Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kasvaimen antigeeni (TA) -targeted monoklonaalinen vasta-aine (mAb) immunoterapia voi olla tehokas hoidettaessa monenlaisia ​​syövän etiologies; kuitenkin, nämä lähestymistavat ovat osoittaneet muuttuja kliinistä tehoa potilailla, joilla on eturauhasen syöpä (PCa). Esteenä hetkellä haittaavat translaation edistyminen on ollut kyvyttömyys määrittää mAb annos, joka saavuttaa tuumoripaikkaan ja sitoutuu kohdennettuja avustajat. Kytkentä mAb nanohiukkasten perustuva magneettikuvaus (MRI) antureista tulisi sallia

in vivo

mittaamisessa potilaskohtaista biodistributions; Näiden mittausten voisi helpottaa tulevaa kehittämistä uusia dosimetrian paradigmoja jossa mAb annos titrataan optimoida tuloksia yksittäisille potilaille.

Methods

eturauhasen kantasoluantigeeni (PSCA) ilmentyy laajasti pinnalla eturauhassyöpä (PCA) soluja. Anti-ihmisen PSCA monoklonaalisia vasta-aineita (mAb 7F5) sidottiin Au /Fe

3 O

4 (GoldMag) nanohiukkasia (mAb 7F5 @ GoldMag) toimimaan PSCA-spesifisiä theragnostic MRI koetin sallii visualisointi mAb biologista jakaantumista

in vivo

. Ensimmäinen vasta-aine immobilisointi tehokkuutta GoldMag hiukkasten ja teho PSCA-spesifinen sitoutuminen arvioidaan. Seuraavaksi PC-3 (eturauhassyövän PSCA yli-ilmentyminen) ja SMMC-7721 (hepatoomasolujen ilman PSCA-ekspressio) kasvainta kantavia hiiriä, joihin injektoitiin monoklonaalista 7F5 @ GoldMag MRI. MRI koetin biodistributions arvioitiin lisäämään aikavälein infuusion jälkeen; terapia vaste arvioitiin sarja kasvaimen tilavuus mittauksia.

Tulokset

kohdistettua sitoutumisen mAb 7F5 @ GoldMag mittapäistä PC-3-solujen varmistettiin optisia kuvia ja MRI; valikoiva sitoutuminen ei havaittu SMMC-7721 kasvaimia. Immunoterapeuttisen tehokkuus mAb 7F5 @ GoldMag PC-3 on kasvain on todennettu merkittävää kasvaimen kasvun inhibitiota verrattuna hoitamattomiin kontrollieläimiin.

Johtopäätös

lupaavia tulokset viittaavat toteutettavuus käyttää mAb 7F5 @ GoldMag antureista uutena paradigman havaitsemiseksi ja immunoterapeuttista hoitoa Eturauhassyövän. Me optimistisesti ennakoida, että lähestymistavat on potentiaalia käännettävä hoitopaikassa.

Citation: Ren J, Wang F, Wei G, Yang Y, Liu Y, Wei M, et al. (2012) MRL Eturauhassyöpä Antigen Expression diagnosointiin ja lmmunotherapy. PLoS ONE 7 (6): e38350. doi: 10,1371 /journal.pone.0038350

Editor: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, France

vastaanotettu: 15 tammikuu 2012; Hyväksytty: 03 toukokuu 2012; Julkaistu: 27 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Ren et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Avustukset National Natural Science Foundation of China (NSFC) 30973408, NSFC 81000627, ja NSFC 81001015. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä miehillä Yhdysvalloissa ja on toinen kuolinsyy syöpään miehillä [1]. Paikallinen PCa voidaan hoitaa leikkauksen tai sädehoidon, mutta tauti uusiutuu noin 20-30%: lla potilaista. Androgeenipuutteen hoidon yleisin hoito jälkeen toistumisen, on tehokas, mutta tauti lopulta etenee useimmilla potilailla, jotka saavat tällaista hoitoa [2], [3], [4]. Miehillä, joilla on metastaattinen PCa, eloonjäämismediaani viime vaiheen 3 tutkimuksissa vaihteli 12,2-+21,7kuukautta [1], [2], [3], [4]. Kemoterapeuttinen aine, dosetakseli, on ainoa hyväksytty hoito osoitettu pidentävän selviytymisen miehillä tätä ehtoa, antavan eloonjäämismediaani hyöty 2-3 kuukautta [5], [6]. Tavanomaisten syövän vastaisten hoitojen, kuten kemoterapian ja sädehoidon, on tunnusomaista puute kasvainsolun spesifisyyden.

vakuuttavia todisteita osoittaa, että kasvaimen antigeeni (TA) -targeted monoklonaalinen vasta-aine (mAb) -pohjaisen immunoterapia on kliinisesti tehokas hoidettaessa monenlaisia ​​syövän etiologies [7], [8]. Kuitenkin TA-kohdennettuja mAb-immunoterapian on osoitettu olevan vaihtelevia kliinistä tehoa hoitoon potilailla PCA; Tämä hoitomuoto on ollut tehokas vain osa taudin ilmaisemiseen kohdennettuja TA [9], [10]. Este, joka on tällä hetkellä esteenä translaation edistyminen on ollut kyvyttömyys määrällisesti potilaskohtaista annos mAb: iden, jotka sitoutuvat kohteena avustajat. Nämä tiedot edelleen suurelta osin tuntemattomia kliinisissä mutta sallisi potilaskohtaista annosta tai hyväksyminen vaihtoehtoisen hoidon strategioita tarvittaessa (eli kohdistaa eri antigeenin ja /tai käyttää vaihtoehtoisia mAb: t).

hoitopaikassa, 18- F fluorodeoksiglukoosia (FDG) positroniemissiotomografia (PET) tarjoaa varhainen ja tarkka tapa selvittää, onko syöpä reagoi hoitoon. Joitakin uusia molekyylikuvantaminen tekniikoita PET pitää lupauksen PCA hallintaan. Fluorestradiol (FES) mittaa estrogeenin reseptorit seurata kasvaimia ja fluoritymidiini (FLT) tarjoaa tietoa solujen kasvua ja lisääntymistä [11], [12]. Viime aikoina on olemassa muita metabolisia PET merkkiaineellista testattu eturauhassyövän [13], [14]. Mikä tärkeintä, on ollut tutkimuksen käytetty humanisoidun anti-PSCA (eturauhasen kantasoluantigeeni) koskemattoman vasta kun molekyylikuvantaminen koetin PET kuvantaminen, joka on parhaillaan kehitteillä arvioitaviksi pilottitutkimuksessa kliinisessä kuvantamistutkimukseen [13]. Kuitenkin PET ehkä riitä varmistamaan spatiaalinen resoluutio havaitsemiseksi alkuvaiheessa PCa [15]. Edut MRI yli ydinvoimalla tuotetun molekyylikuvantaminen tekniikoita ovat korkeammat spatiaalinen resoluutio, ylivoimainen pehmytkudoksen kontrasti, ja kyky integroida molekyyli, anatominen ja fysiologinen kuvatiedon, kaikki ilman, että potilas altistetaan mahdollisesti haitallisia radionuklideja. Lisäksi MK tarjoaa tietoa kasvaimen funktio ja on mahdollista kuroa entisestään välistä kuilua molekyylibiologian ja kliinisen käännös.

Viime prekliininen tutkimus pyrkimyksiä kehittää multimodaalisuudesta molekyylikuvantaminen menetelmiä on potentiaalia noninvasiiviseen Eturauhassyövän diagnoosia ja kuvantaminen-ohjattu immunoterapia [16], [17]. Useita ryhmiä aktiivisesti kehittämään kuvantamisen koettimia solu- ja molekyylitason MRI [12], [16], [18], [19], [20]. Superparamagneettiset rautaoksidi (SPIO) nanohiukkasia voidaan helposti sitoa eri molekyylimarkkereita, kuten ligandeja, vasta-aineita, ja peptidit, kuten MRI-koettimia [21], [22], [23], [24]. Staattinen magneettikenttä on huomattavasti häiritsee nämä SPIO perustuvia koettimia dephasing käsittelyn pyörii johtaa lokalisoitu signaalihäviöt MR kuvia.

Au /Fe

3 O

4 nanopartikkelien kuori /ydin rakenne syntetisoidaan pelkistämällä Au

3 + hydroksyyliamiinin kanssa, kun läsnä on Fe

3 O

4 [25], [26]. Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasia käytettiin tässä tutkimuksessa, joiden keskikoko 50 nm (shell /ydin, 5/45 nm) (GoldMag Biotechnology Co., Ltd, Xi’an). Magneettinen nanohiukkasten (Fe

3 O

4) ovat herättäneet laajaa huomiota, koska niiden mahdollisia sovelluksia MRI [21], [22], [23], [24], [27]. Muodostuminen kulta kuori magneettinen nanohiukkasten suoritettiin iteratiivista vähennys menetelmää käyttäen hydroksyyliamiinia [28], [29]. Fe

3 O

4 ydin tarjoaa hiukkanen pieni kooltaan merkittävä magneettinen momentti, ja kulta pinnoite Fe

3 O

4 ydin voidaan ottaa käyttöön hyvän pohjan tulevalle konjugointi biomolekyylien erityisesti for biosensorit valmistukseen. Kulta päällystetty Fe

3 O

4 nanohiukkasten raportoitu olevan hyvä biologinen yhteensopivuus ja affiniteetti kautta amiini /tioli pääteryhmiä [28], [29]. Suhteellisen suurempi vasta-liikkumattomuudesta kapasiteetti, Au /Fe

3 O

4 nanohiukkaset ovat hyvä vasta-operaattorin verrattuna Au nanohiukkasten ja Fe

3 O

4 nanohiukkasia. Koska luonnostaan ​​korkea kyllästysmagnetoituma, Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasia voi vastauksena nopeasti ulkoisia magneettikentän vähemmän aikaa kulutus aikana erotusprosessia. Siksi kulta päällystetty magneettinen nanohiukkasten täyttävät perusvaatimukset immunologian harjoittaja. Nämä Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasten vaativat vain yhden askeleen vasta-aineen käytöstä ja tarjoavat suhteellisen suuri ja vakaa vasta-sitomiskyky [20], [26], [30], [31], [32]. Vasta-aine-konjugoitu Au /Fe

3 O

4 nanohiukkaset saattavat olla herkkänä theragnostic MRI koetin salliessa

in vivo

visualisointi mAb biojakaantumi- ja kohdennettuja toimitus kasvaimia. Nämä tekniikat voivat lopulta mahdollistaa lääkäreille optimoida yksittäisen annoksen parantaa tuloksia immunoterapian aikana ja /tai sallia nopea, oikea-aikaisen hyväksymisen vaihtoehtoisen hoidon strategioita, kun tarvitaan.

eturauhasen kantasoluantigeeni (PSCA) on glukosylfosfatidyl phosphoinositol ankkuroituja solun pinnan proteiini, joka kuuluu Thy-1 /Ly-6-luokan pinta-antigeenejä. PSCA on ihanteellinen ehdokas kehittämiseen reagensseja tai immunoterapian PCa, koska se on kasvanut ilmentyminen spesifisyys PCa ja on solun pinnan sijainti [33], [34], [35], [36]. mAb 7F5 on tällä hetkellä suositeltavaa, havaitsemiseksi PSCA ihmisperäisten aikana Western-blottaus, immunofluoresenssi ja virtaussytometria menettelyt [36], [37].

Tässä tutkimuksessa mAb 7F5 konjugoitiin Au /Fe

3O

4 nanohiukkasten tuottaa uusia MRI theragnostic koetin (7F5 @ Au /Fe3O4) PCA. Tarkoituksena oli tutkia tehoa tämän theragnostic MRI koetin erityisesti suunnattu PSCA pinnalla ihmisen eturauhasen syöpäsolujen (PC-3-solut) toteamiseksi ja immunoterapiaan hiiren ksenograftimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja eläinmallissa

Tämä tutkimus suoritettiin suostumuksella Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Kaikki eläimet asutettiin ja hoidetaan suurimmalta osin Institutional Animal Care ja käyttö komitean suuntaviivojen ja kaikkien eläinten työ hyväksyi sopiva komitea (IACUC 0000000 ja 0000000A-1). Protokolla hyväksyi paikallinen eettinen komitea (eettinen komitea, neljäs Military Medical University 127/2008) ja kaikki eläimet saivat inhimillinen hoito noudattaen ”Principles of Laboratory Animal Care” muotoiltu National Society for Medical Research ja ”Guide että hoito ja käyttö Laboratory Animals ”julkaissut National Institutes of Health (NIH-julkaisu nro 86-23, tarkistettu 1996).

neljästä kuuteen viikkoa vanhoja karvattomia hiiriä (uros Bab /c-hiirten , joiden paino on välillä 25 ja 30 g) käytettiin näissä tutkimuksissa. Ihmisen eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja; PC-3 aloitettiin luusta etäpesäke on luokan IV eturauhasadenokarsinoomaa [33], [34], [35], [36]. Solut saada kaupallisesti American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja kasvatettiin yhtenä kerroksena Eaglen minimum essential väliaineessa (Invitrogen Corp., Grand Island, New York) täydennettynä 15% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C ° C: ssa seokseen, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. Luomiseen PC-3 kasvain malli, hiiri ympättiin 2 x 10

6 solua /5 ml PBS oikeaan kylkeen. Toinen kasvain hiiri (SMMC-7721 kasvaimet ilman PSCA ilmaus) luotiin palvelemaan kontrolliryhmään. SMMC-7721, ihmisen hepa- karsinooman (HCC) solulinjassa oli Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa (DMEM, Invitrogen Corp., Grand Island, New York) täydennettynä 10% FBS: ää 37 ° C: ssa seokseen, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 [38].

Rakentaminen ja arviointi mAb 7F5 @ Au /Fe3O4 theragnostic MRI Probe

MRI theragnostic koettimet muodostettiin käyttäen joko PCa erityisiä mAb 7F5 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia) tai ei-spesifinen vasta-aine, hiiren anti-ihmis-IgG (Wuhan Boster Biology Co. Wuhan) toimimaan kontrollina koetin. Sekä 7F5 @ Au /Fe3O4 ja IgG @ Au /Fe3O4 koettimet muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [20], [26], [30], [31], [32]. Lyhyesti, 200 ui (1 mg /ml) ja Au /Fe

3O

4 nanohiukkasten laitettiin pipetillä putkeen. Tämä putki sijoitettiin sitten magneettiseen erottimeen 2 min. 100 ug vasta-ainetta proteiinin (joko mAb 7F5 tai IgG) liuotettiin 400 ul: kytkimen puskuria; erotetut Au /Fe

3O

4 nanohiukkasten lisättiin sitten 350 ul: aan vasta-aineliuosta. Jäljellä oleva vasta-aine-liuosta (50 ui) käytettiin kytkemiseksi tehokkuuden testejä. Vasta-liuosta Au /Fe

3O

4 nanohiukkasten sijoitettiin vakiolämpötilassa (37 ° C) ravistelijassa 20 minuutin ajan 180 rpm: ssä, siirretään sentrifugiputkeen. Tämä putki sijoitettiin magneettinen erotin supernatantin poistamiseksi immobilisoidun vasta–Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasia. 50 ui tätä supernatanttia käytettiin kytkemään tehokkuuden testejä. Sitoutumiskyky Au /Fe

3 O

4 pinta määritettiin käyttäen UV-vis spektrofotometrillä (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts) ja kytkimen tehokkuus (prosentteina proteiinin sisäänoton) laskettu: × 100%, jossa OD ( pre) ja OD (post) absorbanssin mittauksia 280 nm: ssä 50 ui esi- ja post-kytkentä vasta-ratkaisuja, vastaavasti. Spesifinen sitoutuminen arvioitiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [20], [26], [30], [31], [32]. Lyhyesti, erikseen, 5 ug /ml 7F5 @ Au /Fe3O4 tai IgG @ Au /Fe3O4 inkuboitiin 5 x 10

5 PC-3-solut ja SMMC-7721-solujen 30 min fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS puskuri). Solut pestiin kahdesti PBS: llä, värjättiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aineella inkuboimalla 1,5 tuntia (huoneen lämpötilassa). Näytteet pestiin kahdesti PBS: llä arviointia varten spesifisen sitoutumisen avulla virtaussytometrialla määritystä. Sillä optinen mikroskopia analyysin PC-3 ja SMMC-7721-solujen kiinni pääliliuskat. Erikseen 200 ug /ml 7F5 @ Au /Fe3O4 tai IgG @ Au /Fe3O4 inkuboitiin sitten PC-3-solut ja SMMC-7721-soluja yli yön 37 ° C: ssa. Solut pestiin kolme kertaa PBS: llä. Solut värjättiin Cy3 konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aineella inkuboimalla 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Sitten solut fiksoitiin 4% formaliiniin 30 minuuttia ja ydin- counterstaining suoritettiin 4, 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI, Sigma, St. Louis, MO) värjäämällä 1,5 ug /ml liuosta (5 min /RT). Lopuksi peitelaseja asennettu ja sitten visualisoidaan laserkeilauksen konfokaalimikroskopia (LSCM, Olympus Optical Co. Ltd., Tokio, Japani).

myrkyllisyys 7F5 @ Au /Fe3O4 MRI Probe in Viljely PC-3 Cells

PC-3-solujen kanssa 93% -95% elinkelpoisuuden (trypaanisinisen värjäys) ympättiin 96-kuoppalevyille (4000 solua /kuoppa) kanssa 4 ml viljelyalustaa. Seuraavana päivänä 20 ui mAb 7F5 tai 20 ui mAb 7F5 @ GoldMag prob lisättiin PC-3-solujen suspensioita. Molemmissa tapauksissa lopullinen pitoisuus mAb 7F5 oli sama (0,2, 2, 4, 8 ja 16 ug /ml, kukin n = 6). Soluja käsiteltiin erilaisilla mAb 7F5 pitoisuuksina (mAb 7F5 liuoksen tai mAb 7F5 @ GoldMag) 96-kuoppalevyille soluviljelmässä-inkubaattorissa 24 tunnin ajan. Myrkyllisyys vastaavat määrät GoldMag hiukkasia verrattuna mAb 7F5 @ GoldMag arvioitiin myös. Lopullinen pitoisuus GoldMag hiukkasen oli sama (2, 4, 8, 16, ja 32 ug /ml, kukin n = 6). Solujen elinkelpoisuus (elävien solujen lukumäärään) mitattiin trypan blue -värjäyksellä hoidon jälkeen 24 tuntia. Solu esto laskettiin kaavalla: solun esto rate = (1- Npost /NprE) x 100%; jossa Npost on elävien solujen lukumäärän ja nprE on solujen lukumäärä kuopissa, esikäsitelty.

myrkyllisyys 7F5 @ Au /Fe3O4 MRI Probe hiirissä

Six-viikko- vanha nude-hiirissä (uros Bb /c-hiiriin, joiden paino on välillä 30 ja 35 g, n = 35) käytettiin toksisuuskokeet. Kaikki ryhmät saivat yhden annoksen kautta laskimoon. Kolme ryhmää hiiriä (kunkin ryhmän n = 5) saivat 7F5 @ Au /Fe

3O

4; kolme ryhmää hiiriä (kunkin ryhmän n = 5) saivat IgG @ Au /Fe3O4 klo annoksilla 100, 200 ja 300 ui vastaavasti (normalisoitu annoksen 1 mg Au /Fe

3O

4 50 ug-vasta-aineen kunkin ml seuraavassa kokeessa). Muihin kontrolliryhmä sai suolaliuosta injektiota (300 ui, n = 5). Myrkyllisyys 7F5 @ Au /Fe3O4 tai IgG @ Au /Fe3O4 antureista arvioitiin useita indeksejä. Välittömän myrkyllisyyden, eläimiä tarkkailtiin tapahtumia, kuten elintoiminnot, henkinen, ruokavalio ja aktiivisuustaso annon jälkeen koetin 96 tuntia. Systeeminen toksisuus arvioitiin käyttäen muutoksia eläimen kehon painoja. Paino ja fyysisen tilan kaikki hiiriä seurattiin 30 vuorokauden ajan. Eläimet punnittiin päivänä koetin injektio ja 5 päivän välein sen jälkeen vasta 30 päivää injektion jälkeen.

magneettikuvauksessa

Nämä tutkimukset suoritettiin käyttäen kliinistä 3.0T koko kehon MR -järjestelmä (Siemens Magnetom Trio, Erlangen, Saksa). Järjestelmä kykeni toimimaan enintään muutosnopeus on 200 mT /m /ms ja enintään kaltevuus vahvuus 40 mT /m. Integroitu järjestelmä kehon keloja käytettiin RF magnetointi ja kahdeksan kanavaa kliininen pää kela käytettiin signaalin vastaanottoon.

In vitro MRI 7F5 @ Au /Fe3O4 Kohdennettu Cells

PC-3-solujen ja SMMC-7721-solua viljeltiin 7F5 @ Au /Fe3O4 ja IgG @ Au /Fe3O4 erikseen 12 tunnin ajan. Pitoisuudet 7F5 @ Au /Fe3O4 ja IgG @ Au /Fe3O4 olivat 1 mg Au /Fe

3 O

4 per 50 ug vasta-ainetta kutakin 1 ml kasvatusliuosta 0,5 miljoonaa solua. Sen jälkeen, kun 12 tunnin ajan, kerättiin solut pestiin 3 kertaa PBS: llä. Cell näytteitä sekoitettiin 1,5 ml 1% agaroosia pienissä sentrifugin putkiin, jotka sisältävät I) PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4; II) PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4; III) SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe

3 O

4; tai IV) SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 kunkin näytteen, jossa on noin 5 x 10

5 leimattuja soluja (kukin ryhmä, n = 8). Fast spin-kaiun T1-painotettu (T1w) ja T2-painotettu (T2W) MRI mittaukset suoritettiin käyttäen seuraavia parametreja: toistoaika (TR) /kaikuajan (TE) = 500/25 ms (T1w) ja 4000/90 ms (T2W), näkökentän (FOV) = 156 x 156 mm

2; leikkeen paksuus = 2 mm; matriisi size = 192 x 192.

In vivo MRI 7F5 @ Au /Fe3O4 Kohdennettu Kasvaimet

PC-3 ja SMMC-7721 tuumoreita kantavaa hiirtä injektoitiin joko 200 ui (1 mg Au /Fe

3O

4 50 ug-vasta-aineen kunkin ml) 7F5 @ Au /Fe3O4 häntälaskimon kautta (PC-3 on kasvain, n = 8; SMMC-7721 kasvainta kantavissa hiirissä, n = 8) tai 200 ui IgG @ Au /Fe3O4 (kukin, n = 8). Magneettikuvauksen aikana tutkimuksissa hiiret nukutettiin ketamiinin (80 mg /kg) kautta vatsaonteloon (IP). MRI tutkimukset tehtiin ennen ja 6, 12, ja 24 tuntia injektion jälkeen. Sen jälkeen lokalisointi scout skannaa FSE T1w ja T2W mittaukset suoritettiin (T1w: TR /TE = 500/25 ms; T2W: TR /TE = 4000/90 ms, leikkeen paksuus = 3 mm, FOV = 56,25 × 100 mm

2; leikkeen paksuus /laatan paksuus = 2 /12,8 mm, matriisi size = 72 x 128). Sen jälkeen MRI, hiiret tapettiin CO

2.

Arvio 7F5 @ Au /Fe3O4 Probe bioleviäminen

Kasvaimen kudokset kerättiin kuusi hiirtä seuraavista 7F5 @ Au /Fe3O4 koetin infuusio ( 3 kustakin kasvaimesta tyyppi) histologista analyysiä. Kasvaimen kudokset jäädytettiin OCT keskipitkällä ja leikattiin 5 um välein. Sillä Preussilainen sinistämisaineita värjäys, nämä kohdat inkuboitiin 1:01 liuokseen, jossa oli 10%: ista vesiliuosta kaliumferrosyanidin ja 20%: ista kloorivetyhappoa 30 minuutin ajan.

Lisäksi 24 hiirtä käytettiin kvantitatiiviseen analyysiin 7F5 @ Au /Fe3O4 ja IgG @ Au /Fe3O4 koetin jakaumat (4 ryhmää, 6 hiirtä /ryhmä, jolla PC-3 tai SMMC-7721 kasvaimia ja vastaanottaa joko 7F5 @ Au /Fe3O4 ja IgG @ Au /Fe3O4 anturi infuusiota). Maksa, perna ja kasvaimen kerättiin kustakin eläimestä 24 tuntia injektion jälkeen. Nämä kudokset preparoitiin induktiivisesti kytketty plasma atomiemissiospektroskopiamenetelmää CCD ilmaisimen. (ICP-AES, Varian, Palo Alto, CA) pilkkomalla solujen 25% kloorihappoa, ja sitten kuumentamalla liuos, kunnes kiinteä jäännös muodostuu. Hiilipitoisen aineet poistettiin ja kiinteä aine liuotettiin 2% HNO

3 (typpihappo). Spektrometri havaitseminen aallonpituus oli asetettu 238 nm raudan ja kalibroidaan kolme erilaista standardinäytteet (Fe valittu metallijäämien tekijä ICP-AES arviointi koetin jakelu koska Fe on periaate komponentti Au /Fe

3O

4 nanohiukkasia).

antituumoriteholla of Theragnostic Au /Fe

3 O

4 MRI Probe

15 päivän kuluttua kasvainsolujen istutuksen, 200 ui 7F5 @ Au /Fe3O4 koetin (PC-3 on kasvain, n = 15; SMMC-7721 kasvainta kantavissa hiirissä, n = 15) tai 200 ui kontrolli-IgG @ Au /Fe3O4 koetin (PC-3 tuumoria kantavissa hiirissä, n = 15; SMMC-7721 kasvainta kantavissa hiirissä, n = 15) injektoitiin häntälaskimon kautta päivinä 0, 4, ja 8 Vital merkkejä, psyykkisen tilan, ruokavalion ja aktiivisuudesta kunkin eläimen tarkkailtiin päivittäin kasvaimen koko mitattiin kolme mitat (pituus, leveys ja korkeus), jossa on paksuus, ja tuumorin tilavuus laskettiin käyttäen kasvaimen kaavan = 4 /3π x (pituus /2) x (leveys /2) x (korkeus /2) [39] . Kasvaimen tilavuus mitattiin useana ajankohtana annon jälkeen anturin (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ja 65 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen istutuksen, koetin infuusiona päivänä 15). Kaikki hiiret lopetettiin päivänä 65.

Kuva-analyysi ja tilastolliset menetelmät

Kuvan analyysit suoritettiin käyttäen ImageJ (versio 1.34s, National Institutes of Health, MD, USA). Kiinnostava alue (ROI) vedettiin käsittää poikkileikkauksia vastaavien putkille tai hiiren kasvaimia (ROI sisälsi noin 30 voxels kunkin phantom injektiopullon, 30 voxels kunkin

in vitro

solussa näyteputkeen tai 40 voxels kunkin kasvaimen ) mittaamaan keskimääräistä T2W signaalin intensiteettiä (S

keskiarvo). Erillinen ROI piirrettiin putken ulkopuolelle tai tietyllä alueella mitätön kudoksen (vedetty johdonmukainen varantoja toistuvissa mittauksissa) arvioida suhteellinen melutaso perustuu keskihajonta taustan signaali (NSD). Näitä laskelmia käytetään arvioitaessa suhteellinen signaali-kohinasuhde (SNR) = S

tarkoittaa /NSD kunkin mittauksen. Kasvaimen kantavien hiirten, nämä mittaukset toistettiin kunkin MRI injektion jälkeen; Näiden mittausten toistettiin myös jokaiselle

in vitro

Au /Fe

3 O

4 solun näyteampulliin.

Kaikki tilastolliset laskelmat tehtiin SPSS ohjelmistopaketti (SPSS, Chicago , IL, USA). Systeemistä toksisuustutkimukset tilille vaihtelu lähtötilanteen painon, ajan kuluessa ruumiin punnituksia kullekin eläimelle ilmoitettiin prosentteina alkuperäisestä painonnousua lähtötilanteeseen. Yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertailua säätää kehon painon indeksit kaikissa hoitoryhmissä kullakin aikavälillä infuusion jälkeen (Tukey post-hoc korjaus, p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä). Seuraavaksi yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertaamaan) T2W SNR mittauksia

in vitro

näytteessä pulloihin, jotka sisälsivät eri solulinjojen ja ohjaavia osia ja b)

in vivo

T2W SNR mittauksia kasvaimia pre-infuusio ja kolme infuusion jälkeen aikaväleillä (erilliset vertailuja PC-3 ja SMMC-7221 hiiri malleissa). Samoin, yksisuuntainen ANOVA käytettiin vertaamaan elinspesifiseen ICP-AES mittauksia koettimen pitoisuus PC-3 ja SMMC-7721 tuumoreita kantavaa hiirtä. Lopuksi terapeuttista tehoa koskevat tutkimukset, jokaisen infuusion jälkeen havaintovälin, Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan kasvaimen tilavuuden mittaukset välillä ryhmien eläinten (p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä).

Tulokset

Selän- Tehokkuus ja spesifinen sitoutuminen arviointi

nopeus vasta-immobilisoitua kytkentä pieneni vähitellen kasvavien pitoisuuksien kanssa mAb 7F5. Lisäämällä 60 ug mAb 7F5 on 1 mg: n näyte Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasten tuotti kytkennän tehokkuus lähes 83 ± 9%; Siten 1 mg: n näyte, noin 50 ug mAb 7F5 oli pinta-kytketty Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasia. Välttämiseksi harhat myöhemmissä

in vitro

ja

in vivo

vertailevia tutkimuksia, kytkemällä tehokkuus määritettiin myös ei-spesifistä vasta-ainetta IgG. Samanlaisissa olosuhteissa, IgG Au /Fe

3O

4 nanohiukkasten kytkennän tehokkuus oli noin 71 ± 5%: mikä vaatii lisäämällä 80 ng: n IgG-proteiini saavuttaa pinta-kytkennän 50 ug IgG vastaa 1 mg: n näyte Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasia. Virtaussytometria osoitti, että positiivinen nopeus sitoutuminen oli 93,6 ± 8,2%, että 7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3-solut, kun taas positiivinen oli vain 4,2 ± 1,2%, että 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721. Positiivinen nopeus sitoutuminen oli 5,7 ± 1,7% IgG @ Au /Fe3O4 + PC-3-solujen ja 6,9 ± 2,1% IgG @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721-soluissa. Punainen fluoresenssi havaittiin kalvon ja sytoplasmassa 7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3-solujen LSCM (ylärivissä kuvassa. 1), kun taas ei punaista fluoresenssia havaittiin 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721-solujen (alarivissä kuvassa. 1). Sillä IgG @ Au /Fe3O4 ryhmä, ei punaista fluoresenssia havaittiin sekä PC-3-solut ja SMMC-7721-solulinjat.

punainen fluoresenssi (7F5 @ Au /Fe3O4rpar, havaittiin kalvon 7F5 @ Au /Fe3O4 + PC-3-solut (ylärivi), kun taas ei punaista fluoresenssia havaittiin kalvoon 7F5 @ Au /Fe3O4 + SMMC-7721-solujen (alarivissä). solujen tumat värjättiin väriltään sininen kautta DAPI (keskimmäinen sarake). 7F5 @ Au /Fe3O4 fluoresenssi kuvat ja DAPI kuvat sulautettu oikealla olevassa sarakkeessa. Mittakaava, 10 pm.

myrkyllisyys 7F5 @ GoldMag MRI anturi viljely PC-3 Cells

myrkyllisyys 7F5 @ GoldMag MRI Probe in vitro on esitetty kuviossa. S1. myrkyllisyys mAb 7F5 tai 7F5 @ GoldMag osoitettiin ja solun esto kasvoivat, mAb-pitoisuus ei ole tilastollista merkitystä kunkin pitoisuuden mAb 7F5 tai 7F5 @ GoldMag (p 0,05 kussakin keskittyminen, Fig. S1A). Lisäksi verrattuna 7F5 @ GoldMag ryhmä, GoldMag hiukkanen ei vaikuttanut solujen lisääntymistä (p 0,05 kussakin keskittyminen, Fig. S1B).

myrkyllisyys Theragnostic Au /Fe

3 O

4 Probe hiirissä

Akuutti myrkyllisyys: kaikki hiiret selvisivät eikä epänormaaleja reaktioita elintoimintojen, mielentilan, ruokavalio ja toiminnan tason 96hrs annon jälkeen. Systeeminen toksisuus kuvassa. 2: hiiret kontrolliryhmässä lihonut tasaisesti aikana kokeen; kun taas painonnousu oli hieman vähäisempää eläimillä, jotka saivat infuusiona 7F5 @ Au /Fe3O4 annoksilla sekä 100 ui ja 200 ui. Mitään merkittävää eroa ei havaittu 7F5 @ Au /Fe3O4 ja suolaisten ryhmiä milloin tahansa vaiheessa eikä mikään näistä hiiristä kuoli 30 päivän tarkkailujakson aikana infuusion jälkeen. Kliinisiä merkkejä toksisuudesta, kuten vapina, vähentynyt aktiivisuus tai epävakaa liikkeitä havaittu. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin IgG @ Au /Fe3O4 hoidetuissa eläimissä annoksilla 100 ui ja 200 ui (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin 20 päivän havaintovälin eteenpäin, ne eläimet, jotka saivat 300 ui annos oli merkittävästi pienempi ruumiinpaino verrattuna eläimiä ohjaus ja kaksi alempaa annosryhmissä (p 0,05 jokaiselle näistä normalisoitu painonnousun vertailut). Yksi hiiren tässä suuren annoksen ryhmässä kuoli 30. päivänä Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin suuren annoksen IgG @ Au /Fe3O4 ryhmä kahdella näiden hiirten kuolevat päivää 25 ja 27, tässä järjestyksessä. Neljä hiiriä suuren annoksen ryhmän (kolme hiiriä 7F5 @ Au /Fe3O4 ryhmä ja yksi IgG @ Au /Fe3O4 ryhmä) oli kliinisiä merkkejä toksisuudesta kuten vapinaa, aktiivisuustason laskua ja epävakaa liikkeitä päivä 20. Nämä tulokset viittaavat lisääntynyt systeeminen myrkyllisyys nämä eläimet sai 300 ui annos joko 7F5 @ Au /Fe3O4 tai IgG @ Au /Fe3O4 antureista.

In vitro

magneettikuvauksessa 7F5 @ Au /Fe3O4 Kohdennettu Cells

In vitro

-tutkimukset osoittivat merkitsevästi enemmän T2W SNR vähennyksiin PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 solunäytteillä (putki I) verrattuna PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4 solunäytteiden SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe3O4 näytteitä, ja SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 näytteitä putkien II, III, ja IV (Fig. 3A). Näytteet sisällä putkien II, III ja IV ei osoittanut selvästi havaittavaa SNR vähennykset (vertailu ei tuottanut tilastollisesti merkittäviä eroja ohjaus, p 0,05 kutakin vertailua); T2W SNR sisällä PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 solu- näyte (putki I) oli huomattavasti pienempi kuin T2W SNR kuluessa näyteputket II, III, ja IV on esitetty. 3B (p 0,05 kutakin vertailua).

Tube I: PC-3 + 7F5 @ Au /Fe3O4 solun näyte, putki II: PC-3 + IgG @ Au /Fe3O4 näyte; putki III: SMMC-7721 + 7F5 @ Au /Fe3O4 näyte; Tube IV: SMMC-7721 + IgG @ Au /Fe3O4 näyte. Quantitative T2W SNR mittauksia (B) solun näyte pulloihin kuvattu (A).

In vivo

magneettikuvauksessa 7F5 @ Au /Fe3O4 Kohdennettu Kasvaimet

PC-3 kasvainta kantavien hiirten annettiin 7F5 @ Au /Fe3O4 nanohiukkasten osoittautunut huomattavan pienenemistä T2W kasvaimen signaalin voimakkuus 6, 12, ja 24 tuntia infuusion jälkeen (ylärivi kuviossa. 4). Ole selkeästi havaittavaa kasvaimen signaali muuttuu havaittiin SMMC -7721 kasvainta kantavien hiirten tahansa kolmesta infuusion jälkeen ajankohtina (alin rivi kuvion. 4). Histologinen analyysit (preussinsininen värjäystä kuvassa. 4) osoitti heterogeeninen levitystä että Au /Fe3O4 Au /Fe

3 O

4 nanohiukkasten kuvataan pistemäinen siniseksi värjäytyneitä pesäkkeitä PC-3 tuumorikudoksia; kuitenkin, nämä talletukset ei havaittu sisällä SMMC-7721 tuumorikudoksia.

PC-3 kasvainta kantavien hiirten annettiin 7F5 @ Au /Fe3O4 nanohiukkasten osoittautunut huomattavan pienenemistä T2W kasvaimen signaalin voimakkuus 6, 12, ja 24 tuntia post -infusion (ylärivi). Ei selvästi havaittavaa kasvaimen signaali muuttuu havaittiin SMMC -7721 kasvainta kantavien hiirten tahansa kolmesta infuusion jälkeen ajankohtina (alarivissä). Preussinsininen värjäys (PB) osoitti, että Au /Fe3O4 nanohiukkasten kuvataan pistemäinen siniseksi värjäytyneitä pesäkkeitä PC-3 tuumorikudoksia; Näiden talletusten ei tapahdu SMMC-7721 tuumorikudoksia. Mittaviivat 10 mm MRI ja 50 um preussinsininen värjäystä kuva.

jälkeen 7F5 @ Au /Fe3O4 infuusio, T2W SNR muutoksia PC-3 kasvaimet olivat tilastollisesti merkitseviä verrattuna lähtötilanteeseen pre -infusion kasvain SNR tasolla (p 0,05 kutakin vertailua), Fig. 5A. Muita merkittäviä vähennyksiä kasvainten SNR havaittiin välillä 6 ja 12 tuntia infuusion jälkeen ajankohtina (p 0,001); kun taas tarkoittaa T2W kasvaimen SNR myöhemmin nousi 24 tunnin infuusion jälkeen (verrattuna ennen mittausta 12 tunnin infuusion jälkeen), tämä havainto ei ollut tilastollisesti merkitsevä annettu näytekoko (p = 0,145).