Krooninen sairaus

tiivistelmä

ilmentymistä tuumorisoluissa proteiinien poikkeavan rakenteen, ilmentymisen tai jakelun osuus kehittämiseen humoraalisen immuunivasteen. Autovasta (AAB) suunnattu kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) voi siten olla erityisen tärkeää syövän varhainen havaitseminen. Serologiset proteomianalyysi (SERPA) pyritään tunnistamaan tällaiset kiertävän AAB kautta immunoblottauksen 2D eroteltu tuumorisolun proteiinien syöpäpotilaan seerumista ja peräkkäiset MS tunnistaminen proteiinien reaktiivisten paikkoja. Tämän menetelmän etuna on käyttää modifioitu translaation jälkeen proteiinit lähteenä mahdollisten TAA. Täällä soveltanut tätä strategiaa käyttämällä kolorektaalisyöpäkasvainsoluja ennalta altistettu hypoksia edistämiseksi ilmaus mallia TAA todennäköisemmin edustaa

in vivo

olosuhteissa. Käytimme kaksi ihmisen HCT116 ja HT29 peräsuolen syövän solulinjoja altistettiin 48 tunnin ajan 1% O

2. Täplät jälkeen positiivinen immuno- 2D-erotettu lysaatit hypoksisten solujen seerumeista kasvainta kantavien hiirten, kerättiin ja analysoitiin MS: n proteiinin tunnistamiseen. Niistä hypoksia-spesifisten immunogeenisten proteiinien, olemme tunnistaneet fosforyloitua muotoa eukaryoottinen translaation pidennystekijä 2 (fosfo-Thr56 eEF2). Varmistimme fosforylaatio lisääntyy tämän proteiinin hypoksisiin kolorektaalisyöpäkasvainsoluja sekä hiiren kasvaimia. Käyttämällä erityistä immunomääritys, voimme havaita vastaavan anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB seerumissa kasvaimen kantavien hiirten (

vs

terveitä hiiriä). Olemme lisäksi dokumentoitu, että havaitseminen näiden AAB edelsi havaitsemisen ilmeni selvänä kasvain massa hiirillä ja validoitu läsnäolo anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB seerumissa sairastavien potilaiden adenomatoottisten polyyppien ja peräsuolen syöpä. Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa vahvistaa fosforyloitua muotoa eEF2 uutena TAA ja yleisemmin näyttää toteen, että sisällyttämällä hypoksian ylävirtaan SERPA tarjoaa osuvampia ohjelmistossa TAA pystyvät paljastaa läsnäolo verenkierrossa AAB.

Citation : Grandjean M, Sermeus A, Branders S, Defresne F, Dieu M, Dupont P, et ai. (2013) Hypoksia Integrointi Serologiset proteomianalyysi unmasks kasvainantigeenejä ja Fosters tunnistaminen Anti-Phospho-eEF2 Vasta mahdollisina Cancer Biomarkers. PLoS ONE 8 (10): e76508. doi: 10,1371 /journal.pone.0076508

Editor: Masaharu Seno, Okayama yliopistossa Japanissa

vastaanotettu: 24 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 27 elokuu 2013; Julkaistu: 10 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Grandjeanin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Fonds National de la Recherche scientifique (FRS-FNRS), Fonds de la Recherche scientifique médicale (FRSM), Action de Recherche Concertée päässä Communauté française de Belgiquen (ARC 09 /14-020), The Interuniversity Attraction Pole (IUAP ohjelma P7.03) ja J. Maisin Foundation. M. Grandjeanin on FRIA (Fonds pour la muodostumista à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture) tutkija. MS laitos on URBC-NARILIS tukivat FNRS (Bryssel, Belgia). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

panos kasvain mikroympäristön syövän etenemistä on nykyään hyvin tunnustettu [1]. Hypoksia on yksi näistä microenvironmental parametrien joiden osuus fenotyyppisiä muutoksia kasvaimissa [2] – [4]. Alhainen happipitoisuus kasvaimia syntyy epätasapainossa tarjonnan ja kulutuksen hapen lähinnä kypsymättömyyden kasvaimen verisuoniston ja nopea syöpäsolujen lisääntymistä vastaavasti [5]. Vastauksena kasvaimen hypoksia, kasvainsolujen hidastaa niiden proteiinisynteesiä koneita, kun samaan aikaan, induktio transkriptiotekijöiden, kuten HIF (hypoksia-indusoituva tekijä) edistää tietyn geenin ilmentymisen ohjelmat [6], [7]. Hypoksisia kasvainsoluja siten esittää proteomic profiili selvä ja normoxic kasvainsolujen, jossa etuoikeutetut proteiinien ekspression tarvitaan tukemaan Adaptaatiomekanismit mukaan lukien johtavat angiogeneesiä ja glykolyyttiset kytkin [8] – [10]. Mielenkiintoista on, hypoksia myös tärkeä rooli syövän synnyssä seurauksena alussa kasvainsolujen proliferaatiota epiteeli- pinnoille, jotka on erotettu taustalla verenkiertoa ehjä tyvikalvon [11]. Myös yhteys tulehdus ja syöpään ehdotetaan integroida hapenpuuteympäristössä kasvaneeseen aineenvaihduntaa ja solujen liikevaihto samalla mikrovaskulaarinen verkko ei ole (vielä) sovitettu [12]. Mielenkiintoista on, että peräsuolen Karsinogeneesin kasvain-karsinooma sekvenssi raportoitu liittyvän induktioon HIF-1α in syöpää edeltävät vauriot [13] sekä dysplasia [14]; HIF-2α raportoitiin myös edistämään etenemiseen adenooma sinoomaan [15].

Vaikka hypoksia tunnustetaan tunnusmerkki kasvainten osuus muutoksia kasvainsolun fenotyyppiin, se on toistaiseksi pitkälti aliarvioida lähde modulaatio rakenteessa antigeenien altis aiheuttaa immunogeenisen vasteen. Kasvaimeen liittyvien antigeenien (TAA) on kuvattu proteiineille, joita vapautuu kasvainsolujen tai peptidejä paljaina tuumorisolujen pinnalla tai antigeeniä esittelevät solut MHC-luokan I ja II molekyylit, vastaavasti [16] – [19]. Mutaatio, katkaisu, väärinlaskostumisen, yli-ilmentyminen ja ektooppinen proteiinien ilmentymisen kasvainsoluissa ehdotetaan selittämään immunogeenisyyden näiden TAA [20] – [22]. Mielenkiintoista, autovasta (AAB) suunnattu nämä modifioidut proteiinit ovat mahdollisia biomarkkereita syövän varhainen havaitseminen tai jopa ennusteen [23] – [26]. Spesifisyys ja vakaus vasta yhdessä suhteellisen helppo havaita edustavat merkittäviä etuja verrattuna muihin kiertävän veren komponenttien [19]. SERPA (serologinen proteomianalyysi) tekniikka hyödyntää erottamista proteiinilysaattien peräisin kasvainsoluista päälle kaksiulotteinen geelit ja peräkkäiset immunoblottaus käyttäen seerumia kerättiin syöpäpotilaista [25], [27], [28].

Tässä syistä altistua yli, päätimme yhdistää hypoksia koska ympäristön parametri SERPA työnkulun esi-inkuboimalla peräsuolen syövän soluja 1% O

2, jotta paljastaa TAA poissa tai havaita lysaateissa normoxic kasvainsoluja. Havaitsimme eri kasvain- ja hypoksia antigeenejä mukaan lukien fosforyloitua Thr56 muoto eukaryoottien elongaatiotekijä 2 (eEF2). Erillisen immunomääritys kehitettiin ja antaneet meille mahdollisuuden vahvistaa fosfo-eEF2 kuin

bona fide

hypoksian aiheuttaman TAA ja vastaavat AAB mahdollisina syövän biomarkkereita hiirillä ja ihmisillä.

Methods

etiikka lausunto

Kaikki kokeet, joihin hiiret ja kasvaimen soluihin sai hyväksynnän

Comité d’Ethique Facultaire

että

Leuvenin yliopistossa

(UCL) ( hyväksyntä ID 2012 /UCL /MD005); Hiiren tutkimukset suoritettiin kansallisen eläinten hoito määräyksiä.

Kaikki potilaat sairaalan vuodeosastolla Universitair Ziekenhuis Brussel (Belgia) ja antoi kirjallinen lupa samaa mieltä politiikan sairaalaan. Tämä sisältää anonyymiä käyttöä jäljellä kehon materiaalia tieteellisen tutkimuksen tarkoitukseen tiukasti mukaisesti Helsingin julistuksen ja artiklan 20.2 Belgian lain (19-12-2008), jotka liittyvät hankinta ja käyttö ihmisen Ruumiillinen Materiaalit Ihmisen Medical sovellukset ja tieteellisen tutkimuksen. Tämä artikkeli on lain mukaan suostumus tutkimukseen käyttää ihmisen biologisten materiaalien katsotaan annetuksi, jos luovuttaja ei ole ilmoittanut vastustavansa tällaiseen käyttöön. Käytännössä kaikki potilaat, joille kolonoskopia tehdään verikoe arvioitaessa niiden veri kaava ja hyytyminen; tämä menettely on pakollinen, jotta endoskooppiset resektio jos polyyppien löytyy. Mikään kirjoittajat oli mukana kokoelmien näytteet: jäljellä verinäytteet kerättiin sairaanhoitajan ja de-tunnistetaan tietohallintojohtajan ennen lähettämistä laboratorioon jota käytetään ainoastaan ​​nykyisen tutkimuksen.

Cells

Human kolorektaalisyöpää HCT 116 ja HT29 solulinjoja ostettiin American Type Culture Collection (ATCC), mukaan tallennetaan tavarantoimittajan ohjeiden ja käyttää 6 kuukauden kuluessa elvytys jäädytettyä erät. Molemmat solulinjat viljeltiin rutiininomaisesti McCoy 5A-alustassa (Invitrogen, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa normoxic (21% O

2, 5% CO

2) olosuhteissa alttiina hypoksian (1% O

2, 5% CO

2) on Invivo2 500 hypoksinen kammiossa 48 h (Ruskinn, Belgia).

hiiret

Male 7 viikon ikäinen uros NMRI (nu /nu) (Elevage Janvier, Le Genest Saint-Isle, Ranska ) injektoidaan subku- 2.10

6 HCT116 tai HT29; kasvain halkaisijat olivat viikoittain seurataan sähköisellä jarrusatula. Seerumit kerättiin serologista määrityksissä kautta retro-orbital puncture päivänä 0 ja joka viikko, kunnes tuumorin halkaisija on 8 mm. Lopussa joukko kokeita, hiiret tapettiin, veri kerättiin sisäisen sydämen reitti, seerumi erotettiin sentrifugoinnin jälkeen huoneenlämpötilassa ja kasvaimet kryosäilöttiin.

Potilaat

Sera oli kerätty potilailta, joille suoritetaan kolonoskopia ruoansulatuskanavan valituksia tai seulontaan. Kuusi koehenkilöillä oli normaali kolonoskopia ja käytettiin verrokkeina, neljätoista potilaalla oli adenomatoottisten polyyppien ja yhdeksän oli karsinooma; keskimääräinen iät näiden kolmen potilaista oli 71 ± 4, 67 ± 3 ja 71 ± 3 vuotta, vastaavasti. Verta kerättiin neutraali-tyypin putket ja sentrifugoinnin jälkeen, seerumi jaettiin eriin ja varastoitiin -80 ° C: ssa.

2-ulotteinen Elektroforeesi analyysi ja SERPA

Proteiinien uuttamiseksi, normoxic tai hypoksinen solut pestiin 20 mM natrium- fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) ja raaputettiin DIGE merkintöjä (DLA) lyysipuskuria (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% CHAPS ja 30 mM Tris, pH 8,5). Sitten supernatantti talteen sentrifugaation jälkeen 10 minuutin ajan 10000 rpm ja 4 ° C: ssa, ja konsentraatio määritettiin Bradfordin proteiinimäärityksellä.

SERPA kokeissa, 25 ug proteiinia uute vähän leimattiin 200 pmol syaniiniväriaine Cy5 (Amersham GE Healthcare) 30 minuutin ajan pimeässä jäällä, mukaan valmistajan protokollaa. Merkinnät Reaktio pysäytettiin inkuboimalla seosta 10 mM lysiiniä (Sigma Aldrich) 10 minuutin ajan. Ei leimatut proteiinit lisättiin saavuttaa yhteensä 250 ug proteiineja ja laimennettiin sopivalla latauspuskuria (4% 3 – [(3-kolamidopropyyli) dimetyyliammonio] -1-propaanisulfonaattia (CHAPS), 7 M ureaa, 2 M tioureaa, 30 mM Tris, 30 mM ditiotreitolia (DTT), 1% IPG-puskuria 3-11 [GE Healthcare]). Näytteet ladattiin nesteytyksestä ensimmäinen mitta nauha (Immobiline- DryStrip, pH 3-11 NL, 18 cm, GE Healthcare). Näytteet erotettiin 2 ulotteinen geelillä käyttäen isoelektrinen fokusointi ensimmäisessä ulottuvuudessa (300 V 3 tuntia, gradientti vaiheet 1000 V: ssa 8 tuntia, 8000 V: ssa 3 tuntia, ja 8000 V 45 minuutin ajan 20 ° C: ssa enintään nykyiset asetukset 50 uA kohti liuska) ja SDS polyarcrylamide geeliä (10% akryyliamidi) (SDS-PAGE) toisessa ulottuvuudessa. Proteiinit lopuksi siirrettiin alhaisen fluoresenssin PVDF-kalvolle. Membraaneja inkuboitiin 2 tuntia 5% rasvatonta maitoa, joka sisälsi Tris-puskuria, suolaliuosta ja 1% Tween (TTBS) estopuskurissa ja sitten altistuvat yön yli huoneenlämpötilassa joko ohjaus- tai tuumoreita kantavaa hiirtä seerumia 1% ei- rasvaton kuiva maito sisältävää TTBS (laimennus 1/100). Kutakin koetta varten, uima-allas kerättyjen seerumeiden 6 eri hiiriä käytettiin sen varmistamiseksi, että luotettavuutta seulontamenetelmällä. Immunodetektio suoritettiin käyttäen HRP-konjugoitua anti-hiiri-IgG-vasta-aineita ja ECL Plus-reagenssia (GE Healthcare). Membraanit skannattiin Cy5 aallonpituus on Typhoon FLA9500 Imager (GE Healthcare) havaitsemiseksi proteiinien ja on Cy2 aallonpituudella vasta-aineiden havaitsemiseksi, hyödyntää HRP-katalysoiman tuotanto fluoresoivan välituotteen emittoi 503 nm: n päässä Acridan substraatista sisältämät ECL Plus-reagenssia. Validointi SERPA kokeissa, membraaneja inkuboitiin kaupallista vasta-ainetta vastaan ​​eEF2 (Abcam, Cambridge, UK) ja HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1/5000, Jackson Immunoresearch, Sufolk, UK).

In Gel entsymaattinen pilkkominen ja massaspektrometria (MS) Identification

näyte elpyminen, leimaamaton proteiinit erotettiin 2D-elektroforeesilla. 2D-geelit olivat fluoresoivasti värjättiin (Krypton proteiini tahra, Pierce, Thermo Scientific) sen jälkeen, kun kiinnitys on 50% vettä, 40% etanolia ja 10% etikkahappoliuos, 1 h huoneen lämpötilassa. Proteiinit kohteita olivat automaattisesti poimittiin geelit käyttäen Ettan Spot Picker (GE Healthcare). Huuhtelun jälkeen, 2D geeli kohteet poistettiin vesi asetonitriilissä 37 ° C: ssa. Hajotus suoritettiin yön yli 37 ° C: ssa trypsiinin (12,5 ng /ml) 100 mM ammoniumbikarbonaattia. Uuttovaihe suoritettiin muurahaishappoa 5% 15 min ajan 37 ° C: ssa. Supernatantteja käytettiin sitten massaspektrometriaa proteiinien tunnistamiseksi, joilla on nano-LC-ESI-MS /MS maxis 4G UHR-TOF (Bruker). Kiinnostavia proteiineja tunnistettiin ansiosta Mascot ohjelmisto (Matrix Science, www.matrixscience.com). Sitten NCBI nonredundant proteiini tietokanta etsittiin nisäkkäiden taksonomian. Ainoa merkittävä osumia, määrittelemän Mascot todennäköisyys analyysi (p 0,001), hyväksyttiin ja Protein tulokset 63 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Immunoblottausmääritys ja immunohistokemia

immunoblotting ja immunovärjäys suoritettiin vasta-aineilla eEF2 (1/1000, Abcam) tai fosfori-Thr56-eEF2 (1/1000, Abcam). Geelilatauspuskuria oli normalisoitu aktiini vasta-aineella (Sigma-Aldrich). Paljastus on tehty anti-kani-lgG-vasta-ainetta yhdistettynä piparjuuriperoksidaasiin (Jackson ImmunoResearch) ja ECL Plus (GE). Sillä immunokemian, 5 um: n leikkeitä jäädytettyjen ksenosiirrettyjä HCT116 kasvaimia asennettu dioja immunovärjäämistä. Proteiinifosfataasi (proteiinifosfataasi, lambda, Calbiochem) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan validoimiseksi spesifisyys fosforyloidun immunovärjäyksen. Hoidon jälkeen fosfataasin, tuumorisektioiden koetettiin anti-eEF2 (1/50) tai anti-Thr56 fosforyloituu eEF2 (1/50) vasta-aineet ja immunovärjättiin anti-kani Alexa 488 (Invitrogen).

eEF2 immunoassay

määrät verenkierrossa vastaan ​​suunnattujen vasta fosforyloidun Thr56 eEF2 määritettiin oma immunomääritys. 96-kuoppaisille levyille (Reacti-Bind, Thermo Scientific) päällystettiin yön yli huoneen lämpötilassa 10 ug /ml 12 aminohapon fosforyloidun peptidin eEF2. Fosfopeptidi sekvenssi oli RAGETRFTDTRK, vastaa aminohappoja 50-61 ja eEF2 proteiinin, jossa fosforylaatio Thr56 (Eurogentec). Pinnoite ja estämällä vaiheet suoritettiin käyttäen ELISA pinnoite puskuria ja ELISA ultrablock (Abd Serotec) mukaan valmistajan ohjeiden. Laimennettu seerumit (1/100 hiiriä ja 1/200 ihmiselle) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen spesifisen hybridisaation mitattiin peroksidaasiin konjugoidun anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (laimennus 1/10 000, Jackson Immuno- Research) ja lisäämällä 3,3 ’, 5,5’-tetrametyylibentsidiini (TMB, Calbiochem). Levyt luettiin 450 nm: ssä VictorX4 mikrolevylukijalla.

Tilastot

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± s.e.m. Opiskelijan

t

testi ja ANOVA kokeita käytettiin tarvittaessa. * P 0,05, ** P 0,01 tai *** P 0,001 katsottiin tilastollisesti merkitsevästi eri kokeissa. Kliinisten tietojen osapopulaatiosta potilaista tunnistaa automaattisesti ajamalla K-means klusterointialgoritmi [29]; pairwise vertailuja selkeä profiilinsa kussakin kunto arvioitiin mukaan t-testin mukaan lukien Benjamini-Hochberg FDR korjaus monikerroille testiä [30].

Tulokset

SERPA tunnistaminen eEF2 AAB vuonna Serum of tuumoreita kantavaa hiirtä

matkia kasvaimen mikroympäristössä, ihmisen kolorektaalisen HCT116 ja HT29-solut altistettiin hypoksian (1% O

2) 48 tunnin ajan, aikaväli ilmentämiseen tarvittavan ja hypoksia-geenin, ohjelman proteiinin tason ja saada aikaan uusi tasapaino nopeudella kasvainsolujen proliferaatiota. Soluja ylläpidetään happiolosuhteissa (21% O

2) käytettiin kontrolleina. Sitten sovellettiin SERPA tekniikka tunnistaa hypoksia-spesifisiä kasvaimen antigeenejä (kuvio 1A). HCT116 ja HT29 lysaatit ensin erotetaan geelissä 2-ulotteinen elektroforeesilla ja siirrettiin kalvoille. Yhdistetyt seerumit kontrollista tai kasvain-hiiriä (6 seerumia per ehto) käytettiin sitten paljastaa paikkoja vastaavat immunogeenisiä proteiineja. Ero analyysi suoritettiin vertaamalla 4 eri olosuhteissa: lysaatit normoxic ja hypoksisia soluja tutkittiin seerumien ohjaus ja kasvaimen kantavien hiirten (kuvio 1 B). Tämä analyysi antoi meille mahdollisuuden hylätä kaksi tyyppiä kohteita: (i) ne, jotka vastaavat proteiineja, vasta-aineet tunnistavat kontrollista hiiren seerumeista ja (ii) ne, jotka vastaavat proteiineja, vasta-aineet tunnistavat päässä on kasvain, mutta se ei ole ilmaista hypoksiaolosuhteissa. Jäljellä kohteet kiinnostavia sitten leikattiin preparatiivisella geelit, pilkottiin trypsiinillä ja analysoitiin MS: n (kuviot 2 ja 3). Yhdistämällä molemmat HCT116 ja HT29-solulinjojen, löydettiin 17-proteiinien kanssa tyydyttävän Mascot tulokset (p 0,001), jotka vasta-aineet tunnistavat kasvaimeen kantavissa hiirissä, 4 hypoksia-spesifisten proteiinien ja 13, jotka vastaavat proteiineja, ilmaistaan ​​sekä hypoksisissa ja happiolosuhteissa (katso alempi paneelit kuvioissa 2 ja 3). Muilta Tämän tutkimuksen päätimme keskittyä hypoksia antigeeni tiukasti reaktiivinen seerumin kasvainta kantavien hiirten ja tunnistaa MS vahvin Mascot pisteet, eli eEF2 tai eukaryoottinen pidennystekijä 2.

. Työnkulun SERPA prosessin, mukaan lukien 2DE-geeli erottaminen lysaatit joko hypoksinen tai normoxic kasvainsoluja, kalvon siirtoa, immunoblottauksella seerumin kanssa joko ohjaus- tai tuumoreita kantavaa hiirtä, ja havaitseminen paikkoja kohteisiin. B. Tyypillisiä immunoblottauksella kuvioita, jotka johtuvat inkuboimalla 2D-ratkaistaan ​​lysaatit HCT116-solujen alttiina normoksia tai hypoksia, jossa on valittu hiiren seerumia. Pohjassa paneelit, proteiinit lysaatit merkitty Cy väriaine (punainen) ja kiinteän vasta-aineet detektoitiin anti-hiiri-vasta-ainetta (vihreä piste); Nuoli osoittaa proteiinin läsnäolo yksinomaan lysaateissa havaitun hypoksisten kasvainsolujen vasta-aineet seerumista kasvaimen kantavien hiirten.

kartoitus kohteet kiinnostavia vertailun tuloksena saatua kuvattu kuviossa 1 ja luettelo tunnistettujen proteiinien (p 0,001) saadaan käyttämällä lysaatit HCT116 peräsuolen syöpäsoluja.

kartoitus paikoista kohteisiin vertailun tuloksena saatua kuvattu kuviossa 1 ja listan tunnistettujen proteiinien (p 0,001), joka saatiin käyttämällä lysaatteja HT29 peräsuolen syövän soluja.

Ensinnäkin, vahvistaa luonteesta eEF2 proteiinin läsnä 2D geelit, me tutkittiin membraanin kaupallisesti saatavilla olevia anti-eEF2-vasta-aineen ja sen on todettu että immunoblot signaali Hyväksytty lokalisoinnin paikalla tunnistetaan SERPA analyysi (kuvio 4A). Lisäksi, tämä koe osoitti, jakelu proteiinin erilaiset isoelektriset pisteet (kuvio 4A ja 4B, yläpaneeli). Vuonna SERPA kokeessa kuitenkin yksi täplä (kolmas mukaan pl arvoalue) oli immunogeeninen (kuvio 4B, keskimmäinen paneeli), mikä viittaa vahvasti siihen, että translaation jälkeinen muutos voitaisiin antaa immunogeenisuutta.

. Edustavia immunoblottauksen 2D-erotettu lysaatit hypoksisten HCT116-solujen kaupallisella vasta-aineen eEF2. Proteiinit lysaatit merkitty Cy väriaine (punainen) ja sekundaarinen vasta-aine on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (vihreitä pisteitä). Positiivinen signaali saadaan useista paikoista on sama molekyylipaino, mutta eri niiden pl-arvon. B. Vertailu eEF2 havaittujen täplien kaupallisella vasta-aineen kokonaismäärä eEF2 (ylhäällä), seerumi on kasvain (keskellä) ja kaupallinen vasta-aine fosfo-Thr56 eEF2 (alhaalla). Spot 4 (äärimmäisenä oikealla spot) vastaa fosforyloitumaton muotoa eEF2 kun taas toinen paikkoja vastaavat monen fosforyloidun muotoja proteiinin; spot 3 (toinen paikalla oikealta) vastaa etuuskohteluun monophosphorylated muodossa eEF2 (on Thr56).

fosforylaatio Thr56 eEF2 jälkeen Hypoksia Human peräsuolen syövän solut

Koska fosforylaatiota eEF2 tiedetään esiintyvän vastauksena hypoksia (johtavat eEF2 inaktivoinnissa ja pidättäminen proteiini käännös), tutkimme laajuus eEF2 fosforylaatio Thr56 aikaisemmin kuvattu ensimmäinen ja tärkein jäännös muutettiin fosfaattiryhmä sisällä eEF2 sekvenssi [31]. Re-koettimena 2D käytetyn membraanin SERPA vahvisti, että paikalla tunnustettu seerumin kasvaimen kantavien hiirten positiivisesti myös värjättiin kaupallisen anti-fosfo-Thr56 eEF2-vasta-ainetta (kuvio 4B, alempi paneeli). Olemme myös vahvistaneet tavanomaisissa Western blotting kokeita, jotka eEF2 fosforylaatio Thr56 lisääntyi merkitsevästi hypoksinen HCT116-soluissa (p 0,01) ja että samanlainen suuntaus havaittiin HT29 (kuviot 5A ja 5B). Myös injektio HCT116-soluja hiiriin johti kehitystä kasvaimen tukevalla värjäytymisen fosfo-Thr56 eEF2 vahvistaa esiintyminen tämän translaation jälkeiset muutos

in vivo

(kuvio 5C, yläpaneeli). Tuumorin hoitoon osien fosfataasilla lambda kumosi kokonaan saatu värjäys kaupallisella anti-fosfo-eEF2 vasta-aineella (kuvio 5C, alapaneeli).

. Edustavia eEF2 ja fosfo-Thr56 eEF2 immunoblottauksen HCT116 ja HT29 viljeltiin 48 tuntia hypoksia (Hx) tai säilytetään normoksia (Nx). B. Normalisoitu ekspressio fosfo-Thr56 eEF2 in normoxic vs hypoksinen HCT116 ja HT29; n = 3, ** p 0,01 C. edustaja fosfo-Thr56 eEF2 immunovärjäyksen osien HCT116 kasvainten puuttuessa (ylhäällä) tai läsnäollessa (alhaalla) ja fosfataasi lambda; Huomaa täydellinen katoaminen fosforyloidun muodon eEF2 käsittelemällä fosfataasin.

validointi Phospho-Thr56 eEF2 kuin kasvaimeen liittyvän antigeenin ja Vastaavat AAB biomarkkerina Hiiren Tumor Growth

tutkia edelleen immunogeenisyyttä fosfo-Thr56 eEF2, olemme kehittäneet määrityksen koetin läsnäolon AAB reaktiivisen vastaan ​​fosfopeptidi 12 aminohapon reunustavat Thr56, vastaa aminohappoja 50-61 (kuviot 6A). Olemme validoitu lineaarisuuden tämän immunomääritys, jossa käytetään samaa kaupallista anti-fosfo-Thr56 eEF2 vasta-aine, kuten on kuvattu edellä (kuvio 6B). Ensimmäisessä koesarjassa käytimme allas 6 seerumit hiirillä suuria kasvaimia (so 28 päivää implantaation jälkeen) ja löysi 10-kertaa suurempi signaali kuin käytettäessä kontrolliseerumit (kuvio 6C). Toisessa koesarjassa, teimme ajan myötä tutkimuksen määrittää muutokset fosfo-Thr56 eEF2 signaalin mukaan kehittämiseen HCT116-kasvaimia. Seerumit kerättiin retro-orbital puncture hiirillä päivänä 0 ja 7, 14 ja 21 päivää injektion jälkeen HCT116-kasvainsoluja; kasvaimen kasvua mitattiin rinnakkain elektroniseen jarrusatula (kuvio 6D). Kuten kuviossa 6E, fosfo-Thr56 eEF2 signaali jo merkittävästi lisääntynyt päivänä 7 (p 0,05

vs.

Päivä 0), kun taas tällä hetkellä, kasvain ei vielä ollut havaittavissa (Fig. 6D) . Vuorokausina 14 ja 21, laajuus fosfo-Thr56 eEF2 signaali edelleen lisätä rinnan kasvua HCT116-kasvainten (kuviot 6D ja 6E).

. Ihmisen ja hiiren aminohapposekvenssit eEF2 alueella Thr56. 12 tähteet vastaava synteettinen peptidi (fosforyloitiin Thr56) käytetty meidän immunomääritys on merkitty (punainen kehys); Huomaa täydellinen identiteetti hiiren ja ihmisen välillä sekvenssit. B. havaitseminen kaupallisen anti-fosfo-Thr56 eEF2-vasta-aineita käyttämällä immunomääritys; katkoviivat esittävät 95%: n luottamusväli bändi regressioanalyysin. C. Detection of anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB seerumissa ohjaus- tai HCT116 kasvainta kantavien hiirten (n = 3). *** P 0,001. D. aikakäyrä HCT116 kasvaimen kasvua määritettynä mittaamalla kasvaimen halkaisija (n = 7 ryhmää kohden). E. havaitseminen anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB osoitettuna ajankohtana HCT116 syövän etenemiseen. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 (n = 6-7 ryhmää kohden). Huomaa, että päivänä 7 implantaation jälkeen, kasvaimet eivät ole havaittavissa (katso paneeli D), mutta positiivinen signaali havaitaan immunomääritys. F. Kaavio edustaa havaitseminen anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB seerumissa verrokeilla (n = 6), ja potilailla, joilla on adenomatoottisia polyyppejä (n = 14) tai karsinooma (n = 9). * P 0,05, ** P 0,01. Huomattavaa on, että K-means klusterointi tunnistettu kaksi alaryhmien potilaita (ks musta ja punainen symbolit) yksilöiden diagnosoitu adenomatoottisia polyypit (P 0,001) ja syövän (P 0,01); samaan osioon havaittiin 100 itsenäistä kulkee vaihtelemalla satunnainen alustuksen K-means algoritmi.

Anti-fosfo Thr56 eEF2 autovasta Identifiy Sub-populaatioissa Potilaat, joilla Colon ja -karsinooman

Lisäksi selvitettiin mahdollisuuksia havaitsemiseen anti-fosfo-eEF2 vasta syrjiä verrokkien ja potilaille, joilla on adenomatoottisia polyyppeja tai peräsuolen cacinoma. Koska identtisyyden hiiren ja ihmisen välillä eEF2 jäännöksissä reunustavia Thr56 (katso kuvio 6A), käytimme samaa immunomääritys potilailla kuin yksi edellä on kuvattu tuumoreita kantavaa hiirtä. Huomasimme, että potilaat diagnosoidaan adenomatoottisia polyyppien ja syövän osoitti kasvua fosfo-Thr56 eEF2 AAB tiitteri (P = 0,0015) verrattuna potilaisiin todettu negatiiviseksi seuraavat kolonoskopiaan (kuvio 6F). Lisäksi käytettäessä K-means klusterointi algoritmia (29), kaksi osapopulaatiosta potilaista voitaisiin tunnistaa joukossa adenomatoottisten polyypit (P 0,001) ja syövän ryhmät (P 0,01) (katso punaiset symbolit kuvassa 6F).

keskustelu

kaksi suurta tämän tutkimuksen tulokset ovat (i) että hypoksia tilit muuttamista immunoproteome osoituksena havaitsemisen kiertävän AAB suunnattu TAA havaita kasvainsoluissa viljelty normoxic olosuhteissa, ja (ii), että hypoksia-välitteistä stimulaatiota eEF2 fosforylaation tilien kehittämällä varhaisen AAB vastaus peräsuolen syövän kehitystä.

AAB on nykyään tunnustettu mahdollisiksi syövän biomarkkereita ja SERPA kehitettiin havaita ne seerumista yksilöt kautta blottaus 2DE eroteltu kasvain solulysaateista. SERPA tekniikka, toisin kuin Serex ja faagi-display, mahdollistaa havaitsemisen proteiineja, jotka ovat läpikäyneet translaation jälkeisiä modifikaatioita. Kuitenkin proteomin lysaateissa eristetty kasvainsoluja viljeltiin tavanomaisessa inkubaattorissa normoksia on kaukana edustaa proteomiin kasvainsolujen niiden

in vivo

mikroympäristössä. Erityisesti hypoksia on tunnusmerkki moniin syöpiin johtuvat epätasapainosta O

2 kulutusta ja O

2 saatavuutta huonosti vascularized kasvaimia. Vaikutus hypoksia kasvainsolun transcriptome ja Proteomi kaksinkertainen: samalla kun globaali translaatiokoneistolla on hidastunut vara energiaa, geenistä ohjelmia säätelevät keskeiset transkriptiotekijät, kuten HIF perhe, houkutellaan sallimaan kasvainsolun adaptaatio [6] . Tärkeintä, epiteelisyövissä kuten kolorektaalisyöpä, hypoksia ehdotetaan myös tapahtua varhain aikana syövän synnyn. Mutant solut todellakin aluksi erotetaan alla verisuonten jonka ehjä tyvikalvon: tämä johtaa kehitystä premalignien vaurioiden suonettoman alueilla ja kohti vastakkaista, vähemmän rajoitetusti alueilla [11].

nykyisessä tutkimuksessa, siksi käytetään kaksi analyyttistä suodattimien valita mahdollisia TAA edelleen validointi. Ensin ulkopuolelle täplät tunnistettu 2D kalvot jälkeen immunoblottauksella kerättiin seerumi ohjaus hiirillä. Toiseksi, emme pitäneet poiminta proteiinia, jotka havaitaan seerumin kasvaimen kantavien hiirten, mutta vain ilmaistu normoxic kasvainsoluissa. Tämä strategia saa vähentää vääriä positiivisia tuloksia ja suosimaan havaitsemiseen erityisten TAA kuten kohdatut

in vivo

olosuhteissa. Käytimme kahta erilaista peräsuolen syövän solulinjoissa (P53-villityypin HCT116 ja P53-mutantti HT29) edelleen lisätä monimuotoisuutta Proteome, ja erityisesti niiden immunoproteome. Tämä strategia johti tunnistamiseen yhteensä 17 otaksuttu TAA, 13 ilmentyy sekä hypoksia ja normoksia ja 4 ollessa yksinomaan ilmaistaan ​​hypoksiaolosuhteissa (katso kuvat 2 ja 3). Jälkimmäisten joukossa olemme keskittyneet eukaryoottitranslaatioon elongaatiotekijä 2 (eEF2), olennainen tekijä ribosomaalisen mRNA käännös. Hypoksia tiedetään edistävän eEF2 inaktivoitumisen estää paljon energiaa kuluttavien proteiinisynteesiä prosessiin, jotta säästää energiaa [9]. Inaktivointi eEF2 johtuu sen fosforylaatio Thr56 jonka eukaryoottinen elongaatiotekijä 2 kinaasia (eEF2K) kautta erilaisia ​​mekanismeja, joihin liittyy mTOR, AMPK ja PHD2 [32] – [34]. Me todellakin merkitty tämän fosforyloitua muotoa eEF2 kuin immunogeeninen proteiini. Vaikka useat fosforylaatiokohdat raportoidaan eEF2 osoituksena neljän täplien erillistä pl havaita yhteensä eEF2 vasta-, sijainti positiivisen paikalla SERPA muistutti fosfori-Thr56 eEF2 kuin seroreactive kokonaisuus. Toinen asento oikean on todellakin yhteensopiva edullisen fosforylaatiokohdan aiemmin raportoitu olevan Thr56 on kineettinen tutkimus sääntelystä eEF2 [31]. Sitten varmistettiin käyttämällä immunoassay modifioidun peptidin fosforyloituu on Thr56 jäännöksen, että tämä alueen osuus immunogeenisyyden eEF2 kuin havaittu omassa SERPA tutkimuksessa. Tätä määritystä käyttämällä havaitsimme, että anti-fosfo-Thr56 eEF2 AAB olivat havaittavissa hiiren seerumin ennen kasvaimia voi olla tunnusteltavissa. Lisäksi olemme havainneet, että nämä AAB voitaisiin havaita ihmisillä adenomatoottisia polyyppeja ja peräsuolen syöpiä.