Krooninen sairaus

tiivistelmä

valvonta radioresistance ja metastaattisen potentiaalin elossa syöpäsolujen on tärkeää parantaa syövän hävittämiseen radiotheraphy. Distaalinen-vähemmän homeobox2 (

DLX2

) -geeni koodaa homeobox transkriptiotekijän mukana morfogeneesissä ja sen sääntelyn purkamista löydetty ihmisen kiinteitä kasvaimia ja hematologisia syöpiä. Täällä tutkittiin miten DLX2 yhdessä säteilyn aiheuttamien epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia ja sen sääntelyä Smad2 /3 signalointi säteilytetty A549- ja MDA-MB-231 ihmisen syöpäsolujen linjat. Säteilytettyyn A549 ja MDA-MB-231-solujen, EMT aiheutettiin osoituksena EMT merkki ilmaisu, fosforylaatio Smad2 /3, ja muuttavien ja invasiivisia kyky. Lisäksi, säteilytettyjä A549 ja MDA-MB-231-solut osoittivat lisääntynyttä syövän kantasoluja (CSCS) markkeri. Mielenkiintoista on, DLX2 yliekspressoitui säteilytettäessä. Siksi tutkimme rooli DLX2 säteilyn aiheuttama EMT ja radioresistance. Yli-ilmentyminen DLX2 yksin aiheuttama EMT, muuttoliike ja invaasio, ja CSC merkki ilme. Pelkistetty pesäkkeitä muodostavaa kykyä säteilytettyyn soluissa osittain palautti DLX2 yli-ilmentymisen. Toisaalta, ehtyminen DLX2 käyttäen si-RNA poisti säteilyn aiheuttamista EMT, CSC merkki ilmaisun, ja fosforylaatiota Smad2 /3 säteilytettyyn A549- ja MDA-MB-231-soluja. Myös ehtyminen DLX2 lisäsi säteilyn herkkyys molemmissa solulinjoissa. Lisäksi pudotus on Smad2 /3, on keskeinen aktivaattori TGF-β1 reitti, kumosi säteilyn aiheuttama DLX2 ilmaisu, joka osoittaa, että säteilyn aiheuttama DLX2 ilmentyminen on riippuvainen Smad2 /3 signalointia. Nämä tulokset osoittivat, että DLX2 keskeinen rooli radioresistance, säteilyn aiheuttamien EMT ja CSC merkki ilmaisun, ja ilmaus DLX2 säätelee Smad2 /3 signalointi A549 ja MDA-MB-231-solulinjoja.

Citation: Choi YJ, Baek GY, Park HR, Jo SK, Jung U (2016) Smad2 /3-säädelty ilmentäminen DLX2 liittyy säteilyn aiheuttamista epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon ja Radioresistance A549 ja MDA-MB-231 ihmisen syöpäsolu Lines. PLoS ONE 11 (1): e0147343. doi: 10,1371 /journal.pone.0147343

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 08 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 31 joulukuu 2015; Julkaistu: 22 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Choi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Research Foundation of Korea (NRF) se rahoitettiin Korea hallitus (MSIP) (nro 2013M2A2A7043663).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sädehoito on eräs yleisimmistä hoitomuotoja syöpään, mutta yksi sen rajoituksista on, että jotkut elossa syöpä solut voivat saada radioresistance [1] ja metastaattinen kyky [2] jälkeen toistettiin sädehoitoa. Läsnäolo epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja syövän kantasoluja (CSCS) on liitetty putatiivisena syy kasvaimen radioresistance potilailla [2]. CSCS ovat erillisiä populaatio kasvainsolujen ominaisuuksia itsestään uudistuminen, ja on tunnistettu erilaisissa ihmisen pahanlaatuisia kasvaimia [3, 4, 5]. CSCS osoittavat tyypillisiä ominaisuuksia EMT [6, 7], ja EMT jälleen liittyy radioresistance [8, 9]. Tästä syystä tutkimus ja kehittäminen ennakoivan biomarkkereiden ja kohdennettua terapeuttista strategiaa CSC ja EMT ovat erityisen tärkeitä ennusteen arviointiin ja radioherkkyyttä paraneminen sädehoito [10, 11]. Edustavia CSC markkereita ovat Oct4, Sox2, Slug /Snail [12, 13, 14], ja viimeaikaiset raportit ovat tunnistaneet erityisesti CD44 kuin CSC liittyvä potentiaali biomarkkeri radiotheraphy keuhkojen ja rintasyövän soluja [15, 16, 17].

EMT prosessissa syöpäsolujen ilmaisuja epiteelin geenejä, kuten E-kadheriinin ja vinkuliini estyvät, kun taas ilmaisuja mesenkymaalisten geenejä, kuten N-kadheriinin ja vimentiinista paranevat [18, 19, 20 ]. Seurauksena EMT solut saavat metastaattista ominaisuuksia kuten kontakti-inhibition menetys, huonokuntoinen kasvun ohjaus, ja aggressiivinen invasiivisuus [18, 21]. EMT säätelevät transkription tekijöitä, kuten Snail, Twist, ja ZEB [7, 22, 23, 24]. Matrix (MMP) ovat myös tärkeitä välittäjiä EMT, jotka hajoavat ECM ja mahdollistavat siirtymisen ja hyökkäys syöpäsolujen kaukaisiin kohtiin tuloksena tuumorimetastaasissa [25].

Normaalissa kunnossa, TGF-β säädökset tuumorisuppressorina, mutta tunnetaan myös parantaa EMT ja tukemaan angiogeneesiä myöhäisessä vaiheessa kasvaimen [26]. Viime aikoina useat raportit osoittivat, että IR edistää EMT kautta Smad-riippuvainen TGF-β-signalointi syöpäsolulinjoissa [6, 27, 28]. TGF-β-reitin, TGF-β-reseptoreihin tunnistavat ligandeja ja laukaista fosforylaation reseptoriin liittyvän Smad proteiinit (Smad2 /3), jotka liittävät Smad4. Smad2 /3/4 komplekseja kertyvät tumaan ja osallistuvat säätelyyn kohdegeenien ilmaisun [29].

selkärankaisten distaalisen-vähemmän homeobox2 (DLX2) toimii homeo-box transkriptiotekijä ja on ratkaiseva rooli alkionkehityksen, kallon ja kasvojen kehitys, kudosten homeostaasin. Uusimpien raporttien, vapautuminen DLX2 löydettiin ihmisen kiinteitä kasvaimia ja hematologisia syöpiä [30, 31, 32], ja DLX2 on spekuloitu olevan osallisena kasvaimen progressiota sääntelyä metabolisen stressin aiheuttama nekroosi [33]. Lisäksi DLX2 itsessään on kohdegeeni Smad-riippuvainen TGF-β signalointia ja toimii negatiivisena palautetta tekijä TGF-β signalointi [34]. Nämä tutkimukset tehdään voimme keskittyä mahdollisesta roolista DLX2 että acquirement CSC ja EMT ominaisuuksien kautta Smad riippuva TGF-β signalointi IR-käsiteltyjen syöpäsolujen.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet rooli of DLX2 yhdessä kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia ja epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja sen sääntelyä Smad2 /3 signalointi säteilytetty A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja ja MDA-MB-231 ihmisen rintasyövän soluja. Me raportoimme tässä, että IR indusoi ilmentymistä DLX2 aktivoimalla Smad2 /3, ja DLX2 edistänyt muuttoliike ja invaasio, ja radioresistance A549 ja MDA-MB-231-solulinjoja.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet

Vasta-aineet DLX2, Smad2 /3, CD44, β-kateniinin, N-kadheriinin ja E-kadheriinin ostettiin Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Anti-Snail, anti-vimentiinistä ja anti-vinkuliini vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA). Anti-pSmad2 /3-vasta-aine hankittiin Kerafast, Inc. (Boston, MA, USA). Anti-β-aktiini-vasta ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).

Soluviljely ja Säteilytys

A549 (ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinja) ja MDA-MB-231 (ihmisen rintasyöpä solulinjassa) ostettiin Korean Cell line Bank (Seoul, Korea). Soluja pidettiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone, UT, USA), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Solut irrotettiin viljelymaljasta käyttämällä 0,25% trypsiiniä ja laimennettiin 1,5 x 10

5 solusta /ml. Soluja säteilytettiin

137Cs γ-säteet käyttämällä Gammacell 40 Exactor (MDS Nordion, Ontario, Kanada) on KAERI ja sitten uudelleen levytettiin viljelyastioihin tai vastaanotto.

Rakentaminen DLX2 yli-ilmentymisen vektori ja transfektio

asetin ihmisen DLX2 monistettiin pCMV-sports6 /DLX2 (Korea Human Gene Bank, Seoul, Korea) PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita:

EcoRI

(eteenpäin): 5 ”-CGGAATTC ATGACTGGAGTCTTTGAC-3 ’ja

Xho

I (käänteinen): 5′-CTCTGAGT TTAGAAAATCGTCCCCG-3′. DLX2 insertit kloonattiin pcDNA3-myc, joka sallii ilmentymisen c-myc-merkitty proteiini nisäkässoluissa. pcDNA3-myc /DLX2 tai pcDNA3-myc sitten soluihin (4 ug /2,5 x 10

5-solut) käyttäen HilyMax (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, ML, USA) transfektiota mukaista reagenssia valmistajan ohjeiden. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut irrotettiin ja säteilytetty.

Small-häiritsevä RNA (siRNA) transfektion

si-RNA: t kohdistaminen DLX2 ja Smad2 /3 ostettiin Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA, USA). Transfektioon, solut maljattiin ja kasvatettiin 70-90% konfluenssiin. Target si-RNA: n tai negatiivinen kontrolli si-Ct jälkeen soluihin (si-DLX2: 50 uM /2,5 x 10

5-solut; si-Smad2 /3: 100 uM /2,5 x 10

5 solua) käyttäen HilyMax transfektioreagenssia mukaan valmistajan ohjeiden. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut irrotettiin ja säteilytettiin.

RNA ja Quantitative real-time PCR

24 h jälkeen säteilytyksen, kokonais-RNA uutteet (1 x 10

6 solua ) eristettiin Trizol-reagenssia (Ambion, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Käänteinen transkriptio suoritettiin cDNA-synteesi käyttäen TOPscript RT DryMIX sisältävät käänteistranskriptaasi, RT-puskuri, dNTP seos, Oligo dT (Enzynomics, Seoul, Korea). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritetaan StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) SYBR Green reagenssilla (Enzynomics, Seoul, Korea). Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) ja sekvenssit esitetään taulukossa 1. Yhteensä reaktion tilavuus PCR-seos oli 20 ui, ja reaktiota olosuhteet olivat 15 min alkudenaturaatio 95 ° C: ssa ja 40 sykliä 10 s 95 ° C: ssa, 15 sekuntia 60 ° C: ssa ja 20 sekuntia 72 ° C: ssa. Vertaileva C

t menetelmää käytettiin ja suhteellinen mRNA: n ilmentymisen taso laskettiin normalisoinnin P-aktiini. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa itsenäisesti.

klonogeeninen määritys

Itsenäinen solut altistettiin eri säteilytysannoksille ja inkuboitiin 7 päivää (A549) ja 10 päivää (MDA-MB -231) 37 ° C: ssa. Keskipitkällä kaikkien kulttuurien uusittiin 3 päivän välein. Pesäkkeet kiinnitettiin 60% metanolia ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Pesäkkeet, jotka sisältävät 50 tai useamman solun laskettiin kuten klonogeenisten solujen. Raportoitiin hengissäsäilymisosuus arvot ovat keskiarvoja kuuden rinnakkaisnäytettä kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Cell migraatiokokeessa

Mittaa muuton, säteilytetty A549 ja MDA-MB-231-solut ympättiin transwell (Corning Incorporated, NY, USA) tiheydellä 2,5 x 10

4 solua /kuoppa 200 ul: aan seerumia ja inkuboitiin 7 h (A549) tai 3 h (MDA-MB-231) 37 ° C ° C. Inkuboinnin jälkeen väliaine poistettiin. Solut kiinnitettiin inkuboimalla 100% metanolilla ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla 15 minuutin ajan. Kalvo leikattiin pois kustakin kammiosta ja siirtynyt solujen alapinnan suodattimen laskettiin suodatinta kohti satunnaisessa mikroskooppisia jätetty 200-kertainen suurennus (Leica, Heidelberg, Saksa). Raportoidut arvot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Cell invaasiomääritys

kyky säteilytettyjen A549 ja MDA-MB-231-solujen läpi matrigeeliä päällystetty suodattimia mitattiin Boyden kammio invaasiomääritys. Matrigel pantiin alkuun polykarbonaatti suodatin (huokoskoko 8 pm). Soluinvaasion analyysit suoritettiin käyttäen matrigeeliä invaasiomääritys kit (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut siirrostettiin ylemmässä kammiossa tiheydellä 2,5-5 x 10

4 solua /kuoppa 500 ul: aan seerumia ja inkuboitiin 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231 ) 37 ° C: ssa. Solut, jotka tunkeutuivat alapinta kunkin kalvon kiinnitettiin 100% metanolilla ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla 15 minuutin ajan. Kalvo leikattiin pois kustakin kammiosta ja tunkeutuu solujen alapinnan suodattimen laskettiin suodatinta kohti satunnaisessa mikroskooppisia jätetty 100-kertainen suurennus (Leica, Heidelberg, Saksa). Raportoidut arvot ovat keskiarvoja kolmen erillisen kokeen.

Western blot-analyysi

24 tunnin kuluttua säteilytyksen kokosoluliuotteista (2 x 10

6 solua) valmistettiin käyttäen RIPA lyysipuskuria (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), joka sisälsi 10 mM phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF), 10 mM natriumfluoridia (NaF), 1 mM natriumortovanadaattia (Na

3Vo

4) ja täydellinen proteaasiestäjäseostabletit (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä BCA-proteiinimääritysreagenssilla (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), naudan seerumin albumiinia standardina. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo (Amersham Hybond, Freiburg, Saksa). Membraani pestiin sitten Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (10 mM Tris ja 150 mM NaCl), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (TBST), ja blokattiin TBST, joka sisälsi 5% rasvatonta maitojauhetta. Kaivoa inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen ja blotti altistettiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja kehitettiin käyttämällä ECL Western blot detektioreagensseja (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).

immunofluoresenssi (IF) värjäys

analysoimiseksi solunsisäinen lokalisaatio F-aktiini ja markkeriproteiinien, A549 ja MDA-MB-231-soluja siementä Lab-Tek kammio slide 8 hyvin lasilevyllä (Nunc, NY, USA) ja transfektio si -Ct tai si-DLX2 24 tuntia ja sitten inkuboitiin 24 tuntia sen jälkeen, kun IR. Solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä värjättiin inkuboimalla primaarista vasta-ainetta (kanin polyklonaalinen anti-N-kadheriinin /vimentiinista /E-kadheriinin /vinkuliinin vasta-aine, laimennettu 1: 100) yön yli 4 ° C: ssa. Ne huuhdottiin sitten PBS: llä, inkuboitiin estopuskurilla, ja käsitellään Alexa 546-konjugoitua anti-kani-vasta-ainetta (Molecular Probes, CA, USA), 3 tuntia huoneenlämpötilassa. Lopuksi, solunsisäinen F-aktiini värjättiin käyttämällä Alexa-phalloidin-488 (laimennettu 1: 300, Molecular Probes, CA, USA) 1 tunnin ajan. Tuma solun värjättiin TO-PRO-3 (Molecular Probes, Eugene, USA). Värjätään solut kiinnitettiin ja kuvataan useilla laser konfokaalinen (Leica, Heidelberg, Saksa).

määritys TGF-β1 in soluviljelysupernatanttia

A549 ja MDA-MB-231 (5 x 10

5 solua /kuoppa) solut altistettiin IR 8Gy, 4Gy ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Taso TGF-β1-proteiinin viljelmän supernatanteissa mitattiin käyttämällä TGF-β1 ELISA-kitillä (BD Biosciences, San Diego, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). TGF-β1-proteiinin tasot määritettiin kolmesta eri kokeissa ja ne ilmaistaan ​​pg /ml.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa. Tilastollisesti merkitseviä eroja ei havaittu käyttämällä Studentin t-testiä. Tilastollinen todennäköisyys P 0,05 pidettiin merkittävänä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SEM. Kolmen kokeita, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tulokset

Ionisoiva säteily aiheuttaa EMT ja lisää CD44 ja DLX2 ilmaisun

Ensin analysoidaan säteilyn herkkyys ihmisen A549 keuhkokarsinooma ja MDA-MB-231 rinnan adenokarsinooma soluissa klonogeeniset määrityksessä. Tässä määrityksessä solujen eloonjääminen oli annoksesta riippuvaa laskua IR (0, 2, 4, 6, 8Gy) molemmissa solulinjoissa, mutta MDA-MB-231-solut olivat herkempiä IR kuin A549-soluja (kuvio 1A). Morfologiset muutokset solujen altistumisen jälkeen IR tarkastettiin A549-solut säteilytettiin 8Gy ja MDA-MB-231-solujen 4Gy. Säteilytettyjä A549 ja MDA-MB-231cells osoitti kara-muotoinen ja pitkänomainen morfologioita, jotka ovat tyypillisiä EMT morfologisten fenotyyppejä verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 1 B).

(A) Itsenäinen-soluja (1 x 10

5cells /ml) altistettiin erilaisille säteilytysannoksille ja inkuboitiin 7 päivää (A549) ja 10 päivää (MDA-MB-231) 37 ° C: ssa. Pesäkkeet, jotka sisältävät 50 tai useamman solun laskettiin kuten klonogeenisten solujen. Elossa osa laskettiin jakamalla maljaustehokkuus käsitellyn näytteen pinnoituksen valvonnan tehokkuutta. Plating tehokkuus laskettiin jakamalla pesäkkeiden kanssa solujen määrän päällystetty. Raportoidut arvot ovat keskiarvoja kuuden rinnakkaisnäytettä kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) IR aiheuttaa elimellisen muutoksen A549 ja MDA-MB-231-solujen 24 tunnin kuluttua altistumisen (A549-8Gy, MDA-MB-231-4Gy). Suurennus kuva on × 100. Ct, hallita solu; IR, säteilytettyjä soluja.

vieressä tutkineet annoksesta ja ajasta riippuvia muutoksia CSC- ja EMT liittyviä merkki ilme. Johdonmukaisesti suhteessa aikaisempiin tutkimuksiin, IR lisääntynyt TGF-β signalointi kerroin pSmad2 /3, CSC merkki (CD44), EMT positiivinen markkereita (N-kadheriinin, vimentiinistä) ja transkriptiotekijöitä säätelevät EMT (Snail, β-kateniinin ), ja vähentynyt ilmentyminen EMT negatiivisia markkereita (E-kadheriinin, vinkuliinin) riippuvaisesti IR-annoksen tai aika molemmissa solulinjoissa (kuvio 2A ja 2B). Mielenkiintoista on, että ilmentyminen DLX2 lisäsivät myös IR molemmissa solulinjoissa. Annos-vaste-kokeet paljastivat, että DLX2 induktio havaittiin 8Gy A549 ja 4Gy tai suurempi MDA-MB-231 (kuvio 2A ja S1 kuviossa), ja aika-kokeet, osoitti, että DLX2 proteiinin tasot lisääntyivät dramaattisesti 24 tunnin kuluttua säteilytys molemmissa solulinjoissa (kuvio 2B ja S2 kuvassa). Lisäksi, IR laukaisi ylössäätely mRNA tasoilla stemness markkereita (Oct4, Sox2, LIF), transkriptiotekijöitä (Twist, Snail), ja etäpesäkkeiden markkereita (MMP2, MMP7) molemmissa solulinjoissa 24 tunnin säteilytyksen jälkeen yhden annoksen 8Gy A549-soluja tai 4Gy MDA-MB-231-soluja (kuvio 2C ja 2D).

(A) A549 ja MDA-MB-231-solut altistettiin IR 0-8Gy ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 h. Lysaatit alistettiin western blot-analyysi, jossa leimattu vasta-aineita. Kaksi erillistä koetta saadaan samanlaisia ​​tuloksia. (B) A549 ja MDA-MB-231-solut kerättiin 0/3/6/24 h kuluttua 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231). Lysaatit alistettiin western blot-analyysi, jossa leimattu vasta-aineita. Kaksi erillistä koetta saadaan samanlaisia ​​tuloksia. (C), (D) A549 ja MDA-MB-231-solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sen jälkeen, solut eristettiin Trizol ja suoritettiin reaaliaikainen PCR-analyysi kanssa leimattuja alukkeita. Kaikki tulokset saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta (*** P 0,001, ** P 0,01, * P 0,05 versus Ct). Ct, hallita solu; IR, säteilytettyjä soluja.

yli-ilmentyminen DLX2 parantaa EMT ja radioresistance

tutkia DLX2 voi ylössäätää säteilynkestävyys ja metastaattisen potentiaalin, A549 ja MDA-MB-231-soluja transfektoitiin ohimenevästi pcDNA3-myc-ilmentävä DLX2 tai pcDNA3-myc kontrollivektorilla, ja tutkimme ilmentymistä CSC: n ja EMT markkereita western blot -analyysillä. Yliekspressio DLX2 lisäsi ekspressiota CSC markkeri (CD44) ja EMT positiivisia markkereita (N-kadheriinin, vimentiinistä) ja väheni ilmentymistä EMT negatiivisia markkereita (E-kadheriinin, vinkuliinin) molemmissa solulinjoissa. Säteilytys indusoi samanlaisia ​​muutoksia näiden markkereiden DLX2 yli-ilmentymisen. Kuitenkin fosforylaatio Smad2 /3 oli hieman laskenut (A549) tai ei ole muuttunut (MDA-MB-231), jonka ilmentynyt DLX2 mutta kasvoi säteilytys molemmissa solulinjoissa. Yliekspressio DLX2 lisääntyneen ilmentymisen Snail A549 mutta ei MDA-MB-231-soluja. Ekspression β-kateniinin ei muuttunut DLX2 yliekspressio molemmissa solulinjoissa (kuvio 3A).

(A) Solut transfektoitiin 4 ug: pcDNA-myc /DLX2 tai pcDNA-myc ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solun irrotuksen jälkeen solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sen jälkeen solut lyysattiin ja lysaatit alistettiin western blot -analyysi. Kaksi erillistä koetta saadaan samanlaisia ​​tuloksia. (B) Soluja transfektoitiin 4 ug: pcDNA-myc /DLX2 tai pcDNA-myc ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solun irrotuksen jälkeen solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 6 h (A549), 3 h (MDA-MB-231), ja transwell ( migraatiokokeessa). Valokuvat ovat edustavia aloilla siirtynyt solujen kalvolla. Käyrä osoittaa keskimäärin siirtynyt solujen määrä kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SE (*** P 0,001 vs. vektorisäätö solut). (C) transfektoitiin 4 ug: pcDNA-myc /DLX2 tai pcDNA-myc ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solun irrotuksen jälkeen solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231), ja matrigeeliä ( invaasiomääritys). Valokuvat ovat edustavia aloilla hyökkäsi solujen kalvolla. Käyrä osoittaa keskimäärin hyökkäsi solujen määrä kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SE (*** P 0,001 vs. vektorisäätö solut).

tutkimiseksi metastaattista vaikutus DLX2 ja IR A549 ja MDA-MB-231-solujen, muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin. DLX2-yli-ilmennetään A549 ja MDA-MB-231-solujen osoittivat lisätä maastamuuttoa kyky 3 ja 4 taittuu, tässä järjestyksessä, verrattuna vektorisäätö (kuvio 3B). Myös altistuminen IR (8Gy A549-, 4Gy MDA-MB-231) lisääntyi siirryttäessä solujen lukumäärät 3,2 taittuu molemmissa solulinjoissa (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittivat, että DLX2 yliekspressio ja IR paransi merkittävästi solun liikkuvuus A549 ja MDA-MB-231-soluja. Sen tutkimiseksi, onko soluinvaasiota kyky oli lisääntynyt samalla tavalla IR tai DLX2 yliekspressio, A549 ja MDA-MB-231-soluja sovellettu hyökkäystä kammioihin ja numerot liimaa solut laskettiin. DLX2-yli-ilmennetään A549 ja MDA-MB-231-solujen osoittivat parantaa invasiivisen kyvyn 3 ja 5,3 taittuu, tässä järjestyksessä (kuvio 3C). Lisäksi altistuminen IR kasvoi hyökkääviä solujen lukumäärät A549 ja MDA-MB-231-solujen 2,5 ja 3,6 taittuu, tässä järjestyksessä (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen DLX2 tai IR paransi merkittävästi muuttavien ja invasiivisen kyvyn sekä ilmentyminen muuttuu CSC ja EMT liittyvien geenien A549- ja MDA-MB-231-soluja.

määräytyy ensi onko DLX2 lisäisi syöpäsolun selviytymisen säteilytyksen jälkeen. DLX2 yli-ilmentäviä A549 ja MDA-MB-231-soluja säteilytettiin 8Gy ja 4Gy, vastaavasti, ja sitten klonogeenisten-määritys suoritettiin. Elossa osa transfektoitujen solujen kontrollivektorilla laski säteilytyksen jälkeen verrattuna ei-säteilytettyjä soluja. Kuitenkin DLX2-yli-ilmentävät solut osoittivat merkittävästi suurempi eloonjäämisaste verrattuna vektori-transfektoiduissa soluissa säteilytyksen jälkeen (kuvio 4A ja 4B). Ei-säteilytetty soluja, pesäkkeiden muodostumisen ei vaikuttanut DLX2-yli-ilmentymisen (kuvio 4A ja 4B). Nämä tulokset osoittavat, että DLX2-yliekspressio ainakin osittain edistää radioresistance A549 ja MDA-MB-231-soluja.

Solut transfektoitiin 4 ug: pcDNA-myc /DLX2 tai pcDNA-myc ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 h. Solun irrotuksen jälkeen solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 7 päivää (A549), 10 päivää (MDA-MB-231) ja solujen kyky muodostaa klooneja mitataan by klonogeeniset määritys A549 (A) ja MDA-MB-231 (B). Valokuvat ovat edustavia levy selviytymisen soluja. Käyrä edustaa keskiarvoa kolmen erillisen kokeen ± SE (*** P 0,001 vs. IR altistuneet solut).

vaiennettu DLX2 estää IR aiheuttaman EMT ja radioresistance

Seuraavaksi tutkittiin, DLX2 hiljentäminen estäisi metastaattista potentiaalia ja radioresistance myönnettyjä IR. A549 ja MDA-MB-231cells transfektoitiin lyhytaikaisesti 50 uM siRNA of DLX2 (si-DLX2) tai si-RNA ohjaus (si-Ct) 24 tuntia ennen säteilytystä (8Gy A549, 4Gy MDA-MB-231) . Sitten olemme analysoineet ilmaus CSC ja EMT liittyviä geenejä, vaeltavat ja tunkeutuvat kykyjä, ja pesäkkeitä muodostavat kyky. Hiljentäminen DLX2 siRNA esti EMT osoituksena vähensi proteiinin tasot EMT positiivisia markkereita (N-kadheriinin, vimentiinistä) (kuvio 5A, S3 kuvassa ja S4 kuvassa) ja kohonnut taso EMT negatiivisia markkereita (E-kadheriinin, vinkuliini) säteilytettyyn A549 ja MDA-MB-231-soluja (kuvio 5A, S5 Kuva ja S6 Kuva). Esto DLX2 myös esti induktiota transkriptiotekijöiden kriittinen EMT (Snail ja β-kateniinin), ja CSC merkki (CD44) säteilytettyyn A549 ja MDA-MB-231-soluja. Mielenkiintoista on, että TGF-β signaloinnin tekijä, Smad2 /3, ei vaikuttanut si-DLX2 säteilytettyyn soluissa (kuvio 5A).

(A) Solut transfektoitiin 50 uM si-DLX2 tai Si- ct ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia, solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sen jälkeen solut lyysattiin ja lysaatit alistettiin western blot -analyysi. Kaksi erillistä koetta saadaan samanlaisia ​​tuloksia. (B) Soluja transfektoitiin 50 uM si-DLX2 tai si-Ct ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solun irrotuksen jälkeen solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 6 h (A549), 3 h (MDA-MB-231), ja transwell ( migraatiokokeessa). Valokuvat ovat edustavia aloilla siirtynyt solujen kalvolla. Käyrä osoittaa keskimäärin siirtynyt solujen määrä kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SE (*** P 0,001). (C) transfektoitiin 50 uM si-DLX2 tai si-Ct ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solun irrotuksen jälkeen solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231), ja matrigeeliä ( invaasiomääritys). Valokuvat ovat edustavia aloilla hyökkäsi solujen kalvolla. Käyrä osoittaa keskimäärin hyökkäsi solujen määrä kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SE (*** P 0,001).

tutkimiseksi antimetastaattisia vaikutusta si-DLX2 säteilytettyyn soluissa, muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin. DLX2-hiljentäminen MDA-MB-231-solujen hidastuu hieman muuttoliike kyky verrata si-Ct soluissa. Myös säteilytettyjä A549 ja MDA-MB-231-solujen transfektio si-DLX2 laski kulkeutuva solujen lukumäärät 1,7 taittuu verrattuna si-Ct transfektiota (kuvio 5B). Nämä tulokset osoittavat, että hiljentäminen DLX2 siRNA esti merkittävästi solun liikkuvuus A549 ja MDA-MB-231-soluja. Sen tutkimiseksi, onko soluinvaasiota kyky saatiin samalla vähennetään DLX2 vaiennettu, säteilytettyjä soluja levitettiin hyökkäystä kammioihin ja numerot liiman solut laskettiin. Ei-säteilytetty soluissa, DLX2-hiljentäminen esti invasiivisia kyky A549-solut 1,4 taittuu, mutta mitään merkittävää muutosta ei havaittu MDA-MB-231-soluja. Säteilytettyyn A549 ja MDA-MB-231-solujen transfektio si-DLX2 laski tunkeutuvat solujen määrä A549 ja MDA-MB-231-soluja 2,3 ja 2,2 taittuu, tässä järjestyksessä (kuvio 5C). Nämä tulokset osoittivat, että hiljentäminen DLX2 säteilytettyyn A549- ja MDA-MB-231-solujen estivät merkittävästi liittyvien geenien ilmentymistä CSC ja EMT, ja muuttavien ja invasiivisia kyky, joka indusoitiin IR.

Analysoimme seuraavaksi onko DLX2-hiljentäminen vaikuttaa syöpäsolun selviytymisen säteilytyksen jälkeen. A549 ja MDA-MB-231-soluja, jotka on transfektoitu si-DLX2 tai si-Ct säteilytettiin 4Gy ja 2Gy, vastaavasti, ja sitten pesäkkeiden muodostumista tutkittiin. Ei-säteilytetty soluissa, DLX2 hiljentäminen aiheutti lievää laskua on eloonjääntifraktio molemmissa solulinjoissa. Säteilytettyyn soluissa, DLX2 äänenvaimennusjärjestelmän lyijyä ylimääräinen lasku solujen selviytymistä merkittävässä määrin (1,5-kertainen pieneneminen A549- ja 1,6-kertainen pieneneminen MDA-MB-231) (kuvio 6A ja 6B). Nämä tulokset osoittivat, että hiljentäminen DLX2 tukahdutetaan IR-indusoidun EMT potentiaalia ja parantaa säteilyn herkkyys.

Solut transfektoitiin 50 uM si-DLX2 tai si-Ct ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Solun irrotuksen jälkeen solut altistettiin IR 4Gy (A549) tai 2Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 7 päivää (A549), 10 päivää (MDA-MB-231) ja solujen kyky muodostaa klooneja mitataan by klonogeeniset määritys A549 (A) ja MDA-MB-231 (B). Valokuvat ovat edustavia levy selviytymisen soluja. Käyrä edustaa keskiarvoa kolmen erillisen kokeen ± SE (*** P 0,001).

IR aiheuttama DLX2 ilmentymistä säätelee Smad2 /3

IR edistää EMT kautta Smad-riippuvainen TGF-β-signalointi syöpäsolulinjoissa [6, 27, 28], ja DLX2 on kohdegeeni Smad-riippuvainen TGF-β signalointi ja negatiivinen tekijä [34]. Siksi tutkimme yhdistys TGF-β signalointia IR aiheuttama DLX2 ilme. Säteilytys A549-soluja (8Gy) ja MDA-MB-231cells (4Gy) lisääntynyt määrä TGF-β1 erittyy elatusaineeseen (kuvio 7A). Myös IR edistänyt fosforylaatiota TGF-β signalointi kerroin Smad2 /3 (kuviot 2A, 2B, 3A, 5A ja 7C, S1 Kuva ja S2 Kuva). Kuitenkin, yli-ilmentyminen DLX2 pikemminkin hieman vähentynyt fosforylaatio Smad2 /3 (kuvio 3A). Fosforylaatio Smad2 /3 ei vaikuttanut joko si-DLX2 säteilytettyyn A549 ja MDA-MB-231-soluja (kuvio 5A). Siksi tutkimme seuraavaksi, onko induktio DLX2 IR säädellään Smad2 /3 signalointia. Smad2 /3 hiljentäminen siRNA kumosi IR aiheuttama DLX2 mRNA ilmaisu (kuvio 7B) ja DLX2 proteiinin ilmentymisen (kuvio 7C ja 7D). Nämä tulokset osoittavat, että IR-indusoidun DLX2 ilmentyminen on riippuvainen Smad2 /3-signalointia.

(A) tasot immunoreaktiivisen TGF-β1 kvantitoitiin solusta elatusaineeseen ELISA, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (*** P 0,001, ** P 0,01, versus Ct). Ct, hallita solu; IR, säteilytetty soluja. (B) Soluja transfektoitiin 100 uM si-Smad2 /3 tai si-Ct, inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Kokonais-RNA eristettiin soluista ja altistettiin reaaliaikainen PCR-analyysi. Käyrä edustaa keskiarvoa kolmen erillisen kokeen ± SE (*** P 0,001). (C) transfektoitiin 100 uM si-Smad2 /3 tai SI-Ct ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin IR 8Gy (A549) tai 4Gy (MDA-MB-231) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sen jälkeen, solulysaateista tehtiin Western blot -analyysiä. Kolmen erillisen kokeen saatu samanlaisia ​​tuloksia. (D) Protein kvantitoitiin densitometrillä. Tiedot esitetään suhteellisina arvoina kuin si-Ct jälkeen normalisoinnin β-aktiini (*** P 0,001, ** P 0,01, * P 0,05 versus si-Ct).

keskustelu

sädehoitoa on kriittinen osa syövän hallintaan, mutta jotkut elossa syöpäsolujen saada radioresistance [1] ja metastaattisen kyvyn [2] toistuva sädehoidon.