Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA: n metylaatio (DNAm) merkkiaineiden perifeerisessä veressä saattaa olla lupaava diagnostisia tai varhainen havaitseminen /riski merkkiaineita epiteelisyövissä. Tähän mennessä ei tutkimuksessa on arvioitu diagnostinen ja ennustavan potentiaalia tällaisten merkkiaineiden suuressa tapauksessa ohjaus kohortti ja genomin laajuisesti.

Keskeiset havainnot

Tekemällä genominlaajuisten DNAm profilointi suuri munasarjasyövän tapauksessa ohjaus kohortin me täällä osoittaa, että aktiivinen munasarjasyöpä on merkittävä vaikutus DNAm kuvio ääreisverenkierron. Erityisesti mittaamalla metylaatiotasoilla yli 27000 CpG: t verisolujen 148 terveiden ihmisten ja 113 samanikäisiin esikäsittelyn munasarjasyövän tapauksissa me johtamiseksi DNAm allekirjoitus, joka voi ennustaa läsnäolo aktiivisen munasarjasyövän sokea koe, joilla olisi AUC 0,8 (95% CI (,74-,87)). Olemme edelleen vahvistaa havaintomme toisessa riippumaton joukko 122 jälkikäsittely tapauksissa (AUC = 0,76 (0,72-0,81)). Lisäksi tarjoamme todisteita merkittävä määrä ehdokkaan riskiä tai varhaisen havaitsemisen merkkiaineita munasarjasyöpä. Lisäksi vertaamalla mallia metylaatio geenien ilmentyminen tietoja suurten verisolutyyppien, me täällä osoittaa, että ikä ja syöpä saada yhteinen koostumuksen muutoksia ääreisveren, joiden myelooinen vinoonajon joka kasvaa iän ja joka on pahentanut siinä läsnäolo munasarjasyöpä. Lopuksi osoitamme, että useimmat syöpä ja ikään liittyvien metylaatio vaihtelu löytyy CpG: t ulkopuolella CpG-saarekkeiden.

merkitys

tulokset korostavat mahdollisuuksia DNAm profiloinnin ääreisverenkierron välineenä havaitsemista tai riski-ennustaminen epiteelisyöpien, ja optio syvällisempää ja korkeamman CpG kattavuus tutkimukset edelleen selvittämiseksi tämän roolin.

Citation: Teschendorff AE, Menon U, Gentry-Maharaj A, Ramus SJ, Gayther SA , Apostolidou S, et ai. (2009) epigeneettisestä Signature ääreisverenkierrossa ennustaa Aktiivinen munasarjasyöpä. PLoS ONE 4 (12): e8274. doi: 10,1371 /journal.pone.0008274

Editor: Rodolfo Aramayo, Texas A M University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 syyskuu 2009; Hyväksytty 13 marraskuuta 2009; Julkaistu: 18 joulukuu 2009

Copyright: © 2009 Teschendorff et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Eve Appeal ja toteutettu University College London Hospital (UCLH) /University College London (UCL), joka sai osan rahoitusta Department of Health, National Institute for Health (NIHR), Biomedical Research Centres rahoitusjärjestelyä. AET tukivat Heller Research Fellowship. AET kiittää Michael ja Morven Heller varten Heller Research Fellowship. SB tukivat Wellcome Trust. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Ian J. Jacobs on konsultti alalla munasarjasyöpä on Becton Dickinson.

Johdanto

rooli epigenetiikka syövän ja muiden yhteisten vaikeiden sairauksien ole kiistetty [1], [2]. Ainutlaatuinen puoli epigenetic merkit, erottaa ne geneettisestä kollegansa, on niiden herkkyys tehdään muutoksia vastauksena ruokavalion ja muiden ympäristöaltisteiden [1], [3], [4]. Kun otetaan huomioon epidemiologinen yhteys ympäristötekijöiden ja syövän on luontevaa oletuksen, että epigeneettiset mutaatiot aikana hankitut yksilön elämän, altistavat yksilön sairauden [1], [5] – [8]. Tällainen malli tukee lisäksi monozygotic kaksostutkimukset viittaavia iän ja ympäristöön liittyviä epigeneettiset eroihin syynä ristiriitainen tautinsa [9], [10]. Siten se vaikuttaa uskottavalta, että epigeneettisellä muutokset liittyvät ympäristön ja ikääntymisen voivat itse liittyä syöpään [11], ja erityisesti, että useat näistä epigeneettiset mutaatiot voivat olla syövän alttiuden markkereita.

Äskettäin DNA: n metylaatio (DNAm) spesifisten geenien (

SEPT9, RASSF1A, APC

) seerumin DNA on ehdotettu ja ennustavia biomarkkereita peräsuolen syöpä [12], [13] ja rintasyövän [14], tässä järjestyksessä. DNA: n metylaatio (DNAm) muuttuu liittyy syövän ja ikääntymisen on havaittu myös perifeerisissä verinäytteissä postmenopausaalisilla naisilla [15], [16]. Erityisesti on ehdotettu, että tunnetun epidemiologisen riskitekijät (esim korkea hormoni taso) voi jättää DNAm painatuksia ääreisverenkierrossa DNA ja että varhainen havaitseminen näiden merkkien voidaan käyttää ennustamaan tulevaa riskiä yksittäisen sairastua syöpään [15]. Kuitenkin myös DNAm markkereita peräisin ääreisverenkierron voivat toimia diagnostisen tai riskien ennustelaitteet edelleen kiistanalainen [17] eikä tutkimus on vielä arvioinut niiden kliinistä potentiaalia genomin laajuisesti.

Suoritimme genominlaajuisten DNAm profilointi ääreisveren näytteitä suuri munasarjasyövän tapaus-verrokki kohortti auttaa käsitellä seuraavia kysymyksiä. Ensinnäkin, mikä vaikutus ei syövän läsnäolon on sen DNAm kuvio ääreisverenkierrossa, kudos, joka ei liity soluun alkuperän epiteelin syöpää, ja tarkemmin, voi läsnäolo syövän voida ennustaa DNAm profiilin veressä ? Toiseksi, voimme tunnistaa metylaatio merkkiaineiden verta, joka voi toimia varhaisen havaitsemisen tai alttius markkereita munasarjasyöpä? Tunnistaminen luotettavia diagnostisia tai varhaiseen havaitsemiseen biomarkkereita verestä on suuri kliininen ja biologista merkitystä, erityisesti varten munasarjasyöpä, joissa varhainen havaitseminen on vaikeaa [18]. Lopuksi viimeaikaisten raporttien mukaan useimmat metylaatio muuttuva asemat sijaitsevat ulkopuolella CpG-saaret [19], selvitimme genomisen malli metylaation asennot suhteessa CpG tiheyteen.

Tulokset

Ikä ja syöpään liittyvät DNA metylointi Patterns

Kaikki 540 ääreisveren näytteet hybridisoitiin 27 k Human metylointi Infinium BeadChip paneelit [20] (materiaalit ja menetelmät, taulukko S1). Tiukka laadunvalvonta ja toisiinsa array normalisoinnin menetelmää käytettiin poistamaan sekoittavia aiheuttama variaatio kokeellinen tekijöihin, jolloin normalisoitu data matriisin metylaation tulokset (β-arvot 0 p 1) poikki 383 näytettä (148 tervettä, 113 pre -käsittelyä (PRET) munasarjasyöpä tapauksissa 122 jälkikäsittely (post) munasarjasyöpä tapausta) ja 25642 CpG sivustoja (materiaalit ja menetelmät, kuva S1). Singulaariarvohajotelma (SVD) normalisoidun tiedot osoittivat vähintään 10 merkittävän komponenttien vaihtelusta suurimman liittyvät komponentit fenotyyppisiä tekijöistä, erityisesti syövän läsnäolon ja iän (kuvio S2, materiaalit ja menetelmät).

DNA metylointi Signature Associated munasarjasyöpä

hyväksyi valvottu lähestymistapa johtaa syövän erityinen DNA: n metylaation allekirjoitus ja kysyä, onko tällainen allekirjoitusta voitaisiin käyttää ennustamaan tautitilanteesta sokea näytteet. Erityisesti meidän väitti, että kasvain läsnäolo saattaa olla tarpeeksi suuri vaikutus DNA metylaation että sen pitäisi olla havaittavissa aäreisverinäytteiden potilailla ennen hoidossa olevilla.

Jotta tuloksia ei puolueellinen tiettyyn valinta koulutus /Koepakettia osio, teimme yhteensä 100 kulkee, jokainen ajo käyttäen erilaista koulutus /Koepakettia osio (materiaalit ja menetelmät). Kunkin valinnan opetusjoukolla (90 valvontaa ja 70 pret näytettä), käytimme Monimuuttuja logistinen regressiomalli (MVLR), jossa CpG erityisiä metylaation profiili ennustajana ja myös BSC (bi-sulfiitti- muuntaminen) hyötysuhde, DNA tulo ja erä vaikutus mahdollisesti häiritsevien tekijöiden johtamiseksi p-arvo yhdessä tapauksessa valvonnanalaisuuden kullekin 25.642 CpG sivustoja (materiaalit ja menetelmät). Seuraavaksi CpG sivustot rankattiin niiden p-arvot ja kutistunut centroid luokittelija koulutettu päällä 1000 CpG sivustoja (FDR 0,05, materiaalit ja menetelmät). Havaitsimme, että suurin osa 100 kulkee, optimaalinen (tai lähes optimaalinen) luokittelija suorituskyky sisäisissä rajat vahvistusten saatiin valitsemalla top 100 CpG sivustoja. Lopuksi jokaisen ajon tuloksena top 100 CpG luokittelija arvioitiin sokea koe joukko koostuu 58 tervettä verrokkia ja 43 Prêt tapauksissa. Luokitin suorituskyky koulutusta ja testi sarjaa arvioitiin avulla ROC käyrät ja liittyvän AUC (kuva 1a-b). Yli 100 kulkee, keskimääräinen AUC ja 95%: n luottamusväli koulutuksessa ja testi sarjaa oli 0,82 (,78-,85) ja 0,80 (0,74-0,87), vastaavasti, mikä osoittaa, että johdettu luokittelijoiden edelleen vahva ennusteita kuolleessa testissä sarjaa ( Kuva 1a-b).

a-b) luokittelu suorituskykyä DNA: n metylaation luokittelijoiden a) koulutusta sarjaa ja b) sokea koe sarjaa. Koulutus ja testi sarjaa koostui verinäytettä esikäsittelyn tapauksissa ja terveiden yksilöiden (materiaalit ja menetelmät). Keskimäärin ROC käyrä yli 100 erilaista koulutus /Koepakettia osioita 95% CI kirjekuori sokea koe sarjoiksi. AUC ja 95%: n luottamusväli yli 100 erilaista osiot annetaan. c) Luokittelu suorituskykyä testissä sarjaa koostuvat tervettä verrokkia ja jälkikäsittelyn näytteitä ja viitteitä aktiivisesta taudista. d) välinen korrelaatio sijoitusta top CpG: t syrjivät esikäsittely tapauksissa terveistä valvontaa regressiomallien että mukana iän (x-akseli) ja ilman ikä (y-akseli) toisena tekijä. Piirretään ovat log10 (p-arvot) varten 25642 CpG sivustoja, kuten arvioitiin useista logistista regressiota tapaus /valvonta-asema vastaan ​​CpG metylaatio profiilin iän toisena kertoimella (x-akseli) ja ilman ikä kuin yhteis- tekijä (y-akseli). Spearmanin korrelaatio kahden rankingissa annetaan.

Seuraavaksi tutkimme onko johdettu luokittelijoiden voi ennustaa syövän tilan jälkikäsittelyn näytteitä ja viitteitä aktiivisesta taudista (määräytyy CA125 seerumin 30) ajankohtana näytteenottoadapteriin (47 näytettä). Keskiarvona 100 kulkee, saimme AUC 0,76 (0,72-0,81, 95% CI) in sokea koe sarjaa, joka koostuu 58 tervettä verrokkia ja (kiinteä) 47 postreatment näytteistä (kuvio 1 c). Merkittävä valta syrjiä jälkikäsittely näytteitä aktiivinen tauti, joilla ei saavutettiin myös (AUC = 0,74,

P

0,001). Näin ollen nämä tulokset vahvistivat kyky johdettujen luokittelijoita ennustaa läsnäolo kasvainten hoidon jälkeen näytteitä. Sen sijaan luokittelijoiden ei ennustanut syövän tilan jälkikäsittelyn näytteitä ilman näyttöä aktiivisesta taudista (70 näytettä) verrattuna terveisiin kontrolleihin (AUC = 0,52 (,48-+0,55, 95% CI)).

seuraavaksi kysyimme, onko luokitus suorituskyky voi vaikuttaa iän. Tilanteen korjaamiseksi, vertasimme sijoitusta CpG sivustoja valvotuissa MVLR analyysin vastaavaan ranking on MVLR malli, joka sisältyi iän kofaktorina. Tämä osoitti, että p-arvot yhdistyksen olivat pääosin ennallaan ja että molemmat ranking korreloivat voimakkaasti (Spearmanin = 0,998, kuvio 1 d), jotka osoittavat, että CpG sivustoja, joiden varaan Luokitus perustui olivat ennustaneet syövän asemasta riippumatta iästä.

Cancer Diagnostic CpG: t (CA-CpG: t) B

Todettuaan, että DNA: n metylaatio allekirjoituksen Ääreisverenkierrosta voitaisiin käyttää ennustamaan läsnäolo munasarjasyöpä, me seuraavaksi käytettävä kaikki terveillä verrokeilla ja pre- käsittely näytteitä johtamiseksi lopullinen luettelo tällaisista ”syövän diagnostiikkaan” CpG: t (CA-CpG: t).

havaintojen mukaan yhteensä 2714 CA-CpG: t läpäisemällä FDR kynnys 0,05 (kuva 2a, taulukko S2, kuva S3 ). Havaitsimme vinossa kohti hypometylaatio kanssa 1513 (56%) CA-CpG: t osoittavat alempia metylaation tapauksissa (kuva 2a, Binomial testi

P

= 9 x 10

-10). Vielä silmiinpistävän, että top 50 CpG: t (47 ainutlaatuinen geenilokukset), 41 (87%) oli hypometyloidut (Binomial testi

P

= 10

-8, taulukko S2). Ja 2714 CA-CpG: t, 1482 (55%) ja 1232 (45%) on sijoitettu (iCpGs) ja ulkopuolella (niCpGs) CpG-saarekkeiden [21], vastaavasti. Koska yliedustettuina iCpGs array (76% iCpGs vs. 24% niCpGs), määrä niCpGs syöpään liittyvän oli paljon suurempi kuin odotettua sattumalta (kuva 2a, Fisherin testi

P

2

e

-16). Yliedustus niCpGs keskuudessa CA-CpG: t oli myös ilmeistä tarkastus top 47 CA-CpG geenilokukset 32 ​​(68%) paikallistettu niCpGs (Fisher testi

P

= 6 x 10

-12 ).

a) jakelu 2714 CA-CpG: t (FDR 0,05) suhteen hyper-ja-hypometylaatio (binomi testi P-arvo annetaan) sekä suhteessa CpG lokalisointi (Fisherin tarkka testi) . b) päällekkäisyys ikään CpG: t CA-CpG: t (Fisher-testi P-arvo päällekkäisyys annettu) ja jakelu 198 yhteistä iän ja CA-CpG: t suhteen hypermetyloitunut ja hypometyloidut kuvioita ja iCpGs /niCpGs (Binomial ja Fisher-testi P-arvot ovat vastaavasti). Out of 198 CpG: t, 47 exbited hypermetylaation iän ja syövän, 150 hypometylaatio iän ja syövän, 1 hyperM iän ja hypoM syöpä ja 0 osoitti hypoM iän ja hypeM syövässä. c) Gene Set rikastus Analyysi yhteisen ikään CA-CpG: t, ikävakioidun CpG: t (ts ikä CpG: t miinus CA-CpG: t) ja CA-erityisiä CpG: t (ts CA-CpG: t miinus ikä-CpG: t) ryhmiteltynä hyper /hypometylation. Benjamini-Hochberg säätää P-arvot annetaan. Useimmat merkittävästi rikastettu biologisesti annetaan.

edelleen vahvistaa diagnostisten luonne 2714 CpG: t, arvioimme niiden päällekkäisyys 520 CpG: t erotteleva jälkikäsittely näytteitä ja ilman aktiivisia munasarjasyöpä (FDR 0,05, tuloksia ei ole esitetty). Tämä tuotti päällekkäisyys 355 CpG: t (Fisher testi

P

2 x 10

-16), vahvistetaan, että käytännössä sama syöpä diagnostisia DNA: n metylaatio allekirjoitus olisi voitu johdettu jälkikäsittelyssä asetusta käyttäen CA125 tasot markkereita kasvaimen läsnäolosta.

biologinen merkitys DNAm allekirjoituksista

tutkia mahdollisuuksia toiminnallinen merkitys CA-CpG set kysyimme, oliko tietty rikastuminen biologisesti ja polkuja, kuten suuri tietokanta funktionaalisen geeniekspression allekirjoituksia [22]. Viime aikoina olemme osoitti, että ikääntyminen on myös merkittävä vaikutus DNAm mallia ääreisverenkierron ja tunnistettu 589 CpG: t huomattavasti liittyy iän (FDR 0,05) [16]. Niinpä, jotta leikellä roolit iän ja syövän suoritimme Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [22] on CpG: t liittyy yksilöllisesti iän ja syövän, sekä 198 CpG: t (190 ainutlaatuinen geenilokukset) yhteinen iän ja CA-CpG luettelee (kuva 2b, taulukko S2). Toteamme, että tämä päällekkäisyys oli erittäin merkitsevä (kuva 2b, Fisherin testi

P

2 x 10

-16), mikä viittaa siihen, että ikä ja kasvaimen läsnäolo saada yhteinen muutoksia DNAm rakenteessa ääreisverenkierron. GSEA paljasti toiminnallinen yhdistysten (oikaistu

P

0,05) neljä pääluokkaa geenien (kuva 2c, taulukko S3): (i)

REST-

-targets ja kehityshäiriöitä geenit [23], [24] kanssa hypermetyloitunut ikään CpG: t, (ii) geenien hematopoieesin ja lymfoidispesifiset myelooinen eriyttäminen hypometyloidut iän ja ikään CA CpG: t, (iii) liittyvien geenien T-solujen aktivaation ja luonnollisen tappaja (NK) välittämää sytotoksisuutta hypermetyloitunut syöpää erityisiä CpG: t, ja (iv) liittyvien geenien solun tarttuvuus ja

HOXA9

sääntelyyn ohjelmia hypometyloidut syöpäspesifisessä CpG: t.

Ymmärtääksemme näiden toiminnallisten yhdistysten me arveltu, että jotkin näistä voi heijastaa vaihtelut verisolujen tyyppi koostumusta, koska tämä tiedetään vaihtelevan sekä iän ja kasvaimen läsnäolo [25] – [29]. Tutkia asiaa tarkemmin, kysyimme geenejä tiedetään ekspressoitua eri välillä tärkeimpien verisolutyyppien [30] oli yliedustettuna iän ja CA-CpG luetteloita. Useita merkittäviä yhdistysten havaittiin, joka oli nopeampaa varten syöpään kuin ikään liittyvä allekirjoituksia (taulukko 1). Erityisesti joukossa CpG: t hypometyloidut syövän tapauksissa oli rikastuminen geenien tiedetään yliaktiivista granulosyytit (

P

= 2 x 10

-5, taulukko 1), kun taas CpG: t hypermetyloitunut syövän rikastettiin geenejä tiedetään voimistuvan T-lymfosyyttien (CD4 +

P

= 0,002, CD8 +

P

= 0,01, taulukko 1, taulukko S4), yhdenmukaisia ​​raportteja korkeampi granulosyytti /lymfosyytti-suhde veressä syöpätapauksista terveisiin kontrolleihin verrattuna [26], [29]. Tämän testaamiseksi edelleen vertasimme metylaatiotasoilla näiden CpG: t kartoituksen geeneihin yliaktiivista granulosyytit ja lmphocytes välillä terveiden verrokkien ja jälkikäsittely tapauksia ja ilman aktiivista sairautta (määritettynä CA125 tasot) (kuva S4). Kuten odotettua, geenit yläreguloituja granulosyytit merkittävästi hypometyloidut jälkeisessä hoidossa tapauksissa positiivinen CA125 tasot suhteessa kontrolleihin, kun taas tämä ei ollut niin jälkeiseen hoitoon tapauksissa ilman aktiivista sairautta (kuvio S4). Samoin geenit yläreguloituja lmphocytes merkittävästi hypermetyloitunut jälkikäsittely tapauksissa positiivinen CA125 tasot suhteessa kontrolleihin, kun taas ei ollut eroa verrattaessa jälkeisen treatmant tapauksissa ilman aktiivista sairautta kontrolleihin (Kuva S4).

Ikä -riippuvaisella DNAm Allekirjoitus ennustaa kasvaimen läsnäolo

vahva päällekkäisyyksiä iän ja syövän liittyy CpG: t ja toiminnalliset rikastamiseen liittyvien geenien myelooisessa-lymfosyyttejä eriyttäminen osoitti meille, että ikä ja syöpä aiheuttaa samoja muutoksia DNAm kuvioita itsenäisesti aiheuttivat samoihin muutokset verisolujen tyyppi koostumus. Siksi arveltu, että ikävakioidun DNAm muutokset voivat pahentua, jos potilaalla on munasarjasyöpä. Tämän testaamiseksi ensin Laskettu keskimääräinen metylaatiotasoilla yli CpG: t, joille tehdään erityinen hyper tai hypometylaatio iän. Nämä kuviot osoittivat odotetun korrelaatiot iän myös terveiden ja esikäsittely syöpätapausta (kuviot 3a, c, e, g kuva S5). Olemme kuitenkin myös havaittu, että keskimääräinen metylointi arvot olivat merkitsevästi toisistaan ​​esikäsittely tapausten ja kontrollien, joilla on alhaisempi keskimääräinen metylaation tapauksissa vastaan ​​kontrollit ikään hypometyloidut niCpGs (kuvio 3b, Wilcox testi

P

= 1 x 10

-13) ja iCpGs (kuvio 3f,

P

= 1 x 10

-11), ja vastaavasti korkeampi keskimääräinen metylaatiotasoilla tapauksissa verrattuna ohjaimet niCpGs hypermetyloitunut iän (kuvio 3d,

P

= 3 x 10

-16). Mikä tärkeintä, nämä yhdistykset tautitilanne olivat riippumattomia ikäryhmässä varten hypometyloidut niCpGs ja iCpGs (kuviot 3a, e). Sillä hypermetyloitunut ikä CpG: t, havaitsimme vastaavan mallin mukaan hypermetylaation syövän kaikissa ikäryhmissä niCpGs (kuvio 3c), mutta ei niin iCpGs (kuviot 3 g, h).

keskiarvo metylaation ikääntymisestä liittyvä CpG: t valitaan valvottu analyysi. (A-b) ikä hypometyloidut niCpGs. (C-d) ikä hypermetyloitunut niCpGs. (E-f) ikä hypometyloidut iCpGs. (G-h) ikä hypermetyloitunut iCpGs. (A, c, e, g) Keskimääräinen metylaatio (y-akseli) valvonnan (vihreä) ja tapauksissa (sininen) kunkin kuuden ikäryhmissä (x-akseli) (50-55,55-60,60-65 , 65-70,70-75, 75). (B, d, f, h) Keskimääräinen metylaatio versus tautinsa (kaikissa ikäryhmissä yhdistetty). Kaikki P-arvot ovat kahden tailed Wilcoxonin summa testi. Kaikissa paneelit, annamme määriä näytteitä kussakin ryhmässä suuremmat kuin vastaavana boxplot. Tapaukset ovat esikäsittelyä näytteitä.

osoittavat lisäksi, että ikään liittyviä DNAm kuvioita itsenäisesti liittyy kasvaimen läsnäolo, kysyimme ikä liittyy CpG: t johdetaan 148 terveiden verrokkien (293 CpG: itä FDR 0,3) [16], pystyivät erottamaan näytteiden mukaan taudin tilan (kuvio 4a). Valvomatta hierarkkinen klusterointi yli 293 CpG: t erillisiä tapauksia valvonta (kuvio 4b, Fisherin testi

P

= 4 x 10

-13). Samanikäisiä-CpG: t pystyivät myös erottamaan tapaukset, joilla on toistuvia aktiivinen tauti joilla ei (mitattuna seerumin CA125 tasolle näytteenottoadapteriin) itsenäisessä joukko verinäytettä 122 jälkikäsittely tapauksissa (kuvio 4c, Fisherin testi

P

= 3 x 10

-5). Edelleen vahvistaa Näiden löydösten merkitystä, yhdessäkään 1000 satunnainen valikoimat 293 CpG: t tekivät vietämme P-arvoja äärimmäinen kuin nämä (kuvio 4d).

a) monimuuttuja lineaarisen regression ikään 148 tervettä verta näytteiden vastaan ​​CpG metylaatio profiileja säätämisen BSC tehokkuutta, erä ja DNA panos vaikutuksia, tunnistettiin 293 CpG: t at q (FDR) 0,3. b) Hierarkkinen ryhmittely 148 tervettä verrokkia ja 113 esikäsittely (PRET) tapaukset yli 293 CpG: t. Kaksi pääryhmään (CLUST) ennusti algoritmi on merkitty sininen ja oranssi. Asia ohjaus tila näkyy aktiivisena tauti (AD): tapaus = musta, kontrolli = harmaa. c) Hierarkkinen klusterointi 117 jälkikäsittelyn tapauksissa jopa saman 293 CpG: t. Niistä 117 jälkikäsittelyä tapauksissa 47 ja 70 oli toistuva (musta) eikä toistuva (harmaa) aktiivinen taudin (AD) näytteessä piirtää, vastaavasti. Kaksi pääryhmään (CLUST) ennusti algoritmi on merkitty sininen ja oranssi. Vuonna lämpökarttoja, CpG erityisiä metylaation β-arvot standardoitu nollaan keskiarvo ja yksikkö varianssi selvyyden vuoksi (sininen: korkea suhteellinen metylaatio, keltainen = matala suhteellinen metylaatio). Paneeleissa b) ja c) annamme näytteiden määrä aktiivisen taudin näytteenottoadapteriin kunkin klusterin, ja saadaan vastaava Fisherin testiä P-arvo. d) Vertailu havaittujen P-arvot, jotka saatiin 1000 satunnainen valinnat 293 CpG: t. P-arvot lasketaan Fisherin testiä varten kaksi klustereiden päätellä soveltaa Gaussin seos malli [43].

Syöpä-Taipumus CpG: t

On todennäköistä, että pieni määrä n 2714 CA-CpG: t ovat rehellisistä syöpään alttiutta markkereita. Oletimme, että jotkut näistä riskin markkereita saatetaan havaita 70-jälkikäsittely ääreisveren näytteitä potilaista, joilla ei ollut uusiutuva sairaus aikaan näytteenottoadapteriin mutta joka voisi lopulta kehittyä uusiutuva sairaus, koska tällaisia ​​näytteitä voisi jäljittelee pre- kliininen taipumus vaiheessa. Sen määrittämiseksi tarkasti, onko tällainen vaara CpG allekirjoitus on olemassa, haimme state-of-the-art Surrogate Variable Analysis (SVA) [31], [32] puitteissa, mitä malleja piilossa ja mahdollisesti häiritsevien tekijöiden saada tarkempi arvio FDR (materiaalit ja menetelmät). Käyttämällä SVA saimme 84 CpG: t kulkee FDR kynnyksen 0,4, mikä viittaa siihen, että keskimäärin noin 50 CpG: t voivat olla syrjiviä välillä jälkikäsittely näytteet ilman aktiivista sairautta (CA125 seerumin 30) ja terveillä verrokeilla (Kuva S6a, taulukko S5). Koska on mahdollista, että jotkut näistä heijastavat metylaatiomuutokset takia hoitoon ja koska riski CpG pitäisi myös olla diagnostinen, me dekonvuloidaan vaikutusta hoidon etsimällä päällekkäisyyden 84 CpG: t ja 2714 CA-CpG: t (hoito vaikuta), joka tuotti päällekkäisyys 18 ”syöpä-alttius” riski CpG: t (Fisher testi P = 0,003, Kuvio S6b, taulukko S5). Kiinnostaa, tämä sisältää listan

TSG101

, geeni jossa on mahdollinen tuumorisuppressoriproteiinia rooleja ja ehdokas rintasyövän alttius geeni [33].

Keskustelu

Tässä olemme suorittaneet ensimmäinen suuri (yli 300 näytettä) genominlaajuisten tutkimus DNAm profiileja käyttäen state-of-art alusta, joka mittaa metylaatiotilaa yli 27000 CpG: t. Olemme osoittaneet, että munasarjasyöpä on merkittävä vaikutus DNAm kuvio perifeerisen veren soluja. Vaikka epigeneettiset allekirjoitus esitimme puuttuu edelleen korkea spesifisyys tarvittavat välitöntä diagnostinen sovellus, että aktiivinen munasarjasyöpä voitaisiin ennustaa suhteellisen suurella tarkkuudella (AUC = 0,8) peräisin DNAm profiilin veressä osoittaa selvästi tulevaisuuden mahdollisuudet epigeneettisellä profilointi diagnostiikkatyökaluna.

lisäksi olemme esittänyt todisteita olemassaolosta DNAm markkereita, jotka voivat toimia varhaisen havaitsemisen tai alttius merkkiaineita munasarjasyöpä. Niistä 18 ehdokasta riskin markkereita, 11 ja 7 osoitti hyper ja hypometylaatio syövässä, vastaavasti, jossa

TSG101

ja ennalta mRNA tekijä

SFRS6

sekä meneillään hypermetylaation syövässä. Lisävahvistusta että markkereita tunnistettu tässä voivat toimia varhaisen havaitsemisen tai alttius markkereita munasarjasyöpä tarvitaan suuri ennakoiva tutkimus, joka on parhaillaan käynnissä [34].

Havaitut DNAm kuvioita voidaan yhteenvetona kaksi biologisesti erillisiä allekirjoitukset. Ensimmäinen havainto, että DNAm allekirjoituksen ikääntymiseen, tunnettu siitä, että ero metylaatio geenejä, joilla hematopoieettisten solujen linjaa ja immuunijärjestelmän toimintoihin on pahentanut läsnä munasarjasyöpä, viittaa siihen, että epiteelin tuu- ja ikääntymisen aikaan yhteinen muutoksia solukoostumus reuna verta. Tätä tulkintaa tukee lisäksi se seikka, että sama biologisesti voimakkaasti rikastettu joukossa geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä verisolutyyppien [30] (taulukko S6), ja että geenit yleisesti yläreguloituja granulosyytit ja lymfosyytit osoittivat ero metylaatio (taulukko 1, Kuva S4) vastasi lisääntynyt granulosyyttien ja lymfosyyttien suhteen vastauksena ikääntymisen tai syöpään. On huomattava, että on olemassa itsenäinen näyttöä siitä, että sekä ikääntymisen ja syövän läsnäolon johtavat myelooinen-vääristävätkö in myeloidisolu- /imukudoksen erilaistumisprosessia, vastaava korkeampi granulosyytti /lymfosyytti-suhde [25] – [29], joka on yhtäpitävä havaintomme että granulosyytti ja T-lymfosyyttien geenien rikastettiin keskuudessa CpG: t hypo-ja hypermetyloitunut syöpä, vastaavasti. Koska tämä vaikutus oli päätellä DNAm profiileista, näyttäisi siltä, ​​että ilmaus huomattava määrä geenejä luonteenomaiset Bood solutyyppejä on suorassa epigenetic asetuksen.

Toinen tähän liittyvä kysymys on se, onko diagnostinen epigeneettiset allekirjoitus on spesifinen munasarjan syöpä. Jos eri syöpiä esiin samanlaisia ​​immuunivasteita ja siten kaltaiset muutokset verisolujen tyyppi koostumus, voimme odottaa osa tunnistetuista diagnostisten allekirjoituksen olevan ei-syöpä erityinen. Kuitenkin lopullisesti päättää, että asia on näin ja että ikä ja syöpä ei välittävä immunologiseen vaarantamatta vaikutusten kautta epigeneettisellä muuttaminen erityisen solutyyppejä, vaatii lisätietoja ei tarjoa tutkimuksessamme. Samoin onko osia havaittu syövän allekirjoitukset voidaan syy osallisena taudin on odotettava lisätutkimuksiin.

Toinen DNAm allekirjoitusta leimasi CpG: t meneillään hypermetylaation iän ja oli erittäin runsaasti kehitys- geenien ja

REST

-targets. Koska

REST

(

NRSF

) osallistuu tukahduttaminen geenejä, joita tarvitaan erilaistumiseen alkion ja aikuisen kantasoluja [24], ikä aiheuttama hypermetylaatiota

REST

-targets, jos vahvistettu kantasolujen populaatio, voi edustaa yleinen mekanismi ikään liittyvä menetys kantasolujen toimintaa ja lisäsi alttiutta syöpään [5].

Lopuksi meidän havainto, että useimmat n metylaatio vaihtelu liittyy niCpGs edelleen tukee näkemystä, että suurin osa fenotyyppisesti asiaa DNAm vaihtelua löytyy muilla kuin CpG-saarekkeiden [19]. Vahvistava edelleen, havaitun yhdistyksen välillä geenin ilmentymistä erilaisten verisolujen-tyyppejä ja rakenteessa DNA hypo ja hypermetylaation oli paljon voimakkaampaa niCpGs kuin iCpGs (tuloksia ei ole esitetty).

Yhteenvetona, tämä työ osoittaa, että DNAm profilointi veressä on merkittäviä lupaava tulevaisuus diagnostinen tai riski-ennustustyökalun ja optio edelleen korkeampi CpG-kattavuus tutkimukset täysin valaista tätä roolia.

Materiaalit ja menetelmät

kuvaus UKOPS näytekokoelma

yhteensä 540 koko otettiin verinäytteet Britanniasta munasarjasyöpä Population Study (UKOPS) sisällytettäväksi tässä tutkimuksessa. Tapaukset (n = 266) koostui postmenopausaalisilla naisilla diagnosoitu primääri epiteelin munasarjasyöpä. Puolet tapauksista (esikäsittely tapauksissa; n = 131) antoivat heidän verensä aikaan niiden diagnosointi ennen hoitoa ja toinen puoli (jälkikäsittelyä tapauksissa; n = 135) antoivat heidän verensä jossain vaiheessa aikana seurata vierailut jälkeen mekaaninen käsittely (2,4 ± 2,7 vuotta välillä diagnoosin ja verinäytteestä). Kontrollit (n = 274) olivat ilmeisesti terveillä postmenopausaalisilla naisilla rekrytoidaan Britanniassa Collaborative Trial of munasarjasyövän seulonta (UKCTOCS) [34], joista laaditaan vuosittaiset seeruminäytteet saatavilla. Rekrytointi tapahtui 8 sairaaloiden Yhdistyneessä kuningaskunnassa. Naisilla, joilla on aiemmin ollut munasarjojen poisto ja /tai syövän suljettiin pois tutkimuksesta. Kaikki tapaukset ja terveet verrokit postmenopausaalisilla ja ikä-haun ja yksityiskohtainen kliininen ominaisuudet on esitetty taulukossa S1.

Näytteiden käsittely

Verinäytteet kerättiin tutkimuksen sairaanhoitaja aluekeskukset putkissa ( 9 ml K3 EDTA Vacuette putkia, valmistanut Greiner Bio One) ja jäädytettiin 3 tunnin kuluessa kokoelma. Näytteitä säilytettiin -80 °

C

klo aluekeskuksen ja laivattiin Keskuslaboratorioliiketoiminnan klo UCL neljännesvuosittain. Kun sai Keski laboratoriossa, näytteet kirjautunut ja siirrettiin -80 °

C

pakastimessa kunnes DNA uutettiin. Seerumin CA125 pitoisuudet määritettiin elektrokemoluminesenssi sandwich immunoassay koskevasta Elecsys 2010 (Roche Diagnostics, Burgess Hill, UK) käyttämällä kahta monoklonaalisia vasta-aineita (OC125 ja M11; Fujirebio Diagnostics AB, Göteborg, Ruotsi), ja arvot 30 otettiin markkerina aktiivisen taudin [35]. Yli 95% esikäsittelyssä tapauksia oli CA125 30, kun taas muun jälkikäsittely tapauksissa noin 40%: lla oli aktiivinen uusiutuva sairaus (CA125 30).

DNA Extraction ja bisulfiittimutaqeneesi muuttaminen

DNA uutettiin Tepnel, käyttäen kloroformi perustuva uuttomenetelmä ja 800 ng (2 x 400 kullekin näytteelle). Keskimääräinen DNA-pitoisuus oli 33,0 ± 17,4 ng /ul. DNA: ta kustakin näytteestä oli bisulfiitin muutettu käyttämällä EZ DNA Metylointi Kit D5008 (Zymo Research, Orange, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Illumina Infinium Pitoisuus

metylointi analyysi suoritettiin käyttäen Illumina Infinium Human Methylation27 BeadChip. Lyhyesti, bisulfiitti konvertoidaan DNA monistettiin, hajanainen ja hybridi- BeadChip paneelit (jokainen siru mahtuu 12 näytettä nimeämää Sentrix kannat A-L).