Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on edelleen johtava kuolinsyy koska sen etäpesäkkeiden kaukaisiin elimiin. Olemme tutkineet vaikutus honokiol, bioaktiivinen osatekijän päässä

Magnolia

kasvi, ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solumigraation ja molekyylitason mekanismien tätä vaikutusta. Käyttämällä

in vitro

solussa migraatiokokeessa, huomasimme, että hoito A549, H1299, H460 ja H226 NSCLC solut honokiol johti estoon siirtyminen niihin solujen annosriippuvaisesti, joka liittyi vähennys tasot COX-2-(COX-2) ja prostaglandiini E

2 (PGE

2). Selekoksibi, COX-2-inhibiittori, inhiboi myös solujen vaeltamiseen. Honokiol esti PGE

2-avusteinen migraation NSCLC-solujen, inhiboi NF-KB: n /p65: n, joka on ylävirtaan säädin COX-2, A549 ja H1299-soluja, ja solujen käsittely kofeiinihapon fenetyyliesteri, estäjä NF-KB: n, myös esti migraation NSCLC soluja. PGE

2 on osoitettu aktivoivan β-kateniinin signalointia, joka osaltaan syövän solujen vaeltamiseen. Siksi pyysimme vaikutus honokiol on β-kateniinin signalointi. Havaittiin, että hoito NSCLC-solujen honokiol hajonnut soluliman β-kateniinin, vähentää ydinaseiden kertyminen β-kateniinin ja alassäädetty matrix (MMP) -2 ja MMP-9, jotka ovat alavirtaan tavoitteet β-kateniinin ja niillä on keskeinen rooli syöpäsolumetastaasi. Honokiol parannettu: (i) tasot kaseiinikinaasi-1α, glykogeenisyntaasikinaasi- 3β, ja (ii) fosforylaatio β-kateniinin kriittisten Ser

45, Ser

33/37 ja Thr

41. Nämä tapahtumat on tärkeä merkitys hajoamista tai inaktivoitumista β-kateniinin. Hoito Selekoksibin vähensi myös ydin- kertyminen β-kateniinin NSCLC soluissa. FH535, estäjä Wnt /β-kateniinin reitissä esti PGE

2-tehostettu solujen kulkeutumista A549 ja H1299 soluja. Nämä tulokset osoittavat, että honokiol estää ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut muuttoliikettä kohdistamalla PGE

2 aktivaatio β-kateniinin signalointi.

Citation: Singh T, Katiyar SK (2013) Honokiol Estää Ei- pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Migration by Targeting PGE

2 aktivaatio β-kateniinin Signaling. PLoS ONE 8 (4): e60749. doi: 10,1371 /journal.pone.0060749

Editor: Xianglin Shi, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 tammikuu 2013; Hyväksytty: 02 maaliskuu 2013; Julkaistu: 08 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Singh, Katiyar. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai taloudellista tukea Veterans Administration Merit Review Award (1I01BX001410-01, SKK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on vastuussa enemmän kuolemia Yhdysvalloissa vuosittain kuin rinta-, paksusuolen ja eturauhasen syöpiä yhdistää, joten on valtava vaikutus ihmisten terveyteen ja terveydenhuollon menot [1]. Yksi kolmesta syöpään liittyvien kuolemien johtuu keuhkosyöpä, eikä sillä ole parannusta viimeisten noin 30 vuoden ajan [2], [3]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 80% kaikista keuhkosyöpään ja sisältää adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä ja suuri-solukarsinoomat [4], [5]. COX-2 (COX-2) on usein konstitutiivisesti säädelty eri ihmisen maligniteettien, mukaan lukien keuhkosyövässä [6] – [10]. Vaikka useita geneettisiä muutoksia ovat välttämättömiä keuhkosyövän riskiä ja sen kehitystä, COX-2 pidetään keskeisenä elementtinä orchestrating keuhkojen syövän synnyn. COX-2 on indusoituva entsyymi ja tuottaa prostaglandiineja (PG), kun sen toiminta arakidonihapon. Niistä PG, PGE

2 pidetään tehokkaimpana aineenvaihduntatuotteen tai tulehduksellinen välittäjänä, joka on ajateltu olevan keskeinen rooli syövän kasvua, eteneminen, invaasio ja metastaasi. Studies in paksusuolen syöpä, jossa COX-2 on spontaanisti yli-ilmennetään, on käynyt ilmi, välinen yhteys COX-2 /PGE

2 ja β-kateniinin signalointia, joka edistää kasvua paksusuolensyöpä [11]. Smith et al [12] ovat osoittaneet, että UV-säteilyn aiheuttamien COX-2: n ilmentymisen ja PGE

2: n tuotannon tulokset on parannettu aktivointi β-kateniinin signalointia. On raportoitu, jotka viittaavat siihen, että COX-2 /PGE

2 /β-kateniinin akselia tai linkin liittyy keuhkosyövän etäpesäke [13]. β-kateniinin on 90 kD sytosoliproteiiniin ja toimii keskeinen osatekijä Wnt-reitin. Koska Wnt-ligandien, β-kateniinin rekrytoimista fosforylaatio /tuhoamisen kompleksi, joka sisältää kasvain vaimennin, adenomatoottisen polypoosin coli (APC) ja ak- siini. Tuhoaminen kompleksi helpottaa fosforylaatiota β-kateniinin by glykogeenisyntaasikinaasi 3β ja kaseiinikinaasin (CK1), joka johtaa proteasomaalisten hajoamista β-kateniinin. Jos β-kateniinin ei fosforyloitu sitten N-terminaalisesti un-fosforyloitua β-kateniinin kerääntyy sytosoliin, se siirtyy tumaan ja on vuorovaikutuksessa transkriptiotekijöiden, kuten T-solujen tekijä, aktivoi kohdegeenien transkriptiota, jotka liittyvät solun eloonjäämisen , leviämisen ja etäpesäkkeiden [14] – [16]. Koska keuhkosyöpä on erittäin pahanlaatuinen syöpä voimakas kyky etäispesäkkeitä etäistä ja merkittävä syy syöpään liittyvien kuolemien, lähestymistapaa, joka vähentää sen metastaattinen kyky saattaa helpottaa kehittää tehokas strategia sen hoitoon ja /tai ehkäisyyn.

Fytokemikaalit terapeuttisen arvojen tarjota lupaavia vaihtoehtoja kehittää tehokkaita strategioita ehkäisyyn kasvainsolun muuttoliikkeen, invaasio ja metastaasi. Honokiol (C

18H

18O

2, kuvio 1A) on lupaava bioaktiivinen ainesosa kuori

Magnolia

kasveja, jota on käytetty perinteisen japanilaisen lääketieteen hoitoon joidenkin vaivoja koska sen antitromboottista, masennuslääke ja antibakteerisia ominaisuuksia [17]. Anti-karsinogeenisia vaikutuksia honokiol on tutkittu erilaisissa syöpäsolun linjat sekä joissakin kasvainmuodoista ei havaita mitään ilmeistä toksisuutta

in vivo

[18] – [25]. Meidän tutkimukset ovat osoittaneet, että honokiol kiinnostavuus chemopreventive vaikutukset ultraviolettisäteilyn aiheuttama ihosyöpä ja että tämä vaikutus liittyy sen kohdistamista tulehdusvälittäjiä, kuten COX-2 ja PGE

2 [25]. Kuitenkin tiedetään hyvin vähän siitä, honokiol tavoitteet invaasio tai metastaattisen potentiaalin keuhkosyövän soluja. Koska keuhkosyöpä on erittäin metastaattinen, pyrimme määrittämään kemoterapeuttisen vaikutuksen honokiol keuhkosyöpään solujen kulkeutumista tai invaasion käyttämällä erilaisia ​​keuhkosyövän solulinjoja kuin

in vitro

mallissa. Esillä olevassa tiedonannossa, selvitimme kemoterapeuttista vaikutusta honokiol siirtymisstrategiasta /invasiivisia potentiaalia ihmisen NSCLC-solujen ja selvitettävä estävä vaikutus honokiol solujen maahanmuutto liittyy inaktivointi β-kateniinin signalointi ja onko PGE

2 on mitään roolia tässä prosessissa. Tätä tarkoitusta varten, neljä erilaista NSCLC solulinjat valittiin: A549, H1299, H460 ja H226. Normaaleja ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja (BEAS-2B) käytettiin kontrollina. Tässä esitämme näyttöä siitä, että honokiol estää invasiivisen potentiaalia NSCLC solulinjojen kohdistamalla PGE

2-aktivaatioon β-kateniinin signalointia.

(A) molekyylirakenne honokiol, bioaktiivinen phytochemical päässä

Magnolia

kasvi. (B) Solujen muuttopotentiaalia eri NSCLC solulinjoissa määritettiin käyttämällä Boyden kammion määrityksessä. Yhtä suuret määrät syöpäsolujen ladattiin ylemmässä kammiossa Boyden kammioita, inkuboitiin 24 tuntia, ja muuttavien soluja havaittiin kalvon värjäyksen jälkeen kristallivioletilla. (C) vaeltavia solut laskettiin ja tulokset on esitetty keskimääräisenä muuttolintulajimäärän solujen ± SD /valittu mikroskooppinen kenttä, n = 3, suurennus: x 10.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta-

Puhdistettu honokiol hankittiin Quality Fytokemikaalit, LLC (Edison, NJ). Boyden Chambers ja polykarbonaatti kalvoja (8 um huokoskoko) ja solumigraation määritykset saatiin Neuroprobe (Gaithersburg, MD). Vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä β-kateniinin ostettiin R Santa Cruz, CA) seuraten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 2 x 10

5 solua /kuoppa ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin kasvaa jopa 70% konfluenssiin. COX-2-siRNA sekoittuvat transfektioreagensseja päällystettiin solujen päälle noin 6 h inkuboinnin kammioon ja siirretään 2 x kasvualustaan ​​noin 20 tuntia. 24 h transfektion jälkeen, tuoretta alustaa lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 48 tuntia aikaisemmin kuvattua [29]. Sen jälkeen solut kerättiin ja alistettiin solujen vaeltamiseen määrityksessä. Pudotus COX-2: n ilmentymisen A549 ja H1299-solujen transfektion jälkeen varmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [29].

Western blot -analyysi

NSCLC-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman honokiol tai muiden aineiden kiinnostusta halutun ajan, sen jälkeen solut otettiin talteen, ja lyysattiin jääkylmällä lyysipuskurilla täydennetty proteaasi-inhibiittoreita, kuten aiemmin on kuvattu [26], [30]. Proteiinit elektroforeettisesti eroteltiin 8-10% Tris-glysiini-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Sen jälkeen, kun esto ei-spesifisiä sitoutumiskohtia, kaivoa inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Membraanit pestiin ja inkuboitiin sitten peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ja spesifisen proteiinin vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia reagenssit. Sen varmistamiseksi, yhtä suuri kuormituksen proteiinien geelit, kalvo kuorittiin ja uudelleenseulottiin joko anti-β-aktiini tai anti-histoni H3 vasta-aine.

Tilastollinen analyysi

solujen vaeltamiseen määrityksissä, tiedon kontrolliryhmässä verrattiin honokiol-, PGE

2- tai selekoksibi-hoitoryhmään erikseen käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA) käyttäen GraphPad Prism versio 4.00 Windows-ohjelmiston (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia. www. graphpad.com.). Kaikki määrälliset tulokset esitetään keskiarvona ± SD. Kussakin tapauksessa

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

vertaileva analyysi Invasive Potential of Human NSCLC Cells

Ensin määräytyy vertaileva invasiivisia potentiaalia eri NSCLC solulinjojen, kuten A549, H1299, H460 ja H226, käyttämällä Boyden chamber määritystä. Inkubointi NSCLC-solujen 24 h Boyden kammiossa aiheutti suuremman määrän solujen kulkeutumista, joka heijastaa niiden invasiivisuus. Edustaja mikrovalokuvia kristalliviolettia-värjäytyneiden solujen esitetään kuviossa 1B. Muuttavien tai invasiivisia solut laskettiin mikroskoopin alla, ja saadut tiedot on esitetty kannalta keskimääräinen lukumäärä invasiivisia solujen ± SD /mikroskooppinen kenttä (suurennos, × 10) (kuvio 1 C). Kuten kuviossa 1C on esitetty, hyökkäys solujen kapasiteetin oli lähes identtinen, paitsi että invasiivisia potentiaalia H226-solujen oli suhteellisesti alhaisemmat kuin muut solulinjat. Identtisissä olosuhteissa, siirtyminen mahdollisuudet normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen oli merkittävästi pienempi kuin NSCLS soluja (tietoja ei esitetty).

Honokiol inhiboi Cell Migration of Human NSCLC Solut

vaikutus honokiol oli määritetään solujen vaeltamiseen tai invasiivisia potentiaalia A549, H1299, H460 ja H226 ihmisen NSCLC solulinjoissa käyttämällä Boyden kammion solujen vaeltamiseen määrityksissä. Aluksi seulonta koe suoritettiin sen määrittämiseksi vaikutuksia pienemmillä pitoisuuksilla ja honokiol (uM). Kuten kuviossa 2A on esitetty, suhteessa ei-honokiol-käsiteltyjen kontrollisolujen, solujen käsittely honokiol pitoisuuksina 0, 5, 10 ja 20 uM 24 h vähensi invasiivisia mahdollisuuksia näiden syöpäsolujen konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Tiheys vaeltavien solujen kalvon värjäyksen jälkeen kristallivioletilla on esitetty kuviossa 2A, ja numerot vaeltavien solujen /mikroskooppisia alalla on esitetty yhteenvetona kuviossa 2B. Solu muuttoliike estyi 38-66% (

P

0,01-0,001) A549-soluissa, mukaan 37-62% (

P

0,01-0,001) in H1299 soluissa , 12-58% (

P

0,05-0,001) H460-soluissa ja 32-69% (

P

0,05-0,001) in H226 solujen pitoisuudesta riippuvasti käsittelyn jälkeen honokiol (kuvio 2B). Suhteellisesti korkeampi inhiboiva vaikutus honokiol on solumigraation havaittiin 48 tunnin aikapisteessä (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Hoito ei-pienisoluisen keuhkosyövän soluja honokiol (0, 5, 10 ja 20 uM) 24 h estää solujen migraatiota annoksesta riippuvalla tavalla. (B) vaeltavat solut laskettiin kummassakin hoitoryhmässä ja tulokset esitetään keskiarvona määrä vaeltavia solujen ± SD /kenttä, n = 3. Merkittävät esto in solujen vaeltamiseen

versus

kuin honokiol saaneilla kontrolliryhmään, *

P

0,001,

†

P

0,01;

¶

P

0,05. (C) haavan paranemisen tai naarmu määritys suoritettiin arvioimaan vaikutuksen honokiol siirtyvien kyky NSCLC soluja. Soluja inkuboitiin kanssa tai ilman honokiol 36 tuntia. Honokiol estää solujen migraatiota annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna kontrolliin (ei honokiol-käsitelty) soluja. Ohjaus (0 h) näytöllä ilmoittaa alkuperäisen väli solukerroksissa välittömästi tehtyään naarmu tai haava. Välinen tila rikki valkoisia viivoja ilmaisee tilan pitkälti tyhjillään jonka keuhkosyövän soluja. Edustaja mikrovalokuvat esitetään kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) tyhjillään tyhjä tila solujen välissä solukerroksissa mitattiin käyttämällä mikro-grid mittakaavassa mikroskoopilla, ja tiedot esitetään tyhjän tilan kannalta um ± SD jokaisen solulinjan. Merkitsevän eston in solujen vaeltamiseen vs. ei-honokiol käsiteltyihin kontrolleihin, *

P

0,001.

estovaikutus honokiol on NSCLC solujen vaeltamiseen Lisäksi todennettiin käyttämällä haavan paranemista määritys, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Haavan paranemista määrityksessä, vaikutus honokiol on solumigraation määritettiin 36 tuntia sen jälkeen, kun hoidon taas Boyden kammion määrityksessä vaikutus honokiol määritettiin 24 tunnin kuluttua. Se johtui siitä, että haavan paranemista määrityksessä ensin solut kiinnitetään levyt, sitten alkaa lisääntyvien ja jälkeenpäin alkaa muuttaa tai aloittaa haavojen. Näin ollen, se kestää kauemmin. Kuten kuviossa 2C on esitetty, suhteessa ei-honokiol-käsiteltyjen kontrollisolujen, solujen käsittely honokiol (0, 10 ja 20 uM) 36 tunnin ajan vähensi siirtymisen kapasiteetin kaikissa solulinjoissa (A549, H1299, H460 ja H226), joita käytetään tässä tutkimuksessa annoksesta riippuvalla tavalla. Suurimmat aukko tai haavoittaen väli solukerroksissa tehtyään haava oli peittynyt vaeltavien NSCLC-solut, joita ei käsitelty honokiol. Kuitenkin välinen tyhjä tila solukerroksissa oli vähemmän piiriin vaeltavien solujen käsitelty honokiol ja tämä vaikutus oli suhteessa annokseen. Haavoittumisen tai välinen tyhjä tila solukerroksissa on korostettu katkoviivoilla (kuvio 2C). Nämä tiedot ehdottaa lisäksi, että honokiol esti muuttavien tehokkuutta NSCLC soluja. Välinen tila rikki valkoisia viivoja mitattiin mikroskooppisesti kummassakin hoitoryhmässä. Kuten esitetty kuviossa 2D, välinen tyhjä tila solukerrokset oli merkittävästi suurempi honokiol-käsitellyissä soluissa (

P

0,001) verrattuna ei-honokiol-käsiteltyjen kontrollisolujen. Tämä osoittaa, että honokiol esti prosessi syöpäsolun muuttoliikettä. Voit varmistaa, että esto syöpäsolun muuttoliikkeen honokiol oli suora vaikutus muuttoliikettä kyky, ja se ei johtunut väheneminen solujen elinkelpoisuuden, MTT-määritys suoritettiin käyttäen soluja, jotka oli käsitelty samalla tavoin niitä käytetään muuttoliike määrityksissä. Hoito normaalia ihmisen keuhkoputken epiteelisoluissa (BEAS-2B) ja NSCLC-solujen honokiol pitoisuuksina 0, 5, 10 ja 20 uM ei ollut merkittävää estävää vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen, kuten on esitetty kuviossa 3A.

(A) vertaileva annoksesta riippuva vaikutus honokiol proliferaatioon potentiaalia BEAS-2B-soluja ja NSCLC-solulinjat, kuten analysoitiin MTT-määrityksellä. (B) Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla honokiol 24 tuntia, ja solujen lysaatit altistettiin Western blot -analyysillä mitata tasojen COX-2. (C) hoito A549 ja H1299-solujen selekoksibi, estäjä COX-2, 24 h estää solumigraatiota potentiaalia annoksesta riippuvalla tavalla. (D) määrä vaeltavien solujen laskettiin kalvon ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona määrä vaeltavia solujen ± SD /kentän kolmesta erillisestä kokeesta. Merkittävät esto honokiol vs. ei-honokiol hoidettuun kontrolliryhmään soluissa *

P

0,001,

†

P

0,01,

¶

P

0,05. (E) Vaikutus Selekoksibin on ekspressiotasot COX-2 A549 ja H1299-soluissa. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla selekoksibin 24 tunnin ajan, sitten kerättiin ja solulysaateista tehtiin Western blot -analyysillä mittausta varten COX-2 tasot. Suhteellinen tiheys proteiinin bändejä bloteissa mitattiin käyttämällä ImageJ kehittämä National Institutes of Health (https://rsb.info.nih.gov/ij) ja normalisoitu kanssa β-aktiini bändejä. Kussakin tapauksessa kontrolliryhmässä annettiin mielivaltainen yksikkö 1.0. (F) transfektio A549 ja H1299 solujen COX-2 siRNA merkittävästi vähentää solujen vaeltamiseen. Merkittävä väheneminen solumigraation versus kontrolli siRNA-käsiteltyjä soluja, *

P

0,001.

estävän vaikutuksen Honokiol solun Migration NSCLC Cells liittyy Reduction endogeenisen COX-2 Expression

tutkia honokiol estää NSCLC migraatiota kohdistamalla endogeeninen ilmentyminen COX-2, määritimme tasot COX-2 in lysaatit käsiteltyjen solujen ja ilman honokiol käyttäen western blot analyysi. Kuten kuviossa 3B on esitetty, hoito A549, H1299, H460 ja H226-solujen kanssa honokiol vähensivät COX-2: n ilmentymisen konsentraatiosta riippuvalla tavalla verrattuna ilmentymisen COX-2 käsittelemättömiin verrokkeihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että inhibitio syöpäsolujen migraatiota honokiol voi liittyä COX-2: n ilmentymisen syöpäsoluissa.

Selekoksibi, COX-2-estäjä, Estää NSCLC Cell Migration

sen määrittämiseksi, onko estävä vaikutus honokiol on NSCLC solumigraation välittyy sen estävä vaikutus COX-2: n ilmentymisen, yhtä paljon A549 ja H1299-solut altistettiin solujen migraatiomääritys käsittelyn jälkeen eri pitoisuuksilla selekoksibin (0, 5 , 10, 20 uM) 24 tunnin ajan. Kuten kuviossa 3C on esitetty, solujen käsittelyä selekoksibin johti annoksesta riippuvainen väheneminen solumigraation kapasiteettia näiden solujen verrattuna ei-selekoksibi-käsiteltyihin kontrolleihin. Tiedot solujen vaeltamiseen on esitetty yhteenvetona kuviossa 3D, joka ehdotti, että solujen käsittely selekoksibia estivät merkittävästi (

P

+0,01-+0,001) kulkeutumista A549 ja H1299 solujen annosriippuvaisesti. Nämä tiedot osoittivat, että inhibitio endogeenisen konstitutiivisen tason COX-2: n ilmentyminen liittyy inhibitioon NSCLC solumigraation. Lisäksi tasot COX-2 tarkastettiin lysaatit käsiteltyjen solujen tai ei-Selekoksibia Western blot -analyysiä käyttämällä. Western blot data paljasti, että hoito A549 ja H1299 soluja Selekoksibilla 24 tuntia johti väheneminen COX-2: n ilmentymisen näissä soluissa, kuten kuvassa 3E.

selektiiviset COX-2 Knockdown Käyttämällä siRNA Johtaa vähentäminen syöpäsolun Migration

rooli COX-2 in solumigraatio lisäksi todennettiin käyttämällä siRNA knock-down COX-2 in NSCLC soluissa ja tutkittiin, se johtaisi estyminen soluvaelluksen syöpä solut. Transfektio A549 ja H1299 solujen COX-2 siRNA johtanut merkittävään vähentämiseen soluvaelluksen A549 (79%,

P

0,001) ja H1299 (75%,

P

määritimme tasot PGE

2, honokiol käsiteltyjä soluja käyttäen PGE

2 immuno-. Tuloksemme paljasti, että solujen käsittely honokiol 24 tuntia johti merkittävään vähenemiseen tuotannossa PGE

2 molemmissa A549 (20-64%,

P

0,01-0,001) ja H1299 ( 13-65%,

P

0,01-+0,001) solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, että honokiol aiheuttama väheneminen PGE

2: n tuotanto voi liittyä estävä vaikutus ja honokiol on solumigraatiota näissä soluissa.

(A) käsittely A549 ja H1299-solujen kanssa honokiol vähensivät PGE

2 annoksesta riippuvalla tavalla. Tasot PGE

2 mitattiin solulysaateista käyttäen PGE

2 immuno- ja tulokset ilmaistaan ​​pg /mg proteiinia ± SD, n = 3. merkittävä alentaminen versus kontrolli soluja, *

P

0,001,

†

P

0,01. (B) Hoito A549 ja H1299 solujen honokiol estää PGE

2-tehostetun solumigraation kyky. Tiedot Solujen migraation solujen kapasiteetin voidaan tiivistää keskimääräinen määrä vaeltavia solujen ± SD /mikroskooppinen kenttä, n = 2. Merkittävät estäminen verrattuna PGE

2 yksin hoito; *

P

0,001,

†

P

0,01.

Seuraavaksi tutkittiin, PGE

2 tehostetun muuttoa NSCLC-solut ja onko honokiol estää PGE

2 aiheuttamaa soluvaelluksen ihmisen NSCLC soluissa. Tätä tarkoitusta varten, A549 ja H1299-soluja käsiteltiin PGE

2 (10 uM) kanssa ja ilman honokiol 24 tuntia ja migraatiota määritettiin.

in vitro

hoitoannos PGE

2 valittiin perusteella aiemmissa tutkimuksissa [29], [31]. Havaittiin, että hoito NSCLC-solujen kanssa PGE

2 johti merkittävään kasvuun solujen vaeltamiseen (

P

0,05) verrattuna soluihin, joita ei ole käsitelty PGE

2 ( kuvio 4B). Hoito A549 ja H1299 soluja honokiol (10 ja 20 uM) aiheutti merkitsevän eston (

P

0,01-0,001) PGE

2 (10 uM) aiheuttaman solumigraation (kuva 4B) .

Honokiol Estää NF-KB /p65 Aktiivisuus NSCLC Solut: NF-KB on tärkeä Regulator syöpäsoluinvaasiota /muuttoliike

NF-KB on alkupään säätelijä COX 2; Siksi päätimme onko honokiol vaikuttaa toiminnan sekä tasot proteiinien NF-KB perheen NSCLC soluissa. Tätä tarkoitusta varten jälleen A549 ja H1299-soluja käsiteltiin honokiol (0, 5, 10 ja 20 uM) 24 tunnin ajan, ja sen jälkeen solut kerättiin ja ydin- lysaatit ja kokosolulysaateille valmistettiin Western blot -analyysiä. Western blot-analyysi osoitti, että solujen käsittely honokiol vähentää tumakertymään NF-KB: n /p65: n annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 5A). Aktiivisuutta NF-KB: n /p65 oli myös merkittävästi vähentynyt (

P

0,05 ja

P

0,001) sen jälkeen, kun solujen käsittely honokiol (kuvio 5B). Meidän data paljasti myös, että hoito honokiol johti tukahduttaminen IKKα, joka on entsyymi, joka vastaa NF-KB: n aktivaation, ja estää hajoaminen IκBα (kuvio 5A). Edelleen ovatko NF-KB on rooli NSCLC solujen vaeltamiseen, A549 ja H1299 soluja käsiteltiin estää voimakkaasti NF-KB, kofeiinihapon fenetyyliesteri (CAPE), ja solujen vaeltamiseen määritettiin. Kuten kuviossa 5C ja 5D, solujen käsittely KAP 24 tuntia aiheutti annoksesta riippuvaa väheneminen solujen migraation A549 (42-78%,

P

0,05-0,001) ja H1299 ( 41-76%,

P

0,05-0,001) solujen suhteen ei-honokiol-käsiteltyjen kontrollisolujen, ja tämä vaikutus KAP oli samanlainen kuin havaittiin hoito soluja honokiol (kuviot 2A, 2B). Edelleen, me myös tarkistaa vaikutusta Kap proteiinien NF-KB perheen A549 ja H1299-soluun käyttäen western blot analyysiä. Kuten on esitetty kuviossa 5E, solujen käsittely KAP johti tukahduttaminen tasojen NF-KB: n /p65: n ja IKKα molemmissa solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla.

(A) A549 ja H1299-soluja käsiteltiin vaihtelevilla honokiol 24 tuntia, solut kerättiin ja sytosoliset ja ydin- fraktioille tehtiin western blot -analyysiä. (B) aktiivisuutta NF-KB /p65 ydinvoiman jakeet solujen mitattiin NF-KB /p65-spesifinen aktiivisuus määritys kit, n = 3. NF-KB /p65-aktiivisuus ilmaistaan ​​prosenttia ei- honokiol-käsiteltyjen kontrollisolujen. Merkittävät esto

verrattuna

ohjaus, *

P

0,001,

¶

P

0,05. (C) Solujen käsittely KAP, estäjä NF-KB: n, 24 h estää solujen migraatiota annoksesta riippuvalla tavalla. (D) tiedot solumigraation voidaan tiivistää keskimääräinen määrä vaeltavia solujen ± SD per mikroskooppinen kenttä /ryhmä. Merkittävät esto

verrattuna

kontrolliryhmään, *

P

0,001,

¶

P

0,05. (E) Solujen käsittely KAP 24 tuntia estää tasojen NF-KB: n ja IKKα määritettynä Western blot -analyysiä käyttämällä.

Honokiol inhiboi Nuclear kertyminen β-kateniinin

PGE

2 on osoitettu aktivoivan β-kateniinin signalointireitin, joka on liitetty syöpäsolujen kasvua, invaasio ja metastaasi [12], [13]. Kuten olemme havainneet, että hoito NSCLC-solujen kanssa honokiol estää tasojen PGE

2 ja estää PGE

2-lisätä maastamuuttoa keuhkosyöpään solujen, meillä on edelleen määrätietoisesti onko esto NSCLC solumigraation by honokiol liittyy myös kanssa tukahduttaminen β-kateniinin signalointi. Tätä tarkoitusta varten, A549 ja H1299-soluja käsiteltiin honokiol 24 tuntia, ja ydin- ja solulimafraktiot solujen lysaatit altistettiin analyysi proteiinien β-kateniinin signalointia. Western blot analyysi paljasti, että hoito A549 ja H1299-solujen honokiol johti vähentäminen olevat tasot tuman β-kateniinin (kuviot 6A ja 6B), annoksesta riippuvalla tavalla. Koska ydinvoima kertyminen β-kateniinin korreloi käänteisesti fosforylaatio tietyissä keskeisissä jäämiä β-kateniinin (Ser

45, Ser

33, Ser

37 ja Thr

41), tarkistimme vaikutus honokiol tasoista β-kateniinin fosforylaatiota näissä kohdissa.