Krooninen sairaus

tiivistelmä

Alalla syövän tutkimuksen ja hoidon on edistynyt merkittävästi, mutta olemme vielä kaukana siitä, täysin turvallisia, tehokkaita ja erityisiä hoitoja, jotka kohdistuvat syöpäsolujen ja säästää terveiden kudosten. Luonnolliset yhdisteet voivat vähentää ongelmia, jotka liittyvät syövän hoitoon. Tällä hetkellä monet kasvituotteet käytetään syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa rohitukiinin, luonnollinen esiintyvä kromoni- alkaloidi uutettu

Dysoxylum binectariferum

, tutkittiin sytotoksisia ominaisuuksia vastaan ​​orastava hiiva sekä vastaan ​​keuhkosyöpä (A549). Olemme pyrkineet nimenomaan tutkia rohitukiinin in

S

.

cerevisiae

yhteydessä MAPK reittejä kuten hiiva luultavasti edustaa kokeellinen malli, jossa organisaatio ja sääntelyn MAPK reittejä ymmärretään parhaiten. MAPK ovat kehityksellisesti konservoituneita proteiinikinaasien jotka siirtävät solunulkoisia signaaleja koneen ohjaukseen olennainen solun prosesseja, kuten kasvua, migraatiota, solujen jakautumista ja apoptoosia. Me pyritään toteuttamaan hypoteesi ajetaan tutkimuksia kohti kohdistaminen tärkeät verkon cellular viestintä, kriittinen prosessi, joka saa pieleen syövässä. Käyttävät mutantti kantojen geneettisen mallijärjestelmä

Saccharomyces cerevisiae

.

S

.

cerevisiae

koodaa viisi MAPK ohjauksessa mukana erillisiä soluvasteita kuten kasvuun, erilaistumiseen, muuttoliike ja apoptoosin. Tutkimuksemme liittyy geenin aihiot on

Slt2

ja

Hog1

jotka ovat toiminnallisia homologeja ihmisen ERK5 ja nisäkkäiden p38 MAPK, vastaavasti. Teimme sytotoksisuusmääritys arvioida vaikutusta rohitukiini solujen elinkelpoisuus ja määritettiin myös vaikutukset lääkkeen sukupolven reaktiivisia happiradikaaleja, apoptoosin induktio ja ilmentymisen

Slt2

ja

Hog1

geenin mRNA-tasolla, kun läsnä on lääkettä. Tulokset Tämän tutkimuksen osoittavat ero vaikutus aktiivisuuteen lääkkeen välillä WT,

Slt2

ja

Hog1

geeni deleetiokanta osoittaa osallistumista MAPK-reitin. Lisäksi tutkimme rohitukiinin aiheuttama sytotoksisia vaikutuksia keuhkosyövän solujen ja stimuloi tuotannoissa ROS altistumisen jälkeen 24 tuntia. Tulokset western blotting mukaan rohitukiinin laukaisi apoptoosia A549- solulinjan läpi säätelyä p53, caspase9 ja alas säätely Bcl-2-proteiinin. Laajuus Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ymmärtää mekanismia syövän vastaisen aktiivisuuden rohitukiinin lisätä ohjelmistoon syöpälääkkeiden, jotta ongelmaan, jonka resistenssiä kohti standardin syövän vastaisia ​​yhdisteitä voidaan lievittää.

Citation: Safia, Kamil M, Jadiya P, sheikki S, Haque E, Nazir A, et al. (2015) Kromoni Alkaloidi, rohitukiinin, tuottaa syövän vastaista aktiivisuutta kautta apoptoosin moduloinnissa Pathways A549 Cell Line ja Hiiva Mitogeenillä aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) Pathway. PLoS ONE 10 (9): e0137991. doi: 10,1371 /journal.pone.0137991

Editor: Muzamil Ahmad, Indian Institute of lääketieteeseen, Intia

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 24 elokuu 2015; Julkaistu: 25 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Safia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: kirjoittajat rahoitetaan Integral University ja University Grant komission Intiassa. Ms Safia on kiitollinen yliopiston myöntää komissiolle (UGC), Intian hallitus varten Maulana Azad National Fellowship, (F1-17.1 /2011 /MANF-MUS-UTT-5405). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

alati kehittyvä koettelemus syövän asennus sen haasteita tutkijat ja kliinikot koska tauti jatkaa määrätä valtavasti terveydelle taakka tuhoisa maailmanlaajuisesti. Merkittävä käsitys sen mekanistinen vihjeet on saavutettu tutkimuksiin, ovat nyt osoittaneet, että tämä sairaus löytää vahva syy muuttunut välistä viestintää ja solujen sisällä [1]. Toistaiseksi tehokas ei-kirurgiset korjaustoimenpiteitä tautia kuuluvat kemoterapiaa ja säteily perustuvat hoito-ohjelmat. Kuitenkin useita mahdollisia syöpälääkkeiden, joka perustuu molekyylien luonnollista alkuperää, ovat osoittaneet lupaus hoidettaessa syöpää, kun taas kohdistaa vähäisiä ei-toivottuja vaikutuksia (anemia, pahoinvointi ja hiustenlähtö) ja vastustamalla haaste lääkeresistenssin [2]. Lisäksi sivuvaikutus ja lääkeresistenssi, kustannukset kemoterapia huumeiden on myös erittäin korkea verrattuna luonnolliseen yhdistettä lääkekasveja.

rohitukiinin (C16H19NO5; 5, 7-dihydroksi- 8- (3- hydroksi-1-metyyli-4-piperidinyyli) -2-metyyli-4H-kromen-4-oni), joka on eristetty

Amoora rohituka

,

Dysoxylum binectariferum

ja

Schumanniophyton problematicum

, tiedetään omaavan tulehdusta, anti-istutusta, anti-hedelmällisyyttä, antiproliferatiivisia ja immunomodulatorisia ominaisuuksia [3]. Kuitenkin syövän vastaisen vaikutusmekanismia rohitukiinin ei tiedetä kohti meidän ymmärtäminen ensimmäistä kertaa se on arvioitu geneettinen malli järjestelmä orastava hiiva sekä keuhkojen syöpäsoluja. Satoja hiivan geenien näytteille linkin ihmisen sairauksien geenien lähes 30% pahamaineisen geenien ihmisen sairauksiin on hiiva ortologeihin [4]. On mielenkiintoista huomata, että 47% hiivan geenien voitaisiin onnistuneesti humanisoituja [5].

S

.

cerevisiae

auttaa myös paljastaa tärkeitä näkökohtia monia sairauksia kuten neurofibromatosis tyyppi l, paksusuolen syöpä [6].

pyrkineet nimenomaan tutkia rohitukiinin in

S

.

cerevisiae

yhteydessä MAPK reittejä kuin hiiva edustaa kokeellinen malli, jossa organisaatio ja sääntelyn MAPK reittejä ymmärretään parhaiten [7]. MAPK ovat kehityksellisesti konservoituneita proteiinikinaasien jotka siirtävät solunulkoisia signaaleja koneen ohjaukseen olennainen solun prosesseja, kuten kasvua, migraatiota, solujen jakautumista ja apoptoosia. Näin ollen, mutaatio tahansa kinaasien näistä reiteistä on suoraan yhdistetty syöpään [8]. On siten järkevää keskittää jatkotutkimusta ponnisteluja suunnittelussa mekanismiin perustuvaa syövänvastainen yhdisteitä, jotka toimivat tietyn molekyylikohteista liittyy taudin etiologiaa [9]. Siksi kinaasikaskadin esittelee uusia mahdollisuuksia kehittää uusia syövän hoitomuotoja suunniteltu vähemmän myrkyllisiä kuin perinteiset kemoterapeuttiset lääkkeet [10]. Tutkimukset suoritettiin käyttämällä geneettistä mallia järjestelmä

Saccharomyces cerevisiae

kuin se on tehokkaasti hyödyntää voidaan selvittää syöpähoidon yhteydessä altistusta 5-fluorourasiilin [11]. Hiiva on myös arvostetaan silmiinpistävä mallina syöpälääkkeen tutkimuksen [12], koska se on osoittautunut hyödylliseksi paljastamiseksi solukohteita Eri huumeiden myös jalometallista syöpälääkettä KP1019 [13]. Orastava hiiva on viisi eri MAPK, mukaan lukien: Fus3, Kss1, Smk1, Hog1 ja Slt2. Slt2 on MAPK soluseinän yhtenäisyyden reitin ja toiminnallinen homologi ihmisen ERK5, jotka aktivoituvat vasteena kasvutekijöiden ja stressiolosuhteissa [14]. Hog1 on toiminnallinen homologi nisäkkäiden p38 MAPK ja on pääasiassa aktivoituu vasteena osmoottisen stressin [15].

raportoidut tutkimukset Tässä hyödyntää geneettistä mallia järjestelmä

S

.

cerevisiae

kohti selvittämisessä vaikutuksia rohitukiinin kaikilla tärkeä prosessi matkapuhelinjärjestelmä välittämän MAP kinaasireitin, mikä vaikuttaa solujen selviytymisen ja kuoleman apoptoosin kautta. Tutkimuksessa selvitetään vaikutusta rohitukiinin apoptoosiin sisällä ihmisen keuhkosyövän solulinjassa ja tutkii mahdollisia mekanismeista kautta tutkimuksia tärkeä modulaattorit prosessin.

Materiaalit ja menetelmät

uuttaminen rohitukiinin

rohitukiinin eristettiin varsi

Dysoxylum binectariferum

kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, ilmakuivattu varren kuori kasvin uutettiin 95% etanolilla ja sitten konsentroidaan alennetussa paineessa. Se on fraktioidaan edelleen neljään fraktiot (kloroformi, liukoinen n-butanoli, n-heksaania ja liukenemattomat n-butanolia osa). Kloroformi osa, tunnettu alkaloidi rohitukiini {5,7-dihydroksi-2-metyyli-8- [4- (3-hydroksi-1-metyyli) piperidinyyli] -4H-1-bentsopyran-4-oni)} oli eristetty toistuvasti pylväskromatografialla silikageelillä ja edelleen puhdistamalla HPLCLC- 20AD käyttäen metanolia liuottimena 55:45 v /v, virtausnopeus 1,0 ml /min. Luonnehdinta Yhdiste suoritettiin käyttäen IR, NMR, massa, johdannaisten ja vertailu saatavilla kirjallisuudesta. Puhtaus rohitukiinin oli 99,6% ja saanto oli 1%.

Hiiva kulttuuri ja ylläpito

Tässä tutkimuksessa, Wild Type kanta BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) ja tyrmäyksellä kanta

Slt2

ja

Hog1

geeni (lahjoitus tri A. Chakrabartin ja tohtori RC Meena alkaen Defence Institute of Physiology and Allied Sciences, DRDO, Intia) käytettiin. Hiivasoluja kasvatettiin YPD media (1% hiivauutetta, 2% baktopeptonia, 2% glukoosia) kohti aikaisemmin kuvatulla menetelmällä [17].

määritys Pienin estävä pitoisuus

Vähintään (MIC) lääkettä määritettiin sekä spektrofotometrisesti (mittaamalla OD 600 nm: ssä käyttämällä monisyvennyslevyjä mikrolevylukijaa: Multi Skan, Thermo Scientific) ja visuaalisesti. Rohitukiinin liuotettiin dimetyylisulfoksidiin. MIC rohitukiinin määritettiin piirtämällä O.D. 600 nm: ssä versus lääkeaineen konsentraatioiden (20 ug /ml 100 ug /ml) [18]. Konsentraatio MIC lääkkeen käytettiin kaikissa kokeissa.

Arviointi kasvun inhibition tiputtelua määrityksessä

jälkeen lääkehoidon kasvun inhibition hiivasolujen arvioitiin tiputtelua määrityksessä. Soluja kasvatettiin vakio hiivauute-peptoni-dekstroosi (YPD) media. Tiputtelua määrityksiä, 5-kertainen sarjalaimennoksia YPD media valmistettiin eksponentiaalisesti kasvava viljelmä eri kannoista. 2 ul kutakin laimennosta sitten täplittäin YPD levy poissa ja läsnä ollessa huumeiden [19] kantavassa kasvueroja kirjattiin seuraavat inkuboimalla levyjä 24h 30 ° C: ssa.

Detection reaktiivisia happiradikaaleja (ROS ) vuonna orastava hiiva

havaitseminen reaktiivisia happiradikaaleja toteutettiin käyttämällä 2 ’7’ Dichlorofluoresceindiacetate (H2-DCF-DA; Cat. No.-D399; Invitrogen) värjäämällä kuten edellä kuvattiin joitakin muutoksia [ ,,,0],20]. Lyhyesti, tasot ROS mitattiin 24 tunnin kuluttua lääkehoidon lisäämällä 0,5 uM H2-DCF-DA soluihin 15 min pimeässä. Solut pestiin kolme kertaa 1X PBS: llä. Fluoresenssimikroskopialla suoritettiin käyttäen Zeiss Axioplan-2 mikroskoopilla käyttäen eksitaatioaallonpituutta 485 nm ja emissio aallonpituudella 520 nm. ROS tuotanto kvantifioitiin käyttäen kuva J ohjelmisto (Kuva J, National Institutes of Health, ja Bethesda, MD). Kaikkiaan 50 solua kustakin ryhmästä määrällisesti fluoresenssin intensiteetti ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin suhteessa hoitamattomaan verrokkiryhmään.

Arvio mitokondrion sisältö työllistää MitoTracker Deep Red värjäystä

Tarkista vaikutus huumeiden mitokondrion sisältö, Mito Tracker Deep Red värjäytymistä (Cat. No.-22426, Invitrogen) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu joitakin muutoksia [20]. Lyhyesti, 100 ui hiivasoluja inkuboitiin 100 nM Mito Tracker tahra 50 minuutin ajan 30 ° C: ssa pimeässä ja sen jälkeen kolme kertaa pesu 1 x PBS: ssä. Kuvantaminen soluja suoritettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia eksitaatioaallonpituudella 637 nm ja emissio aallonpituudella 660 nm. Fluoresenssin intensiteetti mitokondrion sisällön kvantitoitiin käyttäen Image-J-ohjelmisto.

määritys apoptoottisen solukuoleman käyttämällä akridiinioranssia (AO) värjäys

akridiinioranssivärjäyksellä tehtiin tarkistaa induktioon alkuvaiheessa apoptoosin . Akridiinioranssia (Hi-media- 116) liuotettiin PBS: ään (pH = 7). 100 ui hiivasolujen värjättiin 1 ui 2,5 mg /ml AO saada toiminnan konsentraatio 25 ug /ml. Värjäys suoritettiin 30 minuutin ajan pimeässä, ja solut pestiin PBS: llä [21]. Imaging värjäytyneiden solujen suoritettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia eksitaatioaallonpituudella 502 nm ja emissio aallonpituudella 520 nm. Fluoresenssin intensiteetti värjätään solut kvantifioitiin Image J ohjelmisto.

Analyysi tutkimalla DNA pirstoutuminen

DNA: n fragmentoituminen määritettiin Nuc Blue Elävät Cell Stain (R37605 Life Technology Corporation) mukaan valmistajan ohjeiden . Imaging värjäytyneiden solujen tehtiin fluoresenssimikroskoopilla eksitaatioaallonpituudella 352 nm ja emissio aallonpituudella 460 nm ja fluoresenssin voimakkuus värjäytyneiden solujen määrä määritettiin Image J ohjelmisto.

Semi-kvantitatiiviset Käänteinen transkriptio-PCR varten analyysi mRNA-tasojen on

Slt2

ja

Hog1

geenin läsnä rohitukiini

Kokonais-RNA uutettiin ja käänteiskopioitiin käyttäen Palauta Tuen ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas Life Sciences, luok- K1622). cDNA monistettiin käyttämällä spesifisiä alukkeita, jotka on lueteltu taulukossa 1 ja PCR-tuotteet erotettiin 1,5% agaroosigeelillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä.

proteiini-ligandi-vuorovaikutuksen käytetään laskennallisia työkaluja

3-ulotteinen (3D) rakenne p38 ja ERK5 käytetään telakointi tutkimus noudetaan Protein tietopankkia ATE tunnukset: 1WFC ja 4IC8 vastaavasti. Rakenne ligandin (rohitukiinin) (CID: 13422573) käytettiin sijainnista ”pubchem yhdisteestä”. Käyttämällä AUTODOCK työkalut Essential vetyatomit, Kollman yhdistyneet atomi tyyppi maksuja, ja solvatisoituvat parametrit lisättiin. Affinity (grid) kartat 60 × 60 × 60 ruudukon pisteitä ja 0,375 väli luotiin käyttäen Autogrid tähtäävän ohjelman kohdistaminen grid-koordinaatit läheisyys aktiivista kohtaa tavoitteita. Näin ollen arvot x, y ja z-koordinaatit, joita käytetään kohdentamisessa Hog1 ja ERK5 aktiivisen oli 18,783, 35,698, 30,394 ja Hog1 ja 15,928, -17,057, 1,101 ja ERK5 vastaavasti. Telakointisimulaatioiden suoritettiin käyttäen Lamarckian geneettisen algoritmin (LGA) ja Solis Kastelee paikallinen hakumenetelmä. Kymmenen erilaista ajot suoritetaan kullekin telakointi. Lopulliset luvut luotiin avulla Discovery Studio näyttölaitteen (Accelrys).

Cell Culture

A549-soluja (ihmisen keuhkosyöpä solulinja) saatiin National Centre for Cell Sciences (NCC) Pune, Intia, ja niitä viljeltiin DMEM: ssä (Dulbeccon modifioitu Eagle Media) F-12 (1: 1) (HiMedia AL187A), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 0,2% natriumbikarbonaattia ja 1% antibiootti ja antimykoottiliuoksella. Viljelmiä ylläpidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO2 ja 95% kosteassa atmosfäärissä.

MTT-määritystä

MTT (HiMedia-TC191) määritys perustuu vähentämiseen MTT mitokondrion dehydrogenaasi on violetti formatsaani, antaa viitteitä mitokondrioiden eheys, joka tulkitaan arviointi prosenttia solun elinkykyä [22]. Lyhyesti, solut ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille (10

4 solua /kuoppa) täydellisessä DMEM: F-12 väliaineessa, minkä jälkeen inkuboitiin 5% CO 2, 95% ilmakehässä 24 tuntia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen kun 24 tuntia altistuksen huumeiden (10 uM-60 uM), MTT (5 mg /ml varastossa PBS) lisättiin (10 ml /kuoppa 100 ml solususpensiota), ja levyjä inkuboitiin 4 tuntia. Inkuboinnin jälkeen reaktioseos varovasti otettu pois ja 200 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin jokaiseen kuoppaan, sisältö sekoitettiin hyvin pipetoimalla ylös ja alas useita kertoja. Levyjä säilytetään rokkari ravistelijassa 10 min huoneenlämmössä ja sitten lukea 550 nm: ssä käyttäen monisyvennyslevyjä mikrolevyn lukija (Multi Skan, Thermo Scientific). Käsittelemättömät solut ajettiin identtisissä olosuhteissa ja toimi pohjapinta ohjaus. Kukin koe toistettiin kolme kertaa ja keskihajonnat on saatu kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

määritys reaktiivisten hapen lajien (ROS) keuhkosyövän soluja

ROS: n syntyminen on arvioitu käyttäen 2 ’, 7’ -diclorodihydrofluorescein di-asetaatti (H2-DCF-DA; Cat. No.-D399; Invitrogen) kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, solut ympätään musta 96-kuoppalevylle tiheyteen 10

4 solua /kaivo inkuboitiin 1 mM H2-DCF-DA; 30 min 37 ° C: ssa jälkeen inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa lääkeaineen 24 tuntia. Mittaus ROS toteutettiin aikana hoitojakson 485 nm: n virityksellä ja 535 nm emissio aallonpituuksilla. ROS sukupolvi on vahvistanut myös fluoresenssi-mikrovalokuva solujen ROS. Lyhyesti, solut maljattiin 48-kuoppaiselle kudosviljelylevylle ja käsiteltiin 1 mM H2-DCF-DA; 30 min, jota seurasi inkubaatio eri pitoisuuksilla rohitukiini 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Fluoresenssi kuvat otettiin käyttäen Zeiss Axioplan-2 mikroskooppia käyttäen FITC Suodatin 20X objektiivin.

eristäminen totaalisoluproteiinia A549-solujen

rohitukiini käsitellyn ja käsittelemättömän solut pelletoitiin, pestiin kylmällä PBS: llä ja lyysattiin RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi 1 mM EDTA: ta, 50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM NaF, 1 mM Na-

3VO4, 1 mM PMSF ja 1 ug /ml leupeptiiniä [24]. Solulysaattia varovasti vorteksoitiin 30 sekuntia sen jälkeen, kun 1 tunnin inkuboinnin lyysipuskurissa. Supernatantti kerättiin sentrifugoimalla 14000 x g 15 minuuttia ja säilytettiin erinä -20 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus kvantitoitiin käyttäen Bradford-proteiinimäärityksellä.

Western blot -analyysi tunnistaminen Apoptosis-sukuiset proteiinit

Solulysaatit denaturoitiin ja kaksikymmentä mikrogrammaa proteiinia erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Se on elektro-siirrettiin PVDF-kalvolle. Membraanit blokattiin huoneenlämmössä 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), jossa oli 0,05% Tween-20 (TBS-T), 2 tuntia. Kun oli pesty TBS-T-kalvoja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita p53 (1: 3000), caspase9 (1: 3000), Bcl-2 (1: 5000) ja β-aktiini (1: 4000), yön yli 4 ° C. Pesun jälkeen kaivoa inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (anti-kani tai anti-hiiri, 1: 10000, Invitrogen, USA) huoneen lämpötilassa 1 tunti. Western blot vyöhykkeet havaittiin käyttäen kemiluminesenssisubstraatilla (Millipore) käyttäen Chemidoc (GE). β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan samanarvoisesta lastaus ja normalisointi proteiinia. Proteiini Ladder (3B BlackBio Biotech-3B75) (3.5-245kDa) käytettiin molekyylipainon määrittämiseksi proteiinin bändejä. Densitometrian bändeistä saatu tehtiin NIH ohjelmisto Image J versio 1,41 (USA).

Tilastollinen

Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± SEM Tilastollinen merkitys eri ryhmien suoritettiin käyttämällä Studentin t-testi käyttämällä Graph Pad prisma 5 -ohjelmaa. Sillä

in vitro

tutkimustuloksia ilmaistiin keskiarvona ± S.D. ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA Tukeyn monivertailutestillä.

Tulokset ja keskustelu

ΔSlt2 ja ΔHog1 kannat ovat yliherkkiä rohitukiinin hoitoon

tässä tutkimuksessa määritettiin sytotoksisuus rohitukiinin vuonna orastava hiiva- ja myös tutkia MAP kinaasi reitit ovat mukana rohitukiinin solukuolema, joten määritti rohitukiinin solun elinkelpoisuuden ΔSlt2 ja ΔHog1 kantoja. Rohitukiinin näyttää sytotoksisuutta vastaan ​​kaikentyyppisiä hiivakantojen. MIC

50 rohitukiinin määritettiin piirtämällä O.D. 600 nm: ssä versus lääkepitoisuuksia. MIC

50 vastinetta WT havaittiin olevan 80 ug /ml ja niin geenin knock-out kantojen havaittiin olevan 60 ug /ml. Kaikki kokeet suoritettiin annoksella alle MIC

50-arvo (40 ug /ml). Kuvio 1 osoittaa, että rohitukiinin kiinnostavuus sytotoksisia vaikutuksia hiiva. Vaikka konsentraatio rohitukiinin, joka tappaa noin 50% hiivasoluista on suurempi kuin IC

50-arvot raportoitiin syöpäsoluja in vitro [25], tämä tulos ei ole yllättävää, sillä hiivan näyttävät usein korkeampi resistenssi antineoplastisia aineita [ ,,,0],26] on todennäköistä, että läsnäolo Hiivasoluseos voi olla este huumeiden pääsyn soluun ja paljon vienti kuljettajan jotka häiritsevät tulon lääkkeen solun sisällä ja hiivasoluja ovat myös erittäin tehokkaita vähentämään pitoisuutta solun myrkyllisten pienet molekyylit käyttämällä useita liikenteen proteiinien [27].

(a) hiivasoluja elinkelpoisuus eri pitoisuutena rohitukiinin jälkeen 24 tunnin lääkehoidon, 5-kertainen sarjalaimennoksesta eksponentiaalisesti kasvavista viljelmistä WT, ΔSlt2 ja ΔHog1 kannat täpläksi YPD-alustaa, joka sisälsi 40 ug /ml, 80 ug /ml ja 100 ug /ml lääkeainetta. (B) prosenttiosuus eloonjääneiden solujen suhteessa käsittelemättömiin kontrolleihin.

Tulokset osoittivat, että geenin Knockout kannat olivat herkempiä lääkkeen verrattuna WT-kantaa samassa MIC (40 ug /ml), kuten on osoitettu jonka tiheys paikkoja tiputtelua määrityksessä solujen elinkelpoisuuden (kuvio 1A) ja OD 600 nm: ssä (kuvio 1 B) tulos tiputtelua määrityksen vahvisti, että hiivasolut hoidetuilla rohitukiinin hävisi solujen elinkelpoisuuden annoksesta riippuvaisia ​​tavalla. Mikäli WT solujen verrokkitäplä pisteytettiin 0, 40 ug /ml rohitukiinin käsiteltyjen solujen paikalla pisteytettiin 1 solut pisteytettiin 2 klo 80 ug /ml lääkeaineen ja 100 mikrog /ml soluja spot kertoimeksi 3 jälkeen 24 tuntia of lääkehoitoa. Molemmille geenin aihiot (Δslt2, Δhog1) kanta verrokkitäplä pisteytettiin 0, 40 ug /ml lääkeaineen käsiteltyjä soluja, pisteytetään 2, 80 ug /ml lääkkeellä käsiteltyjen solujen kertoimeksi 3 ja 100 ug /ml lääkkeellä käsiteltyjen solujen pisteytettiin 4 jälkeen 24 tunnin lääkehoidon. ΔSlt2 kanta oli yliherkkä erilaisiin genotoksisia aineita, joilla eri toimintatapa lukien methylmetanosulfonate, UV-säteilyä ja fleomysiini [28]. Slt2 aktivointi induktion jälkeen yhden DSB (double-lohkon murtuma) on GAL1: HO-kanta, joka on erityinen vaikutus eheys DNA, joka osoittaa todellisen roolin Slt2 että vastauksena genotoksinen stressiin [29]. Näin ollen nämä geenit aktivoituvat, kun läsnä on lääkettä WT soluissa niin se voisi olla mahdollista, että ΔSlt2 ja ΔHog1 kannat osoittivat yliherkkyyttä huumeiden [30].

rohitukiinin laukaisee solukuoleman indusoimalla oksidatiivisen stressin ja vähentää mitokondrion sisältö in ΔSlt2 ja ΔHog1 kantojen

ROS-tuotanto mitattiin analysoida roolia ROS hiivassa solukuoleman välittämän rohitukiini. Huomasimme, että rohitukiinin indusoi merkittävän määrän ROS 24 tunnin huumehoidon WT ja geenien knockout kannoissa (kuvio 2A). Kvantifiointi fluoresenssin voimakkuuden H2-DCF-DA värjäytymistä (kuvio 2B), osoittivat myös, että rohitukiini käsitelty hiiva-solut tuottivat suhteellisen kohonnut ROS verrattuna käsittelemättömiin soluihin, lisätä ollessa 1,3 (P 0,001), 2,0 (P 0,001), ja 1.7 (P 0,001) taittaa WT, ΔSlt2 ja ΔHog1 kantoja vastaavasti jälkeen rohitukiinin kohtelun kuin käsittelemättömään kontrolliin soluihin. Kuitenkin ΔSlt2 ja ΔHog1 kannat tuottivat enemmän ROS verrattuna WT soluihin käsittelyn jälkeen ja lisätä ollessa 1,4 (P 0,001) ja 1,2 (P 0,001) taittaa ΔSlt2 ja ΔHog1 kantoja vastaavasti verrattuna WT jälkeen lääkehoitoa, joka vahvistaa entisestään yliherkkyys sekä mutanttien kantojen huumeiden. Tämä ero saattaa johtua puuttuessa MAPK jonka tiedetään aktivoituvan oksidatiivisen stressin. Lisäksi MAPK puutteellinen hiivasoluja kerääntyä ROS vielä enemmän kuin WT-solut stationaarivaiheen aikana [31]. MAP-kinaasin reitit vaikuttavat paitsi reseptorin ligandi-vuorovaikutusten, mutta myös erilaiset stressitekijät kuin oksidatiivista stressiä mahdollisia MAPK reittejä. Yleensä lisääntynyt ROS tuotanto soluissa aiheuttaa aktivoitumisen MAPK mutta mekanismeja, joiden ROS voi aktivoida nämä kinaasit ovat epäselviä [32]. Nämä mutantit voivat heikentyä autophagy reitin, joka tarvitaan estämään liiallisen ROS kertymistä. Kyvyttömyys lisäämään ilmentymistä Hengitysketjun komponenttien ja ROS scavengers todennäköisesti johtaa kertyminen ROS autophagy-viallisia soluja.

S

.

cerevisiae

Hog1 MAPK aktivoidaan vastauksena korkea osmolariteetti ja tarvitaan solujen eloonjäämistä näissä olosuhteissa [33]. Vastauksena useiden korostaa, Hog1p fosforyloituu ja siirtyy tumaan. Hog1 null mutantit todettiin olevan yliherkkiä näiden stressin olosuhteissa, mikä johtaa Hog1p aktivointi, erityisesti solunulkoisen hapettimet [34].

(a) DCFDA värjäytymistä (b) Graafinen esitys suhteellinen reaktiivisten happiradikaaleja (ROS) mitattuna H2DCFDA värjäyksellä WT ja geenien knockout hiiva- kuin määrällisesti Image J ohjelmisto *** p 0,001. (C) Mitotracker Deep Red värjäytymistä (d) Graafinen esitys fluoresenssin intensiteetin mitokondrion sisältö orastava hiiva kuin sen määrä Image J ohjelmisto *** p 0,001.

Meillä on myös tarkastettava onko rohitukiinin altistuminen vaikuttaa mitokondrion sisältö. Havaitsimme, että mitokondrion sisältö laski suuremmassa määrin ΔSlt2 ja ΔHog1 rasitusta jälkeen 24 tunnin of rohitukiinin hoitoa, mutta WT solut osoittivat kasvua mitokondrioissa sisällön jälkeen lääkehoidon (kuvio 2C). Kvantifiointi fluoresenssin voimakkuuden mitokondrion sisältö (kuvio 2D) osoittivat, että rohitukiinin käsitelty WT soluissa osoittaa 1,6 (P 0,001) kertaiseksi kun taas rohitukiinin käsitelty ΔSlt2 ja ΔHog1 kannat näytteille 1.2 (P 0,001) ja 2,0 (P 0,001) kertainen vähentäminen vastaavasti verrattuna niiden käsittelemättömään kontrolliin. Kuitenkin ΔSlt2 osoitti 2,3 (P 0,001) ja ΔHog1 kannan näytteillä 2,2 (P 0,001) kertainen vähennys verrattuna WT läsnä lääkettä.

mitokondriot myös olla hyvin tärkeä rooli säätelyssä monissa mekanismien ohjaava solujen eloonjäämistä ja kuoleman [35]. Muutokset mitokondrioiden liittyvät ikääntymiseen, vähentynyt synteesi mitokondrion proteiinit ja alhaisempaa hapettavien entsyymien aiheuttaa laskua mitokondrioiden ATP synteesissä [36]. MAP-kinaasin reitit ovat mukana luontainen apoptoosin läsnä isoorientin ihmisen hepatoblastooma syöpäsoluissa [37]. Flavopiridoli (rohitukiinin johdannainen) aiheuttaa solukuoleman väheneminen mitokondrion kalvon potentiaalia ihmisen leukemiasolujen [38]. Flavopiridoli aiheuttaa myös STI571 (Bcr /Abl estäjä) aiheuttaman apoptoosin ja vaurioita mitokondrioiden ja apoptoosin BCR-ABL-positiivisia ihmisen leukemiasolujen [39]. Näin MAPK mutantit osoittavat lisääntynyt tuotanto ROS joka ehkä todennäköisin syy johtaa mitokondrioiden toimintahäiriöitä.

rohitukiinin aiheuttaa induktion alkuvaiheen apoptoosin ja DNA-vaurioita hiivasoluissa

Tiedot AO värjäys osoitti, että rohitukiinin aiheuttaa apoptoosin geenin tyrmäys kannoissa verrattuna WT-kantaa 24 tunnin kuluttua lääkehoidon (kuvio 3A). Kvantifiointi fluoresenssin voimakkuuden AO värjäyksen (kuvio 3B) osoitti, että WT, ΔSlt2 ja ΔHog1 tahrat hiivan osoittaen 1,3 (p 0,001), 2,0 (s 0,001) ja 1,7 (p 0,001) kertaiseksi kasvaa vastaavasti jälkeen huumehoidon verrattuna niiden käsittelemättömään kontrolliin. Kuitenkin ΔSlt2 kanta osoitti 1,7 (p 0,001) ja ΔHog1 kannan näytteillä 1.2 (p 0,001) kertaiseksi verrattuna WT kanta hoidetuilla rohitukiinin.

(a) a.o. värjäystä (b) Graafinen esitys fluoresenssin intensiteetin apoptoottisen kuoleman hiivasoluissa määrällisesti käyttäen Image J ohjelmisto *** p 0,001 (c) DNA-vaurioita paljasti Nuc Blue Elävät Cell Stain (d) Graafinen esitys fluoresenssin intensiteetin nukleiinihapon hiivasoluissa määrällisesti käyttäen Image J ohjelmisto *** p 0,001.

Havaitsimme myös DNA: n fragmentoituminen 24 tunnin kuluttua lääkehoidon at MIC by NucBlue elävien solujen Stain DNA. Tulos DNA värjäytymistä (kuvio 3C) osoitti selvästi DNA: n fragmentoituminen WT sekä molempien geenin Knockout kantojen jälkeen lääkehoitoa osoittaa apoptoottisen fenotyypin. Kvantitoimme kuvia fluoresenssin voimakkuus DNA värjäyksen (kuvio 3D). Siellä oli 1,5 (p 0,001), 3,0 (s 0,001) ja 3,9 (p 0,001) kertainen rohitukiinin käsitelty WT, ΔSlt2 ja ΔHog1 rasitusta vastaavasti verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Kuitenkin ΔSlt2 osoitti 1,1 (p 0,001) ja ΔHog1 kannan näytteillä 1,3 (p 0,001) kertaiseksi verrattuna rohitukiinin käsiteltyjen WT soluja.

DNA pirstoutuminen, tunnusmerkki apoptoosin [40] havaittiin kaikenlaisia ​​hiivakannoille jälkeen huumehoidon näkemänä DAPI värjäystä. Valproiinihappoa indusoi apoptoosia ROS sukupolvi ja DNA: n fragmentoituminen riippumaton Yca1p pitoisuuksilla, jotka lievästi vaikuttavat leviämisen hiiva [41].

rohitukiinin vuorovaikutus vaikuttaa ilmaus

Slt2

ja

Hog1

geenin villityypin kannasta

mRNA tasot

Slt2

ja

Hog1

todettiin olevan 3,7 ja 2,8 kertaisesti lisääntynyt vastaavasti WT kanta hoidettiin rohitukiinin verrattuna kuin kontrolliryhmän (kuvio 4A). Kuitenkin mRNA ilmaus

Slt2

geenin ΔHog1 rasitusta ja ilmaus

Hog1

geenin ΔSlt2 kanta jäi un-vaikutti jälkeen rohitukiinin hoidon. Kuvio 4B kuvaa kertaiseksi muutoksia mRNA tasoilla eri hoitoryhmään normalisoitui vastaan ​​valvonnan. Selektiivinen kasvu Slt2 ja Hog1 villityypin olosuhteissa eikä sen aihiot joko geeni voi olla seurausta rajat neuvottelut eri MAPK reittejä, jotka ovat hyvin yleisiä [42]. Yli ilmentyminen

Hog1

geenin jälkeen rohitukiinin hoito voi olla riippuvainen läsnäolosta

Slt2

geeni tai päinvastoin.

Zymolyase aktivoi sekä MAPK ja Slt2 aktivointi riippuu Sho1 haara HOG reitin. Molemmat MAPK reitit ovat välttämättömiä solujen selviytymisen läsnä stressiä koska mutanttikantojen joilta puuttuu eri osien sekä reitit ovat yliherkkiä Zymolyase [43]. Siten peräkkäisten aktivointi kaksi MAPK reitit voidaan tarvita solujen sopeutuminen korostaa kunnossa ja soluseinän vaurioita jälkeen rohitukiini hoidon.

aikaisemmista tutkimuksista tiedetään, että hydroksiurea hoito lisää fosforylaatio Slt2 MAP-kinaasin [28 ]. Slt2 vastaa soluseinän koskemattomuuden ja aktivoivat soluseinän vaurioita, niin se voisi olla mahdollinen syy yliherkkyyttä slt2 mutantin lääkehoitoa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osallisina rooli Hog1 MAPK välittämisessä toleranssi erilaisia ​​stressin olosuhteissa, mukaan lukien osmoottinen, hapen, lämmön, arseenia, ja sitruunahappoa, stressi [44]. 0,01, ***

P