Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haiman adenokarsinooma (PAC) on yksi vaikeimmista kasvainten hoitoon. Suuri osa tästä johtuu myöhään diagnoosin. Tunnistaa biomarkkereita varhaiseen havaitsemiseen, tutkimme DNA metylaatio eroja valkosolujen DNA välillä PAC tapauksissa ja valvonnan kaksivaiheisen tutkimuksen. Vaiheessa I, mittasimme metylaatiotasoilla at 1505 CpG sivustoja hoitamattomilla valkosolujen DNA 132 ei-tupakoitsija PAC potilaista ja 60 koskaan tupakoi tervettä verrokkia. Löysimme merkittäviä eroja 110 CpG sivustoja (väärä löytö asti 0,05). Vaiheessa II testasimme ja validoitu 88 96 vaiheen I valinnut CpG sivustoja 240 PAC tapauksissa ja 240 verrokkia (p≤0.05). Käyttämällä rangaistaan ​​logistinen regressio, rakensimme ennustemallin koostuu viidestä CpG sivustoja (IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817) että syrjitty PAC potilaita valvonta (C-tilastoa = 0,85 I vaiheessa; 0,76 vaiheessa II). Kiinnostavaa, yksi CpG sivusto (LCN2_P86) yksin voisi syrjiä kokoisen potilaita valvonta (C-tilastoa = 0.78 I vaiheessa; 0,74 vaiheessa II). Olemme myös suorittaa metylointi polygeeninen ominaisuus (methQTL) analyysi ja tunnistaa kolme CpG sivustoja (AGXT_P180_F, ALOX12_E85_R, JAK3_P1075_R) jos metylaatiotasoilla liittyi merkittävästi yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) (väärä löytö asti 0,05). Tuloksemme osoittavat, että epigeneettisiä vaihtelu helposti saatavissa leukosyyttien DNA, joka ilmenee toistettavissa metylaatioerojen, voidaan käyttää havaitsemaan Pac potilaille. Metylointi erot tietyissä CpG sivustot ovat osittain johtuvat geneettistä vaihtelua. Tämä tutkimus tukee vahvasti tulevaisuuteen epigenome laajuinen yhdistys tutkimuksessa käytetään valkosolujen DNA biomarkkereiden löytö ihmisen sairauksiin.

Citation: Pedersen KS, Bamlet WR, Öberg AL, de Andrade M, Matsumoto ME, Tang H, et al. (2011) Leukosyyttien DNA Metylointi Signature Derivoi Haimasyöpä Potilaat terveistä Controls. PLoS ONE 6 (3): e18223. doi: 10,1371 /journal.pone.0018223

Editor: Hana Algul, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 17 marraskuu 2010; Hyväksytty: 24 helmikuu 2011; Julkaistu: 24 maaliskuu 2011

Copyright: © 2011 Pedersen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Mayo Clinic SPORE in Haimasyöpä (P50 CA102701) ja Department of laboratoriolääketieteen ja Pathology, Mayo Clinic. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PAC) on 10

th yleisin kasvain tyyppi miesten ja naisten vuosittain ilmaantuvuus Yhdysvalloissa ja neljänneksi suurin syy syövän kuolleisuus [1]. PAC liittyy erittäin huono ennuste, koska se on edelleen yksi vaikeimmista kasvainten hoitoon. Suuri osa tästä voi johtua myöhään, jossa syöpä on yleensä havaita. Vuosina 1999 ja 2006, vain 8%: lla potilaista todettiin, usein satunnaiset päätelmää radiologisia kuvantaminen kello lokalisoitu vaiheessa, kun välittömästi poistettu kirurgisella ja myöhemmät hoito voidaan katsoa [2]. Tällä hetkellä ei ole olemassa suositeltavaa seulonta toimenpiteitä [3]. Muutamaa mitään tunnusomaisia ​​oireita ja tunteeton menetelmät varhaiseen havaitsemiseen, parantava interventio on harvinaista.

Epigenetiikka tärkeä rooli taudin kehitystä, koska se yhdistää ydinvoiman uudelleenohjelmointi kehityksen aikana, ympäristön aiheuttamat muutokset kehossa, ja kyky solujen reagoida asianmukaisesti ulkoisiin ärsykkeisiin [4]. Epigeneettiset vaihtelut ovat periytyviä muutoksia geenien ilmentymisen, jotka tapahtuvat ilman muutosta DNA-sekvenssissä itse. DNA: n metylaatio, histonimodifikaation ja microRNA sääntely voi muuttaa geenien ilmentyminen profiileja. Nämä ilme muutokset johtavat usein poikkeava kasvuvauhtiin kasvainsolujen [4].

Useat tutkimukset osoittavat havainnot, että DNA: n metylaatio profiili on syvästi muuttunut ihmisen syövissä, joissa globaali menetys DNA: n metylaation ja promoottori hypermetylaation ovat sekä raportoitu [5], [6]. PAC, aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet paneeli geenejä, jotka ovat poikkeavasti metyloitu ja vaiennettu kasvainkudoksissa, kuten

ppENK

,

SPARC

,

TFPI2

,

FOXE1

,

NPX2

,

TSLC1

,

p16

,

p14

,

p57

, ja

CCND2

[7] – [12]. Nämä geenit ovat voimakkaasti metyloitavaa haiman kasvain kudosten ja harvoin metyloitavaa hyvänlaatuinen haiman kudoksissa [13]. Tuore tutkimus kertoo, että ilmentyminen 58 geenien säädeltiin ero metylaatio. Lisäksi, 10 metylointi markkereita, jotka liittyvät muuttuneeseen geenien ilmentymisen kriittinen

gemsitabiini

reagoida [14]. Nämä tutkimukset on tehty käyttämällä joko

in vitro

järjestelmissä, kuten solulinjat, tai

in vivo

kanssa haimanesteessä näytteitä ja primäärikasvain kudoksia, joita on vaikea saada syövän seulontaa johtuen invasiivisia kyseessä olevien näytteiden menettelyjä [13]. Koska riskejä, kustannuksia ja vaikeuksia saada haiman eritteiden ja kudosten varhaisen diagnoosin, vähän invasiivisia tekniikkaa kuten näytteenoton veri on enemmän toteuttamiskelpoinen lähestymistapa seulonnassa.

Differential metylaatio välillä syöpäpotilaiden ja normaalit kontrollit on ollut raportoitu perifeerisen veren DNA: t, vaikka tiedetään vähän PAC [15] – [18]. Moore

et al.

[16] ilmoitetaan yhteenliittymän valkosolujen DNA hypometylaatio virtsarakon syöpä, riippumaton tupakointi ja muut arvioitiin riskitekijät. Widschwendter

et al.

[18] tarkasteltiin lokus-erityisiä metylaation ja totesi, että erityisesti DNA metylaatiovyöhykkeiden ääreisverenkierron voivat toimia sijaismarkkereita rintasyöpä. Tuoreessa pienisoluinen keuhkosyöpä tutkimus, metylointi profilointi analyysi valkosolujen DNA tunnisti kaksi CpG-sivustoja, jotka yhdessä syrjitty syöpäpotilaiden ulkopuolisista syövän valvontaa [17]. Nämä tulokset osoittivat, että metylaatiostatuksen leukosyyttien DNA yksilöiden saattaa tarjota hyödyllisen biomarkkereiden mahdollisten varhainen havaitseminen ja erotusdiagnoosia. Tunnistaa metylaatio merkkiaineita kliinisiä sovelluksia, tarkastelimme metylointi profiileja kaksivaiheisen tapauskontrollitutkimuksessa, johon kuului ehdokas markkeri löytö ja validointi sekä rakentamisen ennustemallit.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki koehenkilöt edellyttäen kirjallinen lupa; ja tutkimuksen hyväksyi Mayo Clinic IRB.

Tutkimuskanta

PAC indeksi tapaukset olivat aikuisille, joilla on histologisesti vahvistettu ensisijainen haiman adenokarsinooman nähty Mayo Clinic välillä 01 lokakuu 2000 ja 1. kesäkuuta 2006. hyväksyttävät Mayo haiman adenokarsinooma tapauksessa havaittiin läpi erittäin nopea potilaan tunnistusjärjestelmä ja värvätään mahdolliselle tutkimuksen rekisteriä. Tutkimus koordinaattorit tunnistettu potentiaalisia potilaita sähköisen potilaan aikataulujen järjestelmää ja päivittäin patologiaraporteista. Kaikki sopivaa potilasta yhteyttä joko klinikalla aikaan niiden tapaamista tai myöhemmin postitse tai puhelimitse, jos klinikalla nimi ei ole mahdollista. Jos yhteyttä klinikalla, tutkimuksen koordinaattori saatu tietoon perustuvan suostumuksen, järjesti injektiokanyyli 40 ml verta ennen hoidon aloittamiseen (aina kun mahdollista), ja pyysi osallistuja loppuun tutkimuksen kyselyyn. Jos sähköpostiyhteystiedon tarvittiin (noin 28% tapauksista lähestyttiin postitse), tutkimuksen koordinaattori postitetaan kutsukirjeen potilaan kotiosoite. Seurantatutkimus puhelu tehtiin, jos näyte tai lomakkeet ole saanut 1 kuukauden. Noin 74% kaikista tukikelpoisista Potilaita oli rekisteriin. Rekisteristä, valitsimme 132 koskaan tupakoi potilaista vaiheen I ja 240 potilasta faasin II kanssa yhtäläinen edustus sukupuoli, tupakointi (tupakoitsija /nonsmoker) ja vaihe Pac (resektoitavissa, paikallisesti edennyt ja metastaattinen).

terve valkoihoinen verrokit valittu Mayo Clinic perustuva tutkimus rekisterin ensihoidon verrokeilla ottaa rutiinitarkastus-up käyntiä (yleinen lääkärintutkimuksen) välillä 01 toukokuu 2004 ja 31. elokuuta 2006. Kontrollit taajuus-sovitettu tapauksiin iästä (± 5 vuotta), sukupuoli, ja valtion /asuinalueen jakelun tapauksista. Valvonta ei ollut aiemmin diagnosoitu syöpä (lukuun ottamatta ei-melanooma ihosyöpä) aikaan ilmoittautuminen. Ennen nimittämistään, potentiaalinen valvonta postitettiin tiedotteen tutkimusta kuvaava ja kutsukirjeen. Päivänä nimeämisen, tutkimus assistentti lähestyi aihetta, vahvisti kelpoisuusehdot, ja saatua lupaa. Kukin osallistuja tehty tutkimus kyselyt (johon sisältyi itsestään raportin pituus, paino, ja diabetes tila) ja säädetty 30 ml tutkimusta verinäytteestä. Noin 70% kaikista lähestyi valvonnan Tutkimukseen osallistui. Tästä rekisterin valitsimme 60 koskaan tupakoitsija säätimet vaiheen I ja 240 säätimet (puolet ovat tupakoimattomia) vaiheen II.

DNA muutokseen, natriumbisulfiitti

uutettu DNA 5 ml Koko veri hyödyntäen AutoGen Flexstar (AutoGen, Inc., MA) ja muutettu genomi-DNA näytteet käyttäen EZ DNA metylointi Kitin Zymo Research Corporation (Orange, CA), jotka yhdistettiin bisulfiittikonversion ja DNA puhdistusta. Pakki perustuu kolmivaiheisen reaktio, joka tapahtuu välillä sytosiinin ja natriumbisulfiittia jossa sytosiini muuntuu urasiili. Käytimme 1 ug genomista DNA: ta Ääreisverenkierrosta DNA muuttamiseksi kohti valmistajan suosituksen. Käsitellyn DNA: n näytteet säilytettiin -20 ° C: ssa ja analysoitiin kahden viikon kuluessa.

DNA: n metylaatio profilointi analyysi

Illumina (San Diego, CA) GoldenGate metylaatio BeadChip (syöpä paneeli) ja Illumina mukautetun VeraCode metylaatiomääritystä käytettiin vaiheen I ja vaiheen II, vastaavasti, valmistajan ohjeiden mukaisesti. Me kuvattiin taulukot käyttäen BeadArray Reader skannerin (Illumina, Inc.). Osuus metyloitu (β-arvo) kussakin CpG laskettiin käyttäen BeadStudio Software (Illumina, Inc.) vähentämisen jälkeen tausta intensiteetti, joka lasketaan negatiiviset kontrollit, jokaisesta analyysitulokset pisteen. Β-arvo edustaa suhteellista suhdetta fluoresoivien signaalien välillä M (metyloitu) alleeli ja M + U (metyloitumaton) alleelit. Tämä arvo vaihtelee jatkuvasti 0 (metyloitumaton) 1 (täysin metyloitu).

Differential metylointianalyysi

Koska ei-Gaussin jakauma CpG metylaation arvoja, käytimme Wilcoxonin Rank Sum testit tutkia eroja mediaani β-arvot tapausten ja kontrollien välillä sekä vaiheiden I ja II. Korjaa useita testaus ensimmäisessä vaiheessa, käytimme q-arvoja edustamaan väärien löytö määrä (FDR) [19]. CpG: t, joilla on FDR q-arvo ≤0.05 tason pidettiin merkittävinä. Nämä CpG: t olivat sitten ehdokkaita vaiheen II validointi, jossa p-arvo ≤0.05 katsottiin merkitseväksi. Bland-Altman tonttien ja Spearmanin korrelaatiokertoimen käytettiin arvioimaan välille sopimuksen metylaation määrityksissä että 40 aiheet määritettiin sekä vaiheen I ja vaiheen II. Bland-Altman tonttien voidaan arvioida määrityksen erimielisyyttä funktiona tason metylaation [20].

methQTL analyysi

Käyttämällä Plink (https://pngu.mgh.harvard.edu/~ Purcell /plink /) tätä tutkimusta varten, suoritimme kvantitatiivisen ominaisuuden yhdistys analyysi käsittelemällä kunkin CpG β-arvo kuin fenotyyppi (kvantitatiivinen piirre), ja SNP genotyyppien peräisin edeltävästä genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa (GWAS) kuin ennustaja [21]. FDR laskettiin p-arvot määrällisistä piirre yhdistys Wald testi. CpG-SNP parittain FDR ≤0.05 pidettiin merkittävinä (eli näyttöä SNP – CpG metylaatio yhdistys). Koska ikä, sukupuoli, tupakointi ja selvitysvaiheessa voivat vaikuttaa metylaatio tasoilla, methQTL analyysi oikaistu näistä muuttujista. Tämän analyysin tulokset käytettiin arvioimaan geneettistä vaikutusta CpG metylaatio.

Prediction pienoismallit

Kehitetään ennustemallit, käytimme todennäköisyys rajat validoitu rangaistaan ​​logistinen regressio malleja, jotka toteutetaan joko L1 rangaistus (Lasso) [22] tai L2 rangaistuksen (Ridge) käyttäen R paketti ”rangaistaan” [23]. Suopungin malli (tai L1 rangaistus) hyödynnettiin vaiheen I testaus tutkimuksessa, koska se toivottava ominaisuus mallin valinta, joka on minimaalinen vaikutus niihin liittyvien CpG kertoimien ja asettaa assosioitumattomat CpG: t ”kertoimet nollaan. Harjanteen regressiomallia (tai L2 rangaistus), joka kutistuu kaikki kertoimet pieniin arvoihin, mutta ei nollaa myös harkita mallin rakentamiseen. Muuttujan valintaprosessi säätelee parametri, joka pakottaa kaikki kertoimet on kutistunut lähelle nollaa ensin, sitten vapautuu vähitellen vähentää kutistumista. Optimaalinen arvo tämän parametrin määritetään kautta rajat validointi. The Ridge Mallitulosten verrattiin myös tuloksia Lasso mallista hioa lopulliseen malliin.

Lopullinen malli tunnistettu kautta rangaistaan ​​lähestymistapoja oli silloin kunnossa kuin yleistetty lineaarinen malli (logistinen regressio) käyttämällä R paketti ’ GLM ”, jotta voitaisiin arvioida pinta-ala (AUC) vastaanotin toimii (ROC) käyrä kunkin mallin. Mallit asennettiin sekä testaus setti (vaihe I) ja validointi asetettu (vaihe II) erikseen AUC raportoitu kunkin mallin. Perustuu kunkin sovitetun mallin, todennäköisyys kunkin ollessa kyseessä (kontrolli) laskettiin. Jos todennäköisyys olla tapaus oli suurempi kuin 0,50 yksittäiset olisi luokiteltu tapaus. Herkkyys määritellään prosenttia tapauksista luokiteltu oikein tapauksissa mallin. Spesifisyys on prosentin valvonnan luokiteltu oikein valvonnan mallin.

Lisäksi oikaisemattomaan malliin (vain CpG: t), kaksi mallia asennettiin, joka pidetään iän, sukupuolen ja ensimmäisen asteen suvussa kovariantteja ja toinen, joka myös harkita ABO veriryhmä ( ’O’ vs ei-O) ylimääräisenä kovariaattina. ABO veriryhmien johdettiin potilasalaryhmässä joka oli GWAS genotyyppi tiedot [21] käytettävissä. Vaiheen II mallien sovitettiin kahdella tavalla. Ensinnäkin kertoimet faasin I pidettiin kiinteä ja syrjintää arvioidaan. Toiseksi, koska määritys alusta muuttunut faasien I II, mallit sovitettiin mahdollistaa kertoimien arvioidaan uudelleen.

Tulokset

tunnistaminen erilaisesti metyloitua CpG sivustoja vaiheessa I

vaiheen tutkimme 132 koskaan tupakoi potilaiden Pac ja 60 koskaan tupakoi tervettä verrokkia. Johtuen kemo- tai sädehoitoa ennen otettiin verta, 13 potilasta jätettiin pois tästä analyysistä. Arvioimme metylaatiostatuksen (β arvot) 1505 CpG sivustoja leukosyyttien DNA: iden jäljellä 119 tapausta ja 60 kontrolleihin (taulukko 1). Koska merkittäviä metylaatioerojen X-kromosomissa on olemassa miesten ja naisten välillä, analysoimme CpG sivustoja autosomeiksi ja sukupuolikromosomi erikseen. Nämä analyysit tunnistettu merkittäviä eroja PAC potilaiden ja verrokkien 110 CpG sivustoja 92 itsenäistä geenejä (FDR ≤0.05). 109 110 merkittäviä CpG sivustot sijaitsivat autosomeiksi. Taulukossa 2 luetellaan 10 merkittävin CpG sivustoja I vaiheen tutkimus.

arvioida mahdollisten sukupuolieroja, vertasimme 1421 peittyvästi CpG sivustoja miesten ja naisten välillä. Havaitsimme merkittäviä eroja 71 CpG sivustoja, kun yhdistetään tapauksissa ja valvontaa. Kun analysoidaan nämä CpG sivustoja tapausten ja kontrollien erikseen, havaitsimme erot 44 CpG sivustoja PAC potilaille ja 6 CpG sivustoja valvontaa (taulukko S1). Arvioimaan mahdollisia metylaatiomuutokset aikana syövän etenemiseen, selvitimme metylointi erot kolmessa vaiheessa Pac sisällä tässä potilasryhmässä 31. resektoitavissa, 45 paikallisesti edennyt, ja 43 metastaattisen tapauksissa. Vaikka yhdeksän CpG sivustoja osoitti suuntaus yhdessä kliinisessä vaiheessa (p 0,01) (taulukko 3), data-analyysi ei paljastanut merkittävää eroa kolmen vaiheen (kaikki CpG sivustojen FDR 0,05).

Validation valittujen CpG sivustojen vaiheen II

validoimiseksi differentiaalisesti metyloitu CpG määritetyillä alueilla I vaiheen osana laajempaa potilaiden lukumäärä ja laajempaa demografisia ominaisuuksia, suunnittelimme mukautetun VeraCode metylaatiomääritystä (Illumina, Inc.) ja tutkittiin 96 110 merkittävää CpG sivustoja 240 PAC tapauksissa ja 240 verrokkiin. 96 CpG sivustot valittiin mukaan mediaani β erot tapausten ja kontrollien välillä. CpG sivustoja samanlainen mediaani β eroja, CpG sivustot pienempiä FDR valittiin. Niistä 480 aiheita, 40 vaiheen I henkilöillä (20 tapausta ja 20 ohjaa) sisällytettiin, jotta voidaan verrata, missä määrin kyseisten kahden metylointi määrityksissä. Bland Altman tontteja [20] osoitti hieman keskiarvon muutos ja jatkuva vaihtelu erimielisyydet arvoalueella (kuvio 1), mikä osoittaa kohtuullinen välinen sopimus kahdesta analyysistä. Molemmat määritykset olivat merkittävästi korreloi odotetusti kaikkien 96 CpG sivustoja. Mediaani Spearmanin korrelaatiokertoimen r oli 0,94 (vaihteluväli 0,84-0,96).

edustaja Bland-Altman kuvaaja yhdessä aineessa osoittaa hyvää välisen vaiheen I ja vaiheen II tiedot useimpien 96 CpG sivustoja. Jokainen piste edustaa yhtä CpG-sivuston. Mean metylaatio tasolla kunkin CpG-sivuston (0-100%) on esitetty x-akselilla. Metylointi tasoero kunkin CpG-sivuston välillä vaiheen I ja vaiheen II on esitetty y-akselilla. Katkoviivat 95%: n luottamusväli ero kahden määrityksissä ja kiinteä viiva osoittaa keskimääräistä eroja kahden määrityksissä.

Niistä 220 PAC potilailla, jotka olivat ainutlaatuisia vaiheeseen II, 47 potilasta oli hoidettu ennen verta otettiin. Vertasimme metylaatiotasot näiden 47 käsiteltyjen tapausten ja 173 ei-käsiteltyjen tapausten arvioimiseksi käsittelyn vaikutus metylaatiostatuksen näiden valittujen CpG sivustoja. Kaksi CpG-sivustoja (TAL1_P817_F ja CSF3_E242_R) osoitti nimellinen eroja (p = 0,001 ja 0,025, vastaavasti), vaikka nämä tulokset voivat johtua sattumasta, koska suuri määrä vertailuja. Kaiken kaikkiaan olemme eivät havainneet merkittävää hoidon vaikutusta metyloinnin näiden valittujen CpG sivustoja. Vastaavasti, ei ole vaikutusta johtui tupakoinnin historia (tuloksia ei ole esitetty). Lopuista 220 valvonta, viisi ylimääräistä kontrollit ulkopuolelle johtuu riittämättömästä laadusta, jättäen 215 säätimet, jotka olivat ainutlaatuisia vaiheen II (taulukko 1). Kaikkiaan 173 ei-käsiteltyjen tapausten ja 215 valvontaa analysoitiin vaiheessa II. Wilcoxonin Rank Sum Test havaitsi merkittävän eron (p≤0.05) in 88 96 valitun CpG: t. Mikä tärkeintä, kaikki 88 nämä validoitu CpG sivustoja vaiheessa II osoitti myös samansuuntaisesti metylaation muutoksen vaihe I (kuva 2). Näistä 23 ja 65 CpG sivustoja osoittivat hypermetylaation ja hypometylaatio PAC potilaista. Taulukossa 2 luetellaan 10 merkittävin CpG sivustoja faasin II tutkimuksessa (taulukko S2 sisältää tilastotietoja 96 CpG sivustoja molemmissa vaiheissa I ja II).

parvikuvio osoittaa toistettavia metylaatio erot vaiheen I ja vaiheen II . Wilcoxonin Rank Sum z-arvot piirrettiin x-akselille (vaihe I) ja y-akselilla (vaihe II). 88 96 CpG sivustoja todensi p-arvo ( 0,05) ja suunta (hyper /hypo-metylaatio). Vaikka 8 CpG sivustot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä, suuntauksia molemmissa vaiheissa ovat kaikki samoja.

geneettinen vaikutus DNA: n metylaatio

tutkinut, oliko mitään geneettistä vaikutusta CpG metylaatio olemme taantuneet metylointi taso (β-arvo) kullekin 96 vaiheen II CpG sivustoja vastaaviin SNP genotyypeissä 1 megatavun kohteena CpG sivuston. Oli 16217 genotyyppi SNP ympäröivä 96 CpG paikkoihin, joissa on pieniä alleelifrekvensseiltään ≥0.1. 135 valvontaa ja 194 potilaalla oli SNP genotyyppi tiedot. Käyttäen lisäaineen malli ja korjattuna iän ja sukupuolen, tunnistimme 33 CpG-SNP parit (methQTLs) kontrolleissa ja 99 methQTLs PAC tapauksia, joissa FDR ≤0.05 (kuva 3 ja taulukko S3). Näistä 24 methQTLs jaettiin molempien tapausten ja valvontaa. Nämä yhteiset methQTLs mukana kolme riippumatonta CpG sivustoja. MethQTLs vahvin yhdistysten kolmen CpG sivustot olivat ALOX12_E85_R ja rs434473 (FDR = 1,66 x 10

-25 kontrolleissa ja 3,01 x 10

-14 potilailla), AGXT_P180_F ja rs4675872 (FDR = 1,83 x 10

-9 kontrolleissa ja 3,73 x 10

-15 potilailla), ja JAK3_P1075_R ja rs7245564 (FDR = 1,89 x 10

-4 kontrolleissa ja 3,48 x 10

-4 potilailla), vastaavasti (taulukko 4). Etäisyydet SNP ja kohde CpG: t olivat alle 15,5 Kb kaikille kolme paria raportoitu täällä. Olemme myös suoritti methQTL analyysi säätämisen vaiheissa tutkimuksen ja /tai tupakoinnin historiaa lisäksi iän ja sukupuolen. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​säädettäessä ikä ja sukupuoli yksin (taulukko S3).

metylaatiotasoilla kullekin 96 CpG sivustoja oli taantunut kappaleeseen joitakin pieniä alleeleissa lähistöllä (+/- 1 Mb) SNP . CpG sivustoja asetettiin x-akselilla perustuu niiden järjestys kromosomaalisen sijainnin. Y-akseli oli -log10 of methQTL p-arvo säätämisen jälkeen ikä ja sukupuoli. Koko jokainen piste oli verrannollinen merkitystä jokaisen p-arvon. A. ohjaus vain methQTLs ja B. tapauskohtaisesti ainoastaan ​​methQTLs.

Rakennus- ja validointi ennustemallissa

Rakentaa ennustemallit perustuvat vaiheen I tietojen me ensimmäinen jätetty 43 96 CpG sivustoja, jotka osoittivat alle 5% mediaani β erot tapausten ja kontrollien välillä tai p-arvo ≥0.001 (FDR 0,007) I vaiheessa Näitä suodatusehtoja asetettiin seuraavat tekniset seikat. Ensinnäkin, CpG sivustoja pienemmät metylaatioerojen ovat alttiita laboratorioon virhe teknisten rajoitusten takia. Toiseksi CpG sivustoja vähäisempiä p-arvot ovat vähemmän todennäköisesti saataisi tulevassa tutkimuksessa. Perustuen 53 jäljellä CpG sivustoja, ensin rakennettu malleja käyttäen L1 ja L2 seuraamuksia, kuten on kuvattu menetelmissä käyttämällä vaiheen I tietojen. Paras malli valittiin perustunut ROC AUC ja parsimony. Tämä malli testattiin sitten käyttäen vaiheen tietoja ilman 40 aiheita analysoidaan molemmissa vaiheissa varten sopimuksen tutkimusta. Kun otetaan huomioon kaikissa tapauksissa ja kaikkien hallintalaitteiden tunnistimme paneeli viisi CpG sivustoja (Malli I: IL10_P348, LCN2_P86, ZAP70_P220, AIM2_P624, TAL1_P817), jotka olivat ensimmäiset viisi CpG: t tulla ja jäädä Lasso malli ja myös viiden suurimman kertoimet alkaen Ridge mallista. Tämä viisi CpG-ainoa malli oli hyvä syrjiä potilaiden ja verrokkien (c-tilastoa = 0.85 vaiheessa I ja 0,76 faasi II), joka perustuu logistinen regressio mallin. Kun spesifisyys oli asetettu 0,90, suurin herkkyys oli 0,65 vaiheessa I ja 0,51 vaiheessa II. Kun spesifisyys oli asetettu 0,70, suurin herkkyys oli 0,83 vaiheessa I ja 0,72 faasin II (katso taulukko S4 täyden kirjon spesifisyys ja herkkyys). Kun myös covariates logistisessa regressiomallin (ikä, sukupuoli, 1

st aste suvussa pac, ABO veriryhmä), syrjintä parannettiin vaiheen I (c-tilastoa = 0,89), mutta laski vaiheessa II (c-tilastoa = 0,72). Kun uudelleen arvioitaessa kertoimet näiden covariates vaiheessa II (uudelleen istuva), syrjintä parani odotetusti, mutta ei dramaattisesti (c-tilastotieto = 0.77 viisi CpG: t vasta, 0,77 sisällyttämisen jälkeen kovarianttien) (taulukko 5). Kun myös kokoisen potilaille vain ja kaikki säätimet, tunnistimme yhden CpG-sivuston (Malli II: LCN2_P86), joka näytti syrjiä varten kokoisen tauti (c-tilastoa = 0.78 vaiheessa I ja 0,74 vaiheessa II).

keskustelu

tässä kahden vaiheen (testaus-validointi) tutkimuksessa tutkimme ääreisverenkierron DNA selvittää erot metylaatio eri CpG sivustoja voisi erottaa aiheita ja ilman Pac. Me rajoitettu Tutkimuksemme niille potilaille, jotka eivät olleet koskaan hoidettu syövän (sekä vaiheen I ja II), ja ensimmäisessä vaiheessa niille, jotka eivät olleet koskaan tupakoineet. Osoitimme erittäin merkittäviä hypo- tai hypermetylaation loci leukosyyttien DNA potilaista Pac. Tämä päti molemmissa vaiheissa tutkimuksen ja näytti edelleen huomattavat säätö tupakoinnista ja syövän hoitoon. Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että metylointi erot eivät olleet merkittäviä poikki eri vaiheissa taudin mutta merkittävä välillä kokoisen potilaiden ja verrokkien, mikä viittaa siihen, että differentiaalisesti metyloitu CpG allekirjoitukset voivat olla hyödyllisiä varhaisen diagnoosin.

On syytä korostaa että ainakin neljä (

LCN2

,

IL10

,

PECAM1

ja

MMP14

) kymmenen merkittävimmin metyloituja geenit tässä tutkimuksessa on aiemmin on raportoitu olevan diagnostista ja /tai ennusteen arvioinnissa PAC. Esimerkiksi tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumin

IL-10

arvot ovat selvästi kohonneet PAC potilailla [24], [25]. Potilailla, joilla oli korkeampi

IL-10

verrokkeja elinajan verrattuna potilaisiin, jotka osoittivat alempi

IL-10

tasoa. Kohonnut taso

IL-10

seerumissa PAC potilaista on sopusoinnussa nykyisen todetessaan, että valkosolujen DNA: lla oli pienempi promoottori CpG metylaation geenin PAC potilailla kuin verrokeilla (p = 2,50 x 10

-9 vaiheen I ja p 1 x 10

-10 vaiheen II). Mielenkiintoista, toinen geeni,

LCN2

, ehdotetaan varhainen diagnoosi biomarkkeri PAC [26] – [28]. Yksi ilmaisu perustuva tutkimus osoitti, että taso viiden proteiineja, kuten

LCN2

, syrjivät PAC potilaiden ja verrokkia jopa 13 kuukautta ennen syövän diagnoosia [26]. Tässä tutkimuksessa käytetään valkosolujen DNA, huomasimme, että kaksi CpG sivustoja (LCN2_P86_R ja LCN_P141_R) sisällä

LCN2

promoottorialue osoitti merkitsevästi pienempi metylaatiotasoilla PAC potilailla kuin verrokeilla (p = 2,00 x 10

– 10 ja 1,16 x 10

-7 vaiheessa I, p 1 x 10

-10 ja 1 x 10

-10 vaiheessa II, tässä järjestyksessä). Joka perustuu äskettäin kahden tutkimuksen perusteella näyttää siltä, ​​että hypometylaatio liittyy lisääntynyt

LCN2

ekspression leukosyyttien [29]. Lisäksi meidän malli algoritmi sijoittui IL10_P348 ja LCN2_P86 kuin kaksi ylintä CpG paikat valitaan Model I ja LCN2_P86 ainoana CpG valittu malli II. Nämä tulokset siis tukevat vahvasti, että DNA metylaatiostatuksen valkosoluissa voi olla biomarkkereita auttamaan Pac diagnoosia.

Vaikka sekvenssiriippuvaisia ​​alleelispesifinen metylaatio on ainutlaatuinen ominaisuus painettu geenien ihmisen genomin DNA muutos on havaittu myös muissa kuin painettu loci. Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että geneettisiä variantteja voi olla merkittävä vaikutus DNA: n metylaatio eri loci [30] – [33]. Käyttämällä array perustuvissa määrityksissä, kaksi tutkimuksissa on todettu useita genotyyppi-epigenotype vuorovaikutusta näyttämällä merkitsevästi yhteydessä CpG metylaatiotasoilla ja SNP genotyyppiä [30], [33]. Boks et ai. analysoitiin valkosolujen DNA: n metylaatio kaksosilla ja terveillä verrokeilla, ja tunnistettiin huomattava geneettinen vaikutus metylaatio useiden CpG sivustoja [30]. Gibbs et ai. tutkituista 27578 CpG sivustoja yhdessä 1630000 SNP neljäntyyppisistä aivojen kudoksissa [33]. Kunkin kudostyypin, 4-5% näistä CpG: t osoitti merkittävää yhdessä ainakin yhden SNP-kohdan korjauksen jälkeen genominlaajuisten useita testejä. Kaiken kaikkiaan 3619 ainutlaatuinen CpG sivustoja raportoitiin olevan methQTLs. Niistä 887 oli cis-methQTL. Yllättäen huippu rikastus varten methQTL oli vain 45 bp CpG sivuston kyseessä [33]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että vähintään kolme (3,13%) ja 96 valittujen CpG sivustoja vaikutti merkittävästi cis-vaikuttavan SNP. Olemme myös havainneet, että methQTL SNP olivat yleisesti lähellä tavoitetta CpG ( 15.5 Kb). Nämä tulokset osoittavat, että CpG metylaatiotasoilla jossain ei-efekti lokuksen ovat myös erittäin säännelty lähistöllä geneettisiä variantteja. Metylaatiostatuksen ääreisverenkierrossa DNA voi toimia myös biomarkkereita riskinarvioinnista Pac.

Vaikka tämän tutkimuksen tulokset ovat lupaavia, enemmän työtä tarvitaan syiden selvittämiseksi näiden metylaatioerojen ja onko ero metylointi voisi edelleen validoitu kuten seulontaan tai diagnostinen väline valitsematon väestöstä. Tässä vaiheessa, ei tiedetä mikä aiheuttaa metylaatio erot näiden potilaiden ja verrokkien. Sen lisäksi, että on mahdollista geneettinen vaikutus kuin edellä on kuvattu, immuunivastetta lymfosyyttien syöpäsolujen on toinen uskottava selitys. Lisäksi on epävarmaa, samanaikaisia ​​voivat vaikuttaa testin herkkyys ja onko syövän esiaste tai hyvänlaatuinen sairaus, kuten haimatulehduksen, osoittaisi vastaavia metylaation näillä CpG sivustoja. Kuitenkin nämä tulokset voivat olla tulevaisuudessa kliinistä merkitystä. Ensinnäkin hyvin toistettavissa tuloksia aiheen olettaa, että metylaatio eroja on olemassa välillä PAC tapausten ja kontrollien, jotka tarjoavat tukea perustelut suunnittelussa metylaation perustuva määritys varhaista syövän havaitsemista ja jopa riskinarviointi. Toiseksi, hyödyntäen helposti valkosolujen DNA: t, ennemmin kuin haiman kudos- tai mehuun perustuvat alustan, voi hakea suuren mittakaavan epigeneettisellä epidemiologian, kuten epigenome-laajuinen yhdistys tutkimuksessa. Kolmanneksi tutkimuksessa tunnistettiin merkittävä rooli genetiikan DNA metylaatio jossain sairauksiin liittyvän CpG sivustoja. On tärkeää syrjiä geneettisten ja ei-geneettisten vaikutuksia DNA: n metylaatio. Vaikka muutokset metylaation seurauksena sairaus voi olla käyttökelpoinen merkkiaine varhaisen diagnoosin, metylaatio vaihtelu johtuu geneettisestä vaikutteita voi olla mahdollinen markkeri riskinarvioinnin poikki yksilöiden suurempia populaatioissa. Siksi luonnehdinta geneettinen rooli DNA: n metylaatio helpottaa biomarkkereiden löytö ja edelleen kerrostuvat kliinisiä sovelluksia näille molekyyli allekirjoituksia.

Yhteenvetona olemme vahvistaneet toistettavissa metylaatio eroja PAC potilaiden ja verrokkien ja ovat tunnistaneet joukon differentiaalisesti metyloitu CpG sivustoja, jotka näyttävät olevan erittäin osoitus läsnäolosta PAC.