Krooninen sairaus

tiivistelmä

p53 ja NF-KB reittejä tärkeä rooli erilaisissa solun toimintoja, kuten solun kasvussa, apoptoosin, ja kasvaimen kehittymisen. Mutaatiot, jotka inaktivoivat p53-geenin ja konstitutiivista NF-KB-reitin aktivaatio ovat yleisiä ilmiöitä ihmisen syövissä. Vaikka monet lääkkeet on kehitetty, jotka selektiivisesti aktivoida p53 tai estävät NF-KB: tä, on olemassa muutamia lääkekandidaatteja joka voi tehdä molempia. Samanaikainen aktivaatio p53 ja estämällä NF-KB-reitin on siis ensisijainen tavoite uusien syövän lääkekehityksessä. Tämä tutkimus on ensimmäinen raportti suurikapasiteettisten lähestymistapa massa yhdisteitä, jotka samanaikaisesti kohdistettu sekä reittejä. Käyttäen solu-pohjainen seulonta-analyysissä ja kirjaston 200000 synteettisiä yhdisteitä, olemme määritelleet 9 pienet molekyylit, jotka samanaikaisesti inhiboivat NF-KB: n ja aktivoida p53. Yksi näistä yhdisteistä, N-2, lisäsi p53 kohdegeenien, kuten p21 ja GADD45a. Lisäksi, N-2 esti transkriptionaalista aktiivisuutta NF-KB: n, samanaikaisesti tukahduttaa interleukiini-6 ja monosyyttien kemotaktinen proteiini-1 (MCP-1) ilmentymistä. Kun johdetut solulinjat monipuoliset syöpiä hoidettiin

in vitro

N-2, havaitsimme lisääntynyt solukuolema. N-2 myös merkitsevästi esti allograftin kasvua hiiren malleissa melanooman ja keuhkosyöpä. Tulosten perusteella näyttää, että N-2 voi toimia bivalenttinen solunsalpaajaksi samanaikaisten modulaatio NF-KB: n ja p53 toimintaa.

Citation: Hwang SG, Park J, Park JY, Park CH, Lee KH, Cho JW, et ai. (2012) Anti-Cancer Activity of a Novel pienmolekyyliyhdisteen Se aktivoi samanaikaisesti p53 ja inhiboi NF-KB: n Signaling. PLoS ONE 7 (9): e44259. doi: 10,1371 /journal.pone.0044259

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty: 31 heinäkuu 2012; Julkaistu: 13 syyskuu 2012

Copyright: © Hwang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat SK Biolääkkeiden Co., Ltd., ja apurahat (2011K00277) päässä Brain Research Center of the 21st Century Frontier Research Program. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: SGH, CHP, KHL, JYP ja JWC ovat työntekijöitä SK Biolääkkeiden Co., Ltd (Daejeon, Korea), yksi rahoittajien tämän tutkimuksen. SK Biolääkkeiden Co., Ltd, kehittää pienimolekyylisiä lääkkeitä sairauksiin kuten keskushermoston häiriöt ja monipuolinen syöpien. Ei ole olemassa patentteja, edelleen kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

NF-KB ja p53 signalointireittien toiminto lähes kaikissa solutyypeissä ja aktivoituvat vasteena lukuisia biologisia ärsykkeitä. NF-KB on keskeinen toimija erilaisissa solutoiminnoille [1], [2]. Vaikka ensimmäinen tunnistettu transkriptiotekijän osallistuu tulehdusvasteeseen, kokeellista näyttöä siitä, että NF-KB säätelee myös solujen kasvun, eloonjäämisen, ja apoptoosin [3]. IKB proteiinit estävät NF-KB toiminto estämällä NF-KB: n sitoutumisen DNA. NF-KB käsittää fosforylaation erityisiä lKB seriinitähteiksi IKB-kinaasit (IKKS), joka johtaa proteasomi-välitteinen hajoaminen lKB. Kun IKB hajoaminen, NF-KB-kompleksi on sitten vapaasti tulla tumaan, jossa se voi säädellä spesifisten geenien liittyvien tulehdus- tai immuunivasteen, solujen selviytymisen vasteita, ja soluproliferaatiota [4]. Tuumorisuppressorigeenin proteiini p53 on DNA: ta sitova transkriptiotekijä, jolla on tärkeä rooli vartiointi- solussa vasteena erilaisille stressisignaalit [5]. Aktivoitu p53 indusoi useiden geenien liittyvän solukierron pysähtymisen, apoptoosin, Vanheneminen, kääntäminen, ja DNA: n korjaukseen. Fosforylaatiota p53 erityisen seriinitähteiksi liittyy oman toimintansa. Esimerkiksi fosforylaation seriinien 9 ja 46 liittyy apoptoosin induktion ja DNA-vaurioiden [6], [7]. Fosforylaatio seriinissä 15 ja 20 johtaa alennettuun vuorovaikutus sen negatiivinen säätelijä, hiiren kaksinkertainen minuutti 2 (MDM2). MDM2 estää p53 kertymistä kohdistamalla se proteasomin välittämää hajoaminen [8], [9].

konstitutiivisen NF-KB: n havaitaan usein ihmisen syövissä ja eri alkuperää, kuten keuhkosyöpä, melanooma, ja peräsuolen syöpä ja se liittyy angiogeneesiin, kemoterapian resistenssin, ja eloonjääminen syövän kantasoluja [10], [11], [12], [13]. Kasvaimeen soluun liittyvä NF-KB: n ja sen geenien, kuten sytokiinin IL-6, on liitetty kehittämiseen chemoresistance useiden syöpien [14], [15]. Esimerkiksi, IL-6 on kohonnut seerumin ja askites potilailla, joilla on munasarjasyöpä ja lisääntynyt IL-6-pitoisuudet korreloivat huonon ennusteet ja chemoresistance [16]. Tällainen vastustuskyky kemoterapia voi vakavasti vaikuttaa tehoon syöpälääkkeet. NF-KB-reitin on saanut enemmän huomiota kuin syntymässä terapeuttinen kohde syöpäsoluissa mutaatioita Ras geeniperheen, yksi useimmin mutatoitunut geeni perheiden ihmisen syövissä. On tunnettua, että noin 20-30% ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaille (noin 85% kaikista keuhkosyövässä) on onkogeeninen mutaatioita k-Ras [17]. NF-KB: n signalointi heikentää solutransformaatioon ja herkistää Ras-mutatoitunut syöpäsolujen apoptoosin [11], [18], [19], [20], [21]. Tämä esto voisi siis olla lupaava strategia kasvainten hoitoon, jotka ovat Ras mutaatioiden ja muiden syöpien, jotka ilmentävät konstitutiivisesti aktiivista Ras.

Mutaatiot p53-geenin ovat yleisempiä kasvaimia kuin mutaatioita Ras geeniperheen. Itse asiassa, p53 on suoraan mutatoitunut noin 50% ihmisen kasvaimissa [22]. Palauttaminen p53-toiminto voi siis tarjota houkutteleva terapeuttinen strategia kohdistaa syöpäsolujen ja siten, pienet molekyylit kuten MDM2 antagonisti Nutlin-3 [23], p53-proteiinia sitova molekyyli RITA [24], ja MDM2 alas-säädin gambogic happo [ ,,,0],25], on kehitetty. Kuitenkin palauttaminen p53-toiminto ei ole riittävä täydellistä kasvainsolujen menetys. Esimerkiksi p53 yli-ilmentyminen ei ollut vaikutusta kehitykseen huonolaatuisen vaurioita kuten adenoomien ja p53 ei aiheuta täydellistä kasvainsolujen menetys korkealaatuisesta vaurioita kuten karsinoomien [26], [27], [28].

Useat tutkimukset ovat tutkineet rooli NF-KB ja p53 polkuja alle patologisia tiloja, erityisesti syöpä [4], [29]. Aktivointi NF-KB-reitin ja inaktivoituminen p53-reitin havaitaan erilaisissa syövissä. On kuitenkin epätodennäköistä, että aine kohdistaminen vain yksi näistä reiteistä voi olla tehokas hoidettaessa erilaisia ​​syöpätyyppejä, otetaan huomioon monimutkaisuus kasvaimen. Useat p53-indusoivia kemoterapeuttisia on raportoitu indusoivan p53 sekä NF-KB: n eri tyyppisiä soluja [30]. Vaikka p53-indusoidun apoptoosin, NF-KB: n aktivaatio voi edistää vastustuskykyä apoptoosia. Konstitutiivinen NF-KB: n aktivaation on raportoitu erilaisissa ihmisen syövissä ja se liittyy myös lääkeresistenssin [11].

Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että yhdisteet, joilla on kyky tukahduttaa NF-KB-reitin funktio aktivoivat p53 polku saattaa hallussaan korkeamman syöpälääkkeen tehoa. Todellakin, sykliiniriippuvaiset kinaasi (CDK) estäjä seliciclib (r-roskovitiinilla) [31] ja malaria lääke quinacrine (QC), 9-aminoakridiini (9AA) -johdannainen [32], on tämä kaksinkertainen aktiivisuus ja ne ovat tällä hetkellä vaiheessa II kliinisissä kokeissa kuin syöpälääkkeet. QC ja seliciclib on raportoitu estävän NF-KB: n eston kautta Ser-536 fosforylaation p65-alayksikön NF-KB: n [31], [32]. Ser-536 fosforylaation p65-alayksikköä on välttämätön NF-KB aktiivisuutta ja defosforylaatiota Tämän sivuston muuntaa NF-KB osaksi ei-aktiiviseen muotoon. Lisäksi tämä toiminta, QC pystyy aktivoimaan p53-reitin ja aiheuttavat kasvainsolun kuoleman kautta Bcl-2-liittyvä X-proteiinia (BAX) [33] ja seliciclib aktivoida p53 estämällä MDM2-välitteisen p53 hajoaminen [34]. Näin ollen nämä lääkkeet aiheuttavat lupaava mahdollisuus syöpien hoitoon, joissa molemmat näistä reiteistä on vapautettu ja Ras on konstitutiivisesti aktiivinen.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnistettiin pieni molekyyli yhdisteitä, jotka aktivoituvat samanaikaisesti p53 ja inhiboi NF-KB: n käyttämällä eteenpäin kemiallista geneettinen lähestymistapa. Näiden yhdisteiden, N-2 indusoi kuoleman erilaisia ​​syöpäsolutyyppien estämällä NF-KB: n ja induktio p53. N-2 esti myös kasvaimen kasvua B16F10 melanooman ja LLC keuhkosyöpä hiiren siirteen malleja. Siten N-2 voisi edustaa mahdollinen kemoterapeuttinen lääkeaine, jolla on kyky kohdistaa monipuolista pahanlaatuisia kasvaimia.

Tulokset

tunnistaminen pieniä molekyylejä, jotka samanaikaisesti aktivoida p53 ja estävät NF-KB

kirjasto seulottiin yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka samanaikaisesti moduloivat p53 ja NF-KB reittejä. Arvioida herkkyyttä ja luotettavuutta solun perustuva määritys ennen suorittamista HTS, olemme vahvistaneet annos-vaste-profiilit HTS-muodossa käyttäen positiivisen kontrollin Parthenolide, joka estää LPS-indusoidun NF-KB-aktiivisuutta (Fig. 1A). IC

50 vastinetta Parthenolide oli 7,2 uM, joka on sopimukseen aiemman raportin [35], [36]. Optimointi ja miniatyrisointi HTS tehtiin saavuttaa 384-kuoppaisen levyn muodossa. Z ”arvot soluviljelmälevyihin olivat 0,6.

C6-soluissa, jotka ovat peräisin rotan gliooma kuljettavat villityypin p53 käytettiin seulottaessa kirjastoa. (A) annos-riippuvainen vaste NF-KB: n reportterigeeni kasvavien pitoisuuksien kanssa Parthenolide. (B) seulonta yhdisteitä, jotka estävät NF-KB-reportterigeenin avulla kirjaston 200000 yhdisteitä. Yhdisteet, jotka inhiboivat 100 ng /ml LPS-indusoidun toimittaja aktiivisuutta enemmän kuin 80% on valittu ensisijaiseksi osumia (n = 797). (C) seulonta ensisijaisen osuma yhdisteiden aktivoimiseksi p53 reportterigeenin. Yhdisteet, jotka aktivoidaan p53 toimittaja yli 3-kertainen valittiin lopulliseen osumia (n = 9). (D) yhteenveto HTS menettelyjä. Yhteenlaskettu osuma suhde oli noin 0,0045%.

ensimmäinen kierros HTS käyttäen NF-KB-reportterigeenin tunnistettu 797 ensisijainen osumia, mikä vastaa 0,4% osuma suhde (Fig. 1 B). Toinen HTS suoritettiin sitten arvioida kykyä näiden 797 yhdisteiden aktivoida p53 reportterigeeni. Tämä näyttö tunnistettu 9 yhdisteitä, jotka täyttivät tutkimuksen kriteerit (Fig. 1 C). Yhteenlaskettu osuma suhde seulonnan prosessi oli 0,0045% (Kuva. 1 D).

luokittelu kahdenarvoisen pienimolekyylisiä yhdisteitä

Viimeinen 9 yhdisteet tunnistetaan seuraavat kaksi kierrosta HTS ryhmiteltiin niiden kemiallisen rakenne (Fig. 2). Ryhmä D sisältyvät 9AA-johdannaisia, kuten 9AA ja QC. 9AA-johdannaiset 9AA-1 ja 9AA-2 on raportoitu aktivoida p53, mutta NF-KB ei ole raportoitu [33], [37]. Puolet osuma yhdisteet olivat 9AA johdannaisia ​​ja näiden yhdisteiden osoitti hyvää korrelaatiota NF-KB-estäjiä ja p53 aktivaation (R

2 = 0,85, täydentävä kuviot. S1A ja B).

Yhdisteet, jotka indusoi p53 toimittaja yli 3-kertainen ja samalla esti NF-KB toimittaja yli 80% sisällytettiin analyyseihin (n = 9). Lisäksi 8 vähemmän aktiivisia johdannaisia ​​samanlainen rakenne otettiin mukaan rakenne: aktiivisuussuhde arviointi. Suluissa olevat arvot viittaavat mahdollisimman p53: een reagoiva toimittaja induktion soluissa käsitelty 8 tunnin ajan kunkin yhdisteen (0,4-25 uM). Suhteellinen NF-KB: n eston on esitetty inhibition prosenttiosuus NF-KB-reportteri, kun läsnä on 10 uM kumpaakin yhdistettä. 17 yhdisteet ryhmiteltiin rakenteellisen samankaltaisuuden (ryhmät A-D).

Konsernin yhdiste piperlongumine (PIP) on raportoitu valikoivasti tappaa syöpäsoluja perustuu syöpää erityispiirteet ja tämä yhdiste on aiemmin seulottiin käyttäen p53: een reagoiva toimittaja määritystä U2OS luusarkoomasoluissa [38]. Mielenkiintoista on, että meidän näytön, huomasimme, että PIP ei vain aktivoi p53, mutta on myös estää voimakkaasti NF-KB: n aktiivisuuden (kuvio. 2).

joukossa uusia osuma yhdisteitä, N-2 (5-Ehyl- 3-metyyli-6- (1-metyylipyrrolidonissa niin-1 H-pryidin-2-ylideenimetyyli) -phenanthridinium, C

23H

23N

2, MW = 327,5) osoitti lupaavin profiilia. N-2 indusoi p53 toimittaja yli 10-kertaiseksi ja esti voimakkaasti NF-KB aktiivisuus verrattuna muihin uusiin osumia ryhmät A kautta D. Siksi valitsimme tämän yhdisteen jatkotutkimuksiin. QC, joka on tällä hetkellä kliinisissä kokeissa hormonista-tulenkestävien taksaanin kestävä eturauhassyöpä, ja 9AA valittiin ohjaus yhdisteitä.

N-2 inhiboi NF-KB: n ja sen alavirran kohdegeenejä IL-6 , MCP-1, ja typpioksidi

verrattuna 9AA ja QC, N-2 osoittivat lisääntynyttä inhibitiota NF-KB-reportteri C6-soluissa, kun lisättiin samanaikaisesti 100 ng /ml LPS: ää. IC

50-arvot 9AA, QC, ja N-2 NF-KB: n reportterigeeni oli 23,8 uM, 50,4 uM, ja 5,9 uM, tässä järjestyksessä (kuvio. 3A). LPS stimuloi NF-KB-välitteisen typpioksidin tuotantoa sekä sytokiinien ja kemokiinien, kuten IL-6 ja MCP-1 [39]. Hoito hiiren RAW 264.7 makrofagin solujen N-2 inhiboi voimakkaasti LPS-indusoidun typpioksidin tuotannon; IC

50-arvot typpioksidin tuotannon 9AA, QC, ja N-2 oli 7,8 uM, 33,7 uM, ja 0,64 uM, vastaavasti (Fig. 3B). Olemme myös arvioitiin inhibition LPS-indusoidun IL-6 ja MCP-1 ilmentymisen RAW 264.7 soluja. N-2 ja positiivisen kontrollin Parthenolide inhiboi merkittävästi IL-6 ja MCP-1-proteiinin tuotanto (Fig. 3C). Käsittelemällä N-2 (1 uM) esti LPS-indusoidun fosforylaation Ser-536 p65-alayksikön NF-KB: n, joka on samanlainen 20 uM 9AA (Fig. 3d). Yhdessä N-2 esti voimakkaasti NF-KB toimittaja ja sen loppupään sytokiinin IL-6 (kuviot. 3B ja C), ominaisuus, joka tarjoaa perusteet solunsalpaajaresistentti syövän hoidossa käyttäen N-2.

(A ) annos riippuvuus NF-KB: n reportterigeeni lusiferaasin aktiivisuus määritettiin C6-soluissa kasvavien pitoisuuksien kanssa 9AA, QC, ja N-2 (keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta). (B) annosriippuvainen inhibitio typpioksidin (NO) tuotanto määritettiin kasvavilla pitoisuuksilla 9AA, QC, ja N-2 RAW 264.7 soluja. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SD kolmesta kokeesta. (C) tasot IL-6 ja MCP-1 RAW 264.7-solujen käsittelyn jälkeen Parthenolide (Par) tai N-2: n läsnä ollessa LPS. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD neljästä määrityksissä. * P 0,01 pariksi Studentin t-testiä. (D) analyysi Ser536 fosforylaation p65-alayksikön NF-KB: n RAW 264.7-solujen käsittelyn jälkeen 1 tunnin ajan 20 uM QC tai 1 uM N-2: n läsnä ollessa LPS. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

N-2 aktivoi p53 syöpäsoluissa monipuolinen alkuperää

N-2 lisääntyi yhteensä endogeenisen p53-proteiinin ilmentymistä ja ilmaus sen tavoite geeni p21 A549 ihmisen keuhko- syöpäsoluja ja B16F10 hiiren melanoomasoluja on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot. 4A ja 4B). Aktivointi endogeenisen p53 ja p21 saavutti enimmäismäärät 8 h käsittelyn jälkeen N-2 A549-soluissa ja 16 h B16F10 soluissa. N-2 indusoi p53 reportterigeenin ja sen endogeenisen kohdegeenin p21 HCT116 solujen suurempi teho kuin QC (kuviot. 4C ja 4D). Aktivointi p53-reagoiva toimittaja 1 uM N-2 osoitti samanlaista kinetiikkaa 10 uM QC tai 1 uM Dox (Fig. 4E). Suurin vaikutus Dox, N-2 ja QC p53 toimittaja aktivointi havaittiin 12-20 tunnin kuluttua hoidon aikana 3 uM taksolin näkyy huippu p53 reportteriaktiivisuutta kuluttua 40 h (Fig. 4E). 9AA, QC, ja N-2 aktivoituu p53-reportterigeenin erilaisissa solulinjoissa, mukaan lukien C6, HCT116, A549, ja B16F10 (Fig. 4F). Suurin p53-reagoiva toimittaja aktiivisuutta havaittiin soluissa, joita käsiteltiin kunkin yhdisteen välillä 0,4-25 uM. (Fig. 4F). Ei lisää p53-mRNA: n ekspressio havaittiin vasteena N-2 käsittelyä (aineistoa ei esitetty). Sen sijaan, hoito A549-solujen kanssa 1 uM N-2: ssa 12 h indusoi p53 fosforylaation Ser9, Ser20, ja Ser46 (Fig. 4G). Kuitenkin N-2 ei pystynyt indusoimaan fosforylaation Ser-392, joka oli fosforyloitu jälkeen 9AA tai QC hoitoon. Sen arvioimiseksi, N-2 aiheuttaa DNA-vaurioita, tutkimme fosforylaatio γ-H2AX at Ser139. N-2 ja Dox kohonneeseen fosforyloitua γ-H2AX (Fig. 4G ja täydentävä Fig. S2). Emme löytäneet tällaista aktiivisuutta 9AA ja QC kuten aiemmin raportoitu [32]. Näin ollen on todennäköistä, että N-2 stabiloi p53 kautta DNA-vaurioita-välitteisen fosforylaation p53.

(A) tasot endogeenisen p53 ja p21-proteiinien arvioitiin käsittelyn jälkeen A549 ja B16F10-soluja 1 uM N-2. (B) riippuvaisuus annoksesta N-2 endogeenisen p53 ja p21-proteiineja. (C) riippuvaisuus annoksesta N-2 ja QC endogeenisen p53 ja p21 proteiinien HCT116-soluissa. (D) p53-reagoiva toimittaja aktiivisuuden HCT116-soluissa käsiteltiin 12 h 9AA, QC, doksorubisiini (Dox) tai N-2 yli konsentraatioalueella (0,4-25,0 pM). (E) aktivointi kinetiikkaan p53-reagoiva toimittaja aktiivisuuden HCT116-soluissa käsitelty 2-40 h 3 uM N-2, 3 uM taksolin, 1 uM Dox tai 10 uM QC. (F) p53 reportteriaktiivisuutta C6, HCT116, A549 tai B16F10 soluja käsiteltiin 12 h 9AA, QC, tai N-2 yli konsentraatioalueella (0,4-25 uM). Tiedot on esitetty suhteellisen kertainen induktio p53-reportterigeeni on tehokkain konsentraatio kutakin yhdistettä. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo kolmesta kokeesta; palkit osoittavat keskihajonnan (D-F). (G) fosforylaatio p53 eri seriinitähteiksi ja fosforyloitua histoni γ-H2AX A549-soluja käsiteltiin 12 h QC (10 uM), 9AA (5 uM), Dox (1 uM) tai N-2 (1 uM).

N-2 on antituumorivaikutuksia

in vivo

vieressä verrattiin antiproliferatiivista aktiivisuutta 9AA, QC, ja N-2 eri syöpäsolujen. LD

50 pitoisuudesta kutakin solutyypin määritettiin käsittelyn jälkeen 48 tuntia kanssa 9AA, QC, ja N-2 eri villityyppisen ja mutantin p53 soluja. N-2 osoitti suhteellisesti suurempi tehokkuus kuin 9AA ja QC kaikissa testatuissa solulinjoissa (Fig. 5A). Erityisesti N-2 osoitti voimakkain teho LLC-soluja (LD

50 = 80 nM). Siksi valitsimme LLC soluja edelleen

in vivo

testeissä. Lisäksi tutkimme

in vivo

vaikutus N-2 hiiren B16F10 melanoomasoluja (LD

50 = 600 nM) melanooma ja keuhkosyöpä ovat kaksi eniten lääkkeille vastustuskykyisen kasvaintyypeille.

(A) vertailu IC

50 pitoisuuksia 9AA, QC, ja N-2 eri villityyppisen ja mutantin p53 solulinjoissa. Jokainen piste edustaa IC

50 tietyn solutyypin, jotka on ryhmitelty seuraavasti: (

i

) piireissä, p53 villityypin solulinjoilla (A549, H460, HCT116, C6, SH- SY5Y, ja B16F19); ja (

ii

) kolmiot, p53 mutantti solulinjat (H2009, SW480, Jurkat, U937, ja LLC). (B) ajan kuluessa painon muutokset hoidon jälkeen N2. Virhe palkit edustavat SD. (C) Anti-kasvain aktiivisuuden N-2 ja QC B16F10 vieraskudossiirteitä. Kasvaimen tilavuus ja edustaja leikattiin melanooma päivänä 15 on esitetty. (D) anti-kasvain aktiivisuus N-2 LLC allografteja. Kasvaimen tilavuus, ulkonäkö allotransplantaatteja, ja leikattiin LLC kasvaimia 14. päivänä esitetään. Virhepalkit edustavat SD (C-D). * Tarkoittaa merkitys kontrolliin verrattuna, p 0,05,

# p 0,01 ANOVA: lla. (E) Vaikutus N-2 ankkurista riippumaton kasvu A549-soluja. Kukin tietopiste on keskiarvo ± SD kolmesta määrityksissä. * P 0,05,

# p 0,01 pariksi Studentin t-testiä.

arvioitava N-2 oli anti-kasvain vaikutuksia hiiren B16F10 (melanooma) ja LLC siirteen malleja. Aktivaattorit p53 ovat osoittaneet lupaus hoidettaessa ensisijainen uveal melanooman ja hiiren allograftin malleja silmän B16F10 solun melanooma [40]. QC ja N-2 inhiboi kasvainsolujen kasvua allograftien muodostettu vatsaonteloon B16F10-melanoomasoluja in C57 /BL6-hiirissä. N-2 (1 mg /kg) osoitti samanlaista anti-kasvain vaikutuksia 30 mg /kg QC ilman merkittävää painon (jopa 20% annoksella 3 mg /kg hoitoon N-2; kuviot. 5B ja C). Lisäksi N-2 osoitti vahvaa tehoa käytettäessä

in vivo

LLC siirteen mallissa (kuvio. 5D). Tulokset LLC siirteen vastaavat voimakkaimmista

in vitro

LD

50 arvoa N-2 LLC soluissa. Keskimääräinen paino ja tilavuus primäärikasvaimissa N-2-käsitellyissä hiirissä olivat huomattavasti alhaisemmat kuin ajoneuvon-käsitellyillä hiirillä.

Inhibition of NF-KB: n signalointia indusoi apoptoosin p53-null keuhko- syöpäsoluja, ja se esti hiiri keuhkojen adenokarsinooma kehittäminen [19], [41], [42]. Vaikutuksen arvioimiseksi N-2 on ihmisen keuhkosyöpä, käytimme agar pesäkemuodostusta määrityksissä. NF-KB on tärkeä rooli ankkurista riippumattomaan kasvuun, metastaasin ja kasvaimen muodostumista keuhkokarsinoomasoluja, mukaan lukien A549-solut [43]. Pesäkkeenmuodostusta

in vitro

yleensä korreloi tuumorigeenisyystesti

in vivo

[44]. N-2 inhiboi voimakkaasti pesäkkeiden muodostumista annoksesta riippuvaisella tavalla, ja sen teho on paljon suurempi kuin 9AA ja QC A549 pesäkkeiden muodostumisen määritykset (Fig. 5E).

N-2 indusoi stressiä muuniresponssigeeneinä

havainnollistaa molekyylien vuorovaikutus verkko analysoimalla suhde differentiaalisesti ilmaisi kohdegeenien näytetään microarray määrityksessä. Yleinen verkko paljastaa useita mielenkiintoisia vuorovaikutusta, joka voidaan kytkeä p53 tai NF-KB. N-2 käsittely laski geenien ilmentymistä, jotka liittyvät solusyklin, DNA: n replikaatio ja korjaus mutta lisääntyneen ilmentymisen apoptoosi- ja solun stressiin liittyvien geenien (Fig. 6A ja täydentävä Taulukko S1 ja S2). Nämä tulokset vahvistettiin käyttämällä RT-PCR. N-2 hoito leimallisesti indusoi stressiin liittyviä geenejä, kuten DDIT3, DDIT4, SENS2, ja GADD45 samanaikaisessa alas-säätely proliferatiivinen merkki PCNA, CDK1 (cdc2) ja NF-KB kohdegeenin CCND3 (sykliini D3; Fig . 6B).

(A) Interaction kartta DEGS. Kaiken verkon paljastaa monia mielenkiintoisia vuorovaikutusta, joka voidaan kytkeä p53 tai NF-KB. Solmun väri edustaa kertainen muutos (vihreä, downregulation, punainen, säätelyä). (B) N-2 up-säätelee mRNA stressiä muuniresponssigeeneinä (DDIT3, DDIT4, SESN2, ja GADD45a) ja alas-säätelee mRNA-tasolla liittyvien geenien leviämisen (PCNA ja CCND3). Transkription taso valittujen geenien varmistettiin RT-PCR. * P 0,01, ** p 0,001.

Keskustelu

transkriptiotekijöiden p53 ja NF-KB on kaksi kriittistä proteiineja, joita vapautettiin eri ihmisen syövissä. Multi-tavoite lähestymistapa voi olla tulevaisuuden syövän hoitoon, jossa Lääkeresistenssin on kysymys. Tämän valossa, uusien molekyylien että dually säädellä NF-KB ja p53 signalointi voi olla erityisen tärkeää arvioida mahdollista terapeuttista käyttöä kahdenarvoisen huumeiden erilaisissa syövissä [29].

näyttö 200000 yhdisteiden tunnistettu N- 2, kahdenarvoinen molekyyli, joka saattaa moduloida sekä NF-KB: n ja p53: n signalointia. Verrattuna aiemmin raportoitu bi-kohdennettuja lääkkeitä, 9AA ja QC, N-2 osoitti voimakkaampaa tehoa erilaisissa kasvainsolulinjoissa. Voimakas teho N-2 on esillä IC-

50-arvot NF-KB-välitteinen tuotanto typpioksidin 9AA, QC, ja N-2 (7,8 uM, 33,7 uM, ja 0,64 uM, vastaavasti) . N-2 indusoi myös p53 ja sen kohdegeenien pienemmillä pitoisuuksilla kuin QC. p53 aktivointi on myös raportoitu estävän LPS-indusoidun NF-KB: n aktivaation [45]. Mielenkiintoista, IC

50 N-2 syöpäsoluja oli riippumaton p53 perimäluokituksesta samoissa olosuhteissa (täydentävä taulukko S3 ja Fig. S4). Curaxins, QC ja aiemmin tunnetut p53 aktivaattori PIP (ryhmä A) aiheuttaa myös p53-riippumattoman apoptoottisen kuoleman syöpäsolujen [46], [47]. NF-KB: n signaloinnin yksinään voi olla tehokas hoidettaessa keuhkosyöpää, jotka ovat ras-mutaatioiden [19], [41], [48]. 9AA ja QC osoitti myös merkittävää eroa LD

50 arvojen villityyppisen ja mutantin p53 syöpäsolujen (Fig. 5A ja täydentävä taulukko S3), mikä osoittaa, että p53-riippuvaista apoptoosia ei ole ainoa mekanismi N-2- välitteistä kasvainsolun kuoleman. Erityisesti johtaa kuvassa. S4 viittaa siihen, että ROS todennäköisesti toimii signaalin molekyylit N-2-solukuolema ja tämä prosessi on edelleen toiminnallinen jopa ilman p53. Näin ollen, induktio ROS voi tarjota mahdollinen mekanismi N-2 solukuolema sekä p53-villityypin ja p53-mutantin syöpäsoluja.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että aikaisemmin tunnetun p53 aktivaattoreita PIP , 9AA-1, ja 9AA-2 esti myös LPS-indusoidun NF-KB: n aktivaation (Fig. 2). Anti-inflammatoriset ominaisuus aiemmin tunnistettu kahdenarvoinen lääkkeen seliciclib (roskovitiini) voitaisiin selittää estämällä NF-KB: n [31]. Myöhemmissä tutkimuksissa, on tarpeen arvioida anti-inflammatorinen teho näiden osuma yhdisteiden yksityiskohtaisemmin.

maailmanlaajuinen geenin ilmentymisen profilointi tulokset osoittivat selvästi erottuva induktio stressiin liittyviä geenejä, kuten ATF3, DDIT3 , DDIT4, SENS2, ja GADD45 (Fig. 6). On raportoitu, että eri solujen stressiä, mukaan lukien endoplasmakalvostoon, genotoksinen, ja reaktiivisen hapen stressi, voi vakauttaa p53-proteiini. Tehokas indusoija p53 RITA stimuloitiin myös stressi geenejä, kuten ATF3, DDIT3, DDIT4 ja GADD45, kuten N-2 [49]. DDIT3 /CHOP-geeni on osa Endoplasmakalvosto stressivasteen, DDIT4 /REDD1 ja SENS2 ovat estäjiä mTOR selviytymisen polku, ja GADD45 on kriittinen jännitys anturi apoptoottisen solukuoleman kemiallismekaanisella ehkäiseviä lääkkeitä. Lisäksi ATF3, DDIT3, DDIT4, GADD45 ja SESN2 ovat myös p53-geenien [50], [51], [52], [53]. Erityisesti N-2 indusoi ilmentymisen mTOR-inhibiittorit DDIT4 ja SESN2 ja inhiboi fosforylaatiota Ser536 n p65-alayksikön NF-KB: n, joka fosforyloituu AKT [54]. Mekanismi N-2 toiminta saattaa liittyä estämällä AKT /mTOR ja AKT /NF-KB reittejä. mTOR on tullut kriittinen kasvua ohjaussolmu vastaanottaa stimuloivia signaaleja Ras ja fosfatidyyli-3-OH-kinaasi [55]. Tulokset maailmanlaajuisen geeniekspressioprofilointi viittaavat siihen, että induktio DNA-vaurion, ROS tuotanto ja ylössäätöä stressiin liittyvien geenien N-2 todennäköisesti osallistuvat p53 vakauttamiseen sekä estämällä AKT /mTOR tai AKT /NF -κB eloonjäämisreittejä.

Käsittely N-2 indusoi p53 fosforylaation Ser9, Ser20 ja Ser46 A549-soluissa. Fosforylaatio näistä alueista liittyy apoptoosin induktion, DNA-vaurioita, ja p53 vakaus [6], [7], [8]. Erityisesti, fosforylaatio p53 Ser20 esiintyy useimmiten vasteena DNA-vauriolle ja ROS induktio [56]. Varmistimme DNA-vaurioita N-2 indusoimalla histoni γ-H2AX fosforylaation. Olemme määritti N-2 ROS tuotanto A549-soluja käyttämällä 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCF-DA). Hoito N-2 lisääntyi ROS tasoa merkittävästi A549-soluja, mutta 9AA ei. Positiivinen kontrolli forbolimyristaattiasetaattia aiheutti myös kasvua ROS, mutta N-2- parannettu ROS oli paljon suurempi kuin muut yhdisteet (täydennyskuvio. S3). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että voimakas teho N-2 erilaisissa syöpäsolutyyppien johtuu yhdistelmä monista tekijöistä, jotka kohdistavat kaksi keskeistä väyliä kasvainsoluissa. Yhtäläisyydet ja erot QC, 9AA, Dox, RITA, Nurtlin-3, β-fenyylietyyli-isotiosyanaattia (PEIC) ja N-2 koottiin täydennyskuvio. S5.

Yhteenvetona, uusi pieni molekyyli, N-2 on bivalenttinen syöpälääke, joka on voimakkaampi teho kuin muilla aiemmin tunnistettu pieniä molekyylejä. N-2 on potentiaalia hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien kestävät nykyisillä lääkkeillä. Tämä tutkimus antaa myös mekanistinen oivalluksia molekyylitason vaikutusmekanismi muiden tunnettujen p53-induktorit, kuten PIP, 9AA-1, ja 9AA-2 ja korostaa mahdollisuutta käyttää näitä yhdisteitä tulehduskipulääkkeet.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, transfektiot, ja Lusiferaasimäärityksiä

HCT116, C6, B16F10, A549, U937 ja Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) solut saatiin American Type Culture Collection ja HCT116 null solut olivat antelias lahjoitus tri Bert Vogelstein [57]. H460, H2009, SW480, Jurkat ja SH-SY5Y solut saatiin Korean solulinjasta pankki (Seoul, Korea). Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 media, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 120 ug /ml penisilliiniä, ja 200 ug /ml streptomysiiniä, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Transfektiot suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Stabiilia ekspressiota PNF-KB-Luc ja pp53-Luc vektoreita (Clontech, Palo Alto, CA, USA), samalla menetelmällä kuin lyhytaikaista transfektiota on käytetty, paitsi solut kotransfektoitiin pcDNA3.1 (+), mooli- suhde 10:01. Stabiileja pesäkkeitä valitaan 1000 ng /ml G418: aa (Invitrogen, San Diego, CA, USA) ja yksittäiset pesäkkeet siirrettiin 24-kuoppalevylle. Tutkia NF-KB: n välittämä tai p53-välitteisen transkription toimintaa, lyhytaikaisesti transfektoidut solut ja positiiviset kloonit arvioitiin käyttämällä Promega lusiferaasireportterigeenin määritys mukainen valmistajan ohjeiden (Promega, West Virginia, USA). Positiiviset kloonit yllä, kun läsnä on 500 ng /ml G418: aa. Lusiferaasi signaalit havaittiin käyttämällä luminometriä (Victor 5, Perkin Elmer Wallac, Waltham, MA, USA).

Cell-pohjainen high-throughput screening (HTS) tunnistaa pieniä molekyylejä, jotka samanaikaisesti aktivoida p53 ja inhiboivat NF KB

seulomiseksi pieniä molekyylejä, jotka samanaikaisesti moduloivat p53 ja NF-KB polkuja, me tuotti C6 reportterisolulinjaa (peräisin rotan gliooma kuljettavat villityypin p53) stabiilisti transfektoitu p53: een reagoiva ja NF-KB -responsive lusiferaasireportterilla geenejä. Yhdisteen kirjasto koostui 200000 kemikaalien antamat ChemBridge (San Diego, CA, USA), ChemDiv (San Diego, CA, USA), ja Asinex (Moskova, Venäjä) kemiallisten kirjastojen. Seuloa nämä kemikaalit, 1 x 10

4 NF-KB: n reportteri-solut maljattiin jokaiseen kuoppaan 384 ja muovista soluviljelmässä levy 40 ui DMEM väliainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää. Inkubaation jälkeen yli yön, 0,1 ui yhdisteitä DMSO: hon ja 10 ui lipopolysakkarideja (LPS, DMEM: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan loppupitoisuuteen 10 uM yhdistettä ja 100 ng /ml LPS: ää. Yhtä suuret määrät DMSO: ta ja Parthenolide käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena.