Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Maksa etäpesäke on yleisin syy kuoleman potilailla, joilla peräsuolen syöpä. Huolimatta laajan tutkimuksen biologia syövän etenemisen molekyylitason mekanismeja, jotka ohjaavat peräsuolen syövän etäpesäkkeiden eivät ole hyvin ominaista.

Methods

HT29 LM1, HT29 LM2, HT29 LM3 solulinjat on johdettu paksu- ja peräsuolisyövän solulinja HT29 toistettuja kierroksia

in vivo

valinnassa immuunipuutteisilla hiirillä.

tulokset

CD44 ilme, läpäisevä glykoproteiini osallisena solu-solu ja solu- matriisi kiinnikkeistä, ja syöpäsolujen tarttumista endoteelisoluihin lisättiin kaikissa

in vivo

valittu solulinjat, mahdollisimman CD44 ekspression ja syöpäsolujen tarttumista endoteelisoluihin erittäin metastaattinen HT29 LM3 solulinjassa. Aktivointi c-Met upon hepatosyyttikasvutekijän (HGF) stimulaation

in vivo

valittu solulinjoissa on CD44 riippumaton.

In vitro

erottaminen CD44 korkean ja matalan ilmentyminen solujen HT29 LM3 solulinjan FACS lajittelun vahvisti, että c-Met aktivaatio on CD44 riippumaton siitä hepatosyyttikasvutekijän stimulaatiota. Lisäksi

in vivo

arvioinnissa CD44 matalan ja korkean ilmentävien HT29 LM3 solujen osoitettiin eroa maksan etäpesäke penetrance.

Johtopäätökset

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että aggressiivinen metastaattisen fenotyypin

in vivo

valittu solulinjoissa liittyy yliekspressio CD44 ja aktivointi c-MET. Osoitamme, että c-Met aktivaatio on CD44 riippumaton siitä hepatosyyttikasvutekijää stimulaatiota ja vahvistavat, että CD44 ilmentyminen HT29 LM3 solulinjassa ei vastaa kasvu metastaattisen penetrance in HT29 LM3 solulinjassa.

Citation: Elliott VA , Rychahou P, Zaitseva YY, Evers BM (2014) Activation c-Met ja lisääntymisen merkkejä CD44 Expression liittyy metastaattisen fenotyypin peräsuolen syövän maksametastaaseja Model. PLoS ONE 9 (5): e97432. doi: 10,1371 /journal.pone.0097432

Editor: Frédéric André, Aix-Marseille University, Ranska

vastaanotettu: 17 helmikuu 2014; Hyväksytty: 18 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 13, 2014

Copyright: © 2014 Elliott et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia R01DK048498 päässä NIDDK ja T32CA165990 NCI. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Yhdysvalloissa [1]. Metastaattinen tai uusiutuva sairaus on yleisin kuolinsyy näillä potilailla. Ennuste CRC perustuu muodostumista etäispesäkkeitä, ei primaarikasvaimen itse. Vaikka kattavaa tutkimusta biologia syövän etenemisen molekyylitason mekanismeja etäpesäkkeisessä Cascade eivät ole hyvin ominaista.

mekanismit etäpesäke liittyy selektiivinen ja peräkkäinen sarja vaiheita, mukaan lukien erottaminen primaarikasvaimen, invaasio kautta ympäröiviin kudoksiin, pääsyn verenkiertoon, ja perustamalla ja lisääntymistä kaukaisessa sijainti [2]. Kaksi proteiinia, joiden on osoitettu olevan mukana useita vaiheita metastaattisen kaskadin ovat CD44 ja c-MET. CD44, joka on läpäisevä glykoproteiini, joka kuuluu perheeseen soluadheesiomolekyylien, on mukana etenemisen ja etäpesäkkeiden useiden syöpätyyppien [3] – [6], ja se on liitetty huonoon ennusteeseen CRC potilailla [3]. c-MET on proto-onkogeeni, joka koodaa reseptorityrosiinikinaasia, joka tunnetaan myös hepatosyyttikasvutekijän reseptori [4]. Ainoa tunnettu ligandi c-MET on hepatosyyttikasvutekijän (HGF); sekä c-MET ja HGF ovat yliaktiivista monissa pahanlaatuisten kasvainten ja liittyy huonoon ennusteeseen ja varhaisessa ennustaja edelleen etäpesäkkeiden [5]. Erityisesti c-MET on osallisena säätelyssä leviämisen, liikkuvuuteen, invaasio ja etäpesäkkeiden kautta fosforylaation ja aktivaation alavirran signalointireittien [4].

Kattava mekanismien ymmärtämistä, jotka ohjaavat CRC etäpesäke on tärkeä kehittää uusia lähestymistapoja hoitoon tämä syöpä. Siksi tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa geenejä, jotka edistävät maksan etäpesäke CRC. Täällä, loimme kolme erittäin metastaattinen CRC solulinjojen ja osoittavat, että niiden aggressiivisempi metastaattisen fenotyypin liittyy lisääntyminen CD44 ilmentyminen ja aktivaatio c-MET. Lisäksi osoitamme, että aktivointi c-MET oli riippumaton tasojen CD44 läsnä. Lopuksi osoittaa, että lisääntynyt CD44 ilmaisu ei ole vastuussa kasvu metastaattisen penetrance HT29 LM3 solulinjan. Tärkeää on,

in vivo

valikointia ja eristämistä maksa-trooppisten CRC metastasoitunut solut antoi meille mahdollisuuden tutkia biologisia mekanismeja CRC syövän etäpesäkkeiden ja tunnistaa mekanismeja, jotka auttavat maksan etäpesäke CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines, transfektoinneilla

HT29 ja Human Lung mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (HMVEC-L) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), aiemmin todennettu marraskuussa 2011 Genetica DNA Laboratories (Cincinnati, OH) viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, Sigma Aldrich (St. Louis, MO), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja antibiootteja-antimykoottia. EGFP-N1 vektori hankittiin Clontech (Mountain View, CA). GFP-proteiinia ekspressoivien solut valittiin 500 pg /ml Geneticiniä (G418), hankittiin Life Technologies (Carlsbad, CA), ja rikastettu kolme sykliä fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS). Valmiista pGL3 tulikärpäsen lusiferaasi (luc) lentivirus- partikkeleita hankittiin Lentigen (Gaithersburg, MD). Lentivirus transduktio, 5000 solua /kuoppa siirrostettiin 96 kuopan kudosviljelylevyille ja tartunnan seuraavana päivänä luc lentiviraalinen hiukkasia MOI 10 läsnä ollessa 10 ug /ml polybreeniä, ostettu Santa-Cruz Biotechnology (Dallas, TX ).

maksametastaasin Malli ja

vivo

Imaging

Male kateenkorvattomia NCR nude-hiirten välillä 6-8 viikkoa ikäisiä ostettiin Taconic ( Hudson, NY). Kotelo näille eläimille pidettiin HEPA suodattamattoman ympäristölle steriloitu häkeissä 12 h valo /12 tunnin pimeä sykliä. Kaikki eläin menetelmät suoritettiin hyväksynnällä ja noudattaen University of Kentucky Institutional Animal Care ja käyttö komitea; protokolla # 2009-0529. Sillä pernansisäistä injektiota CRC-solujen kateenkorvattomia NCR nude-hiiret nukutettiin isofluraanilla (induktio 4%, ylläpito 2%). 1 cm ihon viilto tehtiin vasempaan kylkeen ja suorittaa alas vatsakalvon seinän. Perna huolellisesti alttiina, ja HT29 GFP-Luc-soluja (5 x 10

6 solua /100 ui) ruiskutetaan perna kapseli käyttämällä 27-gaugen neula. Solujen elinkelpoisuus Ymppäykseen oli suurempi kuin 95% määritettynä Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Kevyesti levitettiin inokulointipaikan kunnes ei ollut näkyvää merkkiä verenvuoto. LIGACLIP ylimääräinen yhden leikkeen liittämällä soveltajana titaanista LIGACLIP ylimääräisiä ligaa- leikkeitä, ostettu Ethicon (San Angelo, TX), käytettiin leikata lienal ja lieno-haiman laskimoiden 5 min kuluttua pernan injektion CRC solujen perna poistettiin sitten. Hiiret tapettiin 4 viikkoa tai aiemmin, jos kuolemaisillaan. Maksakudoksissa säilyivät histologista tutkimusta jumiutuminen 10% puskuroituun formaliiniin seurasi parafiiniupotusta.

Kaikki bioluminesoiviin kuvat hankittiin kanssa IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), jossa vaiheessa kuumennetaan 37 ° C aikana elävien solujen kuvantamisen. Kuvat otettiin 10 minuutin kuluttua i.p. injektio D-lusiferiini (150 mg /kg) käyttäen 15 sekunnin altistuksen. GFP fluoresenssikuvantamiseen suoritettiin käyttäen LT-9500 Illumatool /TLS (Lightools Research, Encinitas, CA), joka on varustettu virityslähde (470 nm) ja suodatinlevy (515 nm).

entsymaattinen eristäminen CRC Cells maksametastaaseista

LiberaseÖ DH Research Grade (05401054001; Roche Applied Science) uudelleensuspendoitiin steriiliin veteen 2,5 mg /ml pitoisuus ja säilytetään yhden käyttää 100 ul: -80 ° C. Kollagenaasi /hyaluronidaasia (07912; StemCell Technologies) jaettiin kertakäyttöisiä 250 ul: n eriä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Keräyksen etäpesäkkeitä sijoitettiin täydellinen soluviljelyalustoja täydennetty 1 X Gibco Antibiootti-Anti-sieni (15240-062, Life Technologies) kuljetusta varten. Etäpesäkekasvainten fragmentit hakattu 2 mm: n kuutioiksi käyttäen saksia ja pilkottiin 50 ug /ml Liberase DH (100 ui) ja 0,5X kollagenaasi /hyaluronidaasia (250 ui), laimennettiin 5 ml: McCoy5A seerumivapaassa 4 tunnin ajan 37 ° C varovasti sekoittaen mukaan magneettisekoitussauvalla. Ei undigested kudos ei havaittu. Digestoidut solut pestiin kahdesti täydellisellä soluviljelyalustoja ja siirrettiin 10% FBS McCoy5A alusta täydennettynä 1X Gibco Antibioottinen-Anti-sieni, ja 100 ug /ml Primocin (ant-pm-1, InvivoGen).

Western blot -analyysi ja vasta-aineet

Yhteensä proteiinin lysaatit (20 ug) erotettiin 4-12% bis-tris geelillä ja siirrettiin Immobilon PVDF siirron kalvoja. Membraanit inkuboitiin 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa blocking-liuosta (Tris-puskuroitu suolaliuos, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa ja 0,1% Tween 20), jota seurasi yli yön inkubaatio primaaristen vasta-aineiden 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin sitten 3 kertaa ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 1 tunti. Kun 3 lisäpesua, immuuni komplekseja kalvot visualisoitiin ECL havaitsemiseen.

Seuraavat vasta-aineet hankittiin ja käytettiin tutkimuksessamme: Cell Signaling (Danvers, MA): fosfo-AKT (# 4058), yhteensä AKT (# 2920), AKT2 (# 3063), fosfori-ERK 1/2 (# 4695), yhteensä ERK ½ (# 9107), PTEN (# 9559), fosfori-mTOR (# 2971), yhteensä mTOR (# 2972), fosfori-MET (# 3129 varten western blotting ja # 3077 IHC), c-MET (# 3148), CD44 (# 3570), fosfori-beeta kateniini (# 4176), fosfori-FAK (# 8556), ja yhteensä FAK (# 3285). Santa Cruz (Dallas, TX): AKT 1 (# 5298). BD (San Jose, Kalifornia): Beta kateniinin (# 610154) ja E-kadheriinin (# 610404). Abcam (Cambridge, MA): KRAS (# 55391). Millipore (Billerica, MA): p85α (# 05-212). Kaikki vasta-aineita käytettiin pitoisuutena 1:1,000.

siRNA Transfektiot ja HGF Cell hoito

HGF, hoito-solut ympättiin pitoisuutena 800000 solua /kuoppa kuopan levylle . 24 tunnin jälkeen solujen elatusaine vaihdettiin seerumivapaassa vielä 24 tuntia. Rekombinantti ihmisen HGF (PeproTech # 100-39) lisättiin sitten kuoppiin pitoisuutena 50 ng /ml 5 minuutin ajan. siRNA transfektioissa: ON-TARGET plus CD44 siRNA (LU-00999907, LU-00999908) ja ohjaamaan siRNA (D-001810-10) ostettiin Dharmacon (Lafayette, CO) ja käytettiin pitoisuutena 100 uM.

Immunohistokemia

immunohistokemia (IHC) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [6]. Parafiini-osat poistettiin parafiini ksyleenillä ja niihin lisätään laskevassa etanolia sarjassa. Proteiini värjäys suoritettiin käyttäen DAKO EnVision Kit, hankittiin Dako Corp. (Carpinteria, CA). CD44 ja p-MET-vasta-aineita käytettiin pitoisuutena 1:100 in DAKO vasta-aineen laimennusainetta. Kaikki leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä ja havaittiin valomikroskoopilla.

proliferaatiotestillä

Lapsen HT29 ja HT29 LM3 solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 25000 solua per kuoppa. Proliferaatio määritettiin solujen laskemisen 24, 48, ja 72 h, käyttäen Beckman-Coulter Vi Cell XR solujen elinkykyä analysaattori (Fullerton, CA).

Endothelial Soluadheesiokoe

Ihmisen mikrovaskulaaristen endoteelisoluja keuhkoista (HMVEC-L) aktivoitiin 15 ng /ml TNFa: ssa 4 tuntia. Vanhempien HT29 ja HT29 LM3-solut leimattiin Calcein AM: n (2,5 mg /ml lopullinen pitoisuus) 30 minuuttia 37 ° C: ssa, pestiin, ja lisättiin huipulla yksikerroksista aktivoitujen HMVEC-L-solut 30 minuutin ajan. Irrallinen solut poistettiin pesemällä PBS: llä (5x) ja kolme GFP Kuvat on otettu kuoppaa kohti laskea kiinnittyneet solut.

virtaussytometria-analyysi ja solujen lajittelu

HT29 LM3 solut leimattiin CD44 – Alexa Fluor 647-vasta-aine (Biolegend) pitoisuutena 2,5 ug /ml per 10

7-soluihin 30 min ajan. Solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen lajittelu-puskuriin (1 x fosfaattipuskuroitu suolaliuos, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia). Näytteessä HT29 LM3 soluja, me järjestetty kahden populaation soluja: 10% soluista, joissa on korkea ilmentymisen CD44 (lyhennetty HT29 LM3 CD44 +), ja solut, jotka eivät ekspressoi CD44 (lyhennetty HT29 LM3 CD44-). Värjäytymättömät HT29 LM3 soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. Seuraavat solulajittelulla, solut laajennettiin soluviljelmässä. Yhdistyneen kuningaskunnan virtaussytometria huoltoon suoritettiin solu-analyysi ja solujen lajittelua.

Tulokset

In vivo

valintaprosessi Liver-trooppisten CRC Metastaattinen Cells

CRC maksa etäpesäke on monivaiheinen prosessi, jossa pahanlaatuisten solujen levinnyt ensisijainen kasvain asuttaa maksaan. Pahanlaatuisten solujen ovat invasiivisia ja metastaattinen; kuitenkin vain rajoitettu osa solujen primaarisen kasvaimen pidetään erittäin metastaattinen.

In vivo

valintamenetelmiä, käyttämällä ensisijaista syövän solulinjoja ja vertailu puhtaan klonaalinen populaatiot eristetyn maksa-trooppisten metastaattinen soluissa on hyödyllinen tieteellinen lähestymistapa tunnistamiseksi biologisten mekanismien tehostetun aikana CRC maksan etäpesäke.

tässä tutkimuksessa olemme suunnitelleet HT29 CRC solulinja ilmaista reportteri plasmidit, GFP ja tulikärpäsen lusiferaasi, joka mahdollistaa fluoresenssin ja bioluminesenssi kuvantamisen yhdessä kokeellisessa mallissa, ja suoritetaan

vivo

valinta HT29, että etäpesäkkeitä maksaan. Lyhyesti, HT29-solut ruiskutettiin pernaan Kateenkorvattomien nude-hiirten; pernanpoistoa suoritettiin 5 min kuluttua pernansisäistä injektion CRC solujen välttää uudelleen etäpesäke. Kokeellinen maksametastaaseista (LM; 30-40 etäpesäkeleesioita) kerättiin, perustettiin kudosviljelmässä, ja nimetty HT29 LM solulinjat. Solut kerättiin näistä viljelmistä injisoitiin perna toinen joukko nude-hiirissä. Sekvenssi

vivo

valinta on esitetty kuviossa 1A. HT29LM1 ja HT29 LM3 vaihdella dramaattisesti suhteessa metastasoituneeseen mahdollisia. Bioluminescent hiirten kuvantamiseen pistetään HT29 LM2 osoitti 2,5-kertainen penetrance verrattuna emosolulinjassa (~ 3,5 vkoa kanssa -100% penetrance vs. ~ 4 viikkoa kanssa -40% penetrance) (kuvio 1 B). Siten

vivo

valikoima HT29 solulinjojen tarjotaan erittäin metastaattinen soluja verrattuna vanhempien soluja isogeenisiin tausta.

(A) Kuva metastaattisen CRC

vivo

valintaprosessissa. Kokeellinen maksametastaaseista korjattu, perustettiin vuonna kulttuuriin ja nimettyjen HT29 LM1, LM2 ja LM3 solulinjat. (B) Bioluminescent kuvia hiirten 4 vkoa jälkeen pernansisäistä injektion vanhempien HT29 ja HT29 LM2 solulinjoissa.

c-MET Pathway taso nousee HT29 solulinjat

Molecular analyysi syöpäsolujen eri vaiheissa etenemistä ovat osoittaneet, että muutokset kasvaimen ja onkogeeneihin kertyy kasvaimen etenemistä ja korreloi kliinisten aggressiivisuus syövän. Seuraavaksi suoritetaan vertaileva analyysi useiden onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeniä ilmentymisen profiilit HT29 LM solulinjoissa Western blotilla. Kuvio 2 osoittaa, että fosforylaatiota c-MET on dramaattisesti lisääntynyt HT29 LM1 ja HT29 LM2 solulinjat, korkein aktivaatio HT29 LM3 solulinja, verrattuna vanhempien HT29. Havaitsimme hieman enemmän koko c-MET proteiinia samoin. Nämä muutokset havaittiin, kun soluja viljeltiin normaalissa tai seerumittomissa olosuhteissa (erillisestä kokeesta). Western blot-analyysi uutteissa HT29 LM solulinjat eivät osoittaneet muutoksia Pakt (Ser473), Akt, p85α, PTEN, Perk (Tyr 1234/1235), ERK, k-Ras-proteiinin ilmentyminen (dataa ei esitetty). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että kasvu metastaattisen potentiaalin HT29 solulinjoissa liittyy aktivaatio c-MET-reitin.

HT29 LM1, LM2, LM3 ja emosolulinjassa viljeltiin normaalissa alustassa 24 (ensimmäinen 4 rataa). Toisessa kokeessa soluja viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa 24 h ja stimuloitiin täydellistä elatusainetta 10 min (loput 4 kaistat). Proteiinin ilmentyminen profiilit analysoitiin Western blot. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Expression of CD44 Proteiini lisääntyy merkittävästi HT29 solulinjat

Ilmaisu keskeisten proteiinien CD44, β-kateniinin , ja FAK polkuja, jotka ovat tärkeässä asemassa CRC etäpesäkkeitä [7] – [9] analysoitiin seuraavaksi. Havaitsimme asteittainen nostaminen suurimolekyylisten CD44 ilmentymistä havaittiin ~150 kDa HT29 LM solulinjoissa, mahdollisimman CD44 ilmaisua HT29 LM3 verrattuna vanhempien HT29 solulinjassa (kuvio 3A). Western blot-analyysi uutteissa HT29 LM solulinjat eivät osoittaneet muutoksia p-β-kateniinin (S675), β-kateniinin, p-FAK (Tyr397) ja FAK-proteiinin ilmentyminen (dataa ei esitetty). Edelleen vahvistamme

vitro

havaintojen kartoitettiin vanhempien HT29 ja HT29 LM3 maksan etäpesäke kudosleikkeiden IHC. Yhdenmukainen Western blot-analyysi, ilmentyminen sekä p-MET ja CD44 lisääntyi merkitsevästi HT29 LM3 verrattuna HT29 LM1 (kuvio 3B). CD44 solun pinta-virtaussytometria-analyysi osoitti myös korkeampaa CD44 ilmentymisen pinnalla HT29 LM3 solujen verrattuna emo-HT29 (kuvio 3C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että tehostettu metastaattinen potentiaali HT29 LM solulinjoissa liittyy lisääntyminen CD44 ilme.

(A) HT29 LM1, LM2, LM3 ja emosolulinjassa viljeltiin normaalissa alustassa 24 h. Proteiinin ilmentyminen profiilit analysoitiin Western blot. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) IHC analyysi CD44 ja p-MET ilmentymistä HT29 LM1 ja HT29 LM3 maksan etäpesäke kudosleikkeiden. (C) Virtaussytometrianalyysi of CD44 geometrinen keskiarvo fluoresenssin intensiteettiä vanhempien HT29 ja HT29 LM3 soluja.

korkean tason c-MET Aktivointi HT29 LM3 on riippumaton CD44 Expression

Met on olennainen reseptorityrosiinikinaasin (RTK), joka indusoi syöpäsolujen lisääntymistä, erilaistumista, muuttoliike ja selviytyminen [10]. Met on väliaikaisesti aktivoituu kun HGF induktion ja vaatii erityistä CD44 isomuotojen sen aktivoitumisen erilaisissa syövissä [11], [12]. Ymmärtääksemme paremmin vuorovaikutusta MET aktivointi ja CD44 että vanhempien HT29 ja HT29 LM3 soluja, olemme analysoineet vaikutuksia HGF stimulaation molemmissa solulinjoissa. Kuten kuviossa 4A, HGF-hoito lisää aktivointi c-MET sekä vanhempien HT29 ja HT29 LM3, hieman korkeampi aktivaatio HT29 LM3 solulinjaa verrattuna vanhempien HT29 solulinjassa. Me seuraavaksi transfektoidut HT29 LM3 soluja siRNA kaikkia CD44 isoformit ja käsiteltiin sitten nämä solut HGF. Kuvio 4B osoittaa samalla tasolla c-MET fosforylaatiota läsnä ollessa tai ilman HGF, mikä viittaa siihen, että aktivaatio c-MET väylän HT29 LM3 soluissa on riippumaton CD44 ilmentymisen.

(A) analyysi CD44, p-MET, c-MET, p-AKT ja AKT ilmaisun vanhempien HT29 ja HT29 LM3 jälkeen HGF stimulaation (50 ng /ml; 5 min) Western blot. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) HT29 LM3 solut transfektoitiin CD44 siRNA ja stimuloitiin HGF (50 ng /ml; 5 min) 24 h kuluttua siRNA transfektion. (C) CD44 ekspressio HT29 LM3 ja vanhempien HT29 maksan etäpesäke kudosleikkeiden analysoitiin IHC. (D) HT29 LM3 solut lajitellaan korkean ja matalan CD44 ilme. Solut aidatulla ja lajitellaan kerätä 10% soluista on korkea CD44 ilmaisun ja solujen alhainen CD44 ilme. (E) analyysi CD44, p-MET, ja c-MET ilmaisun vanhempien HT29, HT29 LM3 CD44-, ja HT29 LM3 CD44 + soluja. (F) Analyysi p-MET, c-MET, CD44, p-AKT, ja AKT ilmaisun vanhempien HT29, HT29 LM3 CD44-, ja HT29 LM3 CD44 + -soluissa, sen jälkeen HGF (50 ng /ml; 5 min) stimulaatio.

IHC analyysi CD44 in HT29 LM3 kudosleikkeiden osoitettu olevan vaihtelevia CD44 ilmentymistä maksassa etäpesäkkeitä; klustereita maksametastaaseista korkea ilmentymä CD44 vieressä etäpesäkkeitä alhainen CD44 ilme (kuvio 4C). Tarkempaa analysointia tätä ilmiötä, käytimme virtaussytometrillä ja solujen lajittelu eristämään kahden populaation soluja perustuu solun pinnalla CD44 ilme. Kaksi solulinjojen korkea CD44 ilme (HT29 LM3 CD44 +) ja alhainen CD44 ilmaisun (HT29 LM3 CD44-) perustettiin (kuvio 4D). CD44 ekspressio näissä solulinjoissa vahvistettiin Western blot -analyysillä. Sekä CD44 + ja CD44- solulinjoissa oli korkeammat aktivointi c-Met verrattuna emosolulinjassa (kuvio 4E).

lisäksi vahvistaa, että aktivointi c-MET on riippumaton CD44 ekspression HT29 LM3 solu linja, CD44 + ja CD44- solupopulaatioiden stimuloitiin HGF ja analysoitiin Western blot. Kuten kuviossa 4F, samantasoista c-MET aktivaation CD44 + ja CD44- soluja havaittiin. Siksi osoitamme, että taso CD44 ilmaisun

vivo

koulutettu HT29 LM3 soluja ei korreloi c-Met aktivointitasoa sen luonnollisen ligandin, HGF, joka edelleen varmistaa, että c- MET toimii itsenäisesti CD44 on HT29 LM3 solulinjassa.

Aggressiivinen Metastasoitunut Behavior HT29 LM3 on liitetty suurentunut kyky kiinnittyä endoteelisoluihin, mutta ei säätele CD44 Expression

syöpäsolun kiinnittyminen endoteelisoluihin on tärkeä askel etäpesäkkeiden ja tiedetään säänneltävä CD44 monissa syöpäsoluissa [13]. HT29 LM3 ja vanhemman HT29 solulinjoja leimattiin Calcein AM ja HT29 LM3 sitova kyky endoteelisoluihin arvioitiin

vitro

adheesiomäärityksellä. Olemme osoittaneet, että HT29 LM3 soluilla oli lisääntynyt kyky kiinnittyä endoteelisoluihin, verrattuna emo-HT29 (kuvio 5A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että aggressiivinen metastaattisen fenotyypin HT29 LM3 solujen voi olla seurausta lisääntyneestä solujen tarttumisen endoteelisoluihin.

(A) Adhesion vanhempien HT29 ja HT29 LM3 solujen HMVEC-L-solut arvioitiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Data näytetään keskimääräisenä kertamuutoksia määrässä vanhempien HT29 kiinnitetty HMVEC-L-solut versus HT29 LM3 soluja (* p 0,001). Edustavia kuvat osoittavat tarttumista vanhempien HT29 ja HT29 LM3 solujen HMVEC-L-solut. (B) fluoresoiva GFP kuvantaminen maksan etäpesäke 4 vkoa jälkeen pernansisäistä injektion HT29 LM3 CD44 + ja HT29 LM3 CD44- soluja (5 x 10

6; 100 ui PBS). IHC analyysi CD44 ilmentymisen CD44 korkea ja CD44 alhainen CRC maksan etäpesäke.

vitro

analyysi

vivo

valittu HT29 solulinjoissa havaittu lisääntyminen CD44 ilmaisun ja c-Met aktivointia. Koska kiinnittyminen endoteelisoluihin on ensimmäinen ratkaiseva nopeutta rajoittava vaihe on hematogenous CRC maksan etäpesäkkeiden jälkeen pernansisäistä injektiota ja CD44-reseptorin tiedetään säätelevän syöpäsolujen tarttumista [7], [12], seuraavan kerran arvioitiin rooli CD44 CRC etäpesäkkeitä

vivo

. HT29 LM3 CD44 + ja HT29 LM3 CD44- solut ruiskutetaan pernat kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Neljä viikkoa injektion jälkeen, fluoresoiva GFP kuvantaminen CRC maksametastaaseihin suoritettiin. Kuten kuviossa 5B, taso CD44 ilmaisua ei ollut merkittävää vaikutusta CRC maksan etäpesäke. CD44 ekspressiotaso CD44 + ja CD44- maksametastaaseista vahvistettiin kanssa IHC värjäystä. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen CD44 ei yksin riitä parantamaan CRC maksan etäpesäke ja että muut reitit ovat todennäköisesti mukana.

Keskustelu

tuhoisimmat näkökohta CRC on syntyminen maksan etäpesäkkeitä, joka on vastuussa pääosasta kuolemista tähän sairauteen. Siten ymmärtää molekyylitason mekanismeja etäpesäke on yksi tärkeimmistä asioista syöpätutkimuksessa. Mukaan käsite kasvainsolujen heterogeenisyydestä, erittäin metastaattinen solut ovat läsnä väestöryhmästä primaarikasvain [14]. Tällä hetkellä on mahdotonta tunnistaa metastaattinen ja ei-metastasoitunut solujen primaarikasvaimen. Tässä tutkimuksessa käytimme

vivo

maavalintamalli tunnistaa molekyylimarkkereiden ennustamiseksi metastaattisen potentiaalin CRC soluja. Tämä malli suonensisäisten syöpäsolujen kohdalla perna, korjuu maksametastaaseja, ja uudelleen injektoidaan perna, luo erittäin metastaattinen solulinjoista mikä vahvistettiin useampia imusolmukkeiden ja maksametastaaseista [15]. Vastaavasti meidän tutkimus osoitti, että solut syntyneet

vivo

-valintasykliin tuotti laajan maksan etäpesäke ja että aggressiivinen käyttäytyminen näiden solujen liittyy muutoksia CD44 ilmaisu, c-MET aktiivisuutta ja lisääntynyt kyky CRC solujen kiinnittyä endoteelisoluihin. Siksi malli

vivo

valinta metastasoineeseen solut voivat olla hyödyllinen väline opiskeluun geneettisiä muutoksia soluissa tapahtuviin jolloin ne saavat metastaattisen fenotyypin. Lisäksi hyödyntäminen tämä malli mahdollistaa ymmärtää paremmin mekanismeja, jotka ohjaavat syövän etenemistä ja voidaan käyttää työkaluna löytää ja kehittää mahdollisia terapeuttisia kohteita CRC etäpesäkkeitä.

c-MET ja CD44 ovat co -expressed useissa syöpien, kuten haimasyövän ja CRC [16], [17]. Haimasyöpäsoluissa suurella ilme sekä c-MET ja CD44 osoitettiin olevan suurempi Tuumorigeenisuustutkimuksissa [17]. Lisäksi ilmaus molemmat proteiinit ovat korreloineet lyhyemmän elossaololuku ajanjakson CRC [3], ja äskettäisessä tutkimuksessa meidän laboratorio osoitti, että CD44 ja c-MET aktivaatio liittyy lisääntymiseen CRC etäpesäkkeitä [18]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen tulokset nykyiseen tutkimuksen osoittavat, että kasvu sekä ilmentymisen CD44 ja aktivointi c-MET korreloi kasvuun metastaattisen potentiaalin HT29 LM3 solulinjassa. CD44 ja c-MET yhteistyötä, ja niiden vuorovaikutusta solukalvon johtaa aktivointiin alavirran signalointireittien jotka edistävät syövän etenemistä [19] – [21]. Toisaalta useat tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivointi c-MET on riippumaton CD44 [22], [23]. Tuloksemme viittaavat siihen, että HT29 LM3 solulinja, CD44 ja c-MET toimimaan riippumattomasti läsnä ollessa tai ilman HGF, c-MET-ligandi. Eroavuudet tutkimukset voitaisiin selittää eroilla käytetyt solulinjat ja osoittavat, että laajuus vuorovaikutuksen CD44 ja c-MET voi olla solu- tyypistä. Koska molemmat proteiinit on liitetty huonoon ennusteeseen on monia syöpiä, edelleen tutkimus niiden vuorovaikutusta metastaattisen solulinjoissa on ratkaisevan tärkeää, ja se voi johtaa uusiin hoitotavoitteet.

paremmin ymmärtää roolin CD44 , käytimme kahden populaation HT29 johdettujen solujen, CD44 + ja CD44-. Mielenkiintoista, meidän tietojen mukaan CD44 ei ole keskeinen proteiini ajo HT29 peräisin olevat solut muuttuvat yhä metastaattinen ja että todennäköisesti, c-Met aktivointi tai muita väyliä parantaa CRC maksan etäpesäke. Mallissa, CD44 ja c-MET signaali itsenäisesti, mikä osoittaa, että c-MET signalointi ei heikennetä CD44- soluja ja jatkaa ajaa etäpesäkkeitä. Lisäksi on olemassa monia isomuotoja CD44 johtuen vaihtoehtoisen silmukoinnin, että pelata erilaisia ​​rooleja etäpesäke, mikä voi selittää ristiriita roolit CD44 in etäpesäkkeiden. Jokainen isoformi on eri rooli syöpäsoluissa ja joidenkin syöpien vain ilmaista yksi isomuotojen taas toiset ilmaista useita isomuotoja [7]. Siksi määritettäessä tarkka toiminto, joka CD44 pelaa jokaisessa tasyöpäsolulinja yhä tärkeämpää kierrätykseen CD44 terapeuttisena kohteena.

Johtopäätökset

perusteellinen ymmärtäminen geneettisiä mekanismeja, jotka aloittaa metastaattinen cascade ja edistää CRC etäpesäke eteneminen maksaan on tärkeää kehittää uusia syöpähoitoihin. Pure klonaalisia populaatioita eristetyn maksa-trooppisten metastasoitunut solut antoi meille mahdollisuuden selektiivisesti tutkia ja vertailla biologisten mekanismien välittäjänä CRC etäispesäkkeitä maksaan. Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että aggressiivinen metastaattinen fenotyypin

vivo

valittu HT29 solulinjassa liittyy yliekspressio CD44 ja aktivointi c-MET. Osoitamme, että c-Met aktivaatio on CD44 riippumaton siitä HGF stimulaation ja vahvistavat, että CD44 ilmentyminen HT29 LM3 solulinjassa ei vastaa kasvu metastaattisen penetrance in HT29 LM3 solulinjassa. Mikä tärkeintä, me osoittavat, että malli

vivo

valinta CRC metastaattisen soluja on arvokas väline määriteltäessä mekanismeja, jotka auttavat maksan etäpesäke CRC ja tunnistaa molekyylitason väyliä kohdennettua terapiaan CRC maksa etäpesäke.

Kiitokset

Tekijät Kiitokset Donna Gilbreath ja Heather Russel Simmons apua käsikirjoituksen valmistelu, Jennifer Strange ja Greg Bauman apua FACS, ja Dana Napier hänen työstään Markey Biospecimen ja kudostenhankintaryhmä resurssin Facility.