Krooninen sairaus

tiivistelmä

GLI (GLI1 /GLI2) transkriptiotekijöitä ovat sekaantuneet kehittymistä ja etenemistä eturauhassyövän vaikka tietämystämme ne todellisuudessa edistävät biologian näiden yhteisten kasvaimia on rajallinen. Havaitsimme, että GLI toimittaja aktiivisuus oli suurempi normaali (PNT-2) ja tuumorisoluja (DU145 ja PC-3) androgeenistä riippumattomia soluja verrattuna androgeeniriippuvaisissa LNCaP eturauhas- syöpäsolujen, ja näin ollen, GLI-mRNA-tasot olivat myös koholla. Ektooppinen ilmentyminen GLI1 tai konstitutiivisesti aktiivisen ΔNGLI2 mutantti indusoi selvä mukulakivi kaltainen morfologia LNCaP-soluissa, että mitä entinen, korreloi lisääntyneen GLI2 sekä ilmentymisen pohjapinta /varsi-, kuten merkkiaineita CD44, β1-integriini, ΔNp63 ja BMI1, ja vähentynyt ilmentyminen luminaaliselle merkki AR (androgeenireseptorin). LNCaP-GLI1 solut olivat elinkelpoisia läsnä AR-estäjän bikalutamidi ja geeniekspressioprofilointi paljasti, että transcriptome LNCaP-GLI1 soluissa oli merkittävästi lähempänä DU145 ja PC-3-soluja kuin ohjata LNCaP-PBP (tyhjä vektori), ja jotka sekä yksilöidä LCN2 /NGAL kuin erittäin aiheuttama transkripti, joka liittyy hormonin itsenäisyyttä rinta- ja eturauhassyöpää. Toiminnallisesti LNCaP-GLI1 soluilla suurempi kloonikasvuun ja olivat invasiivisia kuin kontrolli-soluissa, mutta ne eivät muodosta pesäkkeitä pehmeässä agarissa tai prostaspheres suspensiona viittaa siihen, että niillä ei ole luontaisia ​​kantasolujen ominaisuuksia. Lisäksi kohdennettu tukahduttaminen GLI1 tai GLI2 siRNA eivät muuttaneet transformoidun fenotyypin LNCaP-GLI1 soluissa eivätkä double GLI1 /GLI2 knockdowns aktivoi AR ilmaisun DU145 tai PC-3-solut. Sinänsä varhainen kohdentamiseen GLI onkoproteiineja voivat haitata etenemistä hormonin itsenäisen valtion mutta tarkempi käsitys mekanismien säilyttää tämä fenotyyppi on määritettävä, jos niiden estäminen parantaa tehokkuutta anti-hormonihoito kautta induktio luminaalisen fenotyyppi ja lisääntynyt riippuvuus Jälleenkytkentätoiminto.

Citation: Nadendla SK, Hazan A, Ward M, Harper LJ, Moutasim K, Bianchi LS, et al. (2011) GLI1 annetaan perusteellinen ilmiasumuutokset upon LNCaP syöpäsolujen, jotka sisältävät hankinta hormoni itsenäinen valtio. PLoS ONE 6 (5): e20271. doi: 10,1371 /journal.pone.0020271

Editor: James McCubrey, East Carolina University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 helmikuu 2011; Hyväksytty: 18 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 25, 2011

Copyright: © 2011 Nadendla et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli pääasiallisesti (ja anteliaasti) tukema Middlesex University osuvan rahoitusohjelmaa (SKN), Prostate Action https://www.prostateaction.org.uk/(SKN ja AH: Grant koodit G2007 /55, G2008 /07 ja G2009 /30 ) ja Barts ja London Charity https://www.bartsandthelondoncharity.org.uk/(GWN). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä miehillä ja vaikka kasvaimia aluksi reagoi hyvin anti-hormonihoidon, että monet kasvaimet muuttuvat resistenteiksi tämä hoitomuoto tarjoaa merkittävän esteen hoitoon kehittyneitä muotoja taudin. Vaikka täsmälliset tekijät, jotka aloittavat PCa jäävät epäselviksi, lukuisat tutkimukset ovat kuvanneet geneettisiä vaurioita ja poikkeava signalointimekanismeja jotka voivat vaikuttaa kasvaimen muodostumisen ja etenemisen, ja ne, jotka auttavat antaa androgeeniriippumattomuuteen ovat erityisen tärkeitä, koska ne voivat edustaa uusia kohteita terapeuttiselle interventiolle ( tarkistetaan [1]).

Kuten monissa kasvain muotoja, rooli syövän kantasoluja (CSC) on saanut paljon huomiota PCA biologian, erityisesti kasvaimen aloittamista vaan myös etenemisen ja metastaattinen leviäminen (tarkistetaan in [2]). Koska eturauhasen kasvaimia näyttää pääasiassa luminal fenotyyppiä kuten AR ilmaisun kyseessä arvellaan johtuvan luminaaliselle erityssoluista. Kuitenkin perustuu CD profilointi ja sytokeratiinia ilme, pohjapinta-ominaisuuksiltaan on havaittu ensisijainen kasvaimia ja voi suurentua metastaattisen ja hormoni tulenkestävät kasvaimia [3], [4]. Lisäksi pohjapinta /kantasolujen kaltaisia ​​soluja eristetty sekä ensisijainen kasvaimia ja syövän solulinjat osoittavat suurempaa tumourigenicity hiiren vierassiirrekokeissa [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Sen sijaan, Vander Griendin ym [11] ehdotetaan, että syöpä-aloittavat solu voi olla välittäjänä AR ilmentävä solu, ”hankkii varsi kaltainen aktiivisuus” ja heterogeenisyys Eturauhassyövän käy selvästi ilmi tutkimuksissa hiirimalleissa: Wang et al [12] on kuvattu harvinainen luminal kantasolujen populaation (joka ilmaisee Nkx3-1), joka voi aiheuttaa kasvaimia taas Lawson et ai [13] havaitsivat, että pohjapinta epiteelin kantasolujen transformoitiin tehokkaammin.

Hedgehog (HH) signalointi on merkittävä kehityskulku, joka on osallinen muodostumista ja etenemistä lukuisia kasvaintyypeissä mukaan lukien ihon, rintojen, haima, aivot ja keuhko. HH signalointi, välittyy pääasiassa loppupään GLI (viitaten sekä GLI1 ja GLI2) transkriptiotekijöitä, liittyy tuumorigeneesiä säätelemällä erilaisia ​​mekanismeja, kuten proliferaatiota, erilaistumista, apoptoosin, muuttoliike /invaasion ja ylläpito CSC populaatioiden (tarkistetaan [14], [15], [16]).

Viimeaikaiset tutkimukset ovat kuvanneet aktivoitumisen HH signalointi PCA vaikka tulokset ovat usein olleet ristiriitaisia ​​ja mekanismi (t), johon GLI edistävät neoplasia eivät ymmärretään hyvin (tarkistetaan [17], [18]). Esimerkiksi, useat tutkimukset ovat esittäneet, että lisääntynyt epiteelin GLI1 ilmentyminen edistää kasvaimen muodostumisen [19], [20], [21]. Sen sijaan, Fan et ai [22] havaittu mitään merkittävää eroa SHH tai GLI1 mRNA-tasojen välillä kasvaimen ja vyöhykkeen täsmäsi hyvänlaatuinen kudosten ja, mikä vielä merkittävämpää, että GLI1 ilmentyi strooman, mutta ei epiteelin, osa BPH ja PCa. Mitä kehittyneempiä tautitilan korkeita SHH proteiinin ja GLI1 mRNA on kuvattu metastaattisen näytteitä ja DHH, GLI1 ja GLI2 on yhdistetty siirtymistä hormonin tulenkestävä tilassa [21], [23], [24], [25]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet yhteyden välillä HH /GLI ja AR signalointia androgeeniriippuvaisissa (AD), luminaalisen epiteelin LNCaP eturauhassyöpäsolulinja ja osoittivat, että GLI1 ylläpitää solujen elinkelpoisuuden puuttuessa AR toimintaa [25], [26 ], [27], [28].

Tässä osoitamme, että korkea GLI aktiivisuus havaitaan androgeeni-riippumaton (AI) DU145 ja PC-3 epiteelin eturauhassyövän solulinjoissa ja että kohdunulkoinen GLI1 edistää androgeeniriippumattomuuteen vuonna LNCaP-solut, jotka korreloi muodonmuutosta fenotyyppi tunnusomaisempaa DU145 ja PC-3-solut. Kuitenkin GLI tukahduttaminen ei edistä AD fenotyypin DU145 tai PC-3-solut. Sinänsä varhainen kohdentamiseen GLI onkoproteiineja voi estää etenemisen hormoni itsenäisen valtion, mutta tämä lähestymistapa ei saa lisätä tehoa anti-hormonihoito kasvainsoluissa, jotka ovat menettäneet AR ilmaisun ja jotka eivät ole riippuvaisia ​​sen signalointi niiden toimivuudesta .

tulokset

Analyysi GLI ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa

Tutkiakseen otaksuttu rooli GLI eturauhassyövässä, ensin määritetty taso GLI reportteri toimintaa erilaisissa eturauhasen solulinjoissa. GLI toimittaja aktiivisuus oli korkeampi AI DU145 ja PC-3 eturauhassyöpäsolulinjoissa verrattuna AD LNCaP eturauhassyöpäsolulinja ja toimittaja aktiivisuus oli myös suurempi AI PNT-2 normaali epiteelin eturauhasen solulinja (Fig. 1A). Näin ollen, GLI1 ja GLI2 mRNA: n ilmentyminen oli suurempi kaikilla AI solulinjoissa kuin LNCaP-soluja (Fig. 1 B). Sellaisenaan, olemme analysoineet vaikutus yli-ilmentävien GLI1 ja aktiivinen ΔNGLI2 mutantti kun LNCaP solubiologian. Silmiinpistävin vaikutus kohdunulkoisen GLI1 (eGLI1) ja ΔNGLI2 liittyvät solun muotoon: toisin kuin ominaisuus karamaisen morfologia vanhempien tai ohjata LNCaP-PBP (tyhjä vektori) soluja, muutaman päivän kuluttua transduktio solua /pesäkkeet mukulakivi kaltainen morfologia näkyivät LNCaP yli-ilmentävät eGLI1 tai ΔNGLI2 (Fig. 1 C). Kuluttua lääkkeen valinta, sekä LNCaP-GLI1 ja LNCaP-ΔNGLI2 solut olivat täysin muuttunut antamiseksi morfologia muistuttaa PNT-2 tai DU145 soluja (katso Fig. 5A tarkastella muuttui täysin morfologia). Ektooppinen GLI1 ja ΔNGLI2 proteiinin aktiivisuuden vahvistettiin induktio PTCH1 mRNA: ta (Fig. 1 D). Lisäksi endogeenisen GLI2 mRNA indusoitui LNCaP-GLI1 soluissa, kun taas yllättäen, endogeenisen GLI1 mRNA tukahdutettiin LNCaP-ΔNGLI2 solujen paljastaa, että morfologinen muutos voi välittää GLI2 (Fig. 1 E). Kuten DU145 ja PC-3-solut ilmentävät korkeita sekä GLI1 ja GLI2 verrattuna LNCaP (Fig. 1 B), päätimme tutkia tarkemmin biologiaan LNCaP-GLI1 soluissa.

(A) analyysi GLI lusiferaasireportterista aktiivisuus erilaisissa androgeenista riippumattoman solulinjojen ja verrattuna androgeeniriippuvaisen LNCaP-solulinjasta. (B) Kvantitatiivinen PCR-analyysi GLI1 ja GLI2 mRNA-tasot androgeenistä riippumaton solulinjojen ja verrattuna LNCaP-soluja (C) Cobblestone kaltaisia ​​soluja /pesäkkeet esiin LNCaP ektooppiseen GLI1 tai ΔNGLI2 ilmentymistä (merkitty nuolilla). (D) qPCR analyysi PTCH1 mRNA: n ekspression LNCaP-GLI1 ja LNCaP-ΔNGLI2 soluissa. (E) qPCR analyysi GLI2 mRNA: n ekspression LNCaP-GLI1 solujen ja GLI1 mRNA: n ilmentymisen LNCaP-ΔNGLI2 soluissa. (F) morfologia LNCaP solut, jotka ekspressoivat EGFP ei muutu, kun viljeltiin yhdessä LNCaP-GLI1 soluissa.

Aluksi GLI toimittaja aktiivisuus mitattiin LNCaP-GLI1 solujen ja osoitettu olevan hyvin taso verrattavissa PC-3 ja DU145 soluja (Fig. 1 B, vrt pylväät 2-4). Myöhemmin selvitimme onko kykyä eGLI1 aiheuttavan mukulakivikujia kaltainen morfologia LNCaP-soluissa oli itsenäisen keinoin tai onko tämä tarvita paracrine /juxtacrine signalointi kautta molekyylejä erittämän LNCaP-GLI1 soluissa. Morfologia LNCaP-solujen ilmentämään EGFP: tä ei muutu, kun viljeltiin yhdessä LNCaP-GLI1 solujen paljastaa, että mukulakivikujia kaltainen morfologia indusoi itsenäisesti (Fig. 1 F). Kuitenkin, emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että induktio mukulakivikujia kaltainen morfologia välittyy reseptoreja, jotka ilmaistaan ​​LNCaP-GLI1 soluja (aluksi normaali morfologia), ja että sen jälkeen sitoutuvat molekyylit erittyvät saman (tai muu) LNCaP- GLI1 solujen kautta toimivan paracrine /juxtacrine signalointia.

GLI1 annetaan androgen-riippumattomuuden LNCaP

ilmentyminen epiteelisolujen merkkiaineiden tutkittiin sen määrittämiseksi, onko luminaalinen fenotyypin LNCaP-solujen muuttunut eGLI1: AR voimakkaasti tukahdutettiin LNCaP-GLI1 soluissa, kun taas pohjapinta /varsi kaltaiset merkkiaineita CD44, β1-integriini, ΔNp63, ja BMI1 olivat kaikki kasvanut (Fig. 2A); Tämä vahvistettiin Western blot analyysi AR ja CD44, lisääntynyt ilmentyminen solun pinnalla jälkimmäisen vahvistettiin FACS (kuviot. 2B ja C). Koska yhtenäinen globaali muutos CD44 ilmaisun päätimme palkata heterogeenisen populaation jatkotutkimuksiin. Mitä androgen riippuvuus, kun taas altistuminen AR-estäjän bikalutamidi voimakkaasti tukahdutti leviämisen LNCaP-PBP solujen lisääntynyt proliferaatiopotentiaali LNCaP-GLI1 soluissa oli ennallaan ja tämä varmistettiin virtaussytometrillä (kuviot. 2D, kaistat 1-4 ja E ). Siksi määritettynä epiteelin merkki ilmaisun ja sieto bikalutamidi, nämä tiedot viittaavat siihen, että eGLI1 indusoi regressio (tai de-erilaistuminen) LNCaP solujen pohjapinta /varsi kaltainen muoto, joka on luonnostaan ​​riippumaton AR signalointi elinkelpoisuutta.

(A) qPCR analyysi epiteelin markkerin ilmentymisen LNCaP-GLI1 solujen suhteen LNCaP-PBP-soluja (nb tiedot esitetään luonnolliset logaritmit, joten suhteellinen induktio CD44 on lähes 7000-kertainen). (B) Western blot-analyysi AR ja CD44 ekspressio LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1 ja DU145 soluja (nuolet merkitsevät CD44 isoformit yhteisiä LNCaP-GLI1 ja DU145 solut). (C) FACS-analyysi CD44 ilmentymisen LNCaP-PBP ja LNCaP-GLI1 soluissa. (D) Proliferaatiomääritys verrata ja määrittää vaikutus bikalutamidin kun leviämisen nopeus LNCaP-PBP ja LNCaP-GLI1 soluissa sekä vaikutus AG1478 (EGFR estäjä) ja U0126 (MEK: n estäjä), kun jälkimmäinen. (E) analyysi solusyklin virtaussytometrialla LNCaP-PBP ja LNCaP-GLI1 soluja altistetaan bikalutamidia.

Tämän tutkimiseksi edelleen, LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1, DU145 ja PC- 3-solut analysoitiin DNA mikrosiruja: maailmanlaajuinen array profilointi paljasti, että transcriptome LNCaP-GLI1 soluissa oli samanlainen DU145 ja PC-3-solujen kuin LNCaP-PBP solujen mikä ilmentää sitä, missä määrin LNCaP-GLI1 solut ovat muuttuneet fenotyyppi ( kuva 3A). Suorassa verrattuna LNCaP-PBP-solut, ilmentyminen 260-transkriptien poikkesi enemmän kuin 10-kertaisesti (144 ylös ja 116 alas) LNCaP-GLI1 solut (Fig. 3B ja kuviot S1 ja S2). Toiminnallinen ryhmään nämä selostukset tuotetun 15 ontologisia mukaan lukien ne, jotka liittyvät tuumoribiologiassa kuten solu- soluadheesiota, solun liikkuvuus, EMT (epiteelin-mesenkymaalitransitioon) ja hormoni riippumattomuus (kuva S3); jälkimmäinen ryhmä myös LCN2 (lipokaliini 2) ja CAV2 (caveolin 2), joita on aiemmin määritelty osana yhteistä allekirjoituksen hormonin itsenäisyyden rinta- ja eturauhassyöpää [29]. Suurin osa 144 lisääntynyt transkriptit ilmaistiin samalla tasolla LNCaP-GLI1 solujen verrattuna DU145 ja /tai PC-3-solut ( 3-kertainen ero), kun taas ilmaus 12 transkriptien (mukaan lukien LCN2) oli 3-kertainen LNCaP-GLI soluja verrattuna sekä solutyyppejä (kuvio S1 ja taulukko 1). Vastavuoroisesti 116 laski transkriptien vain yksi, MRPL23, ilmaistiin 3-kertaa pienempi LNCaP-GLI1 soluja verrattuna sekä DU145 ja PC-3-soluja (kuvio S2).

(A) tilastollinen vertailu maailmanlaajuisen geeniekspressioprofiilit prosenttiosuuden määrittämiseksi transkriptien, jotka ilmentyvät merkittävästi eri tasoilla LNCaP-PBP, DU145 ja PC-3-soluja verrattuna LNCaP-GLI1 (Pearson korrelaatio yhteistyössä tehokkaasti ≥0.7, p 0,05) (B ) Heat kartta ilmaiseva transkriptien LNCaP-GLI1 soluihin, joissa muutos ilmaus on sekä 10-kertaiseksi ja erittäin merkittävästi erilainen verrattuna LNCaP-PBP soluja (opiskelijan

t

-testi, p 0,01): vasen paneeli listoja lisääntynyt geenejä, oikea paneeli vähemmän luetteloihin geenejä ja DU145 ja PC-3-soluja esitetty vertailun (* osoittaa transkriptivariantissa saman geenin). (C) Western blot analyysillä vertailemalla ilmentymistä tiettyjen signaloinnin proteiinien välillä LNCaP-PBP ja LNCaP-GLI1 solujen DU145 ja PC-3 lysaatit mukaan vertailun. (D) fosforylaatio tukirankaproteiinin proteiinin MLC2 välittyy ROCK LNCaP-GLI1 soluja (nb vasta täydellisen MLC ei toiminut meidän käsissämme).

Sekä DNA-siru profilointi, missä määrin suurten signalointireitin aktivaatio määritettiin Western-blottauksella LNCaP-GLI1 soluja. Hormoni itsenäisyys liittyy EGFR reitin aktivointi ja vaikka on todettu, että EGFR mRNA ilmaisua ei kasvanut huomattavasti AI solulinjoissa ([29] ja meidän microarray data), voimakasta kasvua EGFR-proteiinin ilmentymistä havaittiin LNCaP-GLI1 soluissa tasolle verrattavissa DU145 ja PC-3-solut (Fig. 3C). ERK (Solunulkoisilla signaali säätelemät Kinase) aktiivisuus lisääntyi myös LNCaP-GLI1 soluja (Fig. 3C) ja farmakologinen EGFR tai ERK vaimentaa niiden korkea proliferaatiopotentiaali (Fig. 2D, vrt pylväät 1, 3, 5 ja 6) . Mitä AKT, vaikka lisääntynyt aktiivisuus liittyy mutaatiostatuksesta inaktivoitumista PTEN LNCaP-soluissa [30], [31], [32], eGLI1 vähensi tasolle verrattavissa DU145 soluihin viittaa siihen, että on olemassa mekanismi (t), joita voitaisiin käyttää lievittämiseksi menetys tämän tärkeän tuumorisuppressorigeeniä (Fig. 3C). Mitä tulee solun tukirangan, LNCaP-GLI1 soluilla kasvua MLC2 (myosiinin kevytketju 2) fosforylaation, joka oli samanlainen sekä DU145 ja PC-3-solut (Fig. 3C ja tietoja ei ole esitetty). MLC2 säätelee aktiinisytoskeletonin (esimerkiksi stressi kuitu muodostuminen) ja on itse säätelee MLCK (myosiinikevytketjua kinaasi) ja ROCK (Rho liittyvä kinaasi); altistuminen ROCK estäjä Y27632 muttei MLCK estäjä ML-7 vähensi MLC2 fosforylaatiota, vaikka tämä ei ole kääntänyt mukulakivikujia kaltainen morfologia LNCaP-GLI1 soluja (Fig. 3d ja julkaisemattomat havainnot). Yhteenvetona, nämä tiedot osoittavat lisäksi, missä määrin LNCaP-GLI1 solut muistuttavat DU145 ja PC-3-solut.

LNCaP-GLI1 solut eivät näy ankkurista riippumaton kasvu

HH /GLI signalointi säätelee normaali ja syövän kantasolukkoa ja viimeaikaiset tutkimukset ovat kuvanneet miten EMT on luontainen piirre tällaisten solujen [15], [16], [33]. Mielenkiintoista on, että vaikka niiden mukulakivi kaltainen morfologia, tulokset microarray paljasti, että eGLI1 indusoi EMT LNCaP-soluissa (kuvio S3). Todellakin, väheni E-kadheriinin ja lisääntynyt vimentiinista ilmentyminen vahvistettiin Western-blottauksella, vaikka tämä ei ollut riippuvainen EGFR tai MEK-ERK signalointi [34] (Fig. 4A). Niinpä LNCaP-GLI1 solut olivat erittäin invasiivisia kautta Matrigel ™ alustan (Fig. 4B) ja ne näytetään myös suurempi kloonikasvuun kun ympättiin alhainen tiheys (Fig. 4C). Kuitenkin huolimatta ilmaus ”stemness” markkereita (mukaan lukien CD44, β1-integriini ja BMI1), EMT ja suurempi klonaalisen kasvun (kuviot. 2A, 4A ja 4C), toisin kuin kontrolli solut LNCaP-GLI1 solut eivät muodosta prostaspheres suspensiossa tai pesäkkeitä pehmeässä agarissa (Fig. 4D). Käsitellä sitä mahdollisuutta, että LNCaP-GLI1 solut eivät lisäänny 3-D-kulttuuri, koska ne eivät kykene erottamaan kohti luminaaliseen fenotyyppiä (so koska konstitutiivisen eGLI1 ilmentymisen), DU145-soluja viljeltiin myös samoissa olosuhteissa. Ei pesäkkeitä kummassakaan määrityksessä DU145 soluihin viittaa siihen, että AR

– solut ovat huonosti klonogeeniset in kiinnittymisestä riippumaton

in vitro

kulttuuri järjestelmät (tuloksia ei esitetty); Tämä tukee Thiyagarajan et al [35], jotka havaittiin, että DU145 (ja PC-3-solut) olivat vähemmän proliferatiivinen pehmytagarissa verrattuna LNCaP vaikka jotkut pesäkekasvun näkyi heidän tutkimuksessa.

(A ) Western blot analyysi verrataan ilmaus EMT merkkiaineiden E-kadheriinin ja vimentiinista välillä LNCaP-GLI1 ja LNCaP-PBP soluja (nb lasku E-kadheriinin LNCaP-GLI1 solujen osa poistuu läsnäollessa EGFR estäjän AG1478 ja vähemmässä määrin MEK estäjä U0126). (B) TranswellTM invaasiomääritys verrataan invasiivisia potentiaalia LNCaP-PBP ja LNCaP-GLI1 solujen kautta Matrigel alustan. (C) kyky muodostaa klooneja määrityksessä arvioidaan pesäkkeitä muodostavien kykyä LNCaP-PBP ja LNCaP-GLI1 soluja ympättiin alhainen tiheys. (D) Anchorage riippumattoman kasvun havaitaan LNCaP-PBP soluissa, mutta ei LNCaP-GLI1 soluja (yläpaneeli – pehmeä agar -pesäkemääritys; pohjapaneelin – prostasphere määritys).

GLI tukahduttaminen ei edistä luminaali kaltainen fenotyyppi androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solujen

Lopuksi pyrittiin määrittämään jos kohdennettua tukahduttaminen GLI riitti kääntämään transformoidun fenotyypin LNCaP-GLI1 soluja tai aiheuttamaan luminaaliselle kaltainen fenotyyppi DU145 tai PC-3-solut. Transfektio LNCaP-GLI1 solujen GLI1 tai GLI2 siRNA ei vaikuttanut morfologia LNCaP-GLI1 soluissa eikä ollut mitään muutosta ilmaus ΔNp63 tai AR-mRNA (kuviot. 5A-C ja kuvio S4A); tämä osoittaa, että fenotyyppinen muuntaminen aiheuttama eGLI1 LNCaP-soluissa on peruuttamaton ja että ylläpito AI fenotyyppi ei riipu GLI2. Mitä DU145 ja PC-3-solujen, teho kaksinkertainen GLI1 /GLI2 knockdowns vahvistettiin lasku GLI reportteri toimintaa, mutta ei ollut muuttunut solujen morfologia eikä ollut mitään muutosta ilmaus ΔNp63 tai AR-mRNA (kuviot. 5D -F, kuvio S4b ja julkaisemattomat havainnot). Olemme myös käyttää GLI estäjä GANT61 (30 uM) [36], mutta tämä oli vähemmän tehokkaita tukahduttamaan GLI toimittaja aktiivisuus kuin RNAi (tuloksia ei ole esitetty). Sinänsä vaikka AI eturauhassyövän solut osoittavat korkeaa GLI mRNA: n ilmentymisen ja aktiivisuuden ja eGLI1 pystyy edistämään AI fenotyypin LNCaP, GLI tukahduttaminen ei edistää luminaalisen kaltainen ja AD fenotyypin AI eturauhasen syöpäsoluja.

(A) transformoituja morfologia LNCaP-GLI1 soluja ei kääntää kun transfektio GLI1 tai GLI2 siRNA. (B) qPCR analyysi GLI1 ja GLI2 mRNA: n LNCaP-GLI1 transfektoitujen solujen GLI1 tai GLI2 siRNA. (C) RT-PCR-analyysi ΔNp63 ja AR-mRNA: n LNCaP-GLI1 transfektoitujen solujen GLI1 tai GLI2 siRNA. (D) qPCR analyysi GLI1 ja GLI2 mRNA DU145 ja PC-3-solut transfektoitu GLI1 ja GLI2 siRNA. (E) GLI toimittaja aktiivisuus vaimennetaan DU145 ja PC-3-solut transfektoitiin GLI1 ja GLI2 siRNA (N.B. toimittaja aktiivisuus voidaan vaikuttaa Gli3 ilmentymistä PC-3-solujen [17]). (F) RT-PCR-analyysi ΔNp63 ja AR-mRNA DU145 ja PC-3-solut transfektoitu GLI1 ja GLI2 siRNA.

Keskustelu

rooli HH signalointi on osoittautunut kiistanalainen PCA-biologia; tämä sisältää keskustelua siitä, onko polku vaikuttaa ensisijaisen kasvaimen muodostumisen sekä todellinen tila signaloinnin (autokriinisiä tai paracrine). Lisäksi on ollut ristiriitaisia ​​tietoja siitä, onko vai ei Gli ilmaisua välittyy kanoninen tai ei-kanoninen reittejä PCA solulinjoissa (tarkistetaan [18]). Emme ole käsitelty luonnetta GLI sääntelyn vaan ovat osoittaneet, että AI solulinjat PNT-2, DU145 ja PC-3 näyttö korkeampi GLI mRNA kuin AD LNCaP eturauhassyöpäsolulinja ja tämä korreloi lisääntynyt GLI reportteriaktiivisuutta (kuviot . 1A ja B). Se, että GLI1 ilmentyminen oli verrattavissa normaalin PNT-2-soluissa ja kasvaimia DU145 ja PC-3-soluissa oli odottamaton, mutta toisin kuin Karhadkar et al [21], Huomasimme myös, että GLI1 mRNA voimakkaasti ilmaistu kaupallisessa ensisijainen eturauhasen pohjapinta epiteelisoluihin (PrECs), vaikka uskollisesti verrattuna solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa ei ollut mahdollista, koska PrECs viljellään asiantuntija väliaineessa, joka ei sisällä seerumia (SKN ja GWN, julkaisematon). Huolimatta Näiden havaintojen proteiinitasolla GLI1 on harvoin havaitaan Tyvisolukerroksessa normaalin ihmisen eturauhasen kudosta taas ilmaisu on yleisempää hyperplastic tyvisoluissa ja karsinoomat [20]. Sinänsä tavalla sukua GLI2 asetuksen [37], vaikka GLI1 mRNA ilmaisu on vakio välillä normaali ja tuumorigeenisen solut, proteiini voidaan vakauttaa jälkimmäisessä (mahdollisesti sulatettua [38]) ja tämä yhdessä GLI2, voisi selittää kasvun GLI reportteriaktiivisuutta.

Tuloksemme viittaavat siihen, että GLI1 indusoi androgeenista itsenäisyyden LNCaP kautta sen kyky aiheuttaa pohjapinta kaltainen fenotyyppi, joka liittyy tyvisolusyöpä väestöä ja että on luonnollisesti riippumaton AR toimintaa; Tämä tukee vähennetään AR ilme yhdistettynä kasvua lukuisten pohjapinta /varsi-kaltainen merkkiaineita. Chen et al [26] kuvataan myös rooli GLI1 edistämisessä AI kasvun LNCaP-soluissa, mutta tämä ei liittynyt alentunut AR ilmaisun ja voi heijastaa sitä, että eGLI1 ilmentyminen oli alempi niiden järjestelmä määritettynä vähemmän taitettava lisäys GLI1 toimittaja toimintaa. Vaikka tutkimukset tehtiin heterogeeninen solupopulaatio, fenotyyppi oli yhdenmukainen emmekä ole pystyneet eristämään LNCaP-GLI1 kloonilinjoissa että ylläpitämään normaalia LNCaP morfologia osoittaa, että retrovirus- eGLI1 edistetään ”kaikki tai ei mitään” vastausta, mutta koska taso Gli toimittaja aktiivisuus oli verrattavissa DU145 ja PC-3-solut tämä osoittaa, että järjestelmä on biologista merkitystä. Miten eGLI1 välittää muutosta LNCaP ei ole selvitetty, mutta se voi liittyä useita mekanismeja: eGLI1 esto AR signalointi yksin ei todennäköisesti aloittaa fenotyypin muutos, mutta yhdistettynä sen kyky ylläpitää solujen elinkelpoisuuden puuttuessa AR signalointi [27] , [28], tämä voi pahentaa vaikutuksia sen pääasiallinen rooli transkriptioaktivaattorina.

kuten edellä todettiin, eGLI1 lisääntynyt yhteensä GLI aktiivisuus LNCaP tasolle verrattavissa DU145 ja PC-3-solut.