (1/200000, 0,0005%), vastaavasti). Seosta, jossa on mutaatio positiivisen kontrollin fragmentteja ja genomista luovuttaja DNA Jokaisessa PCR ajon ja vesi negatiivisena kontrollina. Näyte puhdasta genomista luovuttaja-DNA liitettiin määrittämiseksi määritysten spesifisyyttä (esitetyt tiedot [11]). CV jokaista KRAS mutaatiokokeessa sekä gCYC määritys määritettiin saatujen tietojen perusteella PCR-analyysit jakson aikana 20 kuukauden ja olivat välillä 18% ja 32%. Veden tarkastukset ovat aina negatiivisia. Kvantifiointi

KRAS

tehtiin laskemalla kopioluku mutatoitunut

KRAS

alleelit kuin 10

y-leikkaus (KRAS) -mean Cq (KRAS) /kaltevuus (KRAS) ja normalisoi tämä plasman tilavuus.

tilastollinen

kuvaava vertailu cfDNA tasojen suoritettiin kaksipuolinen t-testi ja Wilcoxonin summa testi. Ylempi normaali raja määrittelemän keskimääräinen + 2 SD kontrolliryhmässä, käytettiin tutkivan cut-off-arvon säilymisen analyysiä. Kaplan-Meier menetelmää sovellettiin arvioitaessa PFS ja OS. Monimuuttujafunktiokehitettiin Coxin regressioanalyysi suoritettiin tutkia erilaisia ​​muuttujia, jotka heikentävät elinkelpoisuudesta, mukaan lukien cfDNA tasot ja testaus lähtötilanteen ominaisuudet (ikä, sukupuoli ja PS) kanssa mahdollisesti vaikuttaa (tunnetaan ennustetekijöiden tai merkittävä tai rajatapaus parametreja esimerkiksi p 0,02 ) eloonjäämiseen. Vastaanotin toiminta käyrä (ROC) analyysi käytettiin kuvaamaan suorituskykyä cfDNA ja pKRAS. P-arvot tarkoitettuja kaksisuuntaisia ​​testejä ja pidettiin merkittävinä, kun p ≤ 0,05. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen sävyä NCS tilasto-ohjelmalla 2007 v.07.1.5 (sävyä NCS Statistical Software, Utah 84037, USA, www.ncss.com).

Tulokset

Potilaan ominaisuudet

tauti ja esikäsittelyä potilaan ominaisuudet esitetään taulukossa 1. mediaani-ikä on koko kohortin potilaista oli 63 vuotta (vaihteluväli 35-82) ja suurin osa oli miehiä, enimmäkseen hyvää suorituskykyä tila. Ei ollut merkittäviä eroja iän, sukupuolen tai suorituskykyluokan välillä 5 ikäryhmät.

terveen yksilön ryhmä koostui 10 urosta ja 10 naarasta vuotiaista 25-44 vuotta, 20 urosta ja 20 naarasta vuotiaiden 45- 59 ja 60-75.

suurin osa potilaista sisältyvät tutkimuksissa oli käytettävissään verinäytteitä. Siten yhteensä 229 potilasta osallistui neljästä tutkimuksissa ja 223 oli saatavilla kasvain kudosten ja 211 Matching perustason plasma näyte. Puuttuvat tulokset johtuivat huonolaatuisia kasvaimen DNA tai riittämättömän määrän plasmaa näytteissä.

Soluvapaitakin DNA ja esikäsittely ominaisuudet

mediaani cfDNA tasot yksittäisten kohorteissa on esitetty taulukossa 1. Cell-free-DNA-tasot analysoitiin korreloi taudin ja esikäsittely ominaisuudet. Ei ollut merkittäviä eroja mediaani cfDNA tasoilla iän tai sukupuolen, mutta huomattavasti suurempi cfDNA pitoisuuksia yhä PS (taulukko 1).

Soluvapaitakin DNA syöpäpotilailla verrattuna terveisiin yksilöihin

keskimääräiset ja mediaani pitoisuudet cfDNA kontrolliryhmässä olivat 2800 ja 2400 alleelien millilitrassa plasmaa vastaavasti on alueella 800-14000 alleelien millilitrassa plasmaa. Mediaani taso cfDNA koko kohortin syöpäpotilaiden oli 17900 alleelien millilitrassa plasmaa (alue 800-4618400). Kuvio 1A havainnollistaa eroja cfDNA pitoisuudet plasmassa terveiden kontrollien ja perustason näytteet eri ikäryhmien syöpäpotilaita. Tiedot esitetään rasiakuvaajan arvojen logaritmisella asteikolla, ja tasot syöpäpotilailla olivat merkittävästi korkeammat kuin terveet kontrolliryhmän. Tasot cfDNA olivat samankaltaisia ​​ikäluokat syöpäpotilaita. Erot cfDNA olivat erittäin merkittäviä välillä kontrolliryhmän ja kaikkien yksittäisten ryhmien syöpäpotilailla (kaikki p-arvot olivat 0,0001). Valta syrjiä terveille henkilöille ja syöpäpotilaiden testattiin arvioimalla ROC ja käyrän alapuolinen alue (AUC) kuten on osoitettu kuviossa 1B. AUC oli 0,9486 (95% CI 0,9182-0,9679, p 0,00001).

kuvaa Box ja viiksi tonttien kanssa 25%, 50%, 75% persentiilit, ylempi ja alempi vierekkäisten arvojen ja harha (pistettä) . Vaakasuunnassa neljä kliinisen tutkimuksen kohortteja ja kontrolliryhmän, pystytasoon cfDNA keskittyminen logaritmisella asteikolla. C setuksimabi tutkimuksessa GemCap GemCap kohortti, PG PG tutkimuskohortissa, T TIRASMUS tutkimuskohortissa, Controls terve kontrolliryhmään. B Näyttää vastaanottimen toiminta käyrä (ROC) arvioimalla suorituskykyä cfDNA syrjiä peräsuolen syövän potilaiden ja verrokkien. AUC oli 0,9486, (95% luottamusväli +0,9182-0,9679, p 0,00001).

ennustetekijöiden arvo cfDNA syöpäpotilailla

Survival analyysin mukaan cfDNA tasot ovat esittelyyn erikseen yksittäisille syövän ryhmien kanssa ensisijaisen tutkimuksen tulosten kanssa [11-13]. Yhdistetty analyysi kaikista potilaista vahvisti lyhyempi kokonaiselossaoloaikaa noustessa lähtötilanteen cfDNA. Kuvio 2A havainnollistaa Kaplan-Meier -käyrät OS potilaiden jaettu neljään ryhmään mukaan kvartiileihin cfDNA tasoilla. OS potilaista luokiteltu matala tai korkea cfDNA pitoisuuden perusteella ryhmiin ylemmällä normaalin kontrolliryhmän (määritelty keskimääräinen cfDNA + 2 SD = 7100 alleelit per ml) on esitetty kuviossa 2B. Coxin monimuuttuja-analyysi mukaan lukien ikä ( / 63 vuotta), sukupuoli, PS ja cfDNA kvartiileihin (käsitellään jatkuvana muuttujana) vahvisti riippumaton ennusteen arvioinnissa on cfDNA koko kohortissa. Jatkuvana muuttujana oli OS riskisuhde 1,5 (95% CI 1,3-1,7) kullekin kasvuun cfDNA tasolla neljännekseen (taulukko 2).

. Potilaita on ryhmitelty kvartiileihin cfDNA (oikealta) alin, toiseksi pienin, toiseksi korkein ja korkeimman neljänneksen joukossa cfDNA. Mediaani OS mukainen cfDNA kvartiileja olivat; 10,2 kuukautta (95% CI 8,9-12,8), 7,8 kuukautta (5,7-9,3), 5,0 kuukautta (4,3-6,0) 3,5 kuukautta (3,0-3,9), vastaavasti. B. Potilaiden ryhmitellään ylempi normaalitasolle määrittelemien keskimääräinen cfDNA + 2 SD kontrolliryhmässä (7100 alleelit millilitrassa.) Matala riskiryhmään (täysi viiva), mediaani OS, 10,2 kuukautta (8,3-11,7). Korkean riskin ryhmässä (katkoviiva) mediaani 5,2 kk (4,6-5,9). HR 1,78, p = 0,0006.

Detection of KRAS mutaatioiden kasvain ja plasmanäytteissä

Kaikkiaan 211 potilasta oli sekä kasvain ja plasmanäytteiden saatavilla luotettavaa havaitsemista on

KRAS

mutaatioita. Plasma näytteet pieni määrä cfDNA alleelien ei ole jätetty pois analyysistä. Kasvaimen erityinen

KRAS

mutaatioita havaittiin yhteensä 119 plasmanäytteistä. Yleinen välistä yhdenmukaisuutta mutaatiostatusta kasvain ja plasma oli korkea: (180/211 = 85%) ja 112 140 kasvain näytteiden mutaatioiden osoitettiin

KRAS

mutaatiot plasmanäytteiden liian, kun taas vain kolme tapausta havaittiin, joissa potilailla oli havaittavissa mutaatio plasmassa, mutta ei primaarikasvaimen.

Cell-free-DNA: ta ja korrelaatio kasvainspesifisen KRAS mutaatioita

korrelaatio määrä yhteensä cell vapaa DNA alleelit ja määrä mutatoitunut KRAS alleelien KRAS mutantti potilaat analysoitiin Spearmanin. Koska monenlaisia ​​määrällistä tasoa Logaritmiasteikolla käytettiin. Kuten näkyy kuviosta 3, joka kuvaa solu vapaa DNA pystysuoraan ja määrä mutatoitunut KRAS alleelien vaakasuoraan nämä olivat korreloivat voimakkaasti Kuvio 3 (r

2 = 0,97, Spearmanin = 0,86, p 0,000). Tämä vahvistaa alustavat tiedot setuksimabin tutkimuksen [11), ja osoittaa, että merkittävä osa cfDNA peräisin kasvain DNA (jota edustaa DNA kasvaimen erityisiä KRAS mutaatioita) B

Tämä juoni kuvaa voimakas korrelaatio välillä kokonaismäärä DNA alleelien ja määrä mutatoituja alleeleja, että potilailla, joilla on KRAS mutaatioita havaittu. Spearmanin laskettiin 0,86 ja r

2 = 0,97 (

p

0,0000). Eri symbolit edustavat yksittäiset ikäluokat syöpäpotilaita. (Square PG korrelaatio = 0,9, ympyrä setuksimabi korrelaatio = 0,88, kolmio GemCap korrelaatio = 86, viisikulmio TIRASMUS korrelaatio = 0.67).

Keskustelu

Lisääntynyt keskittyminen translaatiotutkimukseen ja viimeaikainen tekninen kehitys on antanut uutta tietoa kliinistä merkitystä cfDNA syövän ja sen mahdolliset havaitsemiseksi kasvaimen mutaatioiden ääreisverenkierron.

mittana kokonaismäärästä cfDNA, tässä tutkimuksessa tutkittiin useissa alleelien syklofiliinistä geeni, ja vahvisti korkeammaksi, metastasoitunutta kolorektaalisyöpää potilailla kuin terveillä verrokeilla. Haku samanlaista tutkimusta paljastaa ristiriitaisia ​​tuloksia; kuitenkin eroja tutkimuslääkkeiden menetelmiä tehdä suoria vertailuja vaikeaksi. Yleensä on suuria vaihteluja, että sovellettu menetelmä DNA: n puhdistamiseen, viittaus geeni mitattiin ja ikäluokat tutkittujen yksilöiden. Kuitenkin muutamia tutkimuksia CRC potilaat eivät tue meidän data [21-24]. Erittäin tuoreen tutkimuksen selvitti monikäyttöinen hyödyllisyyttä kiertävästä plasman DNA potilailla, joilla on pitkälle edenneitä syöpiä käyttämällä eri menettelytapaa, joka osoittaa yleensä korkeampi cfDNA CRC, rinta-, eturauhas- ja muiden syöpien kuin terveillä verrokeilla [8]. Kuitenkin otoskoko että tutkimus ei salli perustamista normaalitasolle (n = 20), mutta sen tulokset eivät tue esillä data. Äskettäinen havainto paikallisesti edenneessä peräsuolen syöpä, vaikka käytetään eri mittausmenetelmä cfDNA, paljasti myös huomattava ero cfDNA tasojen valvontaa ja alkuvaiheen peräsuolen syöpä [25]. Kyky syrjiä cfDNA tasojen meidän peräsuolen syövän potilaiden ja terveiden kontrollien oli erinomainen, tukevat tarvetta lisätutkimuksia cfDNA aiemmissa kasvain vaiheessa ja syövän esiasteita. Lisäksi vaihtelu cfDNAin yksilöiden ei-syöpä oheissairaudet on vielä selvitetty, tilille mahdollinen harha. Tässä tutkimuksessa korostetaan myös tärkeä biologinen rooli cfDNA tässä sairaudessa. Kohonneen cfDNA syöpäpotilailla ja korrelaatio, jossa on useita mutatoituja alleeleja osoittavat myös, että cfDNA on suurelta osin kasvaimen johdettu, vaikka alkuperä on edelleen määrittämättä.

On tarpeen lisävälineitä parempi valinta potilaita hoidon raskaasti esikäsitellä metastasoituneen kolorektaalisyövän. Neljässä peräkkäin suoritettu kliinisen vaiheen II tutkimuksissa olemme vahvistaneet yhtenäinen taso cfDNA ja selkeää ennusteen arvioinnissa.

Hiljattain julkaistu tutkimus ryhmämme on havainnollistanut, että cfDNA ei ole pelkkä mitta kasvaintaakkaa [ ,,,0],26]. Sen sijaan ehdotamme, että koko cfDNA on todennäköisemmin heijastavat sekä kasvaintaakkaa ja biologisten mekanismien ja siten monimutkaisempi kuva taudin jossain vaiheessa. Samankaltaisuus lähtötasot näiden neljän vaiheen II tutkimuksissa havaitsimme havainnollistaa homogeenisuus potilaiden ikäryhmät. Potilaat olivat kaikki valitut perustuvat totta kemoterapia tulenkestävää tila sijaan riviä hoidon, joka voi vaihdella määritelmiin ja aiemman hoidon strategioita, ja on siten vähemmän tarkkaa määritelmää pitkälle taudin. Vertailu meidän kohortteja ja myöhempi yhdistäminen tietojen vuoksi perusteltua, koska myös tukee monimuuttujamenetelmin. Tutkimus kemoterapiaa hoitamattomilla potilailla tulisi keskittyä tulevaisuudessa tutkimuksia.

Korkeampi lähtötasot olivat vahvasti huonon ennusteen, ensimmäinen kun analysoidaan yksittäisissä faasin II tutkimuksissa, toinen kun arvioidaan mukaan kvartiileihin cfDNA tasojen koko CRC kohortti, ja lopulta kun jaettu korkean ja matalan pitoisuuden perusteella ryhmiin suurimman cfDNA tasoa terveillä henkilöillä. Lisäksi teknologisen analyysi mahdollisti luotettavan Monimuuttuja-analyysissä, jossa vahvistettiin voimakkaasti ennustetekijöiden vaikutus cfDNA jatkuvana parametri. Prognostisia arvo cfDNA on kuvattu erilaisten syöpien, mutta vain harvat suhteessa kemoterapiaa [15-16, 27]. Hiljattain julkaistu raportti Perkins ym hyväksyy tietomme ja on yksi harvoista joissa tutkitaan cfDNA hoidetuilla potilailla pitkälle syöpä [8].

Therapy for CRC varmasti kehittää edelleen kohti kohdistaminen yksittäisen molekyyli- ominaisuudet tauti. Kuitenkin kasvain heterogeenisyys, genomin epästabiilisuuden, ja klonaalisen molekyylievoluutio paikka suuria vaatimuksia tarkka ja oikea-aikainen luonnehdinta. Performing toistuva kasvainbiopsioissa on tehty, mutta on hankalaa ja johon liittyy potilaalle. Käyttämällä plasma nestemäisenä koepala mutaatioanalyysiä havaitsemiseen on monia etuja ja sillä voitaisiin ratkaista ongelmat, jotka liittyvät toistuvat kasvainbiopsioissa. Toistuva testaus hoidon aikana on helppo tehdä ja nykyinen menetelmä havaitsemiseksi kehitetään

KRAS

mutaatioita on mahdollista, suhteellisen halpa, nopea ja voidaan suorittaa laajamittainen pohjalta. Kuitenkin, esillä oleva qPCR tekniikka sallii vain rajoitetun määrän PCR-reaktiot suoritetaan näytettä kohti. Koska

KRAS

on hallitseva kliininen vaikutus ja korkea taajuus metastasoitunutta kolorektaalisyöpää tämä lähestymistapa on edelleen mahdollista, kun taas menetelmät, kuten seuraavan sukupolven sekvensointi voi tulla ajankohtaiseksi, jos useita mutaatioita mahdollisten kliinistä merkitystä ja käytettävissä tavoitteet paljastuvat. Kuitenkin tällä kertaa, yksinkertainen ja toteuttamiskelpoinen menetelmä näiden tutkimusten tuntuu järkevin lähestymistapa, etenkin kun otetaan huomioon se, että riittävä otoskoot luotettavia kliinisiä tutkimuksia ovat äärimmäisen tärkeitä.

havaitsemismäärä kasvainspesifisten mutaatiot plasmassa riippuu spesifisyys ja herkkyyttä, joka voidaan lisätä ennen analyysin monistusvaiheita, sekä määrä cfDNA näytteessä. Jälkimmäinen voidaan voittaa lisäämällä alkuperäisestä määrästä plasmaa analysoitu. Nämä näkökohdat on otettava huomioon käsiteltäessä välistä yhdenmukaisuutta primaarikasvaimen ja plasma mutaatio asema, joka oli korkea meidän menetelmällä verrattuna muutamia asiaa koskevien tutkimusten kirjallisuudessa [28-30]. Syyt ristiriita sisältyy mahdollinen huono laatu DNA uutetaan parafiiniin arkistointia kasvainkudoksen, tai todellinen sairaus heterogeenisyys ja klonaalisen molekyylievoluutio aikana useita rivejä hoidon.

On kliinisesti merkittävää tutkia, p

KRAS

voidaan käyttää valintaperusteena EGFR-estäjää sijaan t

KRAS

havaitsemiseen. Esillä data ja vastaavan edellisen raportin [31] viittaavat siihen, että p

KRAS

asema on vahva ennustearvo tässä asetelmassa. Tämä koskee myös ikäluokat meidän potilaalla, joita ei ole hoidettu EGFR: n estäjien. Tulokset kuitenkin meidän pienet ei-satunnaistetussa tutkimuksessa olisi tulkittava varovaisesti ja lisätutkimuksia suurempi otoskoko, mieluiten satunnaistetussa tutkimuksessa, ovat perusteltuja.

Olemme toimittaneet testi ja validointi ikäluokat, joilla on riittävä otoskoot monimuuttuja analyysi ennusteen arvioinnissa sekä määritelmä normaalin cfDNA. Tämä tutkimus vahvistaa ennustetekijöiden hyödyllisyyttä cfDNA plasmassa ja toteutettavuus mutaatioanalyysiä testausta esitetyn menetelmän. Vaadimme ponnisteluja vertailla, vahvista ja takautuvasti roolin tutkimiseksi cfDNA kvantifiointiin syövän, yleisen näkökulmasta kääntää tulokset otetaan kliinisen hoidon potilailla, joilla on edennyt syöpä sairaudet.

Kiitokset

Kiitämme tutkimusneuvosto, Lillebaeltin sairaala, Asta og Peter Götz-Petersens Fundation, ja Novo Nordisk Foundation rahoitusta tutkimuksen.