Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä johtuu yhdistelmiä erilaisia ​​geneettisiä mutaatioita. Täällä, ymmärtää merkityksen tumareseptorien (NR) onkogeenin liittyvän keuhkosyövän synnyssä, tutkimme ilmaus profiilia koko 48 NR jäsentä käyttämällä QPCR analyysiä paneelissa ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBECs), joka sisälsi precancerous ja tuumorigeenisia HBECs kätkeminen kasvaimia synnyttävän

K-ras

V12

ja /tai

p53

muutoksia. Analyysi profiilin paljasti, että onkogeeniset muutokset mukana transkription muutosten ilmentymistä 19 NR vuonna precancerous HBECs ja 15 NR mukaan pahanlaatuinen etenemistä HBECs. Näistä, peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptori gamma (PPARy), NR valitaan proof-of-periaatteen tutkimus, osoitti kohonneen ekspression precancerous HBECs, joka yllättäen päinvastainen kun nämä HBECs hankki

in vivo

kasvainten muodostumiseen . Erityisesti PPARy aktivaatio tiatsolidiinidioni (TZD) käsittely päinvastainen lisääntynyt ilmentyminen proinflammatoristen cyclooxygenase 2 (COX2) in precancerous HBECs. Täysin tuumorigeenistä HBECs kanssa indusoituvan ilmentymisen PPARy, TZD hoitoja esti kasvainsolujen kasvua, clonogenecity, ja solu muuttoliikettä PPARy-sumoylation riippuvaisella tavalla. Mekanistisesti sumoylation on ligandoidun-PPAR laski COX2 ilmaisun ja nousi 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenaasin ilme. Tämä viittaa siihen, että ligandi-välitteinen sumoylation PPARy on tärkeä rooli keuhkosyövän synnyssä moduloimalla prostaglandiini aineenvaihduntaa.

Citation: Kim J, Sato M, Choi JW, Kim HW, Yeh BI, Larsen JE, et ai . (2015) Nuclear Reseptori Expression ja toiminta Human Lung Cancer Patogeneesi. PLoS ONE 10 (8): e0134842. doi: 10,1371 /journal.pone.0134842

Editor: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Etelä-Korea

vastaanotettu 4 helmikuuta 2015 Hyväksytty: 15 heinäkuu 2015; Julkaistu: 05 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: National Research Foundation Korean rahoittama opetus-, Science and Technology (NRF-2013R1A1A1A05005075 ja YJ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tumareseptorisuperperheen koostuu 48 jäsentä transkriptiotekijöitä, jotka ovat enimmäkseen ligandiaktivoituja ja keskeisessä asemassa ovat erilaisiin fysiologisiin prosesseihin kuten aineenvaihdunta, kehitys ja erilaistuminen kehossa. Häiriöstä NR polkuja aiheuttaa vakavia kroonisia sairauksia, kuten diabetes [1-3], ateroskleroosin [4, 5], ja useiden syöpätyyppien [6-8]. Ekspression koko NR superperheen on tutkittu erilaisten fysiologisten ja patologisten tilojen, mukaan lukien solujen erilaistumisen mallit [9-12], hiiren anatominen järjestelmät [1], NCI60 paneeli ihmisen syöpäsolulinjoissa [6], ja ihmisen keuhkosyövän solulinjat ja potilaan näytteitä [7, 8]. Nämä tutkimukset ovat paljastaneet, että osajoukot NR eivät liity vain tiettyyn kudokseen fysiologia, mutta ovat myös merkityksellisiä toiminnallinen eriyttäminen erityisiin solulinjat [13, 14]. Lisäksi geneettinen allekirjoitus NR superperheen tai yksittäisten NR jäsenistä on ennustetyövälineenä biomarkkeri keuhkosyöpää, ja jotkut NR ovat druggable tavoitteita, jotka voidaan farmakologisesti kehitetään mahdollisten syöpähoitojen [6-8, 15-19]. Itse asiassa monet linjat todisteet osoittavat, että yksittäiset NR liittyvät puhkeamista ja kehitystä sekä hoitoon tai kemopreventatiivisesti syövän. Esimerkiksi yli-ilmentyminen retiinihapporeseptorin alfa (RARa) johtuen sen fuusio PML (RARa /PML) ja estrogeenireseptori alfa (ERa) ilmentyminen aiheuttaa puhkeamista leukemia ja rintasyövän eteneminen vastaavasti [20-22]. Kohdistaminen ERa käyttämällä selektiivinen estrogeenireseptorin modulaattori (SERM) tamoksifeenin tai raloksifeenin ja salpaus tai ablaatio dihydrotestosteroni (DHT), joka on vahvin endogeeninen ligandi androgeenireseptorin (AR), ovat tunnettuja terapeuttisia järjestelmiä syövän klinikoilla hoitoon vastaava syöpiä [19, 23-25]. Vaikka SERM on laajalti käytetty rintasyövän hoitoon tai jopa kliinisesti arvioitu kemopreventiivisiä aineita vastaan ​​rintasyövän esiintyvyys, on suuri riski kohdun ja kohdun limakalvon syövän ilmaantuvuus on raportoitu aiemmin [26, 27]. Samoin, vaikka Diabeteksen huumeiden TZD ovat kliinisissä kokeissa keuhkosyövän hoitoon, molekyyli- funktio TZD-aktivoitua PPARy ei ole selvästi määritelty vielä kuin antituumorigeenistä tekijä keuhkosyöpään, tai jopa väitti kasvain edistäviä tekijä muiden syöpien, kuten rinta- ja eturauhassyövän [28-30].

Olemme kehittäneet prekliininen malli, johon kuolemattomiksi normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBECs), joka voidaan manipuloida geneettisesti erityisiä onkogeenisia muutokset tutkia keuhkosyöpä synnyssä ja uusien lähestymistapojen varhaiseen diagnosointiin, ehkäisyyn ja hoitoon keuhkosyöpään. Viime aikoina olemme pystyneet kehittämään täysin eteni ja tuumorigeenisia mallien kanssa HBECs perustuu manipulointiin p53, KRAS, ja c-myc [31]. Nämä precancerous ja täysin tuumorigeenisia mallit tarjoavat ihanteellisen järjestelmä tutkia roolia NR keuhkosyövässä synnyssä lukien preneoplasian ja kasvainten muodostumisen.

Tässä tutkimuksessa olemme profiloitu mRNA ilmaus kaikkien 48 NR tässä HBEC oncogene- aiheuttama keuhkosyöpä synnyssä malli [32, 33]. Tämä antoi meille mahdollisuuden tunnistaa avainasemassa PPARy keuhkosyövässä synnyssä. Vuonna mekanistinen proof-of-periaatteen tutkimuksessa, huomasimme, että PPARy sumoylation on tärkeä anti-kasvaimia aiheuttavasta vaikutuksesta TZD keuhkosyövässä synnyssä. Tutkimus tarjoaa tietoa biokemiallinen muutos PPARy, joka on hyödyllinen ymmärtämisen keuhkosyövän synnyssä ja osoittaa myös valtaa tämän prekliinisen järjestelmän tutkia roolia NR keuhkosyövässä synnyssä ja nämä tulokset pitäisi olla kliinistä translationaalisen arvosta.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, normaaleja ihmisen keuhkoputken epiteelisolut kuolemattomiksi CDK4 ja hTERT (HBEC-KT), jota seuraa edelleen stabiilisti onkogeeniset muutokset mukaan lukien K-ras

v12 yliekspressio, knockdovvn p53, tai molemmat [31-33]. Sarja HBEC-kts mukana HBEC-KT, HBEC-KTZ, HBEC-KT + pSRZ + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L ), HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

LacZ

(HBEC-KT53), ja HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L53), jossa pSRZ ja Plenti edustavat vakaa shRNA ja lentivirusvektoreita vastaavasti [31]. Kuolemattomiksi HBECs ja tuumorigeeniset HBEC kloonien (C1 ja C5) viljeltiin K-SFM (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), jota oli täydennetty 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta ilman epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ja RPMI, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, vastaavasti.

Molecular cloning ja stabiili solulinja

sekä PPARy ja tehostetun vihreän fluoresoiva proteiini (EGFP) geenejä reunustavat sisäisen ribosomin päällä oli bicistronically rakennettiin valvonnassa tetrasykliini-indusoituva (Tet /on) sytomegaloviruspromoottorin lentivirusvektorikirjastojen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Site-directed tehtiin mutaatioita sekä sumoylation sivustoja (K79R ja K367R varten PPARγ1, K107R ja K395R varten PPARγ2) on PPARy. Lentiviruksiin tuotettiin ja transduktoitiin tuumorigeenisia HBEC-C1 solulinjoissa. Lisäksi seulonta prosessi suoritettiin valita HBEC-C1-PPAR-klooni, jossa sekä PPARy ja EGFP ilme ovat tiiviisti säädellään tetrasykliiniä hoitoon.

immunoblottianalyysi

Paneeli kuolemattomaksi HBEC solulinjojen viljeltiin läsnä ollessa tai ilman PPARy-agonistin troglitatsoni tai pioglitatsoni 48 tuntia ja sitten kokosoluliuotteista valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [7]. Ensisijainen vasta-aineita solun signaloinnin mukana vasta-aineita p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), K-ras (sc-30, Santa Cruz), fosfori-MEK1 /2 (# 9121, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), MEK1 /2 (# 9122, Cell Signaling), COX2 (sc-19999, Santa Cruz), fosfori-ERK1 /2 (# 9101, Cell Signaling), ERK1 /2 (# 9102, Cell Signaling), β-aktiini (Ab6276, Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK), Lamin A /C (sc-7292, Santa Cruz), ja PPARy (# 2435, Soluviestintä). Ensisijainen vasta solusyklin etenemisen mukana vasta-aineita cyclinD1 (# 2926, Cell Signaling), sykliini A (sc-239, Santa Cruz), p16

INK (sc-468, Santa Cruz), ja p21

WAF1 ( OP64, Calbiochem, La Jolla, CA, USA).

solun kasvua ja pesäkemuodostusta

Cell laskemalla määritys suoritettiin mittaamalla solujen kasvua vasteita. Solujen laskenta määrityksessä kaksi satoja HBECs ympättiin 96-kuoppaisille levyille lopulliseen media 100 ul kuoppaa kohti, jonka jälkeen troglitatsoni käsittely pitoisuuksina 3 uM, kun läsnä oli 100 nM synteettistä RXR-ligandin LG268. Solujen määrä laskettiin viiden päivän ajan käsittelyn jälkeen. Suhteellinen% kasvu normalisoitui jokaisen annoksen ajoneuvolla hoitoa. Sillä pesäkemuodostusta, viisi tuhansia HBEC soluja halkaistu osaksi 6-kuoppalevyille ja käsitelty PPARy tai PPARa ligandeja. Pesäkkeet värjättiin metyleenisinisellä jälkeen 7-10 päivää ligandikäsittelyn.

Cell migraatiokokeessa

HBECs indusoitavissa ilmentymisen wt-PPARy tai SUMO-PPAR ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja täysin kasvanut 100% konfluenssiin, jonka jälkeen mitomysiini C käsittely tukahduttaa solujen lisääntymistä. Haava muodostettiin raaputtamalla solukerros steriilillä pipetillä kärjestä. Sitten soluja inkuboitiin RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia tai ilman tetrasykliiniä induktion reseptorin ilmentymistä ja jota seuraa ligandin hoitoon. Solumigraation mitattiin 24 tuntia PPARy ligandikäsittelyn laskemalla solujen lukumäärä vaelsivat haavoittuneen alueilla.

Luciferase raportin määritys

HEK 293-solut kotransfektoitiin vastaava määrä (15 ng ) joko kontrolli plasmidin tai ilmentämisplasmideja villityypin (wt-PPARy) tai sumoylation mutantti (SUMO-PPARy) PPARy yhdessä lusiferaasireportteriplasmidi PPAR-vaste-elementin (TK-PPRE3x-Luc, 50 ng) ja beta- galaktosidaasin plasmidi (β-Gal, 20 ng) ja normalisointia transfektion tehokkuutta. Sitten soluja käsiteltiin vehikkelillä (EtOH), 1 uM pioglitatsonin tai troglitatsoni ja niistä määritettiin lusiferaasiaktiivisuus.

Käänteinen transkriptio ja QPCR-määritys

Kaikki RNA: t valmistettiin käyttäen Qiagen kit ja käännetyn cDNA: ksi ja QPCR-määritys (TaqMan-menetelmä), kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Käänteinen transkriptio 2 ug kokonais-RNA: ta 100 ul: n reaktiotilavuudessa edelleen säädettiin 200 ui lopullista tilavuutta. SDS-versio 2.1 ohjelmistoa käytetään havaitsemaan reaaliaikaisen PCR-reaktio suoritettiin ABI 7900HT järjestelmään. Tehokkuus korjattu standardikäyrästä määritykset optimoitu nonbiased, monilevylukija vertailu aikaisemmin kuvatulla [8].

QPCR tietojen analysointi

Macro luotiin analysoida raakadataa tuodaan Microsoft Excel. PCR tehokkuus (e), laskettiin e = 10

[- 1 /rinne] jossa rinne saadaan standardikäyrältä SDS 2.1 -ohjelmisto, että 18S viite ja NR kohteita. Makro sisälsi seuraavat tilastollisia laskelmia. Keskimääräinen (ka.) Määrä yksittäisille näytteille oli johdettu keskimääräinen suhteellinen määrä kolmen rinnakkaisen, jossa määrä on yhtä suuri kuin e

-Ct (eli

määrä

= (10

[- 1 /rinne])

-Ct). Variaatiokerroin (CV) voidaan edelleen saadaan jakamalla keskihajonta keskiarvon (STDEV) keskimääräisellä määrä (ka.), CV = STDEV /avg. Tilastollinen harha kohta jätettiin oliko 17% CV. Käyttämällä näitä määriä sekä 18S ja NR kiinnostavat, normalisoitu arvo kullekin NR ilmentymisen edelleen laskettiin jako NR määrä avg viittaamalla määrä avg. (Eli normalisoitu arvo = NR määrään avg /viitemäärä avg). Lisäksi keskihajonta normalisoitu arvo laskettiin S.D. = (Normalisoitu arvo) X {(CV viittaus)

2 + (CV NR)

2}

1/2.

Tulokset

karakterisointi ikuistettu HBECs

yleinen kaava tuottaa kuolemattomaksi ja tuumorigeenisia HBECs esitetään kuviossa 1A. Ymmärtää vaikutus onkogeenisten muutoksia on Tuumorigeenisuustutkimuksissa keuhkoputken epiteelisolujen, me aiemmin luotu paneeli ikuistettu HBECs kätkeminen joko

K-ras

V12

ilme, p53 knockdown, tai molemmat muutokset, jotka ovat merkittäviä mutaatiot keuhkosyövän [32, 33]. Hiiren ksenograftimallia, HBEC klooneja, C1 ja C5, tunnistettiin olevan tuumorigeenisemmiksi ja ominaista. Vakaa Knockdown p53 vahvistettiin sekä mRNA ja proteiinin ilmentymisen käyttäen QPCR määritystä ja immunoblot-analyysi, vastaavasti (kuvio 1 B ja S1 kuviossa). Aktiivisuus onkogeenisten

K-ras

V12

stabiilisti viedä kuolemattomaksi HBEC solulinjoissa vahvistettiin fosforylaatio MEK, alavirran kohde kinaasi K-ras (kuvio 1 B) . Nämä geneettiset muutokset selvästi aiheutti vacuole kaltainen solu elimellisen muutoksen, joka näytti olevan solujen vanhenemista, joka on yhdenmukainen tulosten aiemman raportin [31] (Kuva 1C).

(A) Kaavio tuottaa paneeliin ja HBEC soluja. (B, C)

In vitro

luonnehdinta HBECs. (B) Immunoblot-määritykset suoritettiin ilmentämistä varten K-ras

V12, p53, pMEK yhteensä MEK, ja beeta-aktiini in HBEC soluissa. (C) mikroskooppinen näkymä HBEC soluja (suurennos, 1 x). Huomaa, että HBEC-KT sanoista HBEC solulinjojen kuolemattomaksi

CDK4

plus

hTERT

; KTR

L, KT plus onkogeenisiä

K-ras

V12

; KT53 KT plus

p53

knock-down; KTR

L53, KTR

L plus

p53

knock-down.

NR ilmaisun HBEC paneelissa

Koska viime aikoina osoittaneet, että ilmentymiskuvio varten 48 NR on ennustetyövälineenä biomarkkereiden asettaa sekä mahdollisesti olla terapeuttisia kohteita keuhkosyövän [6-8], mietimme mahdolliset NR liittyy keuhkosyövän synnyssä. Siksi tutkia siitä käyttöönotto

K-ras

V12

ja

p53

onkogeenisiä muutokset vaikuttivat ilmaisun NR ihmisen keuhkojen keuhkoputken epiteelisolujen, me ensimmäinen profiloitu mRNA ilmaus kaikkien 48 jäsentä NR superperheen jonka QPCR vuonna isogeenisissä HBEC paneeli, joka on onkogeenisesti hyvin määritelty ja sisältyy geneettisesti identtisiä keuhkoputkien epiteelin solulinjoissa (kuvio 2 ja S2 kuvassa). Löysimme 31 ulos 50 NR (mukaan lukien PPARδ2 ja PPARγ2, isomuotoja PPARS ja PPARy, vastaavasti) näytteille ole eroja isogeenisissä paneelissa (joko ollut ilmaus tai ei muutoksia ilmaus) (S2 Kuva). Sitä vastoin 19 NR osoitti erilaisia ​​ekspressiomalleja koko isogeeninen HBEC paneelit, joka laski kolmeen eri ryhmään. Ensimmäinen ryhmä (p53 riippuvainen) kuului kaksi jäsentä, kanan ovalbumiini ylävirtaan promoottori-transkriptiotekijä (Coup-TF) α, estrogeenireseptorin (ER) β, NR osoittaa p53-riippuvaisen ekspressiokuviota (kuvio 2A). Toinen ryhmä edusti NR, jossa on K-ras

V12-riippuvaista ekspressiokuviota lukien Coup-TFβ, estrogeeni-reseptori (ERR) α, sukusolujen ydin- tekijä (GCNF), hermokasvutekijän indusoi geeni B (NGFIB ) 3, neuroni johdettu orporeseptoria 1 (NOR 1), PPARa, PPARS, PPARδ2, reverse-erb (Rev-erb) α, ja retinoiinihappo liittyvien orporeseptoria (ROR) α, tyroidihormonireseptorin (TR) β (kuvio 2B). Kolmas ryhmä (K-ras

V12 ja p53 mukaan) olivat ERa, hepatosyyttien ydin- tekijä 4 (HNF4) γ, nur liittyvä tekijä 1 (NURR1), PPARy, Retinoid happo reseptori (RAR) β, RAR liittyvät orpo reseptori (ROR) β, jotka olivat NR dual onkogeenin riippuvan ekspressiokuviota (kuvio 2C). Mukaisesti tulosten meidän edellisessä raportissa, jossa NR ilmentyminen liittyy usein keuhkosyöpään etenemisen [7], tämä tulos tukee käsitystä, että osajoukot NR voisi myös olla mukana keuhkosyöpä synnyssä aiheuttama

K-ras

V12

yliekspressio ja /tai menetys p53-toiminto.

qPCR suoritettiin mRNA: n ilmentymisen koko NR superperheen kuolemattomissa HBEC paneelissa. (A)

p53

pudotus riippuvaista ilme. (B) onkogeeninen

K-ras

V12

-riippuvaisella ilme. (C)

p53

Knockdown ja

K-ras

V12

-riippuvaisella ilme. Huomaa, että HBEC-KT sanoista HBEC solulinjojen kuolemattomaksi

CDK4

plus

hTERT

; KTZ, KT plus kontrolli plasmidin zeosiinivalinnalla merkki; KTR

L, KT plus onkogeenisiä

K-ras

V12

; KT53Z, KTZ plus

p53

knock-down; KTR

L53, KTR

L plus

p53

knockdown. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevää pistettä arvioituna

ANOVA

. *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001 verrattuna HBEC-KT.

PPARy aktivointi päinvastaiseksi onkogeenisel-

K-ras

V12

indusoima COX2 proteiinin

Koska PPARy on suhteellisen hyvin tutkittu muun NR erilaisissa fysiologisiin toimintoihin (esim adiposyyttien erilaistumiseen, tulehduksen kontrolli) ja sen ligandin TZD saatavilla klinikalla tyypin II diabeteksen, seuraavan kerran päätti tutkia molekyylitasolla tutkimuksen PPARy kuten proof-of-concept, ulos 48 NR molekyyli synnyssä keuhkosyöpään [11, 34, 35]. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien osoittavat, että COX2 ilmentyminen liittyy keuhkosyövän etenemisen [36, 37], havaitsimme dramaattinen kasvu COX2 ilmaisun HBECs muunnettu sisältämään onkogeenisen

K-ras

V12

(kuvio 3A ja 3B). Vaikka PPARy mRNA lisääntyi samanaikaisesti COX2 ilme, PPARy proteiini ilmaisut olivat samankaltaiset kaikissa 4 HBEC soluissa viittaa posttranskriptionaalisella säätely PPAR mRNA (kuvio 3B). Koska PPARy on merkittävä rooli tulehdusta vastaus [34, 35], halusimme testata, jos PPARy aktivointi estää proinflammatoristen COX2 ilmentymisen keuhkosyövän synnyssä malli. Todellakin, PPARy-agonistin troglitatsonin päinvastaiseksi lisääntyneen ilmentymisen COX2 mRNA: ta ja proteiinia (kuvio 3A ja 3B). Yhdessä PPARy esto keuhkosyöpään leviämisen kuten aiemmin raportoitu [38, 39], tämä tulos viittaa siihen, että PPAR suppressio COX2 ilmaisun voisi olla tärkeä moduloiva onkogeenin aiheuttaman pahanlaatuisia muutosta HBECs osaksi keuhkosyöpään. Menetys p53-toiminto, ilmaus sykliini D1-proteiinin, avaintekijä solusyklin etenemisen G1: stä S-vaiheeseen, laski HBECs p53 Knockdown ja laski vielä enemmän HBECs dual

p53

ja

K-ras

V12

kasvaimia synnyttävän muutoksia yhdistettynä troglitatsoni hoitoon (kuvio 3B). Sen sijaan, sykliini D1 ei osoittanut muutosta HBECs vain K-ras

V12 ilmaisun kanssa tai ilman troglitatsoni. Nämä tiedot viittaavat siihen, että aikana syövän esiasteita (tyypillistä jonka HBEC solut

p53

menetys ja

K-ras

V12

muutokset), PPARy ilmentyy ja sen aktivoimalla ligandista riippuvaisella voi johtaa dramaattisiin muutoksiin COX-2 ja sykliini D1 ilmentyminen (kuvio 3A ja 3B). Kuitenkin troglitazone hoito osoitti yhtä suuri esto HBEC-KT leviämisen poikki isogeenisissä paneeli (kuvio 3C). Tämä viittaa siihen, että muut tekijät, sekä COX-2 ja sykliini D1, saattaa olla mukana PPARy-välitteisen kasvun tukahduttaminen HBEC soluja.

(A) PPARy ja COX2 mRNA: n ilmentymisen mitattiin QPCR määritystä HBEC linjat kanssa tai ilman troglitazone hoitoa. (B) Immunoblotit käyttämällä vasta-aineita vastaan, COX2, sykliini D1, PPARy tai beeta-aktiini-käytettiin mittaamaan vastaavan proteiinin ilmentymistä HBEC paneelissa, kun niitä käsitellään tai ei ole käsitelty 1 uM troglitatsoni. (C) Growth vaste HBEC-KT solulinjojen yhdistettyyn hoitoon PPARy ligandin troglitatsoni (3 uM) ja RXR ligandin LG268 (100 nM). Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevää pistettä arvioituna

ANOVA

. *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001 verrattuna HBEC-KT ohjaus,

###

P

0,001 verrattuna K-ras

V12 ohjaus,

+++

P

0,001 verrattuna K-ras

V12 + p53shRNA ohjaus.

karakterisointi kasvaimia aiheuttavasta HBEC kloonien

Koska eri PPAR ilmaisun heijastuu eroa kasvun esto ei-tuumorigeenisen HBECs hoidetuilla troglitatsoni (kuvio 3C), mietimme jos transformoitu HBECs näyttää eri vastauksen PPARy-ligandia hoitoon ja erilaisia ​​ekspressiomalleja muiden NR verrattuna syöpää edeltävän HBECs. Ensin tunnettu kahdesta tuumorigeenistä klooneja, HBEC-C1 ja C5, solutasolla ja kudosten tasolla. Histologinen luonnehdinta ksenograftikasvaimissa paljasti, kuten äskettäin meille, että HBEC-KT p53 Knockdown ja K-ras

V12 korkean ilmentymisen manipulointi voi johtaa klonaalisia johdannaisia ​​erilaisilla histologies- levyepiteelisyöpä (SCC, HBEC-C1 ) ja adenokarsinooma (ADK, HBEC-C5) [31] (Kuva 4A). Biokemiallinen analyysi vahvisti, että molemmat onkogeeniset muutokset,

K-ras

V12

toiminnan sekä menetys

p53

ilmaisua, oli yhtä yllä kasvaimia HBEC- C1 ja C5 klooneja (kuvio 4B). Yllättäen sekä PPARy ja COX2 ilmaisut olivat dramaattisesti vähentynyt tuumorigeenisia HBEC klooneja (kuvio 4B ja S3 kuvassa) ja kasvaimia kloonit olivat johdonmukaisesti resistenttejä PPARy kasvun estäminen (kuvio 4C). Nämä tiedot viittaavat siihen mahdollisuuteen, että aikana premalignancy ohjaavat

p53

ja

K-ras

onkogeenisiä muutokset PPAR ja COX2 voi olla hoitotavoitteet mutta kehityksen kanssa koko maligniteetti että kasvaimia ohittaa tämän ohjaus, joka joissakin tapauksissa tapahtuu alaspäin säätely PPAR. Tällaiset havainnot olisivat yhdenmukaisia ​​raportteja, että muiden kuin tulehduskipulääke (NSAID) voivat suojata kehittymistä keuhkosyövän miehillä taas niiden käyttö täysin kehittynyt keuhkosyövässä ei näytä olevan terapeuttisia [40].

(A) histologisen analyysin kasvaimia aiheuttavasta kloonien; C1 kasvain huonosti eriytetty karsinooma suuret solujen viittaavia okasolusyöpä (H 0,001 verrattuna HBEC-KT ohjaus.

NR ilmaisun tuumorigeenisia HBEC klooneja

Koska PPARy ilmentymistä huomattavasti vaimennetaan täysin pahanlaatuinen HBECs, mietimme jos muita NR ovat eri tavalla ilmaistuna samalla tuumorigeenisiä etenemistä. Niinpä valmiiksi mRNA ilmaisun profiilia koko NR superperheen paneelissa ei-tuumorigeenisen HBEC-KTR

L53 solut ja kasvaimia klonaalisen johdannaiset, myös tuumorigeenisia solulinjat perustettiin C1 ja C5 kasvaimia, ja C5 kasvain itse (kuvio 5A ja S4 kuvassa). Viisitoista 50 NR osoitti ekspressoitumista kaavoja mahdollisesti liittyy pahanlaatuinen etenemistä HBEC-KTR

L53 solujen HBEC kasvaimia (kuvio 5A). Mukana tässä ryhmässä olivat AR, Coup-TFα, Coup-TFβ, annostus herkkä sex kääntyminen-lisämunuaisen hypoplasia synnynnäinen kriittisellä alueella X-kromosomissa, geeni 1 (DAX1), ERa, ERRα, HNF4γ, maksa reseptori-homologi-1 (LRH1 ), NOR 1, NURR1, PPARy, RARβ, RORccn, RORβ, ja VDR (kuvio 5A). Mielenkiintoista, yhdeksän 15 NR (AR, Coup-TFα, DAX1, HNF4γ, LRH1, NOR 1, NURR1, RORccn, ja RORβ) osoittivat jatkuvasti kasvava ekspressiokuviota upon tuumorigeenisia etenemisen (kuvio 5B). AR ja DAX1 osoitti dramaattisesti lisääntynyt ilmentyminen vain HBEC kasvaimia, mutta ei kuolemattomaksi HBEC solulinjoja. ERRα ja VDR osoittivat vähentynyttä ilmentymistä aikana tuumorigeneesin ei-onkogeenisistä HBEC-KT kautta HBEC-KTR

L53 ja HBEC kasvaimia (kuvio 5B). Coup-TFβ, ERa ja RARβ oli kaksivaiheinen ekspressiomalli, jossa alkuperäinen ilmentymisen NR in HBEC-KT laski HBEC-KTR

L53, mutta elpyi HBEC kasvaimia, joka on vastapäätä täydellinen menetys PPARy ilmentyminen HBEC kasvaimissa (kuvio 5B). Lisää kiinnostavaa, adenokarsinooma tyyppi HBEC-C5-solujen ja kasvaimen, mutta ei levyepiteelikarsinooma HBEC-C1, osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä Coup-TFα ja β, ja laski ilmentyminen ERRα ja VDR, viittaa siihen, että nämä neljä NR voidaan erityisesti mukana adenokarsinooma tyyppikohtaisia ​​keuhkosyöpä synnyssä.

qPCR suoritettiin mRNA: n ilmentymisen koko NR superperheen ei-tuumorigeeniset HBEC-KTR

L53 solujen

p53

ja

K-ras

V12

muutoksia, kaksi tuumorigeenisemmiksi kloonit C1 ja C5, ja ksenografti- C5 kasvainkudoksen. (A) Quantitative mRNA: n ilmentymisen profiilit NR osaryhmään selvä ilme kuvio elementin poikkisuunnassa. Huomaa, että loput NR profiili on esitetty S4 kuviossa. (B) Yhteenveto NR lausekkeen paneeli A ja kuvio 2 näyttää NR ilmaisun kaskadeja korreloi tuumorigeenisiä etenemiseen. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevää pistettä arvioituna

ANOVA

. *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001 verrattuna HBEC-KTR

L53.

PPARy sumoylation-riippuvaisen inhibition tuumorigeenisiä HBEC kasvun ja muuttoliikkeen

ligandivälitteinen PPARy sumoylation estää indusoitavissa typpioksidin (iNOS), tunnettu proinflammatoristen entsyymi, joka tuottaa typpioksidia, ja anti-inflammatorisen roolin PPARy uskotaan myötävaikuttavan sen tuumoria tukahduttavan funktion kyseisen reseptorin [34], testasimme onko PPARy sumoylation on kriittinen anti -tumorigenic funktio, että reseptorin HBEC etenemistä sarjassa. Tätä varten perustimme tuumorigeenisia stabiileja solulinjoja (HBEC-C1), joka ilmaisee villityypin (wt-PPARy) tai sumoylation mutantti (SUMO-PPARy) muodossa PPAR tutkia, jos voitto-of-funktio eri PPAR ( wt-PPARy vs. SUMO-PPARy) voisi kääntää kasvu vastus kasvaimia HBEC-C1 ligandikäsittelyn. Havaitsimme, että molemmat PPARy muodot havaittu eroa ligandivälitteinen trans-aktivoitumisen toiminto kohdegeenin ilmentymisen käyttäen lusiferaasianalyysissä (kuvio 6A). HBEC-C1-soluissa tiukasti säädeltyä ilmentymistä wt-PPARy tai SUMO-PPAR valvonnassa tetrasykliini-indusoituva toiminta-promoottori (Tet /ON) (kuvio 6B). HBEC-C1-solujen indusoima paino–PPAR oli merkittävä kasvun estäminen yli 50%, kun Pioglitatsoniryhmässä tai troglitatsoni (TZD) (kuvio 7A). Kuitenkin tämä kasvua estävä vaste oli huomattavasti pienentynyt HBEC-C1-solujen indusoituvan ilmentymisen SUMO-PPAR samoissa käsittelyolosuhteissa kuin vastaavat HBEC-C1 soluja, jotka ilmentävät WT-PPARy (kuvio 7A ja 7B). Samoin nestemäinen pesäkkeiden muodostumisen testi osoitti, että PPARy: n ligandi hoitoja esti clonogenecity on HBECs ilmentävien wt-PPARy ja muut keuhkosyövän solulinjat, kuten calu6 ja H2347 ilmentävät endogenouse PPARy, muttei yksi SUMO-PPARy (kuvio 7B ja 7C). Kuitenkin hoito PPARa ligandin WY-14643 ei osoittanut colonogenic vaikutus molempiin paino-PPARy ja SUMO-PPARy ilmentävien HBECs (kuvio 7C). Tämä viittaa siihen, että estävä vaikutus TZD on nimenomaan riippuu PPAR sumoylation. PPARy aktivointi esti myös solujen muuttoliikettä sumoylation riippuvalla tavalla (kuvio 7D). Tämän mukaisesti, ilmaus kummankin sykliini A sykliini D1 laski HBEC-C1 soluja, jotka ilmentävät WT-PPARy, mutta ei muuttunut HBEC-C1 soluja, jotka ilmentävät SUMO-PPAR, hoidetuilla TZD (kuvio 8A ja S5a kuvassa). Huomaa, että ilmaus sykliiniriippuvaisen estäjät, p16 ja p21, ei merkittävästi muuttunut saman kohtelun olosuhteissa (kuvio 8A ja S5a kuvassa). Lisäksi olemme tutkineet useita tulehduksellinen signalointireitteihin osallistuvien typpioksidin tuotantoa, prostaglandiini biokemia, ja TNFa signaalitransduktion. Kiehtovan, huomasimme, että TZD aktivaatio wt-PPAR laski tulehdusta edistäviä COX2 ilmentymisen kolminkertaiseksi, kun taas SUMO-PPARy aktivointi, erityisesti lisääntynyt ilmentyminen COX2 proteiinin kuusinkertaistunut HBEC-C1-soluissa (kuvio 8B). Lisäksi, ekspressiota 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenaasi (HPGD), prostaglandiini-metaboloivien entsyymi, oli dramaattisesti indusoitiin kahdeksantoista-kertaiseksi, kun paino-PPARy aktivoitiin TZD. Kuitenkin HBEC-C1-SUMO-PPARy-soluissa indusoi HPGD ilmentymistä huomattavasti vähemmän (viidestä seitsemään-kertainen), kun käsiteltiin TZD. PPARy aktivointi myös merkittävästi tukahdutti TNFa ilmaisua, mutta ei muita NFKB signalointi tekijät, joka sumoylation riippuvaisella tavalla (S5B kuvio). Huomaa, että iNOS ei ilmaistu tuumorigeenisia HBEC klooneja (S5c kuvio). Yhdessä tämä viittaa siihen, että ligandin indusoiman PPARy sumoylation on erityisesti mukana tukahduttaminen tulehduksellinen COX2 ja TNFa signalointireitteihin, mutta ei iNOS polku, keuhkosyövässä synnyssä.

(A) lusiferaasireporttiterilla määritys villityyppisen ja sumoylation mutantti PPARy plasmideja. RLU, suhteellinen lusiferaasi yksikkö. (B) Tetracycline-indusoima PPARy ja EGFP-proteiinia stabiilisti transfektoiduissa HBEC-C1-wt-PPARy-klooni. Mikroskooppikuvanto tetrasykliiniä aiheuttaman EFGP ilmentymisen (top in B). Immunoblot-määrityksiä varten ilmentymisen lamiini A /C ja tetrasykliini-indusoidun PPARy (pohja B). Bisistroninen konstrukti PPARy ja EGFP: tä stabiilisti tuotu kasvaimia HBEC klooni tuottaa HBEC-C1-PPAR-solulinjat, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). Tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevää pistettä arvioituna

ANOVA

. *

P

0,001 verrattuna HBEC-KT ohjaus.

Kasvu vasteen ja solujen kulkeutumista keuhkosyövän analysoitiin hoitoon PPARy ligandeihin. (A) Cell kasvuvasteeseen.