Krooninen sairaus

tiivistelmä

On yhä enemmän todisteita siitä, että toiminnallinen ylikuulumisen GPCR: ja EGFR edistää etenemistä koolon-, keuhko-, rinta-, munasarja-, eturauhas- ja pään ja kaulan kasvaimia. Tässä tutkimuksessa olemme suoritetaan useita analyysejä GPCR ilmentymisen gefitinibin kestävä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinja, H1975, joka satamat L858R /T790M mutaatio. Ekspression määrittämiseksi profiilia mRNA koodaa 384 GPCR: ien normaaleissa ihmisen keuhkojen fibroblastin (NHLF) ja H1975-soluja, GPCR-spesifinen microarray-analyysi suoritettiin. Lämpöä kartta mikrosirun paljasti huomattavia eroja ilmaus GPCR: välillä NHLF ja H1975 soluja. Vuodesta GPCR ilmaisun luettelosta, valitsimme joitakin GPCR-agonistit /antagonisti tutkia kunkin ligandit voivat vaikuttaa kasvuun H1975 soluja. Niistä hoito joko selektiivinen adenosiini A2a-reseptoreita, jotka olivat erittäin ilmaistaan ​​H1975 solussa ja toinen gefitinibin kestävä NSCLC-solut, HCC827GR soluja tai ”Sirna” (siRNA) kohdistaminen adenosiini A2a-reseptoreita tuotti merkittävän vähenemisen solussa elinkelpoisuus sekä H1975 ja HCC827GR soluja. Niistä säädelty GPCR: ien in H1975 soluissa, GS-, Gi- ja Gq kytketty GPCR: t ilmaistiin lähes yhtä. Niistä alassäädetty GPCR: ien, Gi-kytketyn GPCR: t olivat vallitsevasti ilmaistu H1975 soluissa. Esillä olevat tulokset viittaavat siihen, että monikerroksinen ylikuulumisen GPCR: t ja EGFR voi olla tärkeä rooli orchestrating loppupään molekyylejä, jotka osallistuvat kehittämiseen gefitinibin vastustuskykyisten NSCLC.

Citation: Kuzumaki N, Suzuki A, Narita M, Hosoya T, Nagasawa A, Imai S, et ai. (2012) Multiple analyysit G-Protein reseptorin (GPCR) ilmentäminen kehittämiskeskus Gefitinibin-Resistance in Transforming Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (10): e44368. doi: 10,1371 /journal.pone.0044368

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu 10 syyskuuta 2011; Hyväksytty: 02 elokuu 2012; Julkaistu: 29 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Kuzumaki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on johtava kuolinsyy syöpään. Vaikka kemoterapia voi hieman pidentää elinaikaa potilailla, joilla on pitkälle edennyt tauti, se liittyy myös kliinisesti merkittäviä haittavaikutuksia [1]. Epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), on tärkeä kohde molekyyli anti-NSCLC hoito [2]. Gefitinibi tavoitteet ATP halkeama tyrosiinikinaasiperheen EGFR, joka on yli-ilmentynyt 40-80 prosenttia NSCLC ja monet muut epiteelisyövissä [3]. EGFR signalointi laukaisee sitoutumisen kasvutekijöiden, kuten EGF: n, joka johtaa joko dimerointi EGFR molekyylien tai heterodimerisaatio ja siihen liittyvät reseptorit, kuten HER2. Autofosforylaation ja transphosphorylation sekä poikkeavien eGFR-arvojen kautta tyrosiinikinaasi domeenien rekrytoi myötävirtaan efektoreja ja aktivoi signaalit lisääntymistä ja solujen eloonjääminen [4]. Mutaatioita on tunnistettu EGFR geenin näytteitä potilailta, NSCLC jotka reagoivat EGFR: n estäjien [5]. Nämä mutaatiot koostuvat pieniä deleetioita, jotka vaikuttavat aminohapot 746 kautta 750 (delE746-A750) tai pistemutaatioita (useimmiten leusiini korvataan arginiini kodonissa 858 [L858R]) [6], [7], [8]. Nämä mutaatiot muuttavat alavirran signalointia ja antiapoptoottisten mekanismeja, ja siten välittää kasvaimia aiheuttavalle vaikutukselle [9]. Molemmat mutaatiot tekevät kasvaimen herkempiä yhdisteitä, jotka estävät EGFR, todennäköisesti sijoittamalla kriittiset tähteet, jotka ympäröivät ATP-sitoutumisen halkeamaa tyrosiinikinaasidomeeniin reseptorin, joka stabiloi vuorovaikutusta sekä ATP: n että sen kilpailevat inhibiittorit [6] [7]. Meidän tapauksessamme, DNA sekvensointi EGFR geenin Tuumorinäytteiden malli on uusiutumisen osoitti toisen pisteen mutaatio, joka muutti treoniinin metioniini asemassa 790 (T790M) EGFR [5]. Teho gefitinibi on määräaikainen, lähinnä lääkeresistenssi myönnetty toinen pistemutaatio.

aktiivisuus Akt, joka tunnetaan myös nimellä proteiinikinaasi B (PKB), stimuloidaan erilaisia ​​kasvutekijöitä ja tämä seriini-treoniinikinaasi lähettää evoluutiossa konservoituneen rooleja monissa solun toimintoja, kuten proteiinien synteesiä ja solujen kasvua [10], [11]. On raportoitu, että EGFR estäjä muuttuu vahva, ohimenevä Akt fosforylaation heikko, jatkuva Akt fosforylaation. Johtuen alipäästösuodattimen ominaisuudet Akt-reitin, tämä johtaa siihen, että vahvempi fosforylaation S6, joka on molekyyli, alavirtaan Akt, kuin että ilman estäjää. Näin ollen, EGFR-inhibiittorin voisi toimia alavirran aktivaattori EGFR [12]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että prosessi gefitinibin vastus johtaa pahenemista syöpäsoluja.

suuri määrä todisteita osoittaa, että G-proteiini-reseptorien (GPCR: t) on ratkaiseva rooli kasvainten synnyssä, ja ovat sekaantuneet tärkeitä vaiheita syövän etenemistä muutosta, kasvua ja selviytymistä etäpesäkkeiden. Toinen tärkeä tapa, että GPCR: ien edistävät kasvaimien syntyyn liittyy intensiivinen ylikuulumisen kanssa kanoninen polku. On paljon todisteita siitä, että agonistit joidenkin GPCR: ien läpi kutsutaan transaktivaatiota, voi aktivoida kasvutekijän reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t) ilman lisättyä kasvutekijää [13], [14], [15]. Tämä on tärkeä polku, joka edistää kasvua edistävää aktiivisuutta monia GPCR ligandien. Toisaalta, viimeaikaiset havainnot ovat osoittaneet, että RTK välittää signaaleja käyttämällä GPCR molekyylejä ja RTK ligandit voivat itse transaktivoimaan GPCR: iä. Välittävän kasvain selviytymisen ja proliferaation, GPCR: t voivat olla vuorovaikutuksessa EGFR alavirran signalointireittejä, kuten fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /Akt, ja Janus-kinaasi /signaalimuunta- ja aktivaattorien transkription (Jak /Stat3) reittejä. Itse asiassa, toiminnallinen välinen ylikuuluminen GPCR: t ja EGFR edistää etenemistä koolon-, keuhko-, rinta-, munasarja-, eturauhas- ja pään ja kaulan kasvaimia, [16], [17]. Siten GPCR voi olla erinomainen sivusto esto tuumorigeenisia signaaleja, mikä tekisi GPCR-välitteisen toiminnot lupaavia terapeuttisia kohteita lääkekehityksessä saavuttaa innovatiivisia puuttumista NSCLC. Tässä tutkimuksessa, suoritimme useita analyysejä GPCR ilmentymistä gefitinibiä kestävä NSCLC solulinjaa, H1975.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen ei- pienisoluinen keuhkosyöpä solun (NSCLC) linjat HCC827, NCI-H1975 (H1975; American Type Culture Collection Co., MD, USA) ja HCC827GR viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa HEPES Modification (Sigma-Aldrich Co., MO, USA) 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Invitrogen ™ Life Technologies Co., CA, USA) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (PS; Invitrogen ™ Life Technologies Co.). Normaalit ihmisen keuhkojen fibroblasteja (NHLF; Lonza Inc., NJ, USA) viljeltiin fibroblastien Peruselatusaineen insuliinin, rhFGF-B, GA-1000 ja FBS (kaikki Takara Bio Inc., Tokio, Japani). Kaikki solut ylläpidettiin kostutetussa atmosfäärissä, 5% CO

2 37 ° C: ssa.

perustaminen gefitinibin vastustuskykyisten solulinja, HCC827GR

HCC827 solut altistettiin 1 uM gefitinibin 48 h elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Sitten ne pestiin ja viljeltiin huumeeton väliaineessa asti elossa solut olivat 80% konfluentteja. Nämä solut altistetaan uudelleen kasvavia pitoisuuksia gefitinibin (1-5 uM). Solut vihdoin kasvamaan 5 uM gefitinibin saatiin 1,5 kuukautta sen jälkeen, kun ensimmäisen valotuksen. Perustettu resistentit solut pidettiin elatusaineessa, joka sisälsi 1 uM gefitinibin. Kaikille in vitro -tutkimuksissa, resistenttejä soluja viljeltiin lääkkeettömässä väliaineessa vähintään 1 viikko eliminoimiseksi gefitinibi. Gefitinibin-resistenttejä soluja kutsutaan HCC827GR.

Reagenssit

käytetyt reagenssit esillä olevassa tutkimuksessa olivat gefitinibin (Toronto Research Chemicals Inc., Kanada), [Arg

8] – vasopressiini asetaattisuola (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), angiotensiini II (Sigma Chemical Co.), 2- (metyylitio) adenosiini-5′-trifosfaatti tetranatriumsuola hydraattia (Sigma Chemical Co.), beraprostinatrium ( Toray Industries Inc., Tokio, Japani), a-metyyli-5- (2-tienyylimetoksi) -1 H-indoli-3-etaaniamiini monohydrokloridi (BW723C86; Sigma Chemical Co.), 2-

p

– ( 2-karboksietyyli) fenetyyli–5′-N-etyylikarboksiamidoadenosiini hydraatti (CGS- 21680; Sigma Chemical Co.), 7- (2-fenyylietyyli) -5-amino-2- (2-furyyli) – pyratsolo [4, 3-e] -1,2,4-triatsolo [1,5-c] pyrimidiini (SCH-58261; Sigma Chemical Co.).

solunelinkykyisyysmääritys

Solut elinkyky määritettiin jonka 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-liumbromidi (MTT). Kaksikymmentä ui MTT-liuosta (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan elatusaineesta. Kun oli inkuboitu vielä 2 tunnin ajan, väliaine poistettiin, ja 100 ui DMSO: ta lisättiin ratkaisemiseksi formatsaanikiteet. Optinen tiheys mitattiin tehty käyttämällä mikrolevyn lukijaa absorptio aallonpituudella 600 nm. Kussakin kokeessa kolmea rinnakkaista valmistettiin kutakin näytettä kohden. Osuus elävien solujen määritettiin perustuen absorbanssieroa välillä ja kontrollit.

GPCR TaqMan Array

Kaupallisesti saatavissa TaqMan Array Human GPCR kortti (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA), jonka avulla voimme määrittää ilmaus mRNA: iden, jotka koodaavat GPCR: 50 subfamilies (343 reseptorit, ei hajusteeton, haju-, maku- ja feromoni reseptorit), käytettiin RNA: ta NHLF ja H1975 soluja. Kokonais-RNA, joka on saatu NHLF ja H1975-soluja, uutettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems Inc.). Tässä määrityksessä cDNA valmistettiin suuren kapasiteetin RNA cDNA-kittiä (Applied Biosystems Inc.). Jokainen portti täytettiin cDNA (1,5 ug RNA) ja TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems Inc.) mukaan valmistajan ohjeiden. Levy analysoitiin SDS2.3 ja RQ Manager 1.2 ohjelmisto tarjoaa Applied Biosystems. Jaksoajat normalisoitiin aaato taloudenhoito geeni GAPDH. Vertaileva Ct lähestymistapaa käytettiin määrällisesti suhteellisen mRNA käyttäen RQ 1.2 ohjelmistoa. Suhteellinen ekspressiotasoja laskettiin 2 x 10

5. Lasketaan kunkin GPCR tutkittiin, ja jos näyte oli laskettu kynnys alle 0,1, katsottiin olevan huomaamaton. Näissä tapauksissa tietojen käsittelyyn tarkoituksiin, sykli määrä asetettiin 35,0.

RNA: n valmistaminen ja semikvantitatiivinen analyysi käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Yhteensä-RNA in NHLF, H1975, HCC827 ja HCC827GR uutettiin käyttämällä SV Yhteensä RNA: n eristäminen (Promega, Madison, WI) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puhdistettu kokonais-RNA kvantitoitiin spektrofotometrisesti A260. Valmistamiseksi ensimmäisen juosteen cDNA: ta, 1 ug RNA: ta inkuboitiin 100 ul: aan puskuria, joka sisälsi 10 mM ditiotreitolia, 2,5 mM MgCl

2, dNTP seosta, 200 U käänteistranskriptaasi II (Invitrogen), ja 0,1 mM oligo-DT12 -18 (Invitrogen). Kukin geeni monistettiin 50 ul: n PCR-liuosta, joka sisälsi 0,8 mM MgCl

2, dNTP seos, ja DNA-polymeraasin kanssa syntetisoitiin alukkeita ihmisen A2a (sense: GGCTGCCCCTACACATCATCAACT, antisense: TGGGCCAGGGGGTCATCT) ja GPR87 (sense: 5′-CTCTAAAGGGGTAAGGGAGA -3 ’, antisense: 5′-TGGGTTCAGCATAGGTTATT-3’). Näytteitä kuumennettiin 95 ° C: ssa 1 min, 55 ° C 2 min, ja 72 ° C 3 min. Loppuinkubaatio oli 72 ° C: ssa 7 min. Seos ajettiin 2% agaroosigeelielektroforeesilla, jossa on esitetty markkereita ja alukkeita sisäinen standardi glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi. Agaroosigeeli värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin UV-läpivalaisulla. Intensiteetti bändejä analysoitiin ja puoliksi kvantifioida tietokoneavusteisen densitometrian käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Näytteiden valmistus ja Western blotting

Solut liukoisiksi, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7 0,4), 0,3% (w /v) Triton, 3 mM MgCI

2, 1 M sakkaroosia, 5 mM α-ME, ja 1/1000-inhibiittorin 15 min. Solulysaatit sentrifugoitiin 2350 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti säilytetään lysaatin osa Western blottauksella. Näytteen erä laimennettiin yhtä suurella tilavuudella 2 x elektroforeesin näytepuskuria (Protein Gel Loading Dye-2X, Amresco, Solon, OH), joka sisälsi 2% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) ja 10% glyserolia 0,2 M ditiotreitolia. Proteiinit (7 ul /kaista) erotettiin koon 4-20% SDS-polyakryyliamidigradienttigeellä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille Tris-glysiini-puskuria, joka sisälsi 25 mM Tris ja 192 mM glysiiniä. Sillä immunoblot havaitsemiseksi, kalvoja blokattiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 1% rasvatonta maitoa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), joka sisälsi 0,1% Tween 20 (Research Biochemicals, Inc., MA, USA) 1 h huoneen lämpötilassa sekoittaen. Kaivoa inkuboitiin primääristen vasta-ainetta laimennettuna TBS [1:1000 GPR87 (Abcam, Cambridge UK), 1:200,000 glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA)], joka sisälsi 1% rasvatonta maitojauhe 0,1% Tween 20: ssa yön yli 4 ° C: ssa. Membraani pestiin TBS: ssä, joka sisälsi 0,05% Tween 20 (TTBS), ja sitten inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA) laimennettuna 1 :10,000 TBS, joka sisälsi 1% rasvatonta kuivattua maitoa, joka sisältää 0,1% Tween 20. tämän inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin TTBS: llä. Antigeeni-vasta-peroksidaasi-kompleksi lopulta havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Pierce, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden ja visualisoitiin altistuminen Amersham Hyperfilm (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, USA).

”sirna” (siRNA) transfektion

H1975 ja HCC827GR solut transfektoitiin kaupallisesti saatavilla ”pieni häiritsevä RNA” (siRNA) kohdistaminen adenosiini A2a-reseptoreita (NIPPON EGT CO., Toyama, Japani) seuraavissa käänteinen transfektion menetelmällä. Vastaava kohde-mRNA-sekvenssi adenosiini A2a varten siRNA oli seuraava: 5′-ACAGCAACCTGCAGAACGT-3 ’, (hakunumero: NM_000675.4). Lyhyesti, adenosiini A2a geenispesifiseen siRNA laimennettiin Opti-MEM (Invitrogen) ja sekoitetaan RNAimax (Invitrogen) esilaimennettua Opti-MEM. 20 minuutin kuluttua inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa, kompleksit lisättiin 96-kuoppaisen. Sen jälkeen solut (5 x 10

3 solua) ympättiin että hyvin. 3 päivän kuluttua kulttuurin, solujen elinkykyisyys havaittiin MTT-määrityksellä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± S.E.M. Tilastollista merkitsevyyttä ryhmien välisiä eroja arvioitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Bonferronin /Dunn monivertailutestillä. Tilastollinen merkitys erot kahden ryhmän arvioitiin Studentin

t

-testissä.

Tulokset

vaikutus tyrosiinikinaasin estäjä gefitinibin kasvuun ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin

lisääminen tyrosiinikinaasin estäjä gefitinibin (0,0001 uM-1 uM) ja HCC827 soluja, jotka on luokiteltu gefitinibin herkkä NSCLC solulinja [5], ja 2 päivää tuotettu pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä kasvainsolujen kasvua (kuvio 1a-i, p 0,001 vs. ei-käsitellyssä ryhmässä). Sen sijaan lisäämällä gefitinibin (0,0001 uM-1 uM) ja 2 päivää ei vaikuttanut kasvua H1975-soluja (kuvio 1a-ii).

HCC827 (a) tai H1975 (b) soluja inkuboitiin 2 päivää gefitinibin, ja sitten solujen elinkelpoisuus mitattiin (*** p 0,001 vs. ei-käsiteltyyn ryhmään).

Eri ilmaus GPCR: välillä NHLF ja H1975 solujen

profiiliin ilmentymisen mRNA, joka koodaa 384 GPCR: in NHLF ja H1975-soluja, TaqMan GPCR-spesifinen mikrosiruanalyysi suoritettiin (kuviot 2, 3, kuviot S1-1, S1-2, S1-3 varten luetteloa GPCR geenien array). Sirontakuvaajaan osoitti, että oli paljon enemmän sääteli GPCR: ien kuin alassäädetty GPCR: ien in H1975 soluissa verrattuna NHLF. Lämpöä kartta mikrosirun paljasti huomattavia eroja ilmaus GPCR: välillä NHLF ja H1975 solut (kuviot 2, 3).

Ihmisen GPCR ilmentyminen analysoitiin mikrosiruja.

Jokainen GPCR näkyy yksi pylväs, joka perustuu niiden Ct-arvoja ja värikoodit näkyy alla, joiden kaltevuus vihreästä (negatiivinen ja alin Ct-arvoja) punaiseen (positiivinen ja korkein Ct-arvot).

muutoksia ilmaus suhteiden Ga-alayksiköiden (Gs, Gi ja Gq) vuonna H1975 soluissa

ilmaisu malleja Ga-alayksiköiden kesken ylä- tai alassäädetty GPCR: ien on H1975 solujen verrattuna NHLF jaettiin seuraaviin ryhmille: säädelty Gs-kytketty GPCR (taulukko 1-a), säädelty Gi-kytketyn GPCR (taulukko 1-b), säädelty Gq-kytketyn GPCR (taulukko 1-c), alassäädetty Gs-kytketty GPCR (Taulukko 2-a), alassäädetty Gi-kytketyn GPCR (Taulukko 2-b) ja alassäädetty Gq-kytketyn GPCR (Taulukko 2-c).

mRNA ja sen proteiini ilmauksia GRP87, joka oli kaikkein säädelty GPCR löytyy GPCR array, oli merkitsevästi säädellään ylöspäin H1975 soluissa verrattuna vuonna NHLF soluissa (Kuva 4a: p 0,01 vs. NHLF, Kuvio 4b: p 0,001 vs. NHLF). (B) Ylempi: edustaja Western blotit GPR87 Ala: edustaja Western blotit GPR87 vuonna membranous murto H1975 soluja. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM 3 riippumatonta näytettä (** p 0,001 vs. ei-käsiteltyyn ryhmään).

joukossa säädelty GPCR: ien in H1975 soluissa, GS-, Gi- ja Gq kytketty GPCR: t ilmaistiin lähes yhtä . Niistä alassäädetty GPCR: ien, Gi-kytketyn GPCR: t olivat vallitsevasti ilmaistaan ​​H1975-soluissa (kuvio 5).

prosenttiosuus ekspressiokuvio Ga alayksikköä (Gs: punainen, Gi: sininen ja Gq: vihreä) on ylä- tai alassäädetty GPCR: ien on H1975 solujen verrattuna NHLF näkyy.

Effects of selektiivinen GPCR agonisti tai antagonisti kasvuun gefitinibin vastustuskykyisten H1975 solujen

Valitse GPCR ilmaisu lista, jotkut kaupallisesti saatavilla GPCR /antagonisti on valittu tutkia, onko vastaavien ligandien vaikutusta kasvuun H1975-soluja (kuvio S2). Adenosiini A2a (CGS-21680), angiotensiini II -reseptorin-like-1-agonistin (angiotensiini II) ja purinerginen reseptorin P2Y G-proteiiniin kytketty 2-agonistin (2- (metyylitio) adenosiini-5′-trifosfaatti tetranatriumsuola hydraatti), joka olivat kaikki agonistit säädelty GPCR: ien on microarray luettelossa, ei ollut mitään vaikutusta kasvaimen solujen kasvua. Vastaavasti solujen kasvua eivät vaikuttaneet prostaglandiini I

2-reseptori (IP) agonisti (beraprostinatrium), 5-hydroksitryptamiini-reseptorin 2B agonisti (BW723C86) ja arginiinivasopressiinillä reseptorin 1A agonistia ([Arg

8] -vasopressiinin asetaatti suola), jotka kaikki on luokiteltu ”alassäädetty GPCR: ien”. Sen sijaan lisäämällä selektiivinen adenosiini A2a-reseptorin antagonisti SCH-58261 (10 nM-10 uM) ja 7 päivää (kuvio 6a) tuotti konsentraatiosta riippuvaisen lasku H1975 solujen kasvua (p 0,01, s 0,001 vs. ei- käsitelty ryhmä).

(a) H1975-soluja inkuboitiin 7 päivää kanssa selektiivinen adenosiini A2a-reseptorin antagonisti SCH-58261 (10 nM-10 uM), ja sen jälkeen solujen elinkelpoisuus mitattiin (** p 0,01 , *** p 0,001 vs. ei-käsitelty ryhmä). (B) Käsittely siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptorien H1975 soluja 3 vuorokautta merkittävästi vähentynyt solujen elinkelpoisuutta H1975 solujen (** p 0,01 vs. ei-käsiteltyyn ryhmään).

vieressä suoritetusta transdusoivat siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptorien osaksi H1975-soluissa. Solut kerättiin havaitsemiseksi adenosiini A2a mRNA-tasolla semi-kvantitatiivisesti RT-PCR: llä 72 h transfektion jälkeen. Adenosiini A2a-reseptorin ilmentymisen läsnä ollessa siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptoreihin alassäädetty 90% verrattuna ei-hoitoon (tietoja ei esitetty). Näissä olosuhteissa hoito siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptoreita tuotti merkittävän vähenemisen H1975 solujen kasvua (kuva 6b: p 0,001 vs. ei-käsiteltyyn ryhmään).

rooli adenosiini A2a-reseptorien kasvuun gefitinibin kestävä HCC827GR solut

vahvista toiminto adenosiini A2a reseptoreiden gefiitnib-resistenssi NSCLC, me syntyy anaother gefitinibi kestävä HCC827GR solujen altistamalla HCC827 solujen kasvavia pitoisuuksia gefitinibin varten 1,5 kuukautta. Erään sekvenssianalyysi, HCC827GR solut oli toinen pisteen mutaatio, koska aiheutuu pääasiassa lääkeresistenssi, 2369 C T EGFR eksonissa 20-21, mikä johti siirtymiä Thr790Met (kuva 7a-i). Sen vuoksi, lisäksi gefitinibin (0,01 uM-1 uM) ja 2 päivää ei vaikuttanut kasvua HCC827GR solujen (kuva 7a-ii). Ilmaisu on adenosiini A2a mRNA dramaattisesti lisääntynyt HCC827GR soluissa verrattuna HCC827 ja NHLF soluja (kuvio 7b, p 0,001 vs. NHLF). Näissä olosuhteissa, selektiivinen adenosiini A2a-reseptorin antagonisti SCH-58261 (10 nM-1 pM) ja 7 päivää tuotti konsentraatiosta riippuvaisen lasku HCC827GR solujen kasvua (kuvio 7c, p 0,05, s 0,001 vs. ei-käsitelty ryhmä ). Lisäksi hoito siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptoreita tuotti myös merkittävä lasku HCC827GR solujen kasvua (kuvio 7d: p 0,001 vs. ei-käsiteltyyn ryhmään).

(a-i) sekvenssin analyysi HCC827GR solussa. Yksittäinen nukleotidin muutos C T (EGFR eksoni 20) DNA, joka luo missense muutos proteiinin sekvenssi, joka korvaa treoniinin metioniinijäännös. (A-ii) HCC827GR soluja inkuboitiin gefitinibin ja 2 päivää, ja sitten solujen elinkelpoisuus mitattiin. (B) ylempi: edustaja RT-PCR mRNA adenosiini A2a (ADORA2a) ja GAPDH, sisäistä standardia, jokaisessa solutyypissä. Alempi: intensiteetti bändejä määritettiin semi-kvantitatiivisesti käyttäen ImageJ. Arvot ADORA2a mRNA normalisoitiin arvoa GAPDH mRNA. Data edustaa keskiarvoa ± SEM 3 riippumatonta näytettä (*** p 0,001 vs. NHLF). (C) HCC827GR-soluja inkuboitiin 7 päivää kanssa selektiivinen adenosiini A2a-reseptorin antagonisti SCH-58261 (10 nM-10 uM), ja sen jälkeen solujen elinkelpoisuus mitattiin (* p 0,05, ** p 0,01 vs. ei-käsiteltyjen ryhmä). (D) Käsittely siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptorien HCC827GR soluja 3 vuorokautta merkittävästi vähentynyt solujen elinkelpoisuutta HCC827GR solujen (*** p 0,001 vs. ei-käsiteltyyn ryhmään).

Keskustelu

GPCR: on perinteisesti liittynyt monia toimintoja eriytetty, postmitoottisia soluissa. Toisaalta, GPCR: t ovat myös ilmaistu jakautuvat solut ja edistää alkionkehityksen kudoksen uudelleen ja korjaamiseen, tulehdus, angiogeneesi, normaali solujen kasvuun ja syöpään.

Niistä proteaasi-aktivoitu reseptorit (PAR), kemokiinin reseptorit ja reseptoreihin bio-aktiivisia lipidejä, kuten LPA ja sfingosiini-1-fosfaatti (S1P) on liitetty poikkeavaa soluproliferaatiota erilaisia ​​syöpäsoluja. Lisäksi neuropeptidit kuten endoteliini, bradykiniini, neuromediini B, kolekystokiniini ja angiotensiini II aktivoida sukulaisamideillaan GPCR: ien stimuloimaan solujen lisääntymistä erilaisissa solutyypeissä, ja ratkaiseva rooli monissa aggressiivinen ihmisen syövissä, mukaan lukien pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), haimasyöpä, pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC), ja eturauhasen syöpä [18], [19]. Kuitenkin on ollut muutamia raportteja kriittinen rooli GPCR: ien in gefitinibin kestävä NSCLC-solut, kuten H1975 soluja. Parempi ymmärrys roolin GPCR: ien in NSCLC voi tulla useista analyysejä varten geeni-ilmentymisen profilointi. Microarray tutkimukset ovat todennäköisesti hyödyllisiä työkaluja tähän tarkoitukseen. Siksi teimme GPCR mikrosiruanalyysi gefitinibi kestävä H1975 soluissa verrattuna normaaliin ihmisen keuhkojen fibroblastisoluja. Profiloidaan ilmentymistä mRNA: iden, jotka koodaavat GPCR: ien, löysimme suuri määrä GPCR: ien yli-ilmennetään H1975-soluissa. On todettu, että monet GPCR: iä, jotka olivat yli-ilmentynyt useissa syöpätyypeissä edistää syöpäsolujen kasvua, kun on aktivoitu kierrättämällä tai paikallisesti tuotettua ligandeja. Joukossa GPCR: t, GRP87 mainittiin parhaiten ajan säännelty GPCR esillä GPCR array. Tämän jälkeen joukko, me validoitu sääteli ilmentyminen GRP87 mRNA ja sen proteiini käyttäen RT-PCR ja western blotting, verrattuna havaittiin NHLF soluissa. Vuonna H1975 soluissa, GS-, Gi- ja Gq kytketty GPCR: ien oli yli-ilmentyy lähes samassa määrin, kun taas jotkut Gi-kytketyn GPCR: t olivat säädellä vähentävästi H1975 soluissa.

aktivoituminen A2a-reseptorien on raportoitu johtaa immunosuppressiiviset vaikutukset, mikä vähentää kasvaimia torjuvaa koskemattomuutta ja siten edistää kasvaimen kasvua. Käyttäytymistutkimuksissa, on ehdotettu, että A2a-antagonistit olisi lisättävä immunoterapeuttisia protokollia syövän parantaa kasvaimen immunoterapiaa. Nämä yhdisteet on jo osoitettu olevan turvallinen tehdyissä tutkimuksissa A2a-antagonistien Parkinsonin taudin [20]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme onko tietty agonistit /antagonisti, jotka vaikuttavat GPCR: jotka säädelty tai säädellä vähentävästi H1975 soluissa voisi vaikuttaa kasvuun H1975 soluja. Niistä GPCR: t luetellaan, joka on selektiivinen adenosiinin A2a-reseptorin, joka oli yksi kaupallisesti saatavilla ligandeja GPCR: ien yli-ilmennetään H1975-soluissa, tuotti annoksesta riippuvan väheneminen H1975 solujen elinkelpoisuuden. Samanlainen antagonisti, hoito siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptoreita tuotti merkittävän vähenemisen H1975 solujen elinkelpoisuuden. Jotta voitaisiin edelleen tutkia roolia adenosiini A2a-reseptorien gefiitnib-resistenssi NSCLC, me syntyy toinen gefitinibi kestävä klooni altistamalla gefitinibi gefitinibille herkkien NSCLC-solut, HCC827 soluja. Kuten H1975-soluissa, ekspressio adenosiini A2a-mRNA dramaattisesti lisääntynyt geftinib kestävä HCC827GR soluja verrattuna HCC827 ja NHLF soluja. Näissä olosuhteissa, käsittely joko selektiivinen adenosiini A2a-reseptorin antagonisti tai siRNA kohdistaminen adenosiini A2a-reseptoreita tuotti merkittävän vähenemisen HCC827GR solujen kasvua. Nämä havainnot viittaavat siihen, että vaikka edelleen

in vivo

tutkimuksia tarvitaan edelleen, kyky häiritä adenosiini A2a-reseptorien saattaa tarjota ainutlaatuisia mahdollisuuksia ehkäisyyn ja hoitoon NSCLC. Toisaalta, selektiivisiä agonisteja adenosiini A2a, angiotensiini II reseptorin, kuten 1, purinerginen reseptori P2Y G-proteiiniin kytkettyjen 2, prostaglandiini I

2-reseptorin (IP), 5-hydroksitryptamiini-reseptorin 2B ja arginiini vasopressiinireseptorin 1A oli ei ole vaikutusta H1975 solujen elinkykyä, mikä heijastaa monimutkaisia ​​toimintoja GPCR: ien ilmaistu näissä soluissa. Monet ligandeja tai estäjien GPCR: jotka olivat ylös- tai alaspäin säädeltyjä H1975 soluissa puuttuivat tässä tutkimuksessa. Esimerkiksi katsotaan, että GPR87, joka oli suurin yliekspressoitu GPCR H1975-soluissa, on keskeinen rooli p53-riippuvainen selviytymisen syöpäsoluja altistetaan DNA-vaurioita [21]. Kuitenkin spesifinen ligandi ja sen antagonisti ei ole vielä tunnistettu. Koska ei ole epäilystäkään siitä, että GPCR: t voivat olla keskeisiä toimijoita säätelyssä eri patofysiologisia vasteita, kuten syövän kehittymisen ja etenemisen, on todennäköistä, että lähestymistapojen joihin puuttuminen RNA antaa meille mahdollisuuden ymmärtää paremmin erikoistoimintoja GPCR: ien ilmaistu gefitinibi kestävä NSCLC-solut.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että suuri määrä GPCR: ien oli säädelty vaikka jotkut olivat alassäädetty kautta toiminnallisen ylikuulumisen EGFR loppupään ja GPCR transkriptio kehittämisessä gefitinibin-resistenssin NSCLC.

tukeminen Information

Kuva S1.

Luettelo GPCR-geenin symboleja microarray. TaqMan Array Ihmisen GPCR-kortti, joka antaa meille mahdollisuuden määrittää ilmaus mRNA: iden, jotka koodaavat GPCR: 50 subfamilies (343 reseptorit, ei hajusteeton, haju-, maku- ja feromoni reseptorit), käytettiin.

Doi: 10,1371 /journal.pone .0044368.s001

(PDF) B Kuva S2.

vaikutukset useita GPCR-agonistit kasvuun H1975-soluissa. H1975-soluja inkuboitiin 2 päivää kunkin GPCR-ligandin (1, 10 uM), ja MTT-määritys suoritettiin sitten. Solun elinkelpoisuus data edustaa keskiarvoa ± SEM 5 riippumattomien näytteiden.

doi: 10,1371 /journal.pone.0044368.s002

(PDF) B