Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että mikroskooppinen imusolmukemetastaaseja ja verenkierrossa kasvainsoluihin voi olla kliinistä merkitystä keuhkosyöpä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa uusia molekyylitason markkereita kasvainsolujen imusolmukkeisiin (LNS) ja ääreisverenkierron (PB) potilaista, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

Methods

Candidate markkereita valittiin perustuu digitaaliseen transkriptio profilointia ja edellinen kirjallisuutta.

KRT19

,

CEACAM5

,

EPCAM, DSG3, SFTPA, SFTPC

ja

SFTPB

mRNA alun perin vahvistanut reaaliaikainen käänteinen transkriptio PCR- kvantifiointi 16 NSCLC kasvaimia ja 22 LNS ja 12 PB näytteitä yksilöille tunnettujen syövän. Viisi ehdokas markkereita valittiin toissijainen validointi kvantifiointiin rinnakkain kasvainbiopsioissa, alue- LNS ja PB näytettä 55 leikkauspotilaiden varten NSCLC. LN ja PB merkki tila verrattiin kliinis potilastietoja.

Tulokset

Kaikki valitut markkereita paitsi DSG3 oli huomattavan korkea primäärikasvaimissa ja hyvin pienillä tai ei-havaittavia määriä normaaleissa LNS ja PB ensimmäisellä kierroksella validointi, mikä viittaa mahdolliseen havaitsemiseen kasvainsoluihin pienisoluista keuhkosyöpää. Ilmaisu profiilit

KRT19

,

CEACAM5, DSG3, SFTPA

ja

SFTPC

mRNA vahvistettiin suurempaa ryhmää aikana toissijainen validointi. Käyttämällä korkein normaali LN taso kunkin merkin kuin kynnys, 39 (71%) ja 55 potilasta oli kohonneet ainakin yhtä merkkiainetta alueellisissa LNS. Vastaavasti, 26 (47%) potilaista oli kohonneet vähintään yksi markkeri PB. Huomattavan suuri määrä potilaita, joilla adenokarsinoomien ollut myönteisiä LN asema näiden merkkiaineiden, verrattuna muihin histologisia tyyppejä (P = 0,004).

Johtopäätökset

Useat lupaavat molekyyli- kasvainsolujen merkkiaineiden alueellisissa LNS ja PB tunnistettiin, mukaan lukien uusi

SFTPA

ja

SFTPC

mRNA: t. Kliinistä seurantaa suuremmassa kohortti tarvitaan selvittää niiden ennusteen arvioinnissa.

Citation: Nordgård O, Singh G, Solberg S, Jørgensen L, Halvorsen AR, Smaaland R, et al. (2013) Novel Molecular Kasvain Solumerkkiaineet in paikallisiin imusolmukkeisiin ja verinäytteet leikkauspotilaiden varten ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (5): e62153. doi: 10,1371 /journal.pone.0062153

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 3. joulukuuta 2012 Hyväksytty 18 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 03 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Nordgård et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat 1) Kaakkois-Norjassa terveydenhuoltopiirin ja 2) Folke Hermansen Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti [1]. Ennuste on paras potilaille, joilla on pieniä kasvaimia eikä välikarsina tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä. Potilaat, joilla ipsilateral hilar imusolmukemetastaaseja voi vastaanottaa leikkausta, jos toisin sovi. TNM järjestelmä on laajalti hyväksytty esikirurginen luokittelu [2], ja ohjaa jatkokäsittelyyn.

Monet potilaat, joilla pieniä kasvaimia ja ilman selvää imusolmukkeiden etäpesäkkeet edelleen periksi tauti. Viiden vuoden elossaolo potilailla, joilla oli paikallinen sairaus on 50% naisilla ja 41% miehillä [3]. Tämä osoittaa, että potilasryhmässä, jossa pieniä kasvaimia oli metastaattinen leviäminen ennen leikkausta, ja että tällä hetkellä käytettävissä menetelmät niiden tällaisia ​​leviämisen ovat epäonnistuneet. Tunnistamalla jäljellä syöpäsoluja, valitut potilaat voisivat saada adjuvanttihoitona kitkemiseksi syöpäsolut eivät poistaa kirurgisesti.

Useita hankkeita, joilla pyritään löytämään markkereita tunnistamaan micrometastases ja jäljellä syöpäsolujen joko kasvainsoluja veressä , imusolmukkeet (LN) tai luuytimestä, tai RNA: ta tai proteiineja, jotka ovat peräisin syöpäsolujen veressä, LNS tai luuytimen [4], [5]. Yhteisiä tekniikan käyttöönottoa etäpesäkkeiden kuuluvat RT-PCR (RT-PCR), immunosytokemia ja immunohistokemia. Kasvainsolun tunnistaisivat CellSearch järjestelmä (perustuen immunomagneettisia rikastamiseen ja immunofluorescense) tai suodatusproseduurit, on arvioitu sekä yleisellä keuhkosyövän-väestöstä [5], [6] ja potilailla, jotka saavat erityistä hoitoa kliinisessä tutkimuksessa [7] . Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi imusolmuke lysaatit ajatellaan olevan herkempi tekniikka verrattuna immunohistokemia, ja tämä menetelmä mahdollistaa tutkimuksen koko LNS sijaan vain valitut kohdat. Verinäytteitä voidaan arvioida myös RT-PCR havaitsemiseksi etäpesäkkeitä, ja olisi lievin menetelmien tunnistamiseksi metastaattisen soluja.

Useita erilaisia ​​proteiineja ja selostukset on tutkittu kasvainsolun merkkiaineiden veren ja LNS. MRNA: t epiteelisolujen erityisiä sytokeratiini (CK) 19 ja 7 on ehdotettu markkereita mikroskooppisia imusuonten levisi [8]. Expression of

SFTPB, TACSTD1

, ja

PVA

ovat osoittaneet lupaavia kanssa yhtäpitävästi imusolmukemetastaaseja [9], ja

CEACAM5

ja

PLUNC

ilmaisun imusolmukkeet tutkittiin RT-PCR: llä, paljastaen korrelaatio selviytymisen [10].

CEACAM5

mRNA imusolmukkeissa osoitti yhdessä selviytymisen kiinalaisessa tutkimuksessa NSCLC potilaiden [11]. Tulokset ovat eriytyneet, olipa kyse havaitseminen hinnat ja kliinistä vaikutusta, mikä johtuu mahdollisesti eroja menetelmien ja otoskokoja.

Tässä tutkimuksessa kartoitettiin useita oletettavasti mielenkiintoisia merkkiaineiden LNS ja perifeerisen veren (PB) potilailta, joilla alkuvaiheen keuhkosyöpään leikkauspotilaiden. Vertasimme ilmentymä eri merkkiaineiden kasvaimissa, LNS, ja PB näytteitä suhteessa potilaan kliinisiä tekijöitä.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

Potilaat otettu Oslo University Hospital – Kansallinen sairaalan kirurginen hoito histologisesti varmistettu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) rekrytoitiin takautuvasti tutkimuksen aikana 2009 2010 Kasvaimet potilailta sisällytettiin biopankissa riippuen Tutkimushoitaja saatavuudesta, ja noin 53% kokonaismäärästä keuhkosyöpäpotilaiden kirurgisesti käsitelty tämän ajanjakson aikana otettiin mukaan. Perustaso luokittelu iän, sukupuolen, tupakointi, vaihe (TNM-7-luokitus) ja histologia esitetään taulukossa 1. Mediaani-ikä oli 66,5 vuotta.

Ethics lausunto

projektin hyväksyi Norja Radium Hospital Institutional Review Board ja alueellisen eettisen komitean Kaakkois (luvan numero: S-05307). Kirjallinen suostumus saatiin kullekin osallistujalle.

Näytteitä

Kaikki kasvainbiopsioissa otettiin oletettavasti elintärkeitä kasvainkudoksessa. Pienemmissä kasvaimet ilman merkkejä kuolion, yksilöt otettiin keskiosasta kasvain. Suuremmissa kasvainten merkkejä keskushermoston kuolion, näytteet otettiin enemmän reuna-osista kasvain. Pyritty ottamaan puhtaasta kasvainkudoksen, ilman ympäröivän keuhkokudoksen.

LN näytteenotto useimmiten tehtiin mukaan European Society of Thoracic kirurgien (EST) suuntaviivat [12]. Näytteet pääasiassa otettu odotettavissa valuma-alueen kasvain. Muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta tapahtui tilanteissa, kirurgi epäillään patologian muilla LN asemilla.

Yhdestä neljään hilar LNS leikeltiin kirurgisesta yksilöitä kaikista potilaista, jättäen puolet solmun rutiini patologinen tarkastelu ja puolet molekyyli analyysit. Sekä kasvainkudoksen ja imusolmukkeiden olivat snap-jäädytettiin nestetypessä leikkaussalissa, ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristämistä. Kasvainsolun pitoisuus kasvain näytteet oli yli 70% useimmissa näytteissä.

Sixteen syöpää vapaa LNS 8 leikkauspotilaiden hyvänlaatuisen paksusuolen sairauksia ja 6 LNS 6 leikkauspotilaiden hyvänlaatuisen keuhkosairauksien olivat kerätään normaalisti LN vertailuaineistoa.

kaikille potilaille 2,5 ml verta kerättiin PAX-putkiin ennen leikkausta RNA säilyttämiseen. Verinäytteitä vedetään laskimoiden portti, ja näytteet vedetään tutkimuksen eivät ensimmäisenä; siten, epiteelisolujen saastuminen oli epätodennäköistä. Perifeerisen veren näytteitä saatiin myös 12 tervettä verrokkia.

RNA uuttaminen

LNS ja kasvainkudoksen homogenisoitiin ja hajotettiin, ja RNA uutettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen).

verinäytteet, PAXgene veren RNA putkia sulatettiin huoneenlämpötilassa yön yli. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen PAXgene Veren miRNA Isolation Kit, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA määrä ja puhtaus arvioitiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (ThermoFisher Scientific, Wilmington, Delaware, USA). RNA laatu kontrolloitiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA).

DNaasikäsittelyä ja Käänteinen transkriptio

RNA DNA- se-käsitelty inkuboimalla 500 ng kokonais-RNA: kunkin näytteen 1 yksikön RQ1 RNAasi-vapaa DNAaasi (Promega) kanssa kokonaistilavuudessa 10 l 1 × First Strand Synthesis (Invitrogen), joka sisälsi 10 yksikköä RNAseOUT RNAasi-inhibiittoria (Invitrogen). Reaktioseos inkuboidaan 37 ° C: ssa 30 min ja DNAasilla inaktivoitiin lisäämällä 1 l RQ1 stop-liuosta ja inkuboimalla 10 minuutin ajan 65 ° C: ssa. Komplementaarinen DNA syntetisoitiin DNAasi-käsitellyn RNA M-MLV käänteistranskriptaasia kokonaistilavuudessa 20 l mukaisesti valmistajan protokollan (Invitrogen).

PCR Primers

Ainakin yksi PCR-alukkeet kunkin alukeparia suunniteltiin ulottumaan eksoni /eksoni rajoja tai ne on suunniteltu sitoutumaan eri eksonit. Identiteetti arvioidaan markkerin transkriptit ja alukesekvenssit on esitetty taulukossa 2.

Kvantitatiivinen PCR

PCRmonistukset suoritettiin qPCR SYBR Green Core Kit (Eurogentec) mukaan valmistajan suositusten. Käänteistranskriptio RNA: ta (20 ng) monistettiin kokonaistilavuudessa 25 l, joka sisälsi 1 x reaktiopuskuria, 0,2 mM dNTP: tä, 0,75 l 1:200 SYBR Green I laimennettiin DMSO: hon ja MgCl, eteenpäin ja taaksepäin aluketta pitoisuuksia, kuten on esitetty Taulukko 2. Lämpövuorottelu ja reaaliaikaisen fluoresenssin mittaukset tehtiin käytettäessä Mx3000P reaaliaikainen PCR-instrumentti (Stratagene), ja aktivointi vaiheessa 10 min 95 ° C, minkä jälkeen 40 sykliä 30 sekuntia 95 ° C: ssa ja 60 sekuntia 60 ° C. Tämän jälkeen PCR-tuotteet analysoitiin sulamiskäyrät. Kaikki sulamiskäyriä paljasti hyvin määritelty huiput odotettavissa sulamislämpötilat, mikä vahvistaa spesifisyyttä alukkeiden reaktio-olosuhteissa. Amplikoni identiteetit vahvistettiin myös sekvensoimalla. Reaktio set-up, mallin lisäksi ja lämpösyklitys suoritettiin kolmessa erillisessä omistettu huonetta. Kontrollit, jotka eivät sisällä mallia sisällytettiin jokaiseen aikavälillä seuraamaan mahdollista pilaantumista.

suhteelliset tasot kunkin merkin mRNA määritettiin normalisointi vastaan ​​BCR viite transkriptio ja kalibraattori näyte sisältyy jokaiseen aikavälillä mallin [13] , [14]. Kalibraattori Näyte valmistettiin sekoittamalla RNA NCI-H441 (European Collection of Cell Cultures) solulinja (50%) ja kaksi NSCLC kasvaimia (25% kutakin), valittiin, koska korkea kaikkien mahdollisten markkereita. Toistettavuus määrityksistä määritettiin mittaamalla saman vertailunäytteen viitenä peräkkäisenä kokeissa. Kertoimet varianssi määritetään olivat 7,5%, 9,6%, 6,1%, 7,3%, 8,1%

CK19

,

CEACAM5, DSG-3, SFTPA

, ja

SFTPC

määrityksissä, vastaavasti. Kynnysarvot positiivisuuden kunkin markkerin veressä ja imusolmukkeiden asetettiin korkeimmalle tasolle normaaleissa LNS ja PB näytteitä.

reaaliaikainen PCR kvantitatiivinen tehtiin kaksi henkilöä (GS ja ON), joka paatuivat ominaisuuksien potilaiden ja ensisijainen kasvaimia.

bioinformatiikka- Marker haut

ilmoitettuna sekvenssimerkki kirjastot (EST) ja sarja analyysi geenien ilmentymistä (SAGE) kirjastot etsittiin ehdokasta markkereita cDNA ja SAGE digitaalinen geeniekspression displayer (DGED) työkalut Cancer Gene Anatomy Project (CGAP) web-sivun (www.ncbi.nih.gov/cgap). Yksityiskohtaisesti, kaikki saatavilla EST kirjastot normaalin aikuisen keuhkojen kudosta ja keuhkosyövässä (pool A) verrattiin kirjastojen normaalista LNS ja normaali perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (pool B). DGED työkalu tuotti tulosluettelo geenien määräsi mukaan ekspressiotason eroja kahden kirjasto allasta, lasketaan kullekin transkriptio suhteena sekvenssien uima A- versus allas B. SAGE DGED hakuja tehtiin samalla tavalla. Tekstitystiedostojen asuvat yläosassa sekä korkea-pisteet luettelot (EST ja SAGE DGED) valittiin edelleen karakterisointia. Korkea monissa altaassa kirjastot mieluummin erittäin korkea muutamilla niistä.

Tilastollinen analyysi

mRNA ei normaalisti jakautunut ja verrattiin käyttämällä Mann-Whitney U-testi. Kategorinen data verrattiin käyttämällä Fisherin testiä. Pääkomponenttianalyysin [15] tehtiin

prcomp

toiminto R [16], skaalaus muuttujat on yksikkö varianssi ennen analyysiä. Kaksipuolinen tilastolliset testit suoritettiin ja p-arvot P0.05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Kaikki laskelmat tehtiin siksi, että R ohjelmistopaketti (www.r-project.org) versio 2.13.1.

Tulokset

valinta ja validointi Candidate Markers

systemaattisesti etsitään expressed sequence tag (EST) ja sarja-analyysi geenin ilmentymisen (SAGE) kirjastoja mRNA: t, jotka olivat mahdollisia markkereita kasvainsolujen imusolmukkeiden (LNS) ja perifeerisen veren (PB) pienisoluista keuhkosyöpää. Ehdokas markkereita pisteytettiin ilmaisun mukaisesti välistä tasoeroa keuhkosyövässä ja normaali LNS /PB. Luetteloista transkriptien kanssa korkeimman pistemäärän, valitsimme keratiinin 19 (

KRT19

) karsinoembryonaaliselle antigeeni liittyvä solunkiinnitysmolekyyli (

CEACAM5

), epiteelin adheesiomolekyyli (

EPCAM

), surfaktanttiproteiineja A (

SFTPA

) ja C (

SFTPC

) varten lisävalidointia ehdokkaaksi markkereita.

KRT19, CEACAM5

ja

EPCAM

mRNA oli raportoitu aiemmin lupaavina kasvainsolun merkkiaineiden LNS alkaen pienisoluista keuhkosyöpää [17], kun taas

SFTPA

ja

SFTPC

olivat Uusien geenien tässä yhteydessä. Aiempien kirjallisuutta, me myös valittu desmogleiini 3

DSG3

ja surfaktanttiproteiinin B (

SFTPB

) mRNA lisävalidointia [17]. Pinta-proteiinit ovat olennaisia ​​osia keuhkojen pinta-aktiivista ainetta nesteen, joka on tärkeä toiminto ja homeostatis keuhkojen alveoles. SFTPA osallistuu pääasiassa puolustuksen vastaan ​​hengitystiepatogeenit [18], kun taas SFTPB ja SFTPC ylläpitää tarkka kunto lipidien pinta-aktiivisen elokuva [19].

Koska ensimmäinen validointi 7 ehdokas markkereita, mittasimme heidän tasot 16 NSCLC kasvainbiopsioissa, 22 syöpää vapaa LNS ja 12 normaali valvonta PB näytteiden kvantitatiivisen RT-PCR (kuva 1). Paitsi

DSG3

, tasot kaikkien merkkiaineet olivat huomattavasti korkeammat kasvaimissa verrattuna kontrolliryhmään LNS ja PB (P0.001).

CEACAM5

ja

SFTPC

mRNA oli havaittavissa normaalissa verinäytteistä. Mielenkiintoista, taso

SFTPA

mRNA 6 ohjaus LNS keuhkoista oli merkittävästi suurempi kuin kontrolliryhmässä LNS paksusuolen suoliliepeen (P = 0,002). Samanlainen suuntaus, joskaan ei tilastollisesti merkitsevä, havaittiin myös

SFTPB

ja

SFTPC

, mutta ei jäljellä ehdokas markkereita.

Mediaaniarvot osoitetaan lyhyt horisontaalisia linjat, kun taas näytteiden tasojen alle määritysrajan (LOD) on merkitty alla katkoviivalla vaakasuora viiva. Tasot eri markkereita ovat suhteessa kalibroijana näyte ja eivät ole suoraan vertailukelpoisia.

lasketaan spesifisyys indeksit kunkin markkerin jakamalla mediaani kasvain taso kunkin merkin korkeimman tason normaalin valvonnan LNS ja PB näytteet (tuloksia ei ole esitetty) [20]. Kolme eniten spesifisyys indeksit saatiin

SFTPB

,

CEACAM5

, ja

SFTPA

(alenevassa järjestyksessä) in LNS ja

SFTPA

,

KRT19

, ja

SFTPB

PB. Spesifisyys indeksit

CEACAM5

ja

SFTPC

veressä ei voitu laskea, koska huomaamaton markkeritasoihin normaalissa veressä. Me päätellä, että kaikki arvioitiin ehdokkaat paitsi

DSG3

tuntui olevan hyvät mahdollisuudet kuin kasvainsolun markkereita potilaan LNS ja PB näytteitä, mukaan ekspressiotason eroja kasvainten ja näytteen tyypistä kiinnostava.

erityisiä epiteelin mRNA: t voidaan vaimentua lomakelajitelmana kasvainten, vähentää niiden käyttökelpoisuus etäpesäke markkereita vastaavissa potilaille. Niinpä teimme pääkomponenttianalyysi merkkiaineen tasojen 16 tutki NSCLC kasvaimet tunnistaa covariations. Kaksi ensimmäistä pääkomponentit selitti 62%: n varianssi aineisto. Biplot alkuperäisestä muuttujien (suhteellinen mRNA pitoisuudet) ja kasvaimen näytteet projisoidaan kaksi ensimmäistä pääkomponentit osoitti, että

SFTPA

,

SFTPB

ja

SFTPC

mRNA-tasot korreloivat keskenään (nuolet osoittavat samaan suuntaan), kun taas

EPCAM

ja

CEACAM5

ja

KRT19

mRNA myös covariated (kuva 2). Valita joukko ehdokas markkereita optimaalisesti kattaa kirjon NSCLC syöpien, valitsimme kaksi markkereita kustakin näistä kovariaatiota ryhmiä lisävalidointia lisäksi

DSG3

, joka näytti olevan riippumaton primaarikasvaimen ilme kuvio. Tuloksena merkki paneeli koostui

KRT19

,

CEACAM5

,

DSG3

,

SFTPA

, ja

SFTPC

mRNA.

mustat ympyrät osoittavat näytteen tiedot heijastetaan ensimmäisen ja toisen pääkomponenttien. Punainen nuolet näyttää vanhan muuttujan akselit ennustetaan asti pääkomponenttien.

Marker tasot kasvaimet, LNS, ja verinäytteet NSCLC Potilaat

edelleen vahvistaa 5 merkkiaineiden puhdistettu paneeli, päätimme niiden pitoisuudet kasvaimissa (mukaan lukien 16 alkuperäisestä validointi), alueellinen LNS ja PB näytteitä 55 NSCLC potilailla, joille leikkaushoitoa (kuva 3). Kaikkiaan 84 LNS alkaen 55 potilasta tutkittiin (keskiarvo 1,5 LN /potilas, alue 1-3). Osa potilaista ”LNS ja PB näytteet olivat kohonneita verrattuna normaaliin valvontaa. Kuitenkin markkeritasoihin sisään LNS noudetaan potilaalla on positiivinen solmu tila (PN +) mukaan rutiini histologinen arviointi eivät merkittävästi poikkea muista LNS, vaikka oli selviä suuntauksia joidenkin merkkien (tuloksia ei ole esitetty). Käytimme korkein normaalia kunkin merkin kynnykseksi määritellään patologian LNS ja PB näytteitä, koska kohonneet todennäköisesti johtuivat tuumorisolujen läsnäolo. Perustuen nämä kynnykset, määritimme potilaiden määrä positiivisia kunkin kasvainsolujen markkeri LNS ja PB näytteet (taulukko 3). Kaikkiaan 39 (71%) ja 55 potilasta oli positiivisia ainakin yksi merkki tutkituissa LNS, kun taas 26 (47%) potilaista oli positiivinen PB näytteitä. Sillä LNS, kaikki viisi markkereita edistänyt merkittävästi tunnistamisen potilaita, joilla molekyyli todisteita LN etäpesäkkeitä. PB näytteitä,

KRT19

mRNA on ollut hallitseva asema löytämään potentiaalisia verenkierrossa syöpäsoluja. Huomattavaa päällekkäisyyttä eri markkereita havaittiin. Ei ollut tilastollisesti merkitsevää yhteyttä LN- ja PB merkki tila.

Mediaaniarvot on osoitettu lyhyitä vaakaviivoja, kun taas näytteiden tasojen alle määritysrajan (LOD) on merkitty alla katkoviivalla vaakasuora viiva. Tasot eri markkereita ovat suhteessa kalibroijana näytteen ja eivät ole suoraan vertailukelpoisia.

Vertailu kliinis Data

molecularly määritelty LN ja PB kasvainsolun tila ja kliinis potilaan tiedot (taulukko 1) verrattiin, mutta vain yksi tilastollisesti merkitsevä assosiaatio havaittiin. Huomattavan suuri joukko LN-positiivisten potilaiden oli adenokarsinooman verrattuna muihin histologisia kasvaintyypeille (P = 0,004). Testasimme onko tämä havainto liittyi primaarikasvaimen tasot yksittäisiä merkintöjä, ja totesi, että

SFTPC

tasot olivat merkittävästi korkeammat adenokarsinooman kuin muissa kasvain alatyyppeihin (P = 0,005). Kuitenkin

SFTPA

,

CEACAM5

ja

DSG3

näytteillä samanlainen suuntauksia, rajatilaisesta merkitys (P = 0,06, P = 0,07 ja P = 0,09, vastaavasti).

Jotta voitaisiin edelleen tutkia suhdetta primaarikasvaimen tasojen kunkin merkin ja histologia alatyyppi tiedot, pääkomponenttianalyysi suoritettiin (kuva 4). Tuloksena biplot osoitti, että ensisijainen

SFTPA

ja

SFTPC

tasot korreloivat sekä

KRT19

ja

DSG3

tasoilla. Levyepiteelikarsinoomien näytti olevan korkea molemmat markkerin ryhmiä, mutta ei

CEACAM5

mRNA. Mann-Whitney U-testejä vahvisti merkittävästi alhaisempi

CEACAM5

mRNA-tasot ja korkeammat

DSG3

mRNA tasoilla squaumous solukarsinoomat (P = 0,003 ja P = 0,002, vastaavasti).

Musta numerot osoittavat histologiaa tyyppi (1 = adenokarsinooma, 2 = adenosquamous karsinooma, 3 = bronchioloalveolar syöpä, 4 = karsinoidikasvaimet, 5 = suuri karsinooma, 6 = pienisoluinen karsinooma, 7 = levyepiteelisyöpä).

keskustelu

tutkimiseksi kliinistä merkitystä kasvainsolun levittämiseksi alueellisia LNS ja PB pienisoluista keuhkosyöpää, optimaalinen havaitseminen ovat tarpeen. Tutkimuksessamme valitsimme epäsuoraa tunnistus lähestymistapa, jossa käytetään epiteelin-spesifisten kopioiden kuin sijaismarkkereita syöpäsoluja. Niinpä useita lupaavia markkereita kasvainsolujen alueellisissa LNS ja PB tunnistettiin ja arvioitiin tässä tutkimuksessa. Perusteellinen validointi kliinisistä näytteistä paljastui, että

KRT19

,

CEACAM5

,

SFTPA

,

SFTPC

ja

DSG3

olivat lupaavia merkkiaineita kasvainsolujen LNS ja PB peräisin NSCLC potilaiden.

KRT19

,

CEACAM5

ja

DSG3

markkereita on raportoitu aikaisemmin [9], kun taas

SFTPA

ja

SFTPC

olivat novel tässä yhteydessä.

tulosten perusteella meidän vahvistusten ja Pääkomponenttianalyysin primaarituumorin tasoilla kuvassa 4, suosittelemme käyttäen multimarker paneeli koostuu

KRT19

,

CEACAM5

ja

SFTPA

. Nämä kolme merkkiä edustavat kolmea ryhmää biplot analyysi viittaa siihen, että kaikki 55 kasvaimia meidän validointi kohortissa oli korkea ainakin yksi merkki. Kaikki markkereita havaittiin hyvin pieninä määrinä normaaleissa LNS ja PB, kun taas kaikki paitsi

DSG3

ilmaistiin korkeilla tasoilla useimmissa kasvaimia.

DSG3

ilmentyi suuria määriä useimmissa okasolusyöpää (kuvio 4 ja [9]), mutta sama päti myös

KRT19

. Koska

KRT19

oli myös läsnä kaikkialla muita histologisia alatyyppejä, ja oli suurempi ekspressiotaso eroja kasvainten, LNS, ja PB, suosimme tämä merkki siitä

KRT19 Twitter /

DSG3

ryhmä. Ehdotettu multimarker paneeli on tutkittava kliinisen vaikutuksen tulevissa tutkimuksissa.

Kaikki markkereita arvioitiin tässä tutkimuksessa liittyivät epiteeliosaan fenotyyppi, seurauksena meidän inital hakuehtoja. Tuoreet tiedot viittaavat siihen, että jotkut CTC käytävä epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), jotka helpottavat muuttoliike ja kyky tunkeutua muihin elimiin [21], [22]. Tämä siirtyminen on jossain määrin liittyy downregulation epiteelin geenejä, mikä tarkoittaa sitä, että kyseinen CTC on vaikeampi havaita analyyseillä tukeutuen epiteelin selostukset ja proteiineja. Tästä huolimatta useimmat nykyisin saatavissa CTC rikastamiseen ja havaintomenetelmiä perustuvat epiteelin merkkiaineita [23], [24]. Pienentää ongelmaa, suosittelemme yhdistämällä useita epiteelin markkereita, kuten multimarker määritys ehdotettu Tässä asiakirjassa. Tällaiset määritykset ovat vähemmän alttiita downregulation erityisten epiteelisolujen selostukset kuin yksi merkki määrityksissä.

Odotimme suurempia positiivisuusasteet meidän molekyylitason markkereita LNS sairastavien potilaiden LN etäpesäkkeitä tunnistetaan rutiinitarkastus kaikista haettu solmujen (PN1 ), verrattuna solmu-negatiivisilla potilailla (pN0). Tämä odotus perustui sekä edellisessä molekyyli- analyysejä sentinellieläinten LNS paksusuolen syöpäpotilaiden [25], [26] sekä aiemmat raportit kasvainsolun levittämistä pienisoluista keuhkosyöpää [4], [27]. Emme kuitenkaan eivät havainneet mitään merkittävää yhdistyksen välillä pN vaiheessa ja meidän molekyylitason LN analyysi tässä tutkimuksessa. Yksi selitys tälle voi olla pieni määrä solmuja analysoitiin kunkin potilaan tutkimuksessamme (keskiarvo 1,5), mikä lisäsi suhteellista todennäköisyys läsnäolo etäpesäkkeitä solmuja ei analysoitu. Selventää Tähän kysymykseen olisi mielenkiintoista verrata rutiini histologinen analyysi yhden LNS meidän molekyyli- analyysejä. Kuitenkin histologisesti määritelty etäpesäke tila yhden solmujen ei ollut käytettävissä tässä tutkimuksessa. Toisaalta, yhdeksän 12 imusolmukkeisiin potilaista oli LNS positiivinen meidän markkereita, joka on hyväksyttävä ottaen määrä LNS analysoitu huomioon. Suurin syy puute tilastollista merkitystä näyttää olevan suuri määrä positiivisia löydöksiä muuten solmussa-negatiivisilla potilailla, jotka voivat johtua okkultismin etäpesäkkeitä.

Samalla, havaitsimme merkittävää yhdistyksen välillä kliiniseen vaiheeseen ja kiertävien tuumorisolujen (CTC) tila. Tämä on ristiriidassa tutkimuksen Krebs et ai, jossa huomattavasti enemmän CTC myönteinen vaihe IV keuhkosyöpäpotilaita havaittiin verrattiin kanssa III syöpä [6]. Tutkimuksemme mukana hyvin vähän vaiheessa III ja missään vaiheessa IV potilaat, joten suora vertailu on vaikeaa. Lukumäärä CTC odotetaan olevan pienempi alkuvaiheen syöpien, kuten havaittiin rintasyövän [23]. Lisäksi Krebs et ai. käyttivät CellSearch järjestelmä havaitsee CTC, kun taas käytimme reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR, myös vähentää vertailukelpoisuutta. Lisäksi markkeritasoihin meidän verinäytteistä olivat tuskin yläpuolella herkkyyden (kuva 3), varsinkin kun kyseessä on

CEACAM5

ja SFPTC. Koska mahdollisesti alhainen toistettavuus lähellä määritysrajan, me analysoitiin uudelleen kaikki

CEACAM5

ja

SFTPC

positiivinen verinäytteitä vahvistusta (tuloksia ei ole esitetty). Alhainen markkeritasoihin todennäköisesti vastasi melko alhainen CTC numeroita. Tämä on sopusoinnussa havaintojen alussa syöpäpotilaista [28]. Periaatteessa havaitseminen 1-2 CTC on altis alhainen toistettavuus. CellSearch järjestelmä perustuu 7,5 ml verinäytteitä. Verinäyte volyymi tutkimuksessamme rajoittui 2,5 ml, mikä vähentää todennäköisyyttä havaita CTC.

saatavuus hilar LNS potilailta, joilla syöpä oli alhainen. Siksi analysoimme myös 16 LNS päässä paksusuolen suoliliepeen normaalisti vertailuaineistoa. Voidaan väittää, että suoliliepeen LNS eivät ole täysin vertailukelpoisia LNS keuhkoista. Niinpä me todellakin tarkkailla korkeampi pinta-aktiivisen proteiinin mRNA: t kuuden välikarsinan LNS. Yksinkertainen selitys tälle voisi olla, että välikarsinan LNS saastuneet epiteelisolujen keuhkoista, joko kirurgiset käsittelyn tai normaalin fysiologisen aktiivisuuden LNS. Kuitenkin se, että muille merkeille oli samalla tasolla molemmissa LN ryhmissä näyttää vastustaa tätä selitystä. Toisaalta, pinta-aktiivisen aineen mRNA: t eivät olleet läsnä paksusuolen epiteelissä. Siitä huolimatta, koska käytimme korkeimmat markkeritasoihin kontrolliryhmässä kynnykseksi positiivisuus, välikarsinan LNS määritetty kynnys

SFTPA

,

SFTPB

ja

SFTPC

markkereita.

Emme löytäneet assosiaatio LN ja PB näytteen tasot meidän markkereita. Tämä voi johtua eri reittien metastaaseja kuten jotkut kasvaimet leviävät imunestejärjestelmän taas toiset leviävät veren. Korkea LN tasot epiteelin mRNA arvellaan edustamaan kasvainsolujen metastaattinen potentiaali. Tällaisia ​​tasoja voi edustaa soluja, jotka ovat peräisin kasvain, mutta jotka ovat parhaillaan poistettavissa immuunijärjestelmää, tai solu roskat. Tällaista syrjintää ei voitu määrittää tässä tutkimuksessa, ja kliininen vaikutus on arvioitava tulevissa tutkimuksissa.

Ei merkittävää eroa tunnistettiin positiivisuusasteet eri syövän vaiheissa, tai miesten ja naisten välillä. Muita potilaita, joilla adenokarsinooman oli korkeat kasvain tasoja joidenkin tutki markkereita, verrattuna kanssa okasolukarsinoomia, mutta tämä olisi interpreteded varovasti johtuen pieni otoskoko.

Hoitohenkilökunta tarvitsee parannuksia miten ositusta potilaille for adjuvanttihoito. Meidän kultakantaan, TNM-luokitus järjestelmä, ei anna tyydyttävää ja tarkat arviot eloonjäämisaste. Tämä osoittaa, että potilaat, jotka voisivat hyötyä adjuvanttihoitona ei tarjota tällaista, kun taas joillakin potilailla parantaa pelkkä leikkaus vastaanottaa tarpeettomia adjuvanttihoito. Parannettu syrjiä diabeetikoilla, joiden kasvainsolujen, mahdollisesti tarvitsevat lisähoitoa, ja ilman tätä tarvetta, hyödyttäisi potilaita.

Yhteenvetona tiedot tukevat kliinistä merkitystä okkultismin imusolmukemetastaaseja ja verenkierrossa kasvainsoluja keuhkosyöpäpotilaita on syntymässä [5], [29]. Ennustaminen tulos ja hoitovasteen ovat mahdollisia kliinisiä sovelluksia. Tässä tutkimuksessa tunnistimme paneelia lupaava kasvainsolun merkkiaineiden LNS ja PB näytteitä potilaista, joilla varhaisessa vaiheessa keuhkosyöpään. Lisäkarakterisointia tarvitaan selventämään kliinistä vaikutusta tulokset ja tunnistaa uusia tavoitteita riskien parempaa ehkäisyä ja räätälöinti terapia.

Kiitokset

Haluamme tunnustaa Ingjerd Solvoll käytännön apua.