Krooninen sairaus

tiivistelmä

CD133 (prominin-1), 5-läpäisevä glykoproteiini, on viime aikoina pidetty tärkeänä merkki, joka edustaa osajoukkoa väestöstä syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja. Tässä me raportoimme eristäminen CD133-positiivisia soluja (LC-CD133

+) ja CD133-negatiiviset solut (LC-CD133

-) kudosnäytteistä kymmenestä joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (LC) ja viisi LC solulinjat. LC-CD133

+ näkyy korkeampia Oct-4 ilmaisuja kyky itse uudistaa ja voi edustaa säiliö proliferatiivista potentiaalia luoda keuhkosyövän soluja. Lisäksi LC-CD133

+, toisin kuin LC-CD133

-, erittäin koekspressoi- monilääkevaikutusyhtälöön vastustuskykyisten merkki ABCG2 ja osoitti merkittävää vastustuskykyä kemoterapeuttisten aineiden (ts sisplatiini, etoposidi, doksorubisiini ja paklitakseli) ja sädehoito. Hoito Oct-4 siRNA lentivirusvektorilla voi estettävä valmiutta LC-CD133

+ muodostaa palloja ja voi edelleen helpottaa LC-CD133

+ erilaistumaan LC-CD133

-. Lisäksi knock-down of Oct-4 ilmentymisen LC-CD133

+ voi merkittävästi estää kyvyt kasvaimen invaasion ja pesäkkeiden muodostumista, ja lisätä apoptoottista toimintaa kaspaasi 3 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP). Lopuksi

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset vahvistavat edelleen, että hoidon vaikutuksen kemosädehoito LC-CD133

+ voidaan parantaa käsittelemällä Oct-4 siRNA. Lopuksi osoitimme, että Oct-4 lauseke on keskeinen rooli ylläpitämisessä itseuudistuvien, syöpä varsi kaltainen, ja chemoradioresistant ominaisuudet LC-CD133

+. Tuleva tutkimus on perusteltua koskien sääteli ilmentyminen Oct-4 LC-CD133

+ ja pahanlaatuisen keuhkosyöpään.

Citation: Chen YC, Hsu HS, Chen YW, Tsai TH, miten CK, Wang CY, et al. (2008) Oct-4 Expression Ylläpitäjä Cancer Stem-Like Properties in Lung Cancer-Derived CD133-positiiviset solut. PLoS ONE 3 (7): e2637. doi: 10,1371 /journal.pone.0002637

Toimittaja: Ming Sinä, Washington University, Yhdysvallat

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2008; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2008; Julkaistu: 09 heinäkuu 2008

Copyright: © 2008 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tutkimusmäärärahat National Science (NSC-96-3111-B-075-001-MY3, 95-2314-B-075-055-My2, 96-2628-B-010-006-MY3, 96 -2314-B-075-024), Taipei Veterans General Hospital (V96C1-151, V96E1-004, V96ER2-016, V96E2-010), yhteinen hankkeet UTVGH (VGHUST96-P1-07), Yen-Tjing-Ling Lääketieteen säätiö, Taipei City Hospital (96001-62-014, 96001-62-018, 96002-62-092) ja National Yang-Ming University (opetusministeriö, Aim Top yliopiston Plan), Taiwan.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien kuolemien teollisuusmaissa [1], [ ,,,0],2]. Sädehoito ja kemoterapia pelata merkittävä ja ratkaiseva rooli kliinisessä anti-keuhkosyövän hoidossa saavuttaa pitkäaikainen elossaololuku [3], [4]. Kuitenkin korkea virhetaajuus ja alhainen mediaani eloonjäämismahdollisuus havaitaan potilailla, joille sädehoitoa, joilla on uusiutuva, hankala keuhkosyöpä [5]. Parantaakseen elossaololuku, tutkimus valottaa mekanismi tumorigeneesin keuhkosyöpään tarvitaan [5]. Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, että kasvaimet sisältävät pienen solujen alapopulaation, eli syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja (CSCS) tai syöpä-aloitetaan solut (CIC), joka näytteille uudistuva kapasiteetti ja vastaavat kasvaimen huolto- ja etäpesäkkeiden [6] . Kantasoluja on eristetty niiden kyky pumpata Hoechst 33342 väriainetta ja niitä kutsutaan nimellä ”puolella väestöstä (SP)” [7]. Ho ja työtovereiden eristetty ja karakterisoitu SP-soluissa kuudelta ihmisen keuhkosyövän solulinjat ja osoittaneet, että kohonnut ilmentyminen ABCG2 sekä muita ATP-sitova kasetti kuljettajat korreloivat positiivisesti resistenssi useita kemoterapeuttisia lääkkeitä [8]. Lisäksi Gutova ja kollegat ovat puhdistettu uPAR-positiivisten CSCS kolmesta keuhkosyövän solulinjat. Nämä uPAR-positiivisten solujen koekspressoitiin CD44 ja MDR1, ja oli kyky edistää edenneen taudin ja chemoresistance [9].

CD133 (prominin-1), 5-läpäisevä glykoproteiini, todettiin ensimmäisen kerran CD34

+ kantaisä väestöä aikuisten verestä, luuytimestä, ja sikiön maksasoluissa [10]. Äskettäin CD133 on pidetty tärkeänä merkki edustaa osajoukkoa väestö CSCS leukemia, aivokasvaimet, retinoblastooma, munuaisten kasvaimet, haiman kasvaimet, paksusuolen syöpä, eturauhasen syöpä, ja maksasyövän [11] – [19]. Perustuen immunohistokemiallinen havaintojen Hilbe ja työtovereiden ehdotti, että CD133-positiivinen (CD133

+) progenitorisolujen rooli kehittämisessä kasvaimen verisuoniston potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [20]. Viime aikoina hyvin suunniteltu tutkimus Eramo ja kollegat osoittivat, että keuhkosyöpä sisältää asukkaan CD133

+ CSCS pystyy itse uudistaa ja tuottaa rajattoman jälkeläisiä ei-tuumorigeenisiä soluja. Nämä CD133

+ solut ovat resistenttejä myös tavanomaisen kemoterapian [21]. Kuitenkin geeni sääntelymekanismeja ylläpitämisessä itseuudistumisen ja lääkkeille vastustuskykyisiä ominaisuuksia otaksuttu syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja keuhkotuumoreiden ovat vielä epäselviä.

Oct-4, jäsen perheen POU-domain transkriptiotekijät, ilmaistaan ​​alkion pluripotenttien (ES) ja sukusolujen [22] – [23]. Oct-4 mRNA löytyy yleensä Totipotenttien ja pluripotenttien kantasolujen pregastrulation alkioiden [24]. Tyrmäämällä

Oct-4

geeni hiirissä aiheuttaa alussa kuolleisuutta puutteen vuoksi ICM muodostumista, mikä osoittaa, että Oct-4 on kriittinen toiminto itseuudistumisen ES-solujen [25]. Oct-4 aktivoi transkription kautta oktameeriä motiiveja, ja Oct-4 sitoutumiskohtia on löydetty eri geenejä, kuten

FGF 4

(fibroblastikasvutekijä 4) ja

PDGF

α

r

(verihiutaleiden kasvutekijä α-reseptori) [26], [27]. Tämä viittaa siihen, että Oct-4 toimii pääkytkimenä erilaistumisen aikana säätelemällä pluripotenttien potentiaalit kantasolujen ja Oct-4 on keskeinen rooli nisäkkään kehittäminen [24], [25].

Tässä tutkimuksen CD133-positiiviset solut (LC-CD133

+) ja CD133-negatiiviset solut (LC-CD133

-) eristettiin kudosnäytteistä keuhkosyöpä (LC) potilaiden ja LC-solulinjat. Nämä LC-CD133

+ soluja hallussaan molemmat ominaisuudet kantasolujen kaltaisia ​​soluja ja pahanlaatuisia kasvaimia. Tuloksemme osoittivat lisäksi, että Oct-4 ilmentymisen LC-CD133

+ on mukana kasvain pahanlaatuisuuden keuhkosyövässä ja osoittaa tulenkestävät ominaisuudet kemosädehoito syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus Oct-4 on keskeinen rooli ylläpitää syövän varsi kaltaiset ja chemoradioresistant ominaisuudet keuhkosyöpä johdettu CD133

+ solut.

Materiaalit ja menetelmät

eristäminen CD133

+ solualaryhmäksi

Tämä tutkimus seurasi opinkappaleisiin Helsingin julistuksen ja kaikki näytteet saatiin, kun potilaille tarjotaan tietoon perustuvan suostumuksen. Tutkimuksen hyväksyi institutionaalisten eettinen komitea /Institutional Review Board of Taipei Veterans General Hospital. Dissosioidut solujen näytteistä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaille (taulukko 1) ja keuhkosyövän (LC) solulinjat leimattiin 1 ml CD133 /l micromagnetic helmiä kohden 1000000 soluihin käyttäen CD133 solujen eristykseen kit (Miltenyi Biotech , Auburn, CA). CD133

+ soluja viljeltiin väliaineessa, joka koostuu seerumitonta DMEM /F12 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), N2 täydennys (R Promega) ja niitä inkuboitiin vielä 1,5 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO

2. Solujen elinkelpoisuus suhteessa optinen tiheys (OD) mitattiin kolorimetristä suhteen mitokondrioita toiminnan muuntaa tetratsoliumsuolan värilliseksi liukeneva formatsaanituotetta keskipitkällä. OD-arvot mitattiin aallonpituudella 490 nm 1420 -monileimalukijaa VICTOR Wallac (PerkinElmer Wallac, Turku, Suomi).

Reaaliaikainen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR)

reaaliaikaisen RT-PCR-analyysillä, kokonais-RNA solujen uutettiin käyttäen RNA

helppo (Qiagen, Valencia, CA). Lyhyesti, kokonais-RNA (1 ug) kunkin näytteen käänteisesti transkriptoitiin 20 ui käyttäen 0,5 ug oligo-dT: n ja 200 U Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Monistus suoritettiin kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 0,5 uM kutakin aluketta, 4 mM MgCI

2, 2 ui LightCycler FastStart DNA Master SYBR vihreä I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) ja 2 ui 1: 10 laimennettu cDNA. Kvantifiointi Tuntemattomien näytteiden suoritettiin LightCycler suhteellinen kvantifiointitietokoneohjelmaa, versio 3.3 (Roche Diagnostics). Kussakin kokeessa GAPDH taloudenhoito geeni monistettiin vertailustandardina. GAPDH-alukkeet suunniteltiin: GAPDH (f): GCCAAAAGGGTCATCATC (nt 448-465, GenBank-nro. NM_002046), GAPDH (r): ATGACCTTGCCCACA GCCTT (nt 745-765), Oct-4a (f): CGCAAGCCCTCATTTCAC (nt 5- 22, GenBank ei. NM_002701), Oct-4a (r): CATCACCTCCACCACCTG (nt 98-115, GenBank ei. NM_002701). PCR-reaktiot valmistettiin kahtena kappaleena, ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 10 minuuttia, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 10 sekuntia, pariutuminen 55 ° C: ssa 5 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 20 sekunnin ajan. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena. Standard käyrät (sykli kynnysarvojen vastaan ​​templaattikonsentraation) valmistettiin kunkin kohdegeenin ja endogeenisen viite (GAPDH) kussakin näytteessä.

Immunofluoresenssivärjäys Stem Cell tussit

Avidiini-biotiini monimutkainen menetelmä käytettiin immunofluoresenssivärjäyksen on eriytetty pallomainen ja hermosolujen kaltaista solu. Lyhyesti, solut maljattiin poly-L-ornitiini-pinnoitettu lasi peitinlaseilla ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15-20 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja sitten pestiin kahdesti (10 min), 1 x PBS: llä. Solut tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 /PBS: ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten kaksi kertaa (10 min), 1 x PBS: llä. Solut blokattiin blokkausliuoksella 30 minuuttia ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (Oct-4, Chemicon, Temecula, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten pestään solut kolme kertaa (10 minuuttia kukin), 1 x PBS: llä. Immunoreaktiivisia signaaleja havaittiin seoksella, jossa oli biotinyloitua kanin anti-hiiri IgG: tä ja Fluorsave’lla (Calbiochem, San Diego, CA). Solut edelleen koetettiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) hännitetty toissijainen vasta-aineita. Fluoresenssi kuvia visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Kvantitatiivisesti analysoimaan fluoresenssin intensiteetti, kirjasimme Kuvien fluoresenssikäänteismikroskooppia varustettu CCD-kameralla. Prosenttiosuus signaalin fluoresenssi kohti valokuvattu kenttä analysoitiin kuvankäsittelyohjelmaa (Image Pro-Plus, MediaCybernetics, Inc., Silver Spring, MD).

FACS-analyysi

solunpintamarkkeria tunnistaminen , yhden solun suspensioon sixth- kahdeksas-kanavan solujen trypsinoitiin aloilla värjättiin anti-CD133, CD117 (c-Kit), tai ABCG2 ja toisen fluoreseiini (FITC) -tai fykoerytriini (PE) kanssa kytkettyä vasta-aineita (Dako, Carpinteria). Solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä ja analysoitiin BD FACSCalibur laitteessa (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).

sädehoitoa elinkykyyn Analysis

gammasäteilyä ( ionisoivaan säteilyyn, IR) oli toimittaman Theratronic kobolttikeilahoitolaitteet T-1000 (Theratronic International, Inc., Ottawa, Kanada) annoksena nopeudella 1.1Gy /min (SSD = 57.5cm). Arvioida soluproliferaation tahdilla ympättyä solua 24-kuoppalevyille tiheyteen 2 x 10

4 solua /kuoppa. Solut ympättiin 24 tuntia sen jälkeen, kun IR ja sitten ne analysoitiin methyle tiatsol tetratsolium-määritys (MTT-määritys, Sigma-Aldrich, St. Louis, MN). Määrä MTT formazon tuote määritettiin käyttäen mikrolevylukijaa, ja absorbanssi mitattiin 560 nm: ssä (SpectraMax 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

kemoterapeuttisten aineiden

sisplatiini, etoposidi (VP16), ja paklitakselin saatiin Sigma-Aldrich ja liuotettiin DMSO: hon (Sigma-Aldrich), 100 mM varastoliuosta.

in vitro

Cell Invasion analyysi ja Soft Agar Colony Pitoisuus

24-kuoppalevylle TranswellTM järjestelmässä, jossa on 8-um huokoskoon polykarbonaatti suodatinmembraanille (Corning Costar, Corning, NY) käytettiin. Suodatin kalvo päällystettiin Matrigelillä (BD Biosciences, San Diego), laimennettiin seerumittomalla alustalla ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Solususpensiot ympättiin ylempään osastoon Transwell kammion solun tiheys 1 x 10

5 100 ul: ssa seerumitonta väliainetta. 24 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja suodatin kalvo kiinnitettiin 4% formaliinilla 1 tunnin ajan. Vastakkaisen pinnan suodattimen kalvon päin alempaan kammioon värjättiin Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) 3 minuuttia, ja siirtää sitten solut visualisoitiin käännettyä mikroskooppia. Protokolla pehmeässä agarissa pesäkkeiden määritys on kuvattu seuraavasti. Kukin kuoppa (35 mm) ja kuuden hyvin viljelymaljalle päällystettiin 2 ml: lla pohja agar seosta (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,6% (w /v) agaria). Sen jälkeen, kun pohjakerros jähmettynyt, 2 ml top-agar-väliaineessa seos (DMEM, 10% (v /v) FCS: ää, 0,3% (w /v) agaria), joka sisälsi 2 x 10

4-soluja lisättiin, ja astiat olivat inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 viikkoa. Levyt värjättiin 0,5 ml 0,005% kristalliviolettia 1 tunnin ajan ja sitten preparointimikroskooppia käytettiin laskea pesäkkeiden lukumäärä [29].

Lentivirusvektorikonstruktit-välitteisen RNAi

pLVRNAi vektori ja pCDH-MCS1-EF1-copGFP vektori hankittiin Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA). Menetelmän kloonaus kaksijuosteinen shRNA sekvenssi on kuvattu valmistajan protokollaa. SiRNA-oligonukleotidi 5′-CCGGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCGAGTACAGTGC AGTGAAGTGAGGGTTTTT-3 ’kohdistaminen ihmisen Oct-4 (NM_002701, nt 1035-1055) syntetisoitiin ja kloonattiin pLVRNAi tuottaa lentiviraalinen ekspressiovektoriin. MMA-4-cDNA monistettiin ja puhdistettiin RT-PCR: llä ja kloonattiin pCDH-MCS1-EF1-copGFP vektori. Lentivirusvektorikonstruktit tuotanto tehtiin transfektoimalla 293T-solut käyttäen Lipofectamine 2000 (LF2000, Invitrogen). Supernatantit kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja sitten suodatettiin; viruksen tiitterit määritettiin sitten FACS 48 tuntia transduktion jälkeen. Subkonfluentit solut infektoitiin lentiviruksen on infektiokertoimella 5: n läsnä ollessa 8 ìg /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich).

In Vivo

analyysi Kasvaimen kasvun ja metastaasin

Kaikki toimenpiteet, joissa eläimet olivat mukaiset institutionaalisten eläinten hyvinvoinnin ohjeita Taipei Veterans General Hospital. 1000, 3000, ja 10

4 solua injektoitiin häntälaskimoon SCID-hiirten ja /tai nude-hiiret (BALB /c-kanta) kunkin aged 8 viikkoa. In vivo GFP kuvantaminen tehtiin näkyväksi ja mitattiin valaistuslaitteen (LT-9500 Illumatool TLS varustettu heräte valaiseva lähde [470 nm] ja suodatin levy [515 nm]). Kasvaimen koko mitattiin mittaharpilla ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla (pituus x leveys

2) /2. Integroitu optinen tiheys vihreän fluoresenssin intensiteetti oli kaapattu ja sitten analysoitiin Image Pro-plus ohjelmistojen [29].

Tilastollinen analyysi

Statistical Package of Social Sciences (versio 13,0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Riippumattoman Opiskelijan

t

-testi tai ANOVA käytettiin vertaamaan jatkuvia muuttujia ryhmien välillä, kun taas χ

2 testiä sovellettiin vertailun dikotomisten muuttujia. Kaplan-Meier arvio käytettiin selviytymisen analyysin ja log-rank-testiä käytettiin vertaamaan kumulatiivisen eloonjäämisen kestot eri potilasryhmissä. Taso tilastollista merkitsevyyttä asetettiin 0,05 kaikissa testeissä.

Tulokset

eristäminen ja karakterisointi Lung Cancer johdettujen CD133-positiiviset solut

Käyttämällä magneettihelmi menetelmällä, me eristetty CD133

+ solut (Fig. 1A) kudosnäytteistä kymmenen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilaille (taulukko 1) ja viisi keuhkosyöpä (LC) solulinjoja (taulukko S1). Suuri osuus (97%) CD133

+ (LC-CD133

+) osajoukko eristettiin LC kudoksissa ja vanhempien LC-solulinjassa (kuvio. 1A). On raportoitu, että syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja voidaan viljellä suspensiossa tuottaa kelluva pallomainen kaltaiset elimet (SB) alle seerumia bFGF EGR [30]. Olemme havainneet, että LC-CD133

+ eristetty näistä kymmenestä potilaasta (taulukko 1) ja viisi LC solulinjoja (taulukko S1) voi muodostaa SB DF-12 seerumittomassa väliaineessa bFGF ja EGF (Fig. 1 B, No. 1 [PLC] ja No.2 [LLC]). Lisäksi kyky muodostaa SB (Fig. 1 C) ja proliferaationopeus (Fig. 1 D) LC-CD133

+ olivat huomattavasti korkeampi kuin LC-CD133

– (p 0,05). Lisäksi määrittää

in vivo

tuumorigeenisia aktiivisuutta LC-CD133

+ ja LC-CD133

– injektoimme vastaavat määrät 1000, 3000, ja 10

4 solut häntälaskimoihin SCID hiirillä. Tulokset osoittivat, että 10

4 LC-CD133

– ei aiheuttanut kasvaimen muodostumisen mutta 3000 LC-CD133

+ päässä keuhkosyöpä kudoksia kymmenen potilasta ja viisi LC solulinjoissa ksenotransplantaatio hiirillä voidaan kaikki tuottaa näkyviä kasvaimia 4 viikkoa injektion jälkeen (taulukko 1 ja taulukko S1).

(A) käyttö on magneettinen helmi menetelmää, olemme järjestetty CD133

+ soluja kudosnäytteistä potilailla, joilla on keuhkosyöpä (LC), ja tunnettu siitä, ne FACS määrityksessä. (B) LC-CD133

+ järjestetty kahden potilaan kanssa No.1 (PLC-CD133

+) ja nro 2 (LLC-CD133

+) viljeltiin bFGF ja EGF DMEM serum- väliaineessa. (C) arviointi muodostumisen kyvyt sferoidiviljelmiä kaltaisten elinten (SB) LC-CD133

+ ja LC-CD133

– alle seerumia bFGF EGF. (D) kasvukäyrät LC-CD133

+ ja LC-CD133

– mitattiin hemosytometriin. Bar: 100 pm. Tiedot esitetään tässä ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta.

Lisääntynyt ABCG2 Expression ja invasiivinen kyky LC-CD133

+

In vitro

luonnehtivat eristetty LC-CD133

+, FACS-analyysiä käytettiin ekspression havaitsemiseksi profiilia solujen pinnan markkereita. Kuten kuviossa 2A on esitetty, suurin osa eristetyn LC-CD133

+ värjättiin korkeampia ekspressiotasoja CD133, CD117 (c-Kit), ja ABCG2 verrattuna LC-CD133

-. Tämä tulos osoitti, että eristetty LC-CD133

+ olivat lähes ABCG2-positiivisia soluja (kuvio. 2B). Arvioitava edelleen parantamiseksi kasvaimien LC-CD133

+, tutkimme

in vitro

Matrigel-yhdistetty TranswellTM hyökkäyksen ja pehmeä agar pesäkemuodostusta määrityksiä. Verrattuna LC-CD133

-, LC-CD133

+ peräisin NSCLC Potilaat No.1 (PLC) ja nro 2 (LLC) osoitti korkeampia invaasio aktiivisuus kautta Matrigel TranswellTM invaasiomääritys (

p

0,001; Fig. 2C). Samoin pesäkkeitä muodostumista kykyä LC-CD133

+ PLC: n (nro 1) ja LLC (nro 2) tehostui verrattuna LC-CD133

– Näiden kahden potilaan (

p

0,001; Fig. 2D).

(A) ja (B) ekspressio tasot CD133, CD117 (c-Kit), ja ABCG2 analysoitiin FACS määritys LC-CD133

+ ja LC-CD133

-. Valmiuksia (C) siirtyminen /invaasion ja (D) kasvainpesäkkeet (pehmeä agar siirtomaa) muodostumista LC-CD133

+ merkittävästi noussut verrattuna LC-CD133

– (*

p

0,001). Tiedot esitetään tässä ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta.

Lisääntynyt

In vivo

Kasvaimen-palauttaminen ja Proliferative Kyky LC-CD133

+

Arvioimme lisäksi

in vivo

kasvaimeen palauttaminen ja proliferatiivinen kyky LC-CD133

+ ja LC-CD133

– by ksenotransplantaatio kasvainten muodostumiseen analyysin (Fig. 3A). Neljän viikon kuluttua 10

4 solut ruiskutetaan häntälaskimoiden SCID-hiirten, merkittävä kasvu useita kyhmyt kasvainten muodostumista keuhkojen pinnalla havaittiin LC-CD133

+ – ruiskutetaan ryhmä (kuviot. 3A4 3A7), mutta ei LC-CD133

– ryhmä (Kuva. 3A1). Diffuusi infiltraatioista LC-CD133

+ alkaen keuhkoparenkyymistä alveoliluun onteloon havaittiin (kuviot. 3A5, 3A6 ja 3A8). Histologinen tutkimus osoitti, että näkyvä uudissuonittumista ja trombin muodostumisen havaittiin keuhkojen parenkyymiin LC-CD133

+ – injektoitiin SCID-hiirten (kuvio. 3A9). Sen sijaan ei ole merkittävää kasvainpesäkkeitä tai neovaskulaarinen muodostuminen havaittiin keuhkoissa LC-CD133

– injektoitiin SCID-hiirten (kuviot. 3A2 3A3). Tutkimme lisäksi

in vivo

kasvaimen kasvu 10

4 LC-CD133

+ soluja, 10

6 LC-CD133

– soluja, ja 5 x 10

6 emotuumorisoluille samasta potilaasta. Havainto osoitti, että kasvaimen kasvu 10

4 LC-CD133

+ ryhmä (potilailta nro 1, 2, 4 ja 7, taulukko 1) oli huomattavasti suurempi kuin 10

6 LC-CD133

– ryhmä ja 5 x 10

6 vanhempien kasvainsolu ryhmä (Fig. 3B). Lisäksi 10

4 LC-CD133

+ eristettiin sekundaarikasvaimia voi edelleen synnyttää uusia (toinen) kasvaimia istutetut SCID hiirillä. Tulokset virtaussytometrian osoitti, että suuri prosenttiosuus (60%) CD133-positiivisia soluja havaittiin toisen kasvaimen (Fig. 3C). Lisäksi, tuhat LC-CD133

+ eristetty toisesta kasvain voi myös luoda uusi (kolmas) kasvaimen transplantoitu SCID-hiirissä (Fig. 3C). Yhteenvetona voidaan todeta, meidän tulokset osoittivat, että LC-CD133

+ hetkellä itseuudistuvien ja kannan uudelleen valmiuksia sekä

in vitro

ja

in vivo

.

(EN) i

n vivo

tuumorigeenisyystesti LC-CD133

+ ja LC-CD133

– in häntälaskimoon-ruiskutetaan hiirten analysoitiin makroskooppinen ja histologinen tutkimus. A1-3: LC-CD133

-; nuolet: normaali alveolaarinen rakenne keuhko. A4-6: LC-CD133

+; nuolet: kasvaimen muodostumisen. A7-9: LC-CD133

+; nuolet: neovascularity ja tromboosi. Bar: 200 pm. (B)

in vivo

kasvaimeen palauttaminen ja proliferatiivinen kyky 10

4 LC-CD133

+, 10

5 LC-CD133

– ja 5 x 10

5 yhteensä tuumorisolut potilaasta nro 1, 2, 4 ja 7 tutkittiin ksenotransplantaatio kasvainten muodostumiseen analyysin. (C) Kasvain harvenneiden kykyä LC-CD133

+ tutkittiin siirrettyjen SCID hiirillä. Ilmentymistasojen CD133 määritettiin FACS-analyysillä primaarisesta LC-CD133

+, toinen kasvain, ja kolmas kasvain. Tiedot esitetään tässä ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta.

Tehostettu kemo- ja Säteily-resistenssi LC-CD133

+

Arvioimme usealle (kemoterapia) – kestävä kyvyt LC-CD133

+ ja LC-CD133

-. Testasimme lisäksi neljä yhteistä kemoterapia-aineiden, mukaan lukien sisplatiini, VP16 (etoposidi), doksorubisiini, paklitakseli. Verrattuna LC-CD133

-, LC-CD133

+ ovat huomattavasti kestävät neljä testattu kemoterapia-aineiden (

p

0,01; Fig. 4A). Täsmentämiseksi säteilyn vaikutusta kasvaimen kasvunopeus, käytimme ionisoivan säteilyn (IR) annos 0-10 Gy hoitoon sekä LC-CD133

+ ja LC-CD133

-. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, kun IR käsittelyn eloonjäämisaste ja useita LC-CD133

+ olivat merkittävästi korkeammat kuin LC-CD133

– (

p

0,01). Olemme lisäksi havainneet, että LC-CD133

+ soluilla on korkeampi radioresistance (

p

0,01; Fig. 4B). Lisäksi olemme tutkineet yhdistelmähoito vaikutus radiochemotherapy LC-CD133

+. Kokeet suoritettiin sisplatiinin (10 uM) yksin, VP-16 (10 uM) yksin tai yhdistettynä sisplatiinin ja VP-16 IR (2 Gy) hoidetun LC-CD133

+. Kuten kuviossa 3C, data osoitti, että solujen eloonjäämisaste IR-käsiteltyjen LC-CD133

+ ei merkittävästi vähentynyt IR hoito yhdistettynä sisplatiinin kanssa tai ilman VP-16 (

p

0,05). Päinvastoin, solujen eloonjääminen merkittävästi vähentynyt kemoterapian jälkeen sisplatiiniin yhdistettynä VP-16 IR-käsiteltyjen LC-CD133

– (

p

0,01; Fig. 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että LC-CD133

+ voi olla keskeinen rooli kasvaimen kykyä vastustaa säteilyä ja chemotherapies.

(A) Sekä 10.000 LC-CD133

+ ja LC-CD133

– maljattiin 96-kuoppalevylle ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla sisplatiinin, VP-16, doksorubisiini, paklitakseli 24 tuntia 10% FBS /DMEM /F-12-väliaineessa. Eloonjäämisaste määritettiin MTT: llä. (B) määrittämiseksi säteilyn vaikutusta kasvaimen kasvu, ionisoivan säteilyn (IR) annos 0-10 Gy käytettiin hoitoon LC-CD133

+ ja LC-CD133

-. *

p

0,01: LC-CD133

+ verrattuna LC-CD133

-. (C) yhteenlaskettu hoitoteho radiochemotherapy LC-CD133

+ ja LC-CD133

– arvioitiin edelleen. Neljä protokollat-säteily (2 Gy) ainoastaan, säteily sisplatiiniin (10 uM), säteilyn VP-16 (10 uM), ja säteily paklitakselin (10 nM) -were käytetty. *

p

0,01. Tiedot esitetään tässä ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta.

Role of Oct-4 Expression in LC-CD133

+

Microarray tulokset viittaavat siihen, ilmentymistason lokakuu -4 itseuudistumiseen ja stemness geenin LC-CD133

+ oli merkitsevästi säädelty kuin että LC-CD133

-. Validoida Tämän havainnon, tutkimme ilmentyminen Oct-4 sekä kopiointia ja translaation. Määrät Oct-4 transkriptio ja proteiini eristettyjen LC-CD133

+ (Potilaat 1 [PLC] ja No.2 [LLC]) suurenivat huomattavasti verrattiin LC-CD133

– todellisilla -aika RT-PCR: llä ja western blotting-analyysi (kuviot. 5A ja 5B). Sen tutkimiseksi, Oct-4 lauseke on rooli ylläpitämisessä itseuudistumisen tai syövän kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia LC-CD133

+, käytimme siRNA menetelmää lentivirusvektorilla varten knockdovvn Oct-4 ilmentymisen LC-CD133

+. Löysimme sen tärkeää, että hoito Oct-4 siRNA LC-CD133

+ voivat merkittävästi häiritä ominaisuuksia pallomainen kaltaisten elinten (SB) muodostuminen (

p

0,001; Kuva. 5C ). Kun 7 päivän Oct-4 siRNA hoitoa, SB LC-CD133

+ kyennyt ylläpitämään kelluva palloja mutta erilaistuneet kiinnitetty epiteelin kaltaisia ​​soluja (Kuva. 5C). Sen sijaan hoidossa ryntäily ohjaus siRNA ei vaikuttanut SB kykyä muodostaa LC-CD133

+ (Fig. 5C). SB LC-CD133

+ endogeenisesti ilmaisivat vahvan positiivisen signaalit Oct-4 ja CD133 (Fig. 5D). Lisäksi immunofluoresenssimenetelmällä tulokset osoittivat, että sekä CD133 ja Oct-4 ilmaisuja LC-CD133

+ merkittävästi tukossa 7 vuorokauden Oct-4 siRNA hoitoa (Fig. 5D). FASC määritys vahvisti, että määrä CD133 dramaattisesti vähentynyt Oct-4 siRNA-käsiteltyjen LC-CD133

+ ja prosenttiosuudet LC-CD133

– lisääntyivät merkitsevästi LC-CD133

+ 7 päivän jälkeen Oct-4 siRNA hoito (

p

0,001; Kuva. 5E). Nämä tiedot osoittivat, että Oct-4 voi pitää ominaisuudet primitiivisen kantasolujen ja estää taipumus eriyttäminen LC-CD133

+.

(A) määrät Oct-4 selostukset eristettyjen LC CD133

+ suurenivat huomattavasti verrattuna LC-CD133

– reaaliaikaisella RT-PCR-analyysit. (B) Western Blott tiedot osoittivat, että proteiini tasot Oct-4 LC-CD133

+ eristettyjen PLC ja LLC olivat myös merkittävästi voimistunut verrattuna LC-CD133

-. (C) proteiini ilmentymistä Oct-4 LC-CD133

+ kohdentuvat tehokkaasti estänyt Oct-4 siRNA. Hoito Oct-4 siRNA LC-CD133

+ voi estää ominaisuuksia SB muodostumisen ja helpottamaan edelleen SB erilaistumaan liitteenä epiteelin kaltaisia ​​soluja. Bar: 100 pm. (D) Käyttämällä immunofluoresenssivärjäyksellä, osoitimme, että proteiini ekspressiotasoja sekä Oct-4 ja CD133 LC-CD133

+ merkittävästi vähentynyt jälkeen Oct-4 siRNA hoitoa. Bar: 30 pm. (E) osuus LC-CD133

– lisääntyivät merkitsevästi Oct-4 siRNA-käsiteltyjen LC-CD133

+ FACS: lla määrityksessä. *

p

0,001. Tiedot esitetään tässä ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta.

Tehostettu Chemoradiotherapeutic Herkkyys ja apoptoottinen aktiivisuus in LC-CD133

+ käsitelty Oct-4 siRNA

lisätutkimusta rooli Oct-4 kasvaimen pahanlaatuisuuden LC-CD133

+

in vitro

, muuttoliike /invasiivisia ja pehmeä agar -pesäkemääritys käytettiin. Tulokset osoittivat, että kyvyt

in vitro

muuttavien invaasion ja pesäkkeiden muodostumista LC-CD133

+ käsitelty Oct-4 siRNA oli vähentynyt merkittävästi verrattuna hoitoa saaneilla LC-CD133

+ tai LC-CD133

+ käsitelty scramble-siRNA (kontrolli;

p

0,001; Fig. 6A). Lisäksi hoidon vaikutuksen kemosädehoito varten LC-CD133

+ ryhmä voidaan merkittävästi parantaa käsittelemällä Oct-4 siRNA verrattuna hoitoa saaneilla LC-CD133

+ tai LC-CD133

+ käsitelty by scramble-siRNA (Fig. 6B;

p

0,001). Lisäksi olemme havainneet, että apoptoottinen toiminta anneksiini V (Fig. 6C) ja kaspaasi 3 (Fig. 6D; yläosa) on nopeasti ja tehokkaasti indusoidaan LC-CD133

+ käsitelty Oct-4 siRNA 72 tunnin jälkeen . Mukaisesti tuloksena solujen selviytymistä ja hoidon vaikutuksia Oct-4 siRNA-käsiteltyjen LC-CD133

+ (Fig. 6B), Western blot tiedot osoittivat lisäksi, että määrät aktivoitua (pilkkoa) muodossa PARP olivat jatkuvasti koholla LC-CD133

+ käsitelty Oct-4 siRNA IR yksinään tai yhdistettynä kemoterapiaan (Fig. 6D; alaosa). Siten knockdovvn Oct-4 ilmentymisen LC-CD133

+ voidaan tehokkaasti parantaa chemoradiosensitivities ja apoptoottista toimintaa vastauksena IR ja kemoterapia, mikä viittaa siihen, että Oct-4 voisi olla keskeinen tekijä mahdollistaa LC-CD133

+ vastustaa