Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Hypoksia syövissä tuloksia ylösajon ja hypoksian indusoima tekijä 1 (HIF-1) ja microRNA, HSA-miR-210 (miR-210), joka on liitetty huonoon ennusteeseen.

menetelmät ja havainnot

ihmisen syöpää solulinjat ja kasvaimet, huomasimme, että miR-210 kohdistuu mitokondrioiden rauta rikki rakennustelineet proteiinia ISCU, tarvitaan kokoonpanoon rauta-rikki klustereita, kofaktoreita keskeisiä entsyymejä, jotka osallistuvat Krebsin syklin elektronien kuljetusta, ja raudan aineenvaihduntaa. Down sääntely ISCU oli suurin syy induktion reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) in hypoksia. ISCU tukahduttaminen alennetaan mitokondrioiden monimutkainen 1 aktiivisuus ja aconitase aktiivisuutta, aiheutti siirtyminen glykolyysistä vuonna normoksia ja tehostetun solujen eloonjäämistä. Syövät alhainen ISCU oli huonompi ennuste.

Johtopäätökset

induktio näistä suurista tunnusmerkkejä syöpä osoittavat, että yksittäinen microRNA, miR-210, välittää uusi mekanismi sopeutumista hypoksia, säätelemällä mitokondrioiden toimintaan kautta rauta-rikki-kasauman aineenvaihduntaa ja vapaiden radikaalien sukupolvi.

Citation: Favaro E, Ramachandran A, McCormick R, Gee H, valkaistaan ​​C, Crosby M, et al. (2010) MicroRNA-210 Säätelee mitokondrioiden Free Radical vastaus Hypoksia ja Krebs Cycle syöpäsoluissa by Targeting Iron Rikki Cluster Protein ISCU. PLoS ONE 5 (4): e10345. doi: 10,1371 /journal.pone.0010345

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago (UIC), Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 joulukuu 2009; Hyväksytty: 29 maaliskuu 2010; Julkaistu: 26 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Favaro et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Cancer Research UK ja ystävät Kennington Cancer Research Fund (EF, ALH, JL), The Wellcome Trust (CB1, CC, IR), Royal College of Surgeons British Urology Foundation (CB2, RMCC), Euroopan unioni, ACGT (FB), Rhodes Scholarship (HG), Nuffield Medical Fellowship (AR), FIRC stipendi (EF). Biobanking tukee NIHR Biomedical Research Centre Oxford; Elsa Pardee Foundation (MI), American Cancer Society (MC, MI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hypoksia on merkittävä fysiologinen ero kasvainten ja normaalia kudosta, lähinnä syntyy kasvaimen kasvua kanssa riittämätön verenkierto ja kulutus hapen kasvainsolujen [tarkistetaan [1]]. Hypoksia indusoi monimutkainen transkription vastaus pääasiassa indusoimalla hypoksian indusoima tekijä 1α (HIF1α), jotka vaikuttavat monet biologiset prosessit kuten glykolyyttisellä koulutusjakson, angiogeneesi, pH: n säätelyyn, invaasio ja kuolemattomuus [2].

Kasvava paradigma hypoksia, että mitokondriot tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja, välittyy elektronien kuljetusta jatkuvat hypoksia [3]. Tämä vapaa radikaali polku vaikuttaa säätelyä HIF [4], ja parantaa kasvua in vivo [5], mutta se voi myös olla myrkyllisiä. Erilaisia ​​reittejä aiheuttamien HIF on jo raportoitu suojaamiseksi jälkimmäinen vaikutus, esimerkiksi induktio pyruvaattidehydrogenaasikinaasi estää entsyymin kompleksi pyruvaattidehydrogenaasin ja estää pyruvaatin asetyyli koentsyymi A ensimmäinen vaihe Krebsin syklin [6] ja tehostaa laktaatintuotto [7]. Mitophagy voidaan indusoida BH3-domeenin proteiinia BNIP3, [8], ja sytokromi-c-oksidaasi-alayksiköt voivat siirtyä tehokkaampaan niitä [9].

Viimeksi MikroRNA (Mirs), jotka ovat pieniä (~22 nt) ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät transkription jälkeinen geenin ilmentymisen estämällä käännös kohde- mRNA: iden tai nopeuttamalla niiden hajoaminen [10], [11], on raportoitu indusoituvan hypoksia. Kuitenkin vain harvat tavoitteensa tai vaikutusmekanismit tunnetaan [tarkistetaan [12]]. Me ja muut [13] ovat osoittaneet, miR-210 on voimakkaasti aiheuttama hypoksia monissa solulinjoissa, kautta HIF1α [14]. Olemme hiljattain analysoitu sen ilmentymistä sarjassa 216 syöpäpotilaista ja näytti miR-210 ilmentyminen korreloi monien HIF1α tavoitteita mRNA tasolla (mitattuna hypoksian metageeni) ja oli vahvasti yhteydessä huonoon potilaan selviytymistä. Johdettu vain sekvenssi-algoritmien, joillekin aiemmin validoitu tavoitteet miR-210 ovat Efriini A3 [15], E2F3 [16], RAD52 [17], CASP8AP2 [18], ja MNT [19]. Yhdistimme julkisesti saatavilla algoritmeja, meidän geenijärjestelyillä aineistoja, ennustaa mahdollisia miR tavoitteiden merkitys syöpäsoluissa. Olemme havainneet, että mitokondrion rauta rikki-kasauman homologin ISCU oli korkein ennustettu tavoite miR-210. Äskettäin ISCU on tunnistettu miR-210 tavoite myös normaaleissa keuhkojen endoteelisolujen [20], jossa se edistää Pasteur vaikutus ja ohjaa tasoa ROS tuotannon hypoksia, mikä viittaa sen mahdollinen mukautuva rooli hypoksia yhteydessä keuhkojen endoteelin.

Iron rikkikeskusta [Fe-S] on läsnä aktiivisessa sivustoja monien entsyymien ja proteiinien, kriittisiä niiden aktiivisuuden ja luonteeltaan sellaisia, sääntelyn redox tilan [21]. Nämä klusterit kootaan mitokondrioissa [22] monimutkainen sarja chaperones ja entsyymien kuten ISCU, sitten viedään sytoplasmaan, jossa ne kootaan asiaa proteiini [23]. Joukossa Fe-S klusterin proteiinit mukana useita, jotka koostuvat avaintekijät monimutkaisten I, II ja III mitokondrioissa ja komponentit Krebsin syklin kuten sukkinaattidehydrogenaasi ja aconitase. Sytoplasmisen muoto jälkimmäinen säätelee raudan aineenvaihduntaa kautta tehtäväänsä translaation säädin-IRP1 [24].

Tässä raportissa osoittavat tärkeimmät biologiset vaikutukset miR-210 kohdistaminen ISCU, jotka kaikki ovat todennäköisesti Osallistu tärkeään fenotyyppejä syövässä. Vuoteen vähen- tämisessä ISCU, miR-210 pienenee Krebs sykli entsyymin aktiivisuutta ja mitokondrioiden toimintaa, tarjoaa merkittävän mekanismin lisääntynyt vapaiden radikaalien sukupolvi hypoksia, lisää solujen eloonjäämistä hypoksiaolosuhteissa, indusoi kytkin glykolyysistä vuonna normoksia ja hypoksia (Warburg ja Pasteur vaikutukset) ja säätelyä raudan oton tarvitaan solujen kasvuun. Tärkeää on, että analyysi on yli 900 potilasta, joilla on eri kasvaintyypeissä osoittaa, että suppressio ISCU korreloi voimakkaasti huonompi ennuste. Tämä tutkimus siis osoittaa uuden polku aktivoituu hypoksinen kasvaimissa, välittyy miR-210 vaikuttaa mitokondrioiden entsyymin aktiivisuutta ja vapaiden radikaalien syntymistä ja korostaa mitokondrioiden aineenvaihdunnan hypoksia biology [3].

Tulokset

valinta ISCU mahdollisena kohteena

Vertasimme miR-210 ilmaus meidän julkaistu sarjassa rintasyövän [14] kanssa hypoksian metageeni aihekokonaisuuksien mRNA: iden [25] ja yhdistettynä arviointi tavoite Ennustusalgoritmien osoitti ISCU oli korkein ennakoi maalin, ja kolme tunnettua kohdegeenien myös istua korkeasti rankattu kannat valittiin tätä lähestymistapaa (tukeminen Materiaali ja menetelmät S1, tukeminen taulukko S1).

MiR-210 ja ISCU mRNA tehdään vastavuoroisesti asetuksen

suostumuksella aikaisemmin julkaistu [13], [14], miR-210 oli voimakkaasti indusoitunut MCF7 ja HCT116 hypoksia (1% tai 0,1% happea) 24 ja 48 tuntia, ja maksimaalinen induktio havaittiin 48 tuntia 0,1% happea (kuva 1A ja tukeminen Kuva S1A). ISCU mRNA kvantitoitiin RTPCR oli korreloi käänteisesti miR-210 ja väheni eniten merkittävästi, kun solut altistettiin ankarampaa hypoksia pitempään (kuvio 1 B ja tukeminen kuvio S1B). Samanlainen sääntelyä miR-210 hypoksiaolosuhteissa, ISCU tukahduttaminen on transkriptio taso oli riippuvainen HIF1α eikä HIF2α (tukeminen kuviot S1C ja S1D). Lisäksi ilmiö vastavuoroinen sääntelyn miR-210 ja ISCU hypoksia myös monissa muissa solulinjoissa (tukeminen kuviot S1E ja S1F).

, miR-210 kasvaa alle hypoksia, jossa vahvin induktio nähty 48 tuntia 0,1% happea.

B

, samoissa olosuhteissa, vahvin downregulation ISCU mRNA havaitaan 48 tunnin 0,1% happea. Ilmentymistasojen miR-210 ja ISCU mRNA hypoksiaolosuhteissa ovat suhteessa niiden normoxic ekspressiotasoja 24 tuntia (N). Keskiarvo ± s.e.m. Kolmen riippumattoman kokeen esitetään (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

C

, transfektio anti-210 osittain pelastaa hypoksinen tukahduttaminen ISCU mRNA miimikko-210 yliekspressio pienenee ISCU mRNA normoksia 48 tuntia. Expression of ISCU mRNA on suhteessa anti-ctrl in normoksia (N). Keskiarvo ± s.e.m. Kolmen riippumattoman kokeen esitetään (** p 0,01, *** p 0,001).

D

, (

yläpaneeli

) ISCU proteiini vaimentua MCF7 lysaatit 0,1% happea verrattuna normoxic lysaatit (N), kun anti-ctrl transfektoidaan 48 tuntia. Tämä lasku proteiinin tason hypoksisissa olosuhteissa osittain pelastettu anti-210 transfektoidaan. Under happiolosuhteissa, matkivat-210 estää ISCU proteiinin tasot verrattuna matkia-ctrl transfektoiduissa soluissa.

D

, (

alapaneelin

), kvantifiointi pelastaminen ISCU proteiinin tason transfektoitaessa anti-210. Transfektio anti-210 pelastaa ISCU proteiinin tasot MCF7 noin 40%. Keskiarvo ± keskiarvon standardipoikkeama kahden itsenäisen kokeen näytetään. (* P 0,05).

Mimic-210 tukahdutetaan ISCU normaaleissa happiolosuhteissa ja anti-210 päinvastaiseksi tukahduttaminen vuonna hypoksia

kertasi havaittu hypoksinen induktion miR-210 transfektoimalla MCF7 ja HCT116 kanssa matkivat-210 normoksia. Mimic-210 tukahdutetaan ISCU mRNA-tasoja noin 60% (kuvio 1C ja tukeminen Kuva S2A). Sitten antagonisoivat miR-210 aiheuttama hypoksisissa olosuhteissa anti-210. Esto endogeenisen miR-210 merkittävästi pelasti tukahduttaminen ISCU mRNA, vaikka tämä ei ollut täydellinen (kuvio 1C ja tukeminen Kuva S2A).

ISCU on kaksi vaihtoehtoisesti liitettyjä isoformeja. ISCU1 on vaihtoehtoinen N-terminaalinen sekvenssi, ja on lokalisoitu sytosoliin, kun ISCU2 liittyy mitokondrioissa. Vahvista vasta- aineen käytetään näissä tutkimuksissa, MCF7-soluja käsiteltiin siRNA vastaan ​​ISCU. Bändi havaittu kontrolliryhmässä soluissa oli täysin tukahdutetaan kun transfektio siISCU1 ja siISCU3 (tukeminen Kuva S2B). Kaksi isoformia ISCU ei voitu erottaa Western blotting kokosolulysaateista koska vähäinen ero molekyylipaino. Kuitenkin immunoreaktiivisen detektoitiin sekä sytosolin ja mitokondrioiden fraktiot (tukeminen kuvio S2C). Tämä kaista on kutsutaan ISCU proteiinin ja sen molekyylipaino on sopusoinnussa tulosten Tong et. al. [23].

Under hypoksia, MCF7 ja HCT116-solut osoittivat vähenemistä ISCU proteiinia, ja tämä oli toistettu matkia-210 normoksia (kuvio 1D ja tukeminen Kuva S2D). Lisäksi anti-210 osittain päinvastaiseksi hypoksinen tukahduttaminen ISCU proteiinia (kuvio 1D ja tukeminen Kuva S2D). Hypoksia voimakkaasti tukahdutti lusiferaasireport- sisältävä 3’UTR ISCU joka sisälsi oletetun miR-210 kohdepaikan ja tämä tukahduttaminen voi osittain pelastaa lyhytaikaisella transfektiolla anti-210 (tukeminen Kuva S2E). Lisäksi, matkivat-210 olennaisesti tukahdutti lusiferaasin aktiivisuus verrattuna kontrolliin normoxic MCF7-soluissa (tukeminen kuvio S2E). Lopuksi, vaikka siRNA vastaan ​​ISCU johti downregulation sekä endogeenisen ISCU ja eksogeenisen koodattu ISCU, josta puuttuu 3′-UTR, matkivat-210 välittämä downregulation havaittiin vain endogeenisen ISCU proteiinin (tukeminen kuvio S2F). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että miR-210 downregulates ISCU mRNA ja proteiini tasoilla kohdistamalla sen 3’UTR.

Effects of ISCU downregulation on Fe-S proteiinien

odotettavissa oleva vaikutus downregulation ISCU olisi vähentäminen Fe-S toimitus proteiinien kohdentamiseksi. Siksi olemme analysoineet vaikutuksia ISCU tukahduttamisen kahteen entsyymejä, jotka vaativat Fe-S toimintaansa, aconitase ja mitokondrioiden monimutkainen I. siRNA vastaan ​​ISCU vähensi aconitase aktiivisuutta MCF7 ja HCT116-soluissa verrattuna kontrolloida solujen normoksia (kuvio 2A). Samanlainen väheneminen aconitase aktiivisuus oli ilmeistä molemmissa solulinjoissa, kun transfektio matkivat-210 (kuvio 2A). Kuitenkaan ei ollut muutosta aconitase proteiinin tasot arvioitiin Western blot (tukeminen Kuva S3A). Aconitase köyhdytettyä Fe-S toimii translaation säädin-IRP1, lisätä raudan imeytyminen. Löysimme matkivat-210 nousi rauta kertymä HCT116-soluissa (tukeminen Kuva S3B). Oli myös selvää eston mitokondrioiden monimutkaisten I indusoimaa matkivat-210, kahdessa solulinjoissa (kuvio 2B). Molemmissa solulinjoissa oli alaspäin säätely aktiivisuuden hypoksia, samassa määrin kuin aiheuttama matkivat-210 tai ISCU ehtyminen. Lisäksi transfektio anti-210 MCF7-soluissa pystyi lisäämään merkittävästi aconitase aktiivisuutta hypoksian (kuvio 2C).

Solut transfektoidaan siRNA vastaan ​​ISCU tai matkivat-210 osoittavat merkittävää laskua aktiivisuuden Fe-S-proteiinia aconitase (

) ja monimutkainen I (

B

) 48 tuntia. Aktiivisuus ilmaistaan ​​suhteessa SCR siISCU3 tai jäljittelemään-ctrl varten matkivat-210. Keskiarvo ± s.e.m. Kolmen riippumattoman kokeen esitetään (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

C

, hypoksia vähentää aconitase ja monimutkainen I aktiivisuus MCF7 ja HCT116. Aktiivisuus ilmaistaan ​​suhteessa normoksia (N). Transfektio MCF7 anti-210 nostaa tasoa aconitase aktiivisuuden verrattuna anti-ctrl. Keskiarvo ± s.e.m. Kolmen riippumattoman kokeen esitetään (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

D

, vuonna normoksia, MCF7 transfektoitu matkivat-210 on lisäämistä erittyvän laktaattipitoisuus ja vähentää solunulkoisessa pyruvaatti 48 tunnin kuluttua. Laktaatti: pyruvaattisuhde lisääntyneet merkittävästi samoissa olosuhteissa. Transfektio anti-210 hypoksia vähensi laktaatin tuotanto verrattuna anti-ctrl transfektoiduissa soluissa. Keskiarvo ± s.e.m. Kolmen biologinen rinnakkaisnäytettä on esitetty (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

Koska lasku aconitase ja monimutkainen I aktiivisuus vähentää Krebsin sykli ja mitokondrioiden toiminto tutkimme, oliko muutos glykolyysistä ja laktaatin tuotantoa. Tuloksemme osoittivat erittäin merkittävä väheneminen pyruvaattia ja kasvaa laktaatin normoksia kanssa matkivat-210, jossa on kasvua laktaatti pyruvaattisuhde. Myös lasku laktaatintuotantovaiheessa anti-210 hypoksia (kuvio 2D).

Effects of ISCU downregulation on vapaiden radikaalien tuotantoa

menettäminen Fe-S monimutkaisista I on omiaan vaikuttamaan kuljetusta elektronien elektroninsiirtoketju ja vaikutus vapaiden radikaalien tuotantoa. Siksi mitataan tuotannon superoksidi MCF7 ja HCT116-soluissa. Vuonna normoksia molemmat solulinjat osoittivat selvästi lisääntynyt vapaiden radikaalien tuotantoa, kun transfek- matkivat-210 verrattuna jäljittelemään-ohjaus (kuvio 3A).

vuonna normoksia, transfektoimalla matkivat -210 lisää merkittävästi superoksidituotantoa 48 tuntia mitattuna MitoSox värjäystä. Edustavia kuvia matkivat-210 transfektoidut solut näkyvät ylä- paneelien ja keskiarvoa ± s.e.m. noin 300-solut näkyvät alaosassa paneelit (***, p 0,001).

B

, solujen altistaminen 0,1% happea 48 tunnin ajan parantaa tuotannon superoksidi; tämä vaikutus on lähes täysin päinvastainen transfektoitaessa anti-210. Edustavia kuvia miR-210 transfektoituja näkyvät vasemmalla paneelien ja keskiarvoa ± s.e.m. noin 300 solua näkyvät oikealla paneelien (***, p 0,001).

C

, ROS tuotanto aiheuttama matkivat-210 estyy MCF7-soluissa cotrasfection kanssa ISCU2 ilmentävien plasmidin. Keskiarvo ± s.e.m. noin 300 soluissa esitetään (*** p 0,001). Bars = 10 pm.

hypoksia totesimme erittäin merkittävän kasvun superoksidituotannon, joka oli lähes täysin päinvastaiseksi anti-210 (kuvio 3B). Lisäksi transfektion ISCU2 konstruktin lähes täysin päinvastainen vapaiden radikaalien aiheuttama miR-210 (kuvio 3C). Tämä osoittaa merkittävän uuden mekanismin säätelyyn ROS hypoksia, ja että se ei ole passiivinen vaikutusta pienentää hapen saatavuudesta.

Effects of miR-210 apoptoosin ja eloonjäämiseen normoksia ja hypoksia

Aiemmat tutkimukset hiivan ovat osoittaneet tappava seurauksia ISCU homologeista poistamisen [23]. Tämä käsite johti meidät tutkimaan vaikutuksia miR-210 apoptoosin normoksia ja hypoksia. Oli silmiinpistävä ero vaikutuksia mir-210 näissä vastakkaiset olosuhteissa. Normaaleissa happiolosuhteissa, matkivat-210 oleellisesti lisääntynyttä apoptoosia mitattuna anneksiini V-värjäyksellä, mutta hypoksia, antagonismi miR-210 lisääntynyttä apoptoosia (kuvio 4A).

, apoptoosin (anneksiini V + solut) mitattiin MCF7 (

jäljellä

) ja HCT116 (

oikeus

) käsiteltyjä soluja miR-210 estäjän tai matkivat, 48 tunnin kuluttua altistumisesta 0,1% happea tai normoksia. Keskiarvo ± s.e.m. edustaa 3 itsenäistä koetta (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

B

jälkeen transfektoimalla MCF7-solujen kanssa salattu LNA tai mir-210 LNA ja altistettiin 0,1% happea tai normoksia (48 tuntia), solut uudelleen pinnoitettu (100 ja 500 solua /kuoppa). Jälkeen 12 päivän inkuboinnin pesäkkeet kiinteä, värjättiin, ja elossa fraktiot lasketaan perustuen maljaustehokkuus.

C

, elossa fraktiot laskettu kuten (

B

) HeLa-soluissa, jotka transfektoitiin anti-ctrl tai anti-210 (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, USA) ja altistettiin 0,01% happea tai normoksia. Kaikissa pesäkekokeissa, keskiarvo ± s.e.m. edustaa 2 itsenäistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena käyttämällä 2 eri maljatiheyksiin. (** P 0,01, *** p 0,001).

D

, RT-PCR ISCU ja miR-210 U87 ksenografteissa hoidettu anti-angiogeenisen terapian (bevasitsumabi). Suhteellinen ilmentyminen ISCU normalisoida p-aktiini, miR-210 normalisoitu kolme pientä nucleolar valvontaa, RNU43, RNU44 ja RNU48. Mean ilme ± s.e.m. 4 eläintä /ryhmä näkyy (** p 0,01, *** p 0,001).

Arvioidaan vaikutuksia miR-210 soluproliferaatioon hypoksisissa edellytyksin klonogeeniset määritystä käytettiin lukitun nukleiinihapon antagonisti (LNA) miR-210-molekyylin (kuvio 4B). Vaikka suurin osa väheneminen kyky muodostaa klooneja in hypoksia on selvästi muiden mekanismien kautta, vaikutukset anti-210 alensivat klonogeeniset selviytymisen hypoksiaa, jota esiintyy myös enemmän hypoksia kestävä solulinjan, HeLa-soluja (kuvio 4C).

in vivo tukahduttaminen ISCU hypoksia ja kliininen merkitys ISCU ilmaisun

tutkinut, ilmentymistä ISCU geenin ilmentyminen oli säännelty in vivo, tutkimalla ihmisen tuumoriksenografteja. Ksenografteissa on glioblastoomasolulinjan U87 hoidettiin VEGF estäjän Avastin (bevasitsumabi), tai ajoneuvon ohjaus. Immunohistokemia näiden kasvainten osoitti Avastin aiheuttama nekroosi, ilmaus HIF1α ja HIF kohdegeenien CA9 ja VEGF (tietoja ei ole esitetty). Analysoimme mRNA: n kasvaimia ja löysi merkitty ylössäätely miR-210 ja vastavuoroinen downregulation ISCU mRNA (kuvio 4D).

Ainoat tiedot käytettävissä vertailua miR-210 ISCU RNA ihmisen kasvainten näytteiden meidän rintasyövän ja pään ja kaulan sarjassa. Oli erittäin merkitsevä käänteinen suhde miR-210 ISCU ilmaisun 216 rintasyöpäpotilailla (rho = -0,39, p 0,001) (kuvio 5A,

jäljellä

). Oli erittäin merkittävä käänteinen korrelaatio ISCU on aggressiivisempaa korkealuokkaisesta kasvaimet (p = 0,008) ja huono uusiutumisen elinaika (kuvio 5A,

oikea

). Monimuuttuja-analyysissä, ISCU edelleen merkittäviä (p = 0,028), sekä solmuja, laatu ja ikä (tukeminen taulukko S2). 2 muut sarjan rintasyövän (Rotterdam [26], 286 tapaukset: Uppsala [27]; 235 tapausta) alhainen ISCU oli huono ennustetekijä monimuuttujamenetelmin (tukeminen taulukot S3 ja S4) (p = 0,038 ja 0,015 vastaavasti). Uppsalan sarjan [27] voimme arvioida esiaste miR-210 käyttäen Affymetrix koettimia (Affymetrix U133b, 230710_at), ja tämä osoitti myös käänteinen suhde edeltäjä ISCU ja huono säilyminen (kuvio 5B). Meidän pään ja kaulan alueen syöpä sarja [25], oli käänteinen suhde näiden muuttujien (kuva 5C,

jäljellä

). Sarjassa julkaistujen seurata, Chung et al [28], oli voimakas yhdistys tukahdutetaan ISCU huonoon lopputulokseen (kuvio 5C,

oikea

). Analyysi ilmentymisen normaaleissa kudoksissa verrattuna kasvaimen kudokset 9 kasvaimen tietokokonaisuuksien avulla Oncomine osoitti kaikissa tutkimuksissa tukahduttaminen verrattuna normaaleissa kudoksissa (tukeminen kuva S4).

, miR-210 qPCR ilme (DDCT) funktiona on ISCU mRNA: n ilmentymisen (Illumina paneelit) Oxford rintasyövän sarja (

jäljellä

), ja, uusiutumisen elinaika ilman näytteissä on korkea ISCU ja matalan ISCU jaettuna mediaani Oxford rintasyöpä sarja (

oikea

).

B

, mRNA ilmentyminen transkriptio isännöi miR-210 esiaste funktiona on ISCU mRNA ilmaisun toimenpiteen Affymetrix U133b ja U133a vastaavasti Uppsalan rintasyövän sarja (

jäljellä

), ja uusiutumisen elinaika näytteissä on korkea ISCU ja matalan ISCU hajauttaman mediaani Uppsalan rintasyövän sarja (

oikea

).

C

, miR-210 qPCR lauseke (DDCT) funktiona on ISCU mRNA: n ilmentymisen (Affymetrix paneelit) Oxford-Manchester HNSCC syöpä sarja jossa ISCU oli alun perin todettu liittyvän hypoksia (

vasen

), ja uusiutumisen elinaika ilman näytteissä on korkea ISCU ja matalan ISCU hajauttaman mediaaniarvon Chung et al. HNSCC sarja (

oikea

).

Keskustelu

Tutkimuksemme osoittavat selvästi miR-210 säätelee ilmentymistä ISCU RNA ja proteiini käyttäen matkivat in normoksia syöpää solulinjat. ISCU mRNA ja proteiini tukahdutettiin hypoksiaolosuhteissa ja tämä vaikutus oli merkitsevästi päinvastaiseksi anti-210. Epätäydellisen kääntyminen merkitsee muiden mekanismien mukana myös ISCU downregulation ja on hyvin tunnettua, että RNA käännös vähennetään hypoksia kautta avatulla proteiinivaste [29].

pieneneminen ISCU vaikeuttaisi solujen kyky tuottaa Fe-S klustereiden ja sittemmin vaikutusta toimintaan entsyymejä, jotka vaativat nämä kofaktori osia. Osoitimme, että aconitase keskeinen entsyymi välittäjän aineenvaihdunta vaatii Fe-S klustereita, oli vähentynyt aktiivisuus seuraavan ISCU vähentämiseen. On erityistä merkitystä syöpä on kaksoisrooli aconitase koska IRP1 kun se puuttuu sen Fe-S klusteri. IRP1 säätelee vakautta ja kääntäminen mRNA transferriinin ja ferritiini [24]. Vaikutukset menetys aconitase olisi muuttaa raudan aineenvaihduntaa ja kasvattaa otto, joka on kriittistä kasvaimen kasvua. Todellakin, havaitsimme kertyminen solunsisäisen rautaa kun solujen transfektio matkivat-210 tai siISCU.

Mutaatiot ISCU aiheuttaa maitohappoasidoosia yksilöissä jälkeen kohtuullinen liikunta, joka tarjoaa vahvaa näyttöä, että on tärkeää tämän tavoitteen säilyttäminen tehokas Krebs sykli toimintaa [30], [31]. Osakkuusyhtiöiksi päivästä laski ISCU tasoilla ja myöhemmin lasku Krebsin syklin toiminta oli kytkin glykolyysistä ja lisääntynyt laktaatin tuotantoa. Tämä indusoitiin normoksia by miR-210 ja on siten samanlainen kuin Warburg vaikutus. Tämä voi olla merkitystä tilanteissa, joissa miR-210 säätelyyn ylöspäin tapahtuu normoksia. Esimerkiksi, tämä on esitetty munuaisten syöpäsolulinjoissa mutaatioiden kanssa von Hippel Lindaun proteiinia [14]. Sitä vastoin hypoksia, anti-210 vähensi laktaatin tuotantoa, käännetään Pasteur vaikutus (kytkin glykolyysistä hypoksia).

Rauta-rikki klusterit ovat olennainen tehokkaan toiminnan mitokondrioiden elektroninsiirtoketju. Olemme osoittaneet, että kompleksi I aktiivisuus on laskenut alle hypoksia ja kun transfektointi matkivat-210 normoksia. Lisäksi Complex I, Komplekseja II ja III sisältävät myös Fe-S klusterien ja me spekuloida, että kaikkien kolmen komplekseja voitaisiin vähentää joka miR-210 riippuvaisella tavalla. Heikentynyt elektroninsiirtoketju johtaisi kasvuun vapaiden radikaalien tuotantoa seurauksena elektroni vuoto. Erityisesti kompleksi III on merkittävä tekijä ROS hypoksia [32] ja monimutkainen I ja II muodostaa noin 30% ROS [33]. Vuonna happiolosuhteissa, transfektointi matkivat-210 lisännyt vapaiden radikaalien tuotantoa. Lisäksi normoxic ROS tuotanto havaittiin matkivat-210 oli lähes kokonaan esti kanssa miR-210 kestävä ISCU konstruktio. Sitä vastoin hypoksia, havaitsimme, että induktio miR-210 oli liittynyt lisääntyminen ROS, ja tämä voitaisiin lähes kokonaan päinvastaiseksi anti-210. Tämä tarjoaa merkittävän uuden linkin selittää mekanismin ROS induktion hypoksiaa, jota on raportoitu useiden ryhmien [33] ja voi selittää suurimman osan hypoksinen ROS induktio. ROS julkaistiin hypoksiaa on osoitettu toimivan O

2 antureita, jotka toimivat signalointi aineita, jotka aktivoivat HIF [32], välittäjänä kasvaimen kasvua in vivo kautta HIF riippuvainen mekanismi [5] ja laajentaa elinikä solujen [34] .

toisin hypoksinen induktion ROS ja lievittämiseen anti-210 havaittu tutkimuksessamme, Chan et ai. ei mitata merkittäviä muutoksia ROS tuotanto altistuksen jälkeen hypoksia, ja osoitti käännetyn trendin miR-210 estyi [20]. Syynä tähän ero on epäselvä, mutta saattavat heijastaa taustalla eroa syövän verrattuna normaaliin endoteelisolujen.

Lopuksi analysoidaan oliko yhdistys ISCU downregulation primaarisissa ihmisen syövissä liittyy hypoksiaa ja tulokseen, ja löytyi aggressiivinen fenotyyppi liittyi tähän muutokseen tutkimuksissa yli 1000 potilasta, ja downregulation verrattuna normaaleissa kudoksissa monissa kasvaintyypeissä.

Yhteenvetona olemme löytäneet merkittävän uuden mekanismin vasteen syöpäsolujen hypoksia, koordinoi miR-210 tukahduttaminen ISCU ja myöhemmin lasku aktiivisuuden rauta-rikki-kasauman proteiinit (tukeminen kuva S5). Lisäksi aconitase, monissa aineenvaihdunnan entsyymejä vaativat Fe-S klusterit niiden aktiivisuus viittaa siihen, että downregulation ISCU olisi kauaskantoisia vaikutuksia solujen aineenvaihduntaa. Mutaatiot monissa näissä Fe-S klusterin entsyymit mukaan lukien sukkinaattidehydrogenaasi alayksiköt SDHD, SDHB ja SDHC [35] ja fumarate hydrataasia [36] ovat sekaantuneet hyperproliferatiivisissa häiriöt ja syöpä, joka osoittaa tärkeä yhteys solujen aineenvaihduntaan ja johtuvat muutokset ja kuvataan rooli for HIF kautta miR-210-ISCU akseli näissä prosesseissa. Lisäksi metabolisia entsyymejä, useita DNA korjaukseen entsyymeistä [37] kanssa Fe-S klusterit ovat potentiaalisesti tavoitteita. Olemme aiemmin osoittaneet miR-210 voidaan havaita kohonnut seerumin syöpäpotilaiden [38], joten se on kiinnostava, jos ne kuvastavat metabolisen tilan ensisijaisen syövän ja siten voitaisiin käyttää tulevaisuudessa terapiassa valinnassa. Sääntely erillisiä biologisia väylät ISCU downregulation viittaa potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa synteettisten kuolleisuutta jolloin lääkkeet, jotka välittävät DNA-vaurioita korjataan rauta-rikki-kasauman sisältäviä helikaasit Rad3 [39] tai Fanconin anemia [37] voisi olla käyttöä yhteisvaikutuksessa PARP-inhibiittorit tai inhibiittorit Glykolyysivaiheen [36] ja glutaminolysis alaryhmässä potilaita, joilla eniten miR-210 tasoilla.

Vaikka tämä työ oli valmisteilla kolme uutta miR-210 tavoitteita validoitu eli HOXA1, HOXA9 ja FGFRL1 ja analyysi tuumoriksenograftien peräisin syöpäsolulinjasta yliekspressoivia miR-210 ehdotti mahdollisen osallistumisen miR-210 kasvaimen kasvun aloittamista [40].

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Solun altistuminen hypoksian (1% tai 0,1% tai 0,01% happea) tehtiin vuonna hypoksian inkubaattorissa (MiniGalaxy A, RS Biotech, Skotlanti, UK), käyttäen jatkuva kostutettuun seoksesta 95% N

2 ja 5% CO

2.

miRNA matkivat tai estäjä transfektion

transfektio suoritettiin Dharmacon anti-210, miR-210 matkivat tai ohjaus oligoja (Thermo Scientific, CO, USA) siten, että lopullinen pitoisuus oli 20 nM, käyttäen Optimem seerumittomalla alustalla ja Oligofectamine reagenssia (molemmat Invitrogen, Paisley, UK) kohti valmistajan protokollaa.

transfektio ja lusiferaasin määritykset

lusiferaasireporttiterilla plasmideja, jotka sisältävät 3 ’transloimattomia alueita (UTR) ja ISCU tai satunnainen genomisen sekvenssin (kontrolli) saatiin kojeiston Genomics (Menlo Park, CA. Renilla lusiferaasin ekspressioplasmidin (PRL-TK vektori, Promega, Southampton, UK) käytettiin transfektioon ohjaus.

Entsyymiaktiivisuus määrityksissä

Aconitase aktiivisuus käyttäen Bioxytech Aconitase-340-määritys (Oxis International Inc, Beverly Hills, CA). Tulokset on esitetty% aktiivisuuden verrattuna kontrolliin.

Solut analysoitiin kompleksi I aktiivisuus käyttämällä Mitoprofile kompleksi I: Rapid Elisa Kit (MitoSciences, Eugene, OR, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tulokset esitetään% aktiivisuuden verrattuna kontrolliin.

Lactate ja pyruvaatti mittaukset

Lactate ja pyruvaatti analysoitiin käyttämällä tuotesarjoja Instruchemie (Delfzijl, Alankomaat).

MitoSOX värjäys

Mitokondrioiden superoksidi analysoinnissa käytettiin MitoSOX Red (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kuvat otettiin kanssa -konfokaalimikroskoopilla (Radiance 2000 Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, UK), ja analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [41].

Geenien ilmentyminen tiedonrikastus

Olemme aikaisemmin johdettu hypoksian metageeni perusterveydenhuollossa pään ja kaulan alueen syöpä okasolusyöpä [HNSCC] [25]. Klustereita geenien vastaisen korreloi miR-210 ilmaisu muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]; Spearmanin korrelaatio käytettiin geenien tunnistamiseksi merkittävästi anti-korreloi miR-210 ja väärien löytö määrä (FDR) arvioitiin käyttämällä permutaatio perustuva menetelmä [42]. Geenit kanssa FDR 0,05 valittiin. Käytimme myös 5 tavoite Ennustusalgoritmien: – TargetScanHuman (https://www.targetscan.org/); Pictar [43]; Miranda (https://microrna.sanger.ac.uk/); DianaLab (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), miRDB (https://mirdb.org/miRDB/).

Survival analyysit ja muut tilastolliset analyysit

Spearmanin korrelaatiota käytettiin jatkuvien muuttujien ja Wilcox testi kategorisen muuttujia.