Krooninen sairaus

tiivistelmä

AZD6244 ja MK2206 kohdistetaan pienimolekyylisiä lääkkeitä, estävät MEK ja AKT vastaavasti. Tehoa tällä yhdistelmällä keuhkosyöpä on tuntematon. Meidän edellinen työ osoitti, kuinka tärkeää on aktivoitu AKT välittämisessä vastus ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja AZD6244. Niinpä me arveltu, että dual esto sekä loppupään MEK ja AKT polkuja voisi aiheuttaa synergististä antituumorivaikutus. Tässä tutkimuksessa arvioimme tehoa AZD6244 ja MK2206 yksilöllisesti suuri paneeli keuhkosyövän solulinjat. Sitten me käsiteltiin 28 ihmisen keuhkosyövän solulinjoja yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 kliinisesti sovelletaan lääkkeen moolisuhteet. AZD6244-MK2206 yhdistelmähoito johti synergistinen vaikutus inhibitio keuhkosyövän solujen kasvua verrattuna tuloksiin yhden lääkkeen hoito yksinään. MK2206 parannettu AZD6244 aiheuttama Bim yli-ilmentymisen ja apoptoosin A549 ja H157-soluissa. Kun testasimme yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 suhteissa 08:01, 04:01, 02:01 ja 01:08, huomasimme, että synergistinen vaikutus oli yhdistelmähoidolla suhde riippuvainen. Suhteissa 08:01, 04:01 ja 02:01, lääkeyhdistelmän johdonmukaisesti osoittaneet synergiaa, kun taas vähentää suhde 01:08 johtivat synergian ja tuottivat additiivisen tai antagonistinen vaikutus useimmissa solulinjoissa. Lisäksi AZD6244-MK2206 yhdistelmähoito osoitti synergiaa tukahduttaminen A549 ja H157 ksenograftin kasvaimen kasvu ja keskimääräinen eläinten elinaika. AZD6244-MK2206 yhdistelmähoitoa johtanut tehokkaaseen inhibitioon molempien p-ERK ja p-AKT ilmentyminen kasvainkudoksessa. Lisäksi merkittävä kasvu apoptoosin havaittu tuumorikudoksessa käsiteltyjen hiirien AZD6244-MK2206 verrattuna päässä yksittäisenä aineena käsitellyissä hiirissä. Tutkimuksemme osoittaa, että yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 on merkittävä synergistinen vaikutus kasvaimen kasvuun

in vitro

ja

in vivo

ja johtaa lisääntyneeseen eloonjäämisluvut hiirillä erittäin aggressiivinen ihmisen keuhkokasvaimia.

Citation: Meng J, Dai B, Fang B, Bekele BN, Bornmann WG, Sun D, ​​et al. (2010) Combination Hoito MEK ja AKT estäjät on tehokkaampaa kuin kunkin lääkkeen Alone in Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 5 (11): e14124. doi: 10,1371 /journal.pone.0014124

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2010 Hyväksytty: 5. marraskuuta 2010 Julkaistu: 29 marraskuu 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee osittain National Institutes of Health kautta MD Anderson Cancer Center Support Grant CA-016.672 – Lung Program, virtaussytometria ja Cellular Imaging (FCCI) Core Facility ja tutkimus Animal tuki Facility, erikoistunut ohjelma huippututkimuksen (SPORE) Grant CA-070907 (J. Minna ja J. Roth), jossa R01 Grant CA-124.951 (B. Fang) ja Cohen-Reinach Family hyväntekeväisyysyhdistykseksi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /Akt ja RAS /RAF /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MEK) /solunulkoisen signaali säädelty kinaasi (ERK) reittejä, välittäjänä lisääntymistä ja eloonjäämisen ihmisen keuhkosyövän solujen ja useita samoja loppupään molekyylejä, kuten FOXO3a [1], kaspaasi-9 [2], ja Bad [3].

tällä hetkellä erilaisia ​​pienimolekyylisiä tyrosiinikinaasi-inhibiittorit, jotka on kohdistettu signalointireiteissä on kehitetty , ja kaksi näistä aineita arvioidaan parhaillaan kliinisissä kokeissa. AZD6244 on allosteerisessa estäjä MEK1 /2-kinaasien, joka ei kilpaile adenosiinitrifosfaatista (ATP) sitoutumisaktiivisuutta [4]. Tämä yhdiste sitoutuu MEK1 /2 ja indusoi useiden konformaatiomuutoksia fosforyloitumaton MEK1 /2-entsyymejä, estämällä niiden katalyyttinen aktiivisuus, joka johtaa inhibitioon ERK aktivointi ja tukkiminen signaalitransduktioreittejä. MK2206 on erittäin selektiivinen ei-ATP kilpailukykyinen allosteerinen estäjä AKT IC

50, nM alueella ja on laaja prekliinisissä antituumorivaikutus. Se on myös alkuvaiheessa kliinisissä tutkimuksissa ja arvioidaan parhaillaan hoidossa potilailla, joilla on keuhkosyöpä. Kuitenkin mahdollinen teho yhdistelmän AZD6244 ja MK2206 hoidossa keuhkosyöpä on tuntematon. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutus yhdistelmän AZD6244 ja MK2206 tappamisessa ihmisen keuhkosyövän solulinjoja ja totesi, että tämä yhdistelmä oli erittäin synergistinen

in vitro

ja erittäin tehokas hoito keuhkosyövän ksenograftien. Olemme myös tutkineet mekanismi synergia näiden kahden yhdisteiden. Meidän prekliinisen löydökset tukevat kliiniset tutkimukset AZD6244 ja MK2206 yhdistelmähoitoa keuhkosyöpäpotilaiden.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

AZD6244 ja MK2206, syntetisoida Dr. William G. Bornmann laboratoriossa Teksasin yliopiston MD Anderson Cancer Center, liuotettiin pitoisuuksiin 25 mM ja 20 mM, vastaavasti, dimetyylisulfoksidissa ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Vasta-aineet kokonais- ja fosforyloitu ERK ja AKT ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Vasta-aineet Bim saatiin yhtiöstä Calbiochem (San Diego, CA). Proteaasiestäjäseostabletit, β-aktiini-vasta-aine, ja sulforodamiini B saatiin Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). Proteiinimääritys aineita ostettiin Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). DeadEnd ™ Flurometic TUNEL System hankittiin Promega (Madison, WI).

Soluviljely

Kaikki ihmisen keuhkosyövän solulinjat saatiin joko Dr. John V. Heymach MD Anderson Cancer Centerin tai Drs. Adi Gazdar ja John D. Minna The University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas. Solulinjoja ylläpidettiin RPMI 1640 tai korkean glukoosin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml ampisilliinia ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä; soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

solunelinkykyisyysmääritys

inhiboivat vaikutukset AZD6244, MK2206, ja yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 solun kasvuun määritettiin käyttämällä sulforodamiini B määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu [5]. Kukin koe suoritettiin neljänä rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa. Suhteellinen solujen elinkykyä (%) laskettiin käyttäen yhtälöä OD

T /OD

C x 100% (jos OD

T edustaa absorbanssi hoitoryhmässä ja OD

C edustaa absorbanssi kontrolliryhmä). Mediaani inhiboiva konsentraatio (IC

50) arvot määritettiin käyttäen CurveExpert 1,3 ohjelmistoja ja piirrettiin annos-vaste-käyrät.

Western blot-analyysi

Koko-solu-lysaatit valmistettiin pesemällä solut fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja saattamalla ne hajotus Laemmlin näytepuskuria täydennetty proteaasi-inhibiittoriseosta. Sen jälkeen kun lysaatit sonikoitiin 15 s, proteiinin konsentraatiot kvantitoitiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit. Yhtä suuret määrät kutakin proteiinia ladattiin, erotettiin 10% tai 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja sen jälkeen siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) 80 V: ssa 2 tuntia. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS-puskurissa, joka sisälsi 0,1% Tween-20 (PBST) ja tutkittiin laimealla ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Kalvot pestiin sitten kolme kertaa PBST-puskurissa ja tutkittiin infrapunaväri-leimatut sekundääriset vasta-aineet; Immunoreaktiivisia bändit tehtiin näkyviksi Odyssey Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Solusykli ja apoptoosin määrityksiä

Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, kiinnitettiin jääkylmällä 70% metanolia, ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Sitten solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 25 ug /ml propidiumjodidia, joka sisälsi 30 ug /ml ribonukleaasi 30 min huoneen lämpötilassa. Solut analysoitiin EPICS Profile II virtaussytometrillä (Coulter Corp., Hialeah, FL) käyttämällä Multicycle AV ohjelmisto (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Kokeet toistettiin ainakin kolme kertaa.

Eläinkokeet

Kaikki Eläinkokeet suoritettiin hyväksynnän jälkeen MD Anderson Institutional Review Board (11-03-09932) ja tehtiin mukaisesti suuntaviivojen Care ja käyttö Laboratory Animals julkaissut National Institutes of Health.

BALB /c-nude-hiiret hankittiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Hiiriä sijoitettu laminaarisen virtauksen kaapit spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa ja käytettiin, kun ne olivat 6- 8-viikkoa vanhoja. Yhteensä 3 x 10

6 H157 tai A549-solut istutettiin ihonalaisesti oikeaan selkäpuolen kyljissä nude-hiirissä. Kun kasvaimet saavuttivat keskimäärin tilavuus on noin 0,1 cm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti kontrolli- ja testiryhmään (

n

= 5 eläintä ryhmää kohti). Jotta H157-kantavissa hiirissä, hoitoryhmissä annettiin 20 mg /kg AZD6244, 10 mg /kg MK2206 tai AZD6244-MK2206 yhdistelmä 20 mg /kg-10 mg /kg, jotka kaikki oli liuotettu alustassa, joka sisälsi 0,5% hydroksipropyylimetyyliselluloosaa ja 0,1% polysorbaatti-puskuria. Kun A549-kantavissa hiirissä, hoitoryhmissä annettiin 24 mg /kg AZD6244, 6 mg /kg MK2206 tai AZD6244-MK2206 yhdistelmä on 24 mg /kg-6 mg /kg, jotka kaikki oli liuotettu alustassa, joka sisälsi 0,5% hydroksipropyylimetyyliselluloosaa ja 0,1% polysorbaatti-puskuria. Kaikki lääkkeet liuotettiin 100 ul apuainepuskurissa kullekin hiirelle. Kaikki lääkkeet kaksi kertaa vuorokaudessa suun kautta letkulla. Kontrolliryhmä sai ajoneuvon puskuriin yksin. Hoidon pituus oli 20 d. Kasvaimen koko mitattuna jarrusatulat, tallennettiin joka 5 d. Kasvaimen tilavuus laskettiin ottaen pituus on pisin halkaisija koko kasvain ja leveyden olevan vastaava kohtisuora halkaisija, seuraavalla kaavalla: pituus x leveys

2 x 0,52. Tuumorin kasvun esto laskettiin 100% × (kasvaimen koko

käsitelty /kasvaimen kokoa

ohjaus) on jokaisen mittauksen päivä. Kasvain hiirillä jatkoi hoitoa kuten edellä jälkeen 20 d. Hiiret saivat elää jopa niiden luonnollisen kuoleman tai tapettiin, kun niiden kasvaimen tilavuus oli suurempi kuin 2000 mm

3. Kaplan-Meier selviytymisen käyrät piirrettiin ja analysoitiin tilastollisesti. Eläimen kehon paino mitattiin ja merkittiin muistiin joka 5 d hoidon aikana.

farmakodynaamisella tutkimuksella, kasvaimet perustettiin edellä kuvatulla tavalla ja annettiin kasvaa kokoon 0.5-0.8cm

3 ennen hoitoa alkoi. Hiirillä, s.c. A549-kasvaimia sitten päivittäin vehikkeliä, AZD6244, MK2206 tai AZD6244-MK2206 samoina pitoisuuksina edellä mainittujen (

n

= 5 eläintä ryhmää kohti) ja 3 päivää. Neljän tunnin kuluttua viimeisestä annoksesta eläimet tapettiin ja kasvaimet resektoitiin, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja parafinoidut immunohistokemiaan värjäystä ja TUNEL määritys.

immunohistokemia

kohdat poistettiin parafiini ksyleenillä ja sarja- etanolia laimennuksen. Antigeenit haettiin ja endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus estettiin 0,3% vetyperoksidia 10 minuutin ajan. Sitten leikkeet käsiteltiin 10% normaalia vuohen tai hevosen seerumia 30 min. Yön yli inkuboinnin jälkeen primaarisilla vasta-aineilla, mukaan lukien p-AKT (laimennus 1:100) ja p-ERK (laimennus 1:100), leikkeet tutkittiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita ja inkuboitiin sitten streptavidiini-biotiini-kompleksin (Lab Vision, Fremont , CA). Sitten leikkeitä värjättiin liuoksella, jossa oli 3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB; Lab Vision, Fremont, CA), vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), kuivattu ja kiinnitetty.

TUNEL määritys

osat poistettiin parafiini ja TUNEL-määritys suoritettiin noudattamalla valmistajan ohjeita kaupallisesti saatavaa reagenssipakkausta (DeadEnd ™ fluorometrinen TUNEL System) Promegalta. Apoptoottiset solut osoittavat voimakasta ydin- vihreän fluoresenssin että voitaisiin havaita tavallisella fluoreseiini suodatin. Kaikki solut värjättiin DAPI osoittavat vahvan sininen ydin- fluoresenssi. Levyjä tarkasteltiin fluoresenssimikroskopian suhteellisen apoptoottiset solut määritettiin laskemalla TUNEL-positiivisten solujen viidellä satunnaisesti aloilla (at x 100 suurennus) jokaisesta näytteestä.

Tilastollinen

in vitro

sytotoksisuus kokeet suoritettiin kolminkertaisesti kunakin ajankohtana ja keskittyminen. Merkitys

in vitro

data määritettiin käyttämällä Student

t

testi (2-tailed). P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

geenimutaatioita solulinjat saatiin online-tietokanta (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/). Korrelaatiot

in vitro

vastauksena AZD6244 tai MK2206 (IC

50) ja geenimutaatioita arvioitiin käyttämällä Wilcoxonin testi ja logistinen regressio.

in vivo

tutkimuksissa kasvainten tilavuudet laskettiin keskiarvo ± keskihajonta. Wilcoxonin summa testi ja Kruskal-Wallisin testiä käytettiin vertaamaan hoitoa eroja. Spearmanin korrelaatiokertoimen avulla arvioitiin korrelaatio kaksi jatkuvaa muuttujaa. Hoitoerot suhteen säilyminen arvioitiin kautta log-rank-testi. Kaikki testit olivat kaksipuolisia. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Tilastollinen ohjelmisto SAS 9.1.3 ja S-PLUS 8.0 käytettiin kaikissa analyyseissä.

Tulokset

Vaikutukset AZD6244 tai MK2206 Single-lääkehoitoa on Keuhkosyöpä Cell Lines

Ennen vaikutuksia arvioitaessa yhdistelmähoidosta, testasimme antiproliferatiivinen vaikutus AZD6244 ja MK2206 kuin yhden aineen hoitomuotojen paneelin 47 ihmisen keuhkosyövän solulinjoja (kuvio 1). Vaste AZD6244 vaihtelivat suuresti, mistä erittäin herkkä (IC

50 0,2 uM) ja erittäin vastustuskykyinen (IC

50 150 uM), joukossa solulinjat. Annosvasteen valikoima MK2206 oli johdonmukainen, jossa IC

50 vaihtelevat 0,4 uM 25 uM. Löysimme solulinjat olivat herkkiä AZD6244 mutta resistenttejä MK2206 (kuten Calu-6, HCC1171, ja H1993), kun taas muut solulinjat olivat resistenttejä AZD6244 mutta herkkiä MK2206 (kuten H522, H1395, ja Calu-3) . Välillä ei herkkyys näiden kahden yhdisteen havaittiin. Vertaamalla annos-vaste tuloksia ja online-geenimutaatio-tietokanta, ei korrelaatio löytyi EGFR, KRAS, BRAF tai PI3K geenimutaatioita ja IC

50 AZD6244 tai MK2206. Myös eivät havainneet korrelaatioita yleinen EGFR /KRAS /BRAF geenimutaatioita ja IC

50 AZD6244 tai yleinen EGFR /PI3K geenimutaatioita ja IC

50 MK2206 (taulukko 1 ja 2).

ilmoitettu solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla joko AZD6244 tai MK2206 96 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttäen sulforodamiini B, ja IC

50 laskettiin annos-vaste-käyrä.

vaikutukset AZD6244-MK2206 yhdistelmä vaihtelevat keuhkosyöpä solulinjat

From 47 solulinjat, päätimme 28 testata antituumorivaikutukset AZD6244 ja MK2206 yhdistelmähoitoa. Solulinjat valittiin edustamaan spektrin herkkyys yhdelle tai molemmat lääkkeet. IC

50 oli 5 um sekä AZD6244 ja MK2206 21 oli 28 solulinjoissa. Muiden solulinjojen IC

50 oli 5 um varten AZD6244 tai MK2206 tai molempia. Sen määrittämiseksi, antituumorivaikutukset saatu erilaisilla AZD6244 ja MK2206 yhdistelmät olivat synergistisiä, laskimme yhdistelmän indeksi (CI) mukaan Chou-Talalay menetelmällä käyttämällä Calculsyn ohjelmistoa (Biosoft, Cambridge, UK). (CI 1,1, antagonismi; CI = 0,9-1,1, lisävaikutus, CI = 0,2-0,9, synergia; CI 0,2 epätehokkaalla). Koska Chou-Talalay malli vaatii sytostaattien voidaan käyttää kiinteällä annoksella suhde, päätimme käyttää AZD6244 ja MK2206 klo 05:01 moolisuhteessa. Käsittelyn jälkeen eri pitoisuuksilla AZD6244 (0,024-100 uM), MK2206 (0,005-20 uM) ja AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005-100/20 uM), jotka ovat alueella pitoisuuksilla, jotka saavutetaan seerumissa potilailla, suun AZD6244 ja MK2206, yhdistelmä-indeksi (CI) mitattiin kustakin solulinjasta. 67%: n solulinjojen, mukaan lukien H2023, H2347, HCC827, ja H23 on esitetty kuviossa 2, yhdistelmä hoito tuotti voimakkaan synergistisen vaikutuksen. Yhdistetyt käsittely tuottivat additiivisen tai antagonistisia vaikutuksia vain 11%: n solu- linjojen (taulukko 3).

Keuhkosyöpä solulinjoja käsiteltiin eri pitoisuuksilla AZD6244 (0,024-100 uM), MK2206 (0.005- 20 uM) ja AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005-100/20 uM) 96 tuntia. Annosvaikutuskuvaajia yhdistelmän ja kunkin aineen yksinään annetaan vertailua varten. Edustavia solulinjoja, jotka osoittivat vahvaa synergiavaikutuksen yhdistelmähoidon tehon on esitetty.

synergiavaikutuksesta AZD6244-MK2006 yhdistelmähoito on suhde riippuva

lääkehottuma suhdeluvut laajennettiin 7-solulinjat (H1792, H157, A549, H515, H1693, H1703 ja H3122), jotka olivat herkkiä yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 on 08:01, 04:01, 02:01, 01:02, 1: 4, ja 01:08. Huomasimme, että johdonmukainen synergia johtivat kun 08:01, 04:01, ja 02:01 suhteet käytettiin (kuvio 2, taulukko 4), kun taas vähentämällä AZD6244:MK2206 suhde 01:08 johtivat synergian ja tuotettujen additiivinen tai antagonistinen vaikutus useimmissa solulinjoissa (taulukko 4). Huomasimme myös, että kukin solulinja oli oma optimaalinen lääkeaineen suhde. Esimerkiksi, H1703 osoitti korkeimman synergian klo AZD6244:MK2206 suhteessa 08:01; H1693 ja A549 oli korkeimmillaan 04:01 (kuvio 3A, vasemmalla); ja H157 oli korkeimmillaan 2:01 (kuvio 3A, oikealla).

(A) A549 ja H157 käsiteltiin AZD6244, MK2206, tai näiden kahden yhdisteiden ilmoitettuina pitoisuuksina 48 tuntia. (B) proteiini näytteet kerättiin ja AKT, p-AKT, ERK, p-ERK ja Bim ilmaisun detektoitiin Western blot-analyysi. (C) Solut trypsinoitiin ja kiinteä, ja solusyklin mitattiin virtaussytometrialla. Luvut esittävät prosenttiosuuksia apoptoottisten Saharan G

1-vaihe soluissa. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta samanlaisin tuloksin.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baari

, SD. *,

P

0,05 verrattuna monoterapiana hoitoja.

MK2206 parantaa AZD6244 aiheuttaman apoptoosin

Sen määrittämiseksi, MK2206 ollut vaikutusta AZD6244: n indusoiman apoptoosin, testasimme ilmentyminen AKT, p-AKT, ERK, p-ERK, ja Bim ja määrällisesti apoptoottisten solujen käsittelyn jälkeen yksittäiset ja yhdistelmä aineita. AZD6244 tiedetään upregulate ilmentymisen Bim, BH3-vasta-proteiinia, joka johtaa mitokondrioiden reitin aktivointi ja apoptoosin, jota välittää FOXO3a [6]. Lisäksi AKT voi myös fosforyloivat FOXO3a, ja estämällä AKT saattaisi vahvistaa FOXO3a aktivointi defosforyloimalla. Huomasimme, että hoito AZD6244 yksinään johti suhteellisen maltillista yliekspressio Bim 48 tuntia. Vaikka emme havaitse on selvästi muuttunut Bim ilmaisun hoidon jälkeen MK2206, kun MK2206 yhdistettiin AZD6244, Bim ilmaus nostettava tasolle korkeampi kuin aiheuttama AZD6244 yksinään (kuvio 3B). Olemme myös havainneet, että 2-lääkeyhdistelmä johti enemmän apoptoottisia soluja kuin joko yksittäisen lääkkeen hoito yksinään. Kun yhdistetään MK2206, AZD6244 indusoiman apoptoosin kasvoi 14,4%: sta 29,8%: in A549 solulinjassa ja 6,0%: sta 27,0% vuonna H157 solulinjassa (

P

0,05, kuvio 3C). Nämä tulokset osoittavat, että MK2206 tehokkaasti parantaa AZD6244 aiheuttama aktivointi mitokondrioiden apoptoosin.

synergistinen vaikutus

in vivo

Vastaus AZD6244-MK2206 yhdistelmä hoito

in vivo

arvioitiin ihon alle kasvaimien tuotetaan injektio A549 tai H157-solujen kylkiin BALB /c-nude-hiirissä. Hiiret vakiintuneiden kylki kasvaimia yhtä suuret tilavuudet sai vehikkeliä, yhdellä AZD6244 hallinto, yksi MK2206 hallinto, tai AZD6244-MK2206 yhdistelmä. Sekä A549 ja H157 ihonalainen ksenografti hiiri malleja, jotka saivat yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 osoitti merkittävästi vähentynyt keskimääräistä kasvaimen tilavuus (135 ± 120 ja 188 ± 107 mm

3) verrattuna hiiriin sai AZD6244 yksin (848 ± 302 ja 669 ± 154 mm

3), MK2206 yksin (1497 ± 380 ja 858 ± 125 mm

3), tai kontrollikäsittely (2666 ± 275 ja 1437 ± 217 mm

3) päivällä 20 (

P

0,01 kaikkia kolmea vertailuissa, kuvio 4A). Tämä tulos osoittaa, että tukahduttaminen AKT kanssa MK2206 kasvatti A549 ja H157-solujen herkkyys AZD6244

in vivo

. Lisäksi olemme havainneet, että eläinten eloonjäämisajan olivat pidempiä ryhmissä, jotka saivat 2-lääkeyhdistelmä kuin ryhmissä, jotka saivat yhden aineen yhdisteitä tai kontrollikäsittely (kuvio 4B). Keskimääräinen elinaika eläinten käsitelty AZD6244-MK2206 yhdistelmä kasvoi merkittävästi (

P

0,01, kuva 4B). Vuonna A549 ksenograftimallia, hiiriä hoidettiin AZD6244-MK2206 oli keskimääräinen elinaika 50 d, kun taas käsitelty AZD6244 yksin, MK2206 yksin, ja valvonta ajoneuvon oli eloonjäämismediaani aikoina 32 d, 23 d, ja 17 d, vastaavasti (

P

0,01 kaikkien kolmen vertailut). Meillä oli samanlaisia ​​tuloksia H157 ksenograftimallia: mediaani eloonjäämisajasta yhdistelmähoito merkittävästi nostettu 45 d kun taas AZD6244-alone, MK2206-yksin, ja ohjaus hoidot olivat 33,5 d, 33 d, ja 26,5 d, tässä järjestyksessä (

p

0,01 kaikkien kolmen vertailut). Lisäksi, 20% H157 tuumoreita kantavaa hiirtä ja 40% A549-kasvaimen kantavien hiirten, jotka saivat yhdistelmähoitoa säilynyt viimeisen 55 d ja ei ollut kasvaimia viimeisessä havainto. Lisäksi ei ole merkittäviä eroja hiiren ruumiinpainon havaittiin neljän ryhmän jälkeen 20 d hoitoa, ja ei ollut ilmeisiä toksisuuksia lääkeaineen yhdistelmä (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 on synergistinen terapeuttinen vaikutus ihmisen keuhkosyövän solukasvua paneelissa NSCLC solulinjojen

in vitro

ja A549 ja H157-solulinjoja

vuonna vivo

.

kylki kasvaimia perustettiin nude-hiirissä ja käsiteltiin ajoneuvon AZD6244, MK2206 tai yhdistelmä AZD6244-MK2206 hoito suun kautta kahdesti päivässä ilmoitetuilla annoksilla. (A) Tuumoritilavuudet. Kaiken eroja hoitojen välillä olivat tilastollisesti merkitseviä (

P

0,001; Kruskal-Wallisin testi). Havaitsimme tilastollisesti merkittävä aika-by-hoidon vaikutuksia verrattaessa ohjaus vs A (

P

0,05); Ohjaus vs M (

P

0,05); Ohjaus vs A + M (

P

0,05); A vastaan ​​M (

P

= 0,05); A vastaan ​​A + M (

P

= 0,05) ja M vs A + M (

P

0,05) A549; Tulokset olivat samanlaisia ​​H157, paitsi että A vs. M ei ollut tilastollisesti merkittävä. (B) Survival kertaa. Kaiken eroja hoitojen välillä olivat tilastollisesti merkitseviä (

P

0,001; Log-RankTest).

Target modulaatio A549 ksenografti- hiirimallissa

farmakodynaamisella tutkimuksella neljä tuntia viimeisen annoksen jälkeen päivänä 3, eläimet lopetettiin ja tuumorit kudokset leikattiin irti ja analysoitiin p-ERK ja p-AKT immunohistokemiallisella värjäyksellä. Inhibition of p-ERK ilmentymistä havaittiin kasvainten hoidettujen hiirien AZD6244 yksin tai AZD6244-MK2206 yhdistelmä. Inhibition of p-AKT havaittiin kasvaimia käsiteltyjen hiirien MK2206 yksin tai AZD6244-MK2206 yhdistelmä (kuvio 5A). Tulokset osoittivat, että p-ERK ja p-AKT oli esti kanssa AZD6244 ja MK2206

in vivo

. Yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 voi myös estää tavoitteet tehokkaasti. TUNEL-määritys osoitti, että MK2206 parannettu AZD6244-indusoitua apoptoosia merkittävästi (

P

0,05) 2,6%: sta 11,2% ksenograftin kasvaimen kudoksessa (kuvio 5B).

xerograft hiiri mallit olivat vehikkeliä ohjaus, AZD6244 (24 mg /kg), MK2206 (6 mg /kg) tai AZD6244-MK2206 (24 mg /kg-6 mg /kg) yhdistelmä 3 päivää. Neljä tuntia viimeisen annoksen jälkeen, kasvaimet resekoitiin, kiinnitetyille ja parafiiniin upotettuja. (EN) osat analysoitiin immunohistokemiallisesti käyttäen p-ERK ja p-AKT vasta-aineita ja edustavien valokuvat tuumorisektioiden näytetään. (B) leikkeitä altistettiin TUNEL ja DAPI-värjäyksellä. Suhteellinen apoptoottiset solut määritettiin laskemalla TUNEL positiivisten solujen viidellä satunnaisesti aloilla (100-kertainen suurennus) kullekin näytteelle.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baari

, SD. *,

P

0,05 verrattuna monoterapiana hoitoja. Edustaja valokuvat tuumorisektioiden esitetään.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa raportoivat, että yhdistelmähoito MEK estäjän AZD6244 ja AKT-estäjällä MK2206 voi aiheuttaa dramaattisia synergistinen tuumorikasvun estoon

in vitro

ja

in vivo

. Aiemmin tutkimuksissa on havaittu, että vastustuskyky AZD6244 keuhkojen syöpäsoluja välittävät AKT aktivaation [5], [7]. Palautelooppiin RAS /RAF /MEK /ERK ja PI3K /AKT väyliä sai meidät oletuksen, että tukahduttaminen näiden kahden reitin voi voittaa vastustuskyvyn AZD6244 ja synergistisesti kasvua estäviä keuhkosyöpään. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että yhden aineen hoitoa joko AZD6244 tai MK2206 on vaatimaton estävä vaikutus keuhkosyöpään solulinjoissa. Koska tiettyjä geenimutaatioita voi kohdistua vastauksena näiden aineiden, myös tarkistanut mutaatiostatuksesta riippumatta BRAF, KRAS, EGFR ja PI3K näissä solulinjoissa. BRAF V600E mutaatio on raportoitu korreloivan herkkyys MEK estäjiä [8], [9] ja sitä on käytetty tärkeänä kriteerinä rekrytoida potilaita kliinisessä tutkimuksessa MEK estäjien melanoomapotilaissa. KRAS, BRAF /KRAS ja LKB /KRAS-mutaatio (t) korreloivat herkkyys MEK estäjien munasarjasyöpä [10], peräsuolen syöpä [11], ja NSCLC [12], vastaavasti. Emme kuitenkaan ei havaittu selvää korrelaatiota mutaatiosubstituoimalla ilmentyminen EGFR, BRAF, PI3KI tai KRAS ja herkkyys AZD6244 tai MK2206 on keuhkosyöpä linjat testasimme. Tämä voi johtua siitä, että erilaisia ​​vaikutuksia on mutaatiot tietyissä histologinen syöpätyyppien tai solulinjassa tiettyjä reittejä. Esimerkiksi, rinta- ja keuhkosyövän, geenin ilmentyminen liittyy ero herkkyys AZD6244 sisälsi useita geenejä, jotka eivät olleet yhteisiä molemmille histologialtaan [13]. Toinen mahdollinen selitys poikkeamasta tuloksemme ja aikaisempia tutkimuksia voi johtua eri taajuuksien geenimutaatioita eri syöpätyyppejä. Esimerkiksi, BRAF on mutatoitunut moniin syöpiin, mukaan lukien pahanlaatuisen melanooman (27-70%), papillaarinen kilpirauhassyövän (36-53%), munasarjasyöpä (noin 30%), ja peräsuolen syöpä (5-22%). Kuitenkin BRAF mutaatiot havaittiin vain 1-2% keuhkosyöpäpotilaiden. Olisi vaikea osoittaa tilastollisesti merkitseviä suhteita niin matalataajuista tapahtumia.

Tutkimus osoitti, että dual-aine AZD6244-MK2206 yhdistelmähoito osoitti synergistisen vaikutuksen kasvaimen kasvuun suhteessa kumpaakin annettaisiin erikseen. Yhtenä-aine terapia, AZD6244 oli tehoton joidenkin keuhkosyövän solulinjat (kuten Calu-1, H460, ja H661). Kuitenkin, kun yhdistetään MK2206, nämä kestävät solulinjat olivat herkkiä yhdistelmähoitoon. Mukaan Chou-Talalay menetelmillä [14], käytettiin kiinteän lääkeaineen suhde testata synergistinen vaikutus. Kliinisissä tutkimuksissa yhdistelmähoito annetaan potilaille toistuvia 28-d jaksoissa. Suunniteltu aloitusannos MK2206 on 45 mg /kg joka toinen päivä (korkein kerran joka toinen päivä annos MK2206 on 45 mg /kg) tai 90 mg /kg kerran viikossa ja lisäämällä niin paljon kuin 250 mg /kg kerran viikossa ; suunniteltu aloitusannos AZD6244 on 75 mg /kg kaksi kertaa päivässä (https://clinicaltrials.gov/). Valitsimme lääkeaineen suhde 05:01 AZD6244:MK2206 joka on tällä alueella meidän alustavan tutkimuksen

in vitro

. Tuloksemme osoittivat, että AZD6244:MK2206 voi aiheuttaa synergistisiä vaikutuksia joukossa 89% solulinjoissa. Saadakseen enemmän kvantitatiivista analyysiä, laajensimme lääkeaineen suhde tunnistaa tehokkain alue sekä optimaalinen synergistinen suhde. Olemme havainneet, että nämä kaksi lääkkeet osoittivat johdonmukaisesti synergistisiä vaikutuksia 08:01, 04:01, ja 02:01 suhde AZD6244 ja MK2206, kun taas vähentämään tätä suhdetta 1:08 johtivat synergian ja läsnäolo vain additiivisten vaikutusten tai jopa antagonismia useimmissa solulinjoissa. Otimme kaksi KRAS muuntunut solulinjoista, A549 ja H157, edelleen vaikutuksen tutkimiseksi AZD6244-MK2206 yhdistelmä

in vivo

. Kasvaimen kasvu inhiboitui merkitsevästi yhdistelmähoidon verrattuna monoterapiana hoitoon. Farmakodynaamisten vaikutusten A549 xerografts osoitti, että ilmentymistaso p-ERK ja p-AKT tukahdutettiin riittävästi AZD6244 ja MK2206 vastaavasti. Yhdistelmä AZD6244 ja MK2206 estämällä sekä p-ERK ja p-AKT tehokkaasti. TUNEL testi osoitti, että yhdistelmä indusoi paljon enemmän tuumorisolujen apoptoosin kuin sellaisia ​​lääkkeitä. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että AZD6244 ja MK2206 synergistisesti indusoivat apoptoosin dual inhibition ERK- ja AKT-fosforylaation.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että onko syöpälääke yhdistelmä synergistisesti vuorovaikutuksessa tai antagonistisesti voi riippua suhde yhdistetyn aineet [15 ], [16]. Puutteellinen valvonta huumeiden suhteet vuoksi koordinoimatonta mekanismien tai farmakokinetiikkaa voisi siten johtaa lääkeresistenssi jos kasvainsolut altistetaan antagonistisia huumeiden suhteet. On mahdollista, että tarkka suhde on kuvattu

in vitro

ei ehkä saavuteta kasvaimen potilaan johtuen ero jakeluun ja aineenvaihduntaa näiden kahden yhdisteen. Kuitenkin olemme huomanneet, että synergiavaikutuksen tapahtuivat laajan lääkeainepitoisuudet ja onkin todennäköistä, että terapeuttinen vaikutus saavutetaan.

mekaanistetulle ja

in vivo

tutkimuksissa käytimme A549 ja H157 solulinjat koska molemmat satama KRAS mutaatioita. Mutaatiot KRAS on löytynyt 20%: sta 30% keuhkosyövässä ja uskotaan avainasemassa tässä maligniteetti [17].