Krooninen sairaus

tiivistelmä

immunoterapia perustuu luonnon tappaja (NK) solun infuusiot on potentiaalinen adjuvantti hoito moniin syöpiin. Tällainen terapeuttinen käyttö ihmisillä vaatii suuria määriä toiminnallisia NK-solujen, jotka on valittu ja laajentaa käyttämällä kliinisen laadun protokollia. Olemme perustaneet erittäin tehokas sytokiinia perustuvan kulttuurin järjestelmä

ex vivo

laajentaminen NK solujen hematopoieettisten kanta- ja progenitorisolujen napanuoran verestä (UCB). Systemaattinen jalostaminen kaksivaiheinen järjestelmä käyttämällä uutta kliinistä laatua keskipitkällä johti terapeuttisesti sovellettavissa soluviljelmässä protokollaa. CD56

+ CD3

– NK-solujen tuotteet voidaan rutiininomaisesti syntyvät juuri valittu CD34

+ UCB solujen keskimääräinen laajentamista 15000 kertaiseksi ja lähes 100% puhtaus. Lisäksi meidän protokolla on kyky tuottaa yli 3-log NK-solujen laajennusta jäädytetty CD34

+ UCB-soluissa. Nämä

ex vivo

-muodostunutta solu tuotteet sisältävät NK solualaryhmiä differentiaalisesti ilmentävät NKG2A ja tappaja immunoglobuliinin kaltaisia ​​reseptoreita. Lisäksi UCB johdettu CD56

+ NK-solujen tuottamat meidän protokollan tasaisesti ilmentävät korkeita aktivoivan NKG2D ja luonnon sytotoksisuutta reseptoreihin. Toiminnallinen analyysi osoitti, että nämä

ex vivo

-muodostunutta NK-solujen tehokkaasti kohdistaa myelooinen leukemia ja melanooma kasvainsolulinjoja, ja välittävät sytolyysin ensisijaisen leukemiasolujen alhaisilla NK-kohde-suhteilla. Kulttuurimme järjestelmä on esimerkki läpimurtoa tuottamaan puhdasta NK-solujen tuotteita rajoitettu määrä CD34

+ solujen syövän immunoterapiaa.

Citation: Spanholtz J, Tordoir M, Eissens D, Preijers F, van der Meer A, Joosten I, et ai. (2010) Korkea Log laajennusvaiheen Functional Human Natural Killer solut napanuoraverestä CD34-positiivisia soluja varten Adoptive Cancer immunoterapia. PLoS ONE 5 (2): e9221. doi: 10,1371 /journal.pone.0009221

Editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Julkinen de la Santé (CRP-Santé), Luxemburg

vastaanotettu 16. lokakuuta 2009; Hyväksytty: 21. 2010 Julkaistu: 15 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Spanholtz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai taloudellista tukea Radboudin yliopisto Medical Centre ja Glycostem Therapeutics. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Työ liittyy GBGM® väline ex-vivo sukupolven NK-solujen, joka on kaupallisesti saatavilla soluviljelyalustaa aiemmin kehittänyt Glycostem Therapeutics. Osto ja /tai käyttöä GBGM® väliaineen ei rajoita patenttioikeuksia. Glycostem Therapeutics on toiminut sponsori on osa tätä tutkimusta. Tekijät Spanholtz ja Tordoir ovat työntekijöitä Glycostem, tieteellisesti ohjannut Dolstra. Korvaus Dolstra osallistumisesta tässä projektissa maksaa Glycostem yleiseen tutkimuksen talousarvion RUNMC. RUNMC ja Glycostem yhteistyötä pohjalta tutkimusyhteistyö- sopimus, joka säätelee edellä etuja. Kumpikaan Dolstra eikä RUNMC on taloudellisia etuja Glycostem. Kaikki kirjoittajat vahvistavat, että tämä ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille. Kirjoittajat sopivat vapaasti tarjota kaikki materiaalit ja tiedot liittyvät niiden julkaisemista, jotka kohtuudella pyytämät varten muut akateemisen, ei-kaupallinen tutkimus.

Johdanto

Natural Killer (NK) solut ovat CD56

+ CD3

– suuri rakeinen lymfosyyttejä, jotka kohdistavat synnynnäisen immuniteetin virusinfektioita ja syöpää [1]. NK-solut tunnistavat ja myöhemmin reagoida virus-tartunnan ja transformoidut solut ilman edeltävää immunisaatiota, pohjimmiltaan kautta tasapaino signaalien estävä ja aktivoimalla reseptoreita [2]. Näin ollen NK-solut on aikaisemmin kuvattu lupaavana efektoreina adoptiiviseen immunoterapiaan syöpää vastaan ​​[3]. Anti-kasvain potentiaali NK-solujen on paras osoittanut hoidon aikana leukemian potilailla allogeenisen kantasolusiirron (SCT). Ruggeri et ai. osoittivat, että NK-solujen alloreactivity voi ohjata uusiutumisen akuutin myelooisen leukemian (AML) aiheuttamatta Käänteishyljintä (GVHD), jos havaitaan HLA-paritonta haploidentical allogeeniseen SCT [4]. Lisäksi haploidentical NK-solujen infuusiota yhdessä IL-2 ei-elinsiirron asetus on yhdistetty täydellisen hematologisen remission huono-ennusteen potilailla, joilla on AML [5]. Nämä rohkaisevia tuloksia huomauttaa, että allogeeninen NK-solujen immunoterapian saattaa olla lupaava terapeuttinen strategia AML sekä ei-elinsiirtoa ja elinsiirron asetus [5], [6].

Tähän mennessä suurin osa kliinisistä tutkimuksia hyödyntämällä allogeenisia NK-solujen adoptiivista immunoterapiaa ole tehty NK-solujen valittu leukafereesejä tuotteiden immunomagneettisia palloja valintaohjelmat [7] – [12]. Kiertämiseksi rajoituksia solujen määrä, puhtaus ja aktiivisuudesta kuten verestä peräisin NK-solut,

ex vivo

laajentamista NK-solujen, joilla on korkeampi puhtausaste helpottaa infuusiona suurempi määrä aktivoitua NK-solujen potilailla, joilla on suhteellisen suuri kasvain taakka tai sallii useita NK-solun infuusioiden [8], [13], [14]. Siksi innovatiivisten strategioiden mahdollistaa sukupolven kliinisesti merkittäviä NK-solujen tuotteiden korkea solujen määrä, korkea puhtaus ja toimivuus lupaa läpimurtoa NK-solujen immunoterapian.

Tässä tutkimuksessa kehitimme sytokiini- perustuva menetelmä suuren mittakaavan laajentamiseen toiminnallinen CD56

+ NK-solujen hematopoieettisten kantasolujen ja progenitorisolujen. Samanlaisia ​​tutkimuksia ei ole tehty aiemmin keskittyen joko CD34

+ hematopoieettisten kantasolujen (HPC) luuytimestä (BM) tai napanuoran verestä (UCB) [15] – [17]. Kuitenkin useimmat näistä kulttuurin järjestelmät eivät sovellu kliiniseen käyttöön, koska käytön eläinten seerumeista, eläinperäiset proteiinit ja tukeva syöttölaite solulinjat. Lisäksi useimmat näistä menetelmistä saatiin vain rajallinen NK-solujen määrä onnistuneen adoptiivista immunoterapiaa syöpäpotilailla. Jotta voittaa nämä puutteet, loimme kaksivaiheinen kulttuuri järjestelmä, jossa käytimme uutta kliinistä laatua keskipitkällä tuottaa yli 3-4-log taitettava laajennettu toiminnallinen CD56

+ NK-solujen vasta valittu tai kylmäsäilytetyt CD34

+ UCB-soluissa, vastaavasti. CD56

+ NK-solujen tuotteita tuotetaan tällä menetelmällä on hyvin suuri puhtaus, sisältävät erilaisia ​​NKG2A ja tappaja immunoglobuliinin kaltaista reseptoria (KIR) ilmentävät kypsää osajoukkoja ja tehokkaasti hajottamaan AML ja kiinteän kasvaimen soluihin. Nämä havainnot ovat esimerkkejä, että tämä kulttuuri järjestelmä voisi hyvin lupaavilta, että

ex vivo

sukupolven kliinisen laadun NK-solujen tuotteita cellular immunoterapiaa syöpää vastaan.

Tulokset

ex vivo

kantasolujen laajennus ja NK-solujen erilaistumisen

tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää tehokas sytokiinia-pohjainen

ex vivo

kulttuurin järjestelmän laajentamiseen CD34

+ solut seurasi myöhemmin log-asteikko sukupolven CD56

+ CD3

– NK-solujen. Löytää sopiva väliaine kliiniseen sovellettavissa laajentamiseen ja erilaistumista NK-solujen, testasimme eri pohjapinta materiaalille kaksivaiheista

in vitro

erilaistumiseen järjestelmään (kuva 1). Aluksi vertasimme media H3000, Stemline I ja Stemline II kylvö 1 x 10

4 CD34

+ soluihin käyttäen menetelmää I. Olemme havainneet voimakasta kasvua CD34

+ solujen määrä kaikissa kolmessa väliaineessa, tuloksena in keskimääräinen kasvuvauhtimme kaikissa kokeissa (n = 15) 48 ± 7-kertaiseksi ja 78 ± 27 kertaiseksi jälkeen 1 ja 2 viikon kulttuurin, vastaavasti. Kokonaissolutiheys laajennus liittyi asteittainen väheneminen taajuuden CD34

+ soluja 84% ± 16% päivänä 0 till 47% ± 14% viikolla 1 ja 17% ± 9% viikolla 2 (Kuva S1a ja S1B).

Menetelmä I-III erilaisia ​​yhdistelmiä sytokiinien testattiin, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti materiaalit ja menetelmät alkavat eri määrä aluksi kylvetään CD34

+ solut. Menetelmässä I ja II, NK-solut syntyvät juuri valitun UCB luovuttajien ja kulttuuri kesto 5 viikkoa. Menetelmässä III, CD34

+ soluja käytetty kylmäsäilytetyt UCB luovuttajien ja kulttuuri aikana oli 6 viikon ajan. Lopuksi kaavio kuvaa joka NK tuotteita käytettiin ja näytetään tulokset lukuina ja täydentävää materiaalia.

Seuraavaksi tutkimme, onko laajennettu UCB johdettu CD34

+ solut pystyivät erilaistumaan CD56

+ NK-soluissa. Eriyttäminen askel seurattiin analyysiin solun pinnan molekyylejä CD34, CD117, CD56, CD94 ja CD161, jotka on kuvattu ilmaistaan ​​eri ihmisen NK-solujen kehitysvaiheet

in vivo

[18]. Havaitsimme 3 viikon kuluttua yhteensä kulttuurin kesto että prosenttiosuus CD34

+ soluja edelleen väheni, kun taas CD56

+ CD161

+ CD94

+ NK-solujen populaatio kasvoi 10-18% (esim kuva 2a). Sen jälkeen väestö CD56

+ CD161

+ CD94

+ solujen nopeasti nousi 60-77% 4 viikon kuluttua ja 80-96% 5 viikon viljelyn (esim kuva 2a).

CD34-rikastettu UCB-soluja laajennettiin kahden viikon ajan käyttäen kolmea eri median (H3000, Stemline I ja Stemline II) ja sen jälkeen erilaistuneet NK-solujen lisäksi kolme viikkoa samassa peruselatusaineessa käyttäen menetelmää I (katso kuva 1). Soluviljelyt viikoittain analysoitiin solujen määrä ja fenotyypin avulla FCM. (A) Havaintoesimerkki antigeenin ilmentymisen aikana kaksivaiheisen kulttuuri aikana käyttäen H3000 väliaineessa. Viikko alkamisen jälkeen NK solujen erilaistumisen vaiheessa 2 (eli 3 viikon kuluttua yhteensä kulttuuri kesto) CD56

+ CD161

+ CD94

+ NK solupopulaation nousee ja saavuttaa erittäin puhdasta 3 viikon eriyttämisen (eli viikko 5). (B) keskimääräinen CD56

+ solun taajuuden aikana 5 viikkoa kulttuuri ajan kolmelle eri medioihin, jotka on testattu rinnakkain kokeellisesti 3-6 UCB luovuttajia. (C) keskimääräinen koko CD56

+ NK-solujen määrä kuluttua ensimmäisestä kylvämisen 1 x 10

4 CD34

+ UCB-solujen aikana 5 viikon kulttuurin käyttäen menetelmää I. Data edustaa teoreettisia laskelmia perustuu todelliseen laajentamiseen hinnat CD56

+ soluja. Kokonaissaanto CD56

+ solujen viikoittain laskettiin kertomalla laajeneminen viikossa lukumäärän kanssa soluviljelmässä. (D) keskimääräinen kertainen laajeneminen koko solujen jälkeen alkuperäisen kylvämisen 1 x 10

4 CD34

+ UCB-solujen aikana 5 viikon kulttuurin käyttäen menetelmää I. Data edustaa teoreettisia laskelmia perustuu todelliseen laajentamiseen hinnat kaikista soluista .

Vaikka emme voi havaita merkittäviä eroja eri pohjapinta media, puhtaus CD56

+ cell tuote oli hieman korkeampi H3000 väliaineen (77% ± 24%; n = 3 ) ja Stemline I keskipitkän (75% ± 21%, n = 6) verrattuna Stemline II väliaineessa (66% ± 17%, n = 6) (kuvio 2b). Lisäksi suuntaus oli kohti korkeampia CD56

+ solujen numerot Stemline I keskipitkän (alue 4 × 10

6-1,1 x 10

8 CD56

+ soluja; n = 6) ja sen jälkeen H3000 (5.2 x 10

6-5,4 x 10

7 CD56

+ soluja; n = 3) ja Stemline II keskipitkän (alue 1 x 10

6-2 x 10

7 CD56

+ -solut; n = 6) (kuvio 2c). Keskimääräinen koko solun laajentamisen jälkeen 5 viikon kulttuurin Stemline I keskipitkän oli ~4,400-kertainen ja H3000 keskipitkän ~3,200-kertaiseksi, mutta vain ~850-kertainen laajennus Stemline II (kuva 2d). Nämä tulokset osoittavat, että viljelyolosuhteet rahoitus tehokkaan seuraus CD56

+ NK-solujen kanssa erittäin puhdasta lopullisen NK-solujen tuote kuluttua viljelmäaikaa 5 viikon erilaisilla -peruselatusaineessa.

Superior laajentaminen erittäin Puhdas NK Cell Tuotteet saatiin aikaan käyttämällä Novel Clinical Grade Medium

Vaikka korkeat laajeneminen hinnat ja puhtaudet voitaisiin saada myynnissä olevat -peruselatusaineessa, emme olleet tyytyväisiä puhtauden CD56

+ NK solutuotteen seuraavat 5 viikkoa kulttuurin käyttäen menetelmää I (kuvio 1). Edelleen lisätä tehokkuutta kulttuurimme menetelmän, testasimme äskettäin muotoiltu seerumittomassa väliaineessa, nimetty Glycostem Basal Growth Medium (GBGM®), joka on tuotettu GMP-olosuhteissa ja sopivia kliinisiä sovelluksia. Lisäksi olemme hieman säätää sytokiini testin aikana laajentamisen vaiheen, koska havaitsimme, että laajentuminen CD34

+ solujen sekä kokonaisia ​​soluja oli merkittävintä ensimmäisen viikon aikana kulttuurin (kuva S1a ja S1c). Lisäksi lisätä balanssia laajeneminen NK-solujen esiasteita lisäsimme IL-15 sijasta TPO laajentamiseen väliaineen päivästä 9 kulttuurin, ja jättää pois Flt3L erilaistumiseen väliaineessa (kuva 1). Käyttämällä tätä muutettu Method II, kulttuurin GBGM® johti korkeimmat solun laajentamisen ensimmäisen viikon aikana ja sen jälkeen erilaistuminen CD56

+ NK-solut (kuva 3 ja kuva S1E). Kokonaissolutiheys laajeneminen kurssi GBGM® nousi 15000 kertaiseksi (vaihteluväli 16,991-73,666; n = 3) (kuvio 3a). Vielä tärkeämpää on,

ex vivo

sukupolven CD56

+ NK-solujen GBGM® tuotti merkittävästi korkeampi puhtausaste on vähintään 99% ± 1% (n = 3) verrattuna H3000 88% ± 3% (n = 3; p 0,05) ja Stemline I 63% ± 24% (n = 3; p 0,05), (kuvio 3b). Nämä tiedot osoittavat, että keksinnön mukainen modifioitu kulttuuri järjestelmän avulla juuri muotoiltu GBGM® väliaineessa johtaa yli 4-log laajentaminen puhdasta ihmisen NK-solujen vasta valittu CD34

+ UCB-soluissa.

Uusi GBGM® väliaine verrattiin kahteen aiemmin testattu median NK-solun sukupolven järjestelmä menetelmän II (katso kuvio 1). Soluviljelyt viikoittain analysoitiin solujen määrä ja fenotyypin avulla FCM. (A) Taita laajentaminen koko solujen jälkeen alkuperäisen kylvämisen 1 x 10

4 CD34

+ UCB-soluissa määritettiin aikana 5 viikon kulttuurin. Data edustaa laskennan perustuu todelliseen laajentamiseen hinnat kaikista soluista ja näkyvät keskiarvona ± SD kolmesta eri kokeita. (B) CD56

+ solufrekvenssit erilaistumisen aikana vaiheessa kolme erilaista mediaa, joka on testattu rinnakkain kokeita kolmella UCB luovuttajia. Tiedot on esitetty keskiarvona ± SD. * Tarkoittaa p-arvo 0,05.

fenotyyppinen profiili CD56

+ NK peräisin olevia soluja Laajennetut CD34

+ Solut

Virtaussytometrinen analyysi paljasti, että

ex vivo

-muodostunutta NK-solujen jälkeen 5 viikkoa viljelyn sisälsi homogeenisen solupopulaation näytetään korkean ilmentymisen CD56 puuttuessa CD3 (kuvio 4a). Korkea esiintymistiheyttä CD56

+ CD3

– NK solupopulaation näkyy ilmentymisen CD94, kun taas vain rajalliset oli positiivinen CD16. Lisäksi NK-solujen tuotteet näkyvät homogeeninen ja suhteellisen korkea ilmentyminen NKG2D ja luonnollisen sytotoksisuus reseptorit (NCR) NKp30, NKp44 ja NKp46, kun taas NKG2A oli enemmän ilmentyvät eri (Kuva 4b ja Kuva S2a). Lisäksi nämä havainnot havaitsimme korkeita ilmentymisen 2B4 (CD244) ja NKR-P1 (CD161) tyypillisinä NK-solun reseptorien, kun taas NKG2C ja NKp80 olivat poissa tai ilmaista suhteellisen alhaisella tasolla. Lisäksi havaitsimme korkeita MHC-luokan I (HLA-ABC) ja sytokiinireseptorin ketjut IL-2 ja IL-15 (CD122; IL-2 /IL-15Rβ) ja SCF (CD117, c-kit-R) , jotka ovat tärkeitä NK-solujen erilaistumista, laajentamista ja aktivointi.

(a) virtaussytometrianalyysin edustavasta NK-solujen tuote tuotetaan CD34

+ UCB esisolut. Solut 5 viikon viljelyn analysoitiin ilmentymisen CD56, CD3, CD94 ja CD16. (B) ilmentäminen valikoimaa reseptorien tärkeitä säätelemiseksi NK-solujen aktiivisuutta, kuten C-tyypin lektiini reseptorien luonnollisia sytotoksisuus reseptorit ja sytokiinien reseptoreihin. Histogrammit esittävät antigeenin ilmentymistä kohteisiin (musta histogrammi) verrattuna tietyn isotyyppikontrolli (harmaa histogrammi). (C) hankinta KIR

+ NK-solujen alaryhmiä aikana

ex vivo

NK-solujen tuottaminen laajennettu CD34

+ UCB-soluissa. KIR ilmentyminen määritettiin viikolla 4 ja 5 erilaistumisen aikana askel FCM.

KIR ohjelmistoon analyysi osoitti merkittäviä tilakohtaisia ​​eroja taajuutta KIR ilmentävien NK solualaryhmiä eri UCB luovuttajia. KIR

+ NK-solujen alaryhmiä voitiin jo havaita viikolla 4 kulttuurin ja pysyi suhteellisen vakaana loppuun kulttuurin ajankohtaan viikolla 5 (kuvio 4c ja kuva S2b). Vaikka jotkut CD56

+ NK-solujen tuotteita, jotka sisältyvät positiiviset solut kaikkien neljän KIR fenotyypit analysoitiin (kuvio 4c), toiset nimenomaan puuttui KIR2DL1 /DS1

+ osajoukko (kuvio S2b). Yleensä KIR2DL2 /DL3 /DS2

+ osajoukko oli läsnä suurempi osuus kaikkien NK-solujen tuotteet analysoidaan toistaiseksi, mikä on yhtäpitävä aikaisempien havaintojen kanssa elpymisen KIR2DL2 /DL3 /DS2

+ NK-solujen on nopeampi verrattuna KIR2DL1 /DS1

+ osajoukko seuraavat HSCT [19].

Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että UCB johdettuja NK-solujen tuottamista optimoidulla kulttuurin vaikutuksesta sisältävät kehityksellisesti kypsä NK solupopulaatioiden ilmentävien NKG2A , KIR ja erilaiset aktivoivat reseptoreita.

Ex vivo

-muodostunutta CD56

+ KIR

+ ja CD56

+ NKG2A

+ NK solut Toiminnallisesti säätelemä MHC-luokka I Expression

fenotyyppianalyysillä osoitti, että meidän

ex vivo

-muodostunutta NK-solujen sisältämiä tuotteita jopa 10% CD56

+ KIR

+ solujen ja suuri osa (40 -60%) CD56

+ NKG2A

+ soluja. Määrittämiseksi sytolyyttinen aktiivisuus näiden osajoukkojen ja tutkia, jos tätä toimintaa säätelee ilmaistuna estävä reseptoreihin, suoritimme CD107a-pohjainen degranulaation määrityksiä käyttäen HLA-negatiivisten K562-solut ja KG1a solut, jotka ilmentävät suhteellisen korkeita HLA-ABC ja -E (katso taulukko 1). Näitä kokeita varten käytimme kaksi

ex vivo

-muodostunutta NK-solujen tuotteita, jotka sisälsivät noin 15-30% CD56

+ CD107a

+ solujen upon rinnakkaisviljelemällä K562 (kuvat 5 ja S3 ). Sen sijaan, KG1a solut tuskin stimuloitiin jyvästen häviämistä näiden NK-solujen tuotteita, mikä osoittaa, että sytolyyttisen aktiivisuuden inhiboi HLA ilmaisua. Vastaavasti noin 35% CD56

+ KIR2DL2 /DL3

+ osajoukko degranulated kun liipaisu K562, kun taas vain pieni osa (alle 5%) ilmaistuna CD107a seuraavat rinnakkaisviljelemällä KG1a (Kuvio 5a ja kuvio S3). Suostumuksella nämä tulokset, degranulaatio jonka CD56

+ KIR2DL2 /DL3

+ osajoukko olisi erityisesti inhiboida K562-solut, jotka oli transfektoitu HLA-C ryhmä 1 alleeli HLA-Cw3, kun transfektio HLA-C-ryhmän 2 alleeli HLA-CW4 alleeli ollut vaikutusta (kuva S4). Lopuksi, havaitsimme, että myös hallitseva CD56

+ NKG2A

+ osajoukko pystyi tehokkaasti degranulate vastauksena K562 (28% CD107a

+ solut), kun taas degranulaatio kohti KG1a oli alhainen johtunee suhteellisen korkea HLA-E-molekyylejä (kuvio 5b ja taulukko 1). Nämä tiedot osoittavat, että KIR

+ ja NKG2A

+ osajoukkoja sisällä UCB johdettujen NK-solujen tuotteet ovat täysin reagoivat välittävät voimakasta väistyviä toimintaa, joka säätelee MHC-luokan I molekyylien on mukana kohdesoluihin.

Ex vivo

-muodostunutta NK-soluissa käyttäen menetelmää II GBGM inkuboitiin yksin tai 18 tuntia MHC-luokan I-negatiivinen K562 tai MHC-luokan I-ilmentävien KG1a solujen klo E:T suhde 1:01. Sitten solut värjättiin CD56, CD3, KIR tai NKG2A, ja degranulaation antigeenin CD107a. (A) jyvästen häviäminen koko CD56

+ CD3

– NK-solujen ja KIR2DL2 /DL3

+ NK solualaryhmäksi laajennettu 5 viikon CD34

+ UCB-soluissa. Density juonet eroteltiin CD56

+ CD3

– NK-solujen ja histogrammit osoittavat CD107a degranulation että KIR2DL2 /DL3

+ NK-soluissa. (B) jyvästen häviäminen koko CD56

+ CD3

– NK-solujen ja NKG2A

+ NK solualaryhmäksi laajennettu 6 viikkoa CD34

+ UCB-soluissa. Density juonet eroteltiin CD56

+ CD3

– NK-solujen ja histogrammit osoittavat CD107a degranulation on NKG2A

+ NK-soluja.

ex vivo

-muodostunutta NK solut tehokkaasti Target Leukemia ja Solid tuumorisoluissa

määrittämiseksi sytotoksisen potentiaalin

ex vivo

-muodostunutta NK-solujen tuotteita, suoritimme virtaussytometria-pohjainen sytotoksisuus määritykset, joissa käytetään erilaisia ​​myelooinen leukemia (K562, Lama, Kasumin ja KG1a), ensisijainen AML-solujen ja kahden melanoomasolulinjoja (BLM ja FM3).

Ex vivo

-muodostunutta NK-solujen GBGM® välittämää tehokasta lyysiä K562-solujen (-40% ja ~90% sen jälkeen, kun 4 ja 24 tuntia, vastaavasti) on hyvin alhainen E:T suhde 2:01 ( kuva 6a). Lisäksi syvällinen lyysi voitiin havaita vastaan ​​MHC-luokan I-ilmentävien KG1a soluja (-20% ja -40% sen jälkeen, kun 4 ja 24 tuntia, vastaavasti). Mielenkiintoista on, että NK-solut viljeltiin GBGM® osoitti korkeampi sytotoksinen ja jyvästen häviämistä aktiivisuus verrattuna NK-solujen viljeltiin H3000 väliaineessa samasta UCB luovuttajan (kuvio S5a-c). Lisäksi olemme havainneet, että GBGM johdettu NK-solut osoittivat korkeampia ilmentymisen aktivoimiseksi reseptorien NKG2D, NKp30, NKp44 ja NKp46 (kuvio S5d).

(a) Erityiset sytotoksisuus CD56

+ NK-solujen tuote (puhtaus 98%) vasten myelooista leukemiaa solulinjat K562 ja KG1a. Spesifinen lyysi määritettiin jälkeen 4 ja 24 tuntia yhteistyön kulttuuria FCM-pohjainen sytotoksisuusmääritystä klo E:T suhteessa 02:01. Data näytetään keskimääräisenä ± SD kolmen kuopan. (B) jyvästen häviämisen CD56

+ NK-soluissa määritettiin FCM prosenttiosuutena CD107a

+ solut. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolmen kuopan. (C) IFNy-tuotanto määritettiin ELISA: lla ja kuvattu keskiarvoja ± SD kolmena kappaleena mittauksia. (D) erityiset sytotoksisuutta toisen CD56

+ NK-solujen tuote (95% puhtaus) vastaan ​​myelooista leukemiaa solulinjoissa K562, Lama, Kasumi ja KG1a ja Melanoomasolulinjojen BLM ja FM3. Spesifinen lyysi määritettiin 18 tunnin kuluttua yhteistyön kulttuuria FCM-pohjainen sytotoksisuusmääritystä klo E:T suhteessa 01:01. Data näytetään keskimääräisenä ± SD kolmesta näytteestä. (E) jyvästen häviämisen CD56

+ NK-soluissa määritettiin FCM prosenttiosuutena CD107a

+ -soluissa, sen jälkeen yön yli stimulaation eri tavoitteita. Data on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta näytteestä. (F) IFNy-tuotanto määritettiin ELISA: lla ja kuvattu keskiarvoja ± SD kolmena kappaleena mittauksia. (G) erityiset sytotoksisuutta kolmannen CD56

+ NK-solujen tuote (97%: n puhtaus) vastaan ​​ensisijainen AML soluja 5 eri potilailla. Spesifinen lyysi määritettiin jälkeen 24, 48 ja 72 tuntia yhteistyön kulttuuria FCM-pohjainen sytotoksisuusmääritystä klo E:T suhteessa 03:01. Data näytetään keskimääräisenä ± SD kolmesta näytteestä.

Lisäksi tehokkaan lyysin K562, myös leukemiasolulinjoja Lama ja Kasumin sekä BLM ja FM3 melanooma-solut hajottivat tehokkaasti, että NK-solut (kuvio 6d). Mielenkiintoista, yksinkertaisen kerroksen FM3 melanoomasolujen tuhoutui täysin tunnin kuluessa rinnakkaisviljelemällä NK-solut (Elokuva S1). Korkean NK soluvälitteistä sytolyyttistä aktiivisuutta leukemiaa ja melanoomasolulinjat liittyi suuri prosenttiosuus CD107a

+ NK-solut (kuvio 6b ja 6e) ja merkittäviä tuotanto IFNy (kuva 6c ja 6f).

Lopuksi tutkimme, ensisijainen leukemia solut ovat alttiita tappaminen jonka

ex vivo

-muodostunutta NK-soluja. Siksi teimme -sytotoksisuusmäärityksiä AML solujen viidestä eri potilailla. Ensisijainen AML-solujen kolmesta potilaasta (Pt 2, 4 ja 5) on olennaisesti tapettiin 3 päivän sisällä yhdessä viljelemisen alhaisella E:T suhde 03:01 vaikkakin vähemmän tehokkaita kuin K562-soluja (kuvio 6g). Nämä tulokset osoittavat, että UCB johdettuja NK-solujen tuottamat meidän tehokas viljelymenetelmä on kyky tappaa myelooista leukemiaa ja kiinteän kasvaimen soluihin.

Ex vivo

Generation NK Cell Tuotteet Frozen CD34

+ UCB Solut

sen tutkimiseksi, meidän NK-solujen laajentamiseen protokolla voitaisiin mukauttaa kliinisesti sovellettavasta menettelystä, olemme suorittaneet kokeita käyttämällä GBGM® väliaineessa, johon lähdimme pois LIF ja MIP-1α matala- annos sytokiinien seosta, koska nämä sytokiinit eivät ole käytettävissä kliinistä laatua. Lisäksi suoritimme nämä kokeet käyttäen CD34

+ solut valitaan sulatettu UCB menetelmän III kuviossa 1. sulatus ja CD34

+ solun valinta johti saamiseksi 1,30 ± 0,61 x 10

6 (alue 0,84 -2,50 x 10

6) CD34

+ UCB solujen kuudesta luovuttajien (taulukko 2).

Ex vivo

sukupolven käyttäen menetelmää III johti laskennalliseen NK-solujen saanto on 4,6 ± 2,4 x 10

9 (vaihteluväli 1,9-7,8 x 10

9) NK-solut ja sen puhtaus on 95 % sen jälkeen 6 viikkoa viljelyn (taulukko 2). Laajennus vaihteli välillä 1500 ja 6500 fold alkaen CD34

+ soluja kylmäsäilytetyt UCB. Nämä tiedot osoittavat, että siirto meidän kuvattua menettelyä kliininen sovellettavat edellytykset on toteutettavissa, ja tuottaa puhdasta NK-solujen tuotteita, joiden yli 3-log kasvumahdollisuudet.

Keskustelu

Täällä me raportoimme uusi ja erittäin voimakkaat kaksivaiheinen kulttuuri menetelmä

ex vivo

sukupolven toiminnallisia NK-solujen kliiniseen käyttöön hoidettaessa potilaita, joilla AML ja muiden pahanlaatuisten kasvainten. Me käyttöön uuden kliinisen laadun Peruselatusaineen, nimetty GBGM®, mikä helpottaa tehokasta

ex vivo

HPC ja NK-solujen laajennuksia. Meidän menetelmä mahdollistaa sukupolven toiminnallinen ihmisen NK-solujen yli 4-lokit CD34

+ soluja rikastetaan juuri otettu UCB yksikköä ja yli 3-log pakastetusta UCB. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että ihmisen CD56

+ NK-solut voidaan tehokkaasti syntyy

ex vivo

niin suuria log-asteikon suuruus.

Vastaavat tutkimukset ovat raportoitu aiemmin käyttämällä erilaisia ​​yhdistelmiä sytokiinien kanssa tai ilman syöttölaite solulinjojen ja käyttöä eläinten ja ihmisten seerumit [15] – [17], [20] – [24]. Esimerkiksi tuore tutkimus Kao et al. osoittivat, että seerumivapaassa laajennettu CD34

+ soluja voitaisiin eriyttää osaksi NK-solujen tuote, jonka keskimääräinen puhtaus on 40% -60% 5-7 viikon viljelyn. He pääsivät Laskettu keskiarvo laajeneminen nopeudella 300-kertainen, mutta käytetty sikiön seerumia aikana NK-solujen sukupolvi vaiheessa [16]. Niihin verrattuna äskettäin julkaistujen tietojen, meidän uusi kulttuuri järjestelmä erittäin lupaava, johtavat yli 3-log-asteikko

ex vivo

sukupolven NK-solujen tuotteita lähes 100%: n puhtaudella käyttäen kliinistä laatua keskitason, ihmisen seerumin, ja sytokiineja. Ainoat sytokiineja, jotka ovat tällä hetkellä tai lähitulevaisuudessa ole käytettävissä kliinistä reagensseja ovat LIF ja MIP-1α, jotka ovat osa pieniannoksisilla tukeva sytokiiniseoksessa. Kuitenkin kokeet, joissa käytetään CD34

+ valitaan solut kryosäilöttiin UCB paljasti, että nämä kaksi tekijää voidaan heittää pois ilman menetystä NK-solun erilaistumisen potentiaalin puhdistetut protokollan (taulukko 2). Kun korkea kasvumahdollisuudet, järjestelmämme mahdollistaa sukupolven keskimäärin 4,6 × 10

9 erittäin puhdasta NK-solut jäädytetystä CD34

+ UCB-soluissa (taulukko 2). Lisäksi alustava parannus kokeissa soluviljelmässä pussit paljasti, että vahvistettu viljelmä pystyy tuottamaan jopa 2 x 10

9 NK-solut, joilla on sama fenotyyppi ja toiminto, kuten on esitetty, että NK-solujen populaatiot tuotettiin kudosviljelylevyille (tuloksia ei ole esitetty) . Nämä havainnot osoittavat, että puhdistettu

ex vivo

laajeneminen protokolla on potentiaalia tuottaa lisää NK-solujen (eli 2 x 10

9, jonka puhtaus välillä 95-99%) verrattuna puhdistuksen kypsien NK-solut 15 litran lymphapheresis menettelyä, joka tuottaa 0,25 x 10

9 ± 0,14 x 10

9 (vaihteluväli 0,01-0,47 x 10

9) NK-solut mukaan julkaistujen tietojen McKenna et al. vuonna 2007 [7] – [12].

NK-solujen tuote luomia menetelmällä näkyvissä toistettavasti aktivoitu fenotyyppi, jolla on korkea ilmentymisen CD56 ja erilaisten aktivoivat reseptoreita, kuten NKG2D, NKp30, NKp44 ja NKp46. Linjassa aikaisempien havaintojen kanssa, meidän

ex vivo

-muodostunutta NK-soluja viljeltiin IL-2 ja IL-15 osoitti CD56

kirkas fenotyypin joista vain osa ilmaistaan ​​CD16 [20], [21], [25], [26]. Tuloksena NK-solujen tuotteita, jotka sisältyvät 40-60% CD56

+ NKG2A

+ NK-soluissa ja jopa 10% CD56

+ väestöstä ilmaistaan ​​eri Kirs, vaikka oli huomattavaa vaihtelua taajuuden KIR

+ NK-solujen alaryhmiä eri UCB luovuttajia. Mukaan NK-solun erilaistumista malli Freudin ja Caligiuri, meidän

ex vivo

-muodostunutta NK-solujen tuotteita pääasiassa sisältää kehityksellisesti kypsät NK solut, jotka ilmentävät korkeita CD94 /NKG2A, CD117 ja /tai KIR välittämällä voimakas sytolyyttinen aktiivisuus K562- [27]. Vähemmistö CD56

+ NK solujen tuotteet ovat fenotyypiltään kehittymättömät puuttuvat NKG2A ja KIR. Nämä kypsymättömiä NK-solut voivat olla mahdollisesti maturate

in vivo

seuraavissa adoptiivisen siirron. Mielenkiintoista on, Cooley et ai. ovat osoittaneet, että CD56

+ NKG2A

-KIR

– NK-solut kykenevät kypsymään

in vitro

upon viljely IL-15 ja strooman syöttölaite solulinjassa [28]. Fenotyyppianalyysillä ovat paljastaneet, että UCB johdettuja NK-solujen tuottamista meidän protokollan näyttö ilmaus sytokiinireseptorit kuten IL-2 /IL-15Rβ (CD122), joka voi edistää

in vivo

selviytyminen, laajentamiseen ja kypsyminen siirtyessään seuraavista immunosuppressiivista hoitoa.

voimakas sytotoksinen aktiivisuus meidän UCB-johdettu NK-solut vastaan ​​eri kasvainsolulinjoja sekä sytolyysin ensisijaisen AML solut näytetään spesifinen lyysi, CD107a-välitteisen degranulaation ja tuotanto IFNy. Useimmat kokeet tehtiin AML solulinjojen ja primaaristen AML-solujen, joka on osoitettu olevan houkutteleva kohde NK soluvälitteisen immunoterapia [5], [6]. Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu tehokas hajoamiseen Melanoomasolulinjojen, joka vahvistaa terapeuttista potentiaalia meidän NK-solujen tuote myös kohti ei-hematologinen syöpiä. Myös monet tutkimukset ovat osoittaneet,, että NK-solun välittämää sytotoksisuutta ja käyttö NK-solun immunoterapian voisi olla tehokas lähestymistapa melanooman hoitoon, joka on osoitettu myös vaiheen I kokeessa, jossa käytettiin NK-92-solulinja [ ,,,0],29] – [31].

Yhteenvetona, menetelmä esitetään tässä on tärkeä ennakolta tuottaa kliinisesti merkittäviä NK-solujen tuotteita hematopoieettisten kantasolujen ja progenitorisolujen korkea solujen määrä, korkea puhtaus ja toiminnallisuus käytettäväksi NK solu-pohjainen immunoterapia.