Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sperm proteiini (SP17) on houkutteleva kohde munasarjasyöpä (OC) rokotteita, koska sen yli-ilmentymisen ensisijainen sekä etäpesäkeleesioita kaikissa vaiheissa taudin. Meidän tutkimukset viittaavat siihen, että SP17-pohjainen rokote voi aiheuttaa pysyväisen puolustuslinja OC kehitystä C57BL /6-hiirten kanssa ID8 solujen jälkeen profylaktisia ja terapeuttisia hoitoja. Tämä on ensimmäinen kerta, kun hiiri vastine syövän kiveksen antigeeni (SP17) osoitettiin ilmaistaan ​​OC hiirimallissa, ja että rokotus tämän antigeenin merkittävästi ohjattu kasvaimen kasvua. Tutkimuksemme osoittaa, että CpG-adjuvanttia SP17 rokote ratkaisee ongelman immunologinen toleranssi, suurimpana esteenä kehittämään tehokasta immunoterapiaa OC. Lisäksi tämä tutkimus tarjoaa paremman käsityksen OC biologian osoittamalla, että Th-17-solujen aktivointia ja nykyaikainen immunosuppressiivinen T-reg-solujen eston tarvitaan rokotteen tehoa. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ennalta ehkäisevää ja terapeuttista rokotukset voivat aiheuttaa pitkäaikaisen suojan OC ja viive kasvaimen kasvua, mikä viittaa siihen, että tämä strategia voi tarjota lisää hoitoja ihmisen OC ja sairauksien ennaltaehkäisyssä puhkeamista naisilla, joiden suvussa OC.

Citation: Chiriva-Internati M, Yu Y, Mirandola L, Jenkins MR, Chapman C, Cannon M, et al. (2010) Cancer Kivesten antigeeni Rokottaminen Tuottaa pitkäaikaisen suojan hiirimallissa munasarjasyöpään. PLoS ONE 5 (5): e10471. doi: 10,1371 /journal.pone.0010471

Editor: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Lasten Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 helmikuu 2010; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2010; Julkaistu: toukokuu 12, 2010

Copyright: © 2010 Chiriva-Internati et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat Billy ja Ruby Virta Endowment for Cancer Research ja Laura W. Bush instituutti Naisten terveys- ja Center for naisten terveys ja tasa-Based Medicine. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä (OC) on kuudenneksi yleisin syöpä ja seitsemäs johtava syy syövän naisten yleisin kuolinsyy [1], [2]. Joukossa OC, 90% tapauksista edustaa epiteelin munasarjojen syöpien (EOC), jotka johtuvat epiteelin vuori, munasarjojen pinnan tai osallisuudesta kystat [3], [4]. Kuolleisuutta OC johtuu kyvyttömyydestä havaita taudin varhaisessa elimeen rajoittunut vaiheessa ja siitä puuttuu tehokas hoitojen myöhäisvaiheen tauti [4]. Myöhään diagnoosi ja korkea resistenssi kemoterapiaa rajoittaa hoitomahdollisuuksia. OC potilailla, joiden suvussa OC osuus 10% kaikista tapauksista [5]. Kliiniset vaihtoehtoja näillä potilailla ovat kirurgisia toimenpiteitä, joka johtaa hedelmättömyyteen tai kemopreventiossa ehkäisypillerit, johon usein liittyy vakavia sivuvaikutuksia [6], [7]. Immunoterapia strategiat kuten syövän rokotteet pidetään vähemmän myrkyllisiä ja täsmällisempi kuin nykyiset hoidot [8], ja siksi pidä mahdollista tarjota etuja OC potilaille, joilla on ilmeinen taudin ja korkean riskin OC potilailla. Koska niiden toiminnan spesifisyyttä, voimakkaita ja pysyviä vaikutuksia ja sovellettavuus lähes mitä tahansa kasvain, syöpälääkkeen rokotteet ajavat edun kliinisen onkologit. Keskeinen askel kehityksessä perus syövän rokotteiden toteuttamista rokotusstrategioiden mahdollistaa johdonmukaisen immuunivasteiden induktio tuumoriantigeeneille. Tältä osin Sopivien antigeenejä, jotka perustuvat sekä taajuuden ja erityistilanteiden ilmaisun syövässä kudoksissa, on ensiarvoisen tärkeää. Syöpä /kivesantigeenien (CTA) [9], [10], [11], [12], jotka sisältävät SP17 antigeeni [9], [13], [14], [15], [16], on syntymässä lupaavina ehdokkaita immunoterapeuttinen tavoitteita. CTA edustavat alaluokka, kasvaimeen liittyvien antigeenien (TAA), jotka ovat ei-mutatoidun omia antigeenejä ilmaistaan ​​tai yli-ilmentynyt kasvaimissa, ja tunnistavat CD8-T-solujen [12], [14], [17], [18], [19], [20]. Immunogeeninen SP17-proteiinia on karakterisoitu kattavasti [10], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Ihmisen SP17 on erittäin konservoitunut, jolla 70% homologiaa kanin ja hiiren, ja 97% homologia paviaani [25]. SP17 on molekyylipaino 17,4 kDa, jota koodaa geeni sijaitsee kromosomissa 11, ja on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​syövissä liittymättömän histologisten alkuperästä [25] mukaan lukien multippeli myelooma (MM) ja OC [21], [22]. SP17-spesifistä CTL: ää, joka on luotu normaaleilta luovuttajilta, MM ja OC potilailla, on osoitettu tappaa HLA-täsmäsi kasvainsolulinjoja ja tuoretta kasvainsoluja, joissa SP17 epitooppeja sitovat HLA luokan I molekyyleihin [13], [14], [21] . Nämä havainnot tukevat viimeaikaiset tutkimusten mukaan SP17 voi olla sopiva antigeeni immuunihoidolle OC [13], [25]. Rekombinanttiproteiinit käytetään yleisesti kehittämiseen antiviraalisia rokotteiden, ja voi olla houkutteleva ehdokas antituumorivaikutuksen rokotteet [11], [26], [27], [28], [29]. Antigeeniä esitteleviä soluja (APC: t) tunnistavat taudinaiheuttajia läpi erilaisia ​​reseptoreita, kuten Toll-kaltaiset reseptorit (TLR), jotka tunnistavat taudinaiheuttajan liittyvä molekyyli malleja, mukaan lukien CpG-oligodeoksinukleotidit (CpG ODN) sisällä määritellään viereisten sekvenssien [27], [ ,,,0],29], [30], [31]. CpG-motiivit, jotka ilmaistaan ​​usein bakteerin genomiin, mutta genomisesti tukahdutetaan selkärankaisissa, pidetään ulko- immuunijärjestelmää ja, sen seurauksena, edistää isännän puolustusmekanismit [11], [27], [29], [32], [33], [34]. CpG-ODN näytteille suuria mahdollisuuksia terapeuttisessa syövän hoidossa johtuen niiden kyvystä aktivoida synnynnäisen ja adaptiivisen immuniteetin [15], [26], [27], [28]. TLR9 sitova CpG indusoi erityksen Th1 sytokiinien, mukaan lukien IFN-γ ja TNFa, ja tuotanto antigeenispesifisten IgG2a B-solujen [11], [12], [32], [33], [34]. Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet ennalta ehkäisevää ja terapeuttista immuunivaste toistuvilla rokotuksen SP17 rekombinanttiproteiinia annettiin CpG. Käytimme hiiren ID8 OC-solulinja, joka on peräisin spontaanista

in vitro

pahanlaatuisiin C57BL /6-hiiren munasarjojen pinnan epiteelisolujen indusoimaan kasvaimen kasvua hiirissä [34]. Tuloksemme osoittavat ensimmäistä kertaa, että täyttöajon SP17 proteiinia ja CpG on tehokas strategia indusoi kestävä OC terapia.

Tulokset karakterisointi SP17 ja MHC-I ilmentymisen ID8 soluissa

SP17 mRNA (kuva 1a) ja SP17-proteiinia (kuvio 1 b) havaittiin ID8 solulinjassa. Lisäkarakterisointia immunosolukemiallisella (ICC) ja immunofluoresenssilla (IF) paljasti sytoplasmista ja pinnan värjäytyminen näiden solujen (kuva 1c). Sytospin of ID8 läpäiseviksi (P) solut osoittaa positiivisen sytoplasminen värjäys SP17, joka vahvistettiin IF. Lisäksi ei läpäiseviksi (NP) solut osoittavat myös selkeä osoitus kautta IF (kuva 1c, alempi neljännesten) vaikkakin vähemmän ICC (kuva 1c, ylempi neljännesten). Olemme lisäksi määritettiin SP17 pinta ilmaisun flow-Sytometrinen analyysi, joka osoitti korkean taajuuden SP17 positiivisten solujen (kuvio 1 d). Vastaavasti virtaussytometrialla analyysi paljasti, että 60% ID8 värjättyjen solujen positiivinen MHC-I alla pohjapinta viljelyolosuhteissa, kun on lisätty 100 IU /ml IFN-γ 72 tuntia johti 98% MHC-I positiivisia soluja.

SP17 mRNA hiiren ID8 kasvainsoluja ja hiiren kiveksissä (positiivinen kontrolli). MRNA-tasot analysoitiin RT-PCR: SP17 ilmaisua. Solun taloutta geenin, B-aktiini, sisällytettiin kontrollina. PCR-vasta kontrolli (ei RT vaihe) ei ole tuottaa tuotteen, mikä osoittaa, ettei DNA-kontaminaation näytteissä. Lisäksi RT-PCR: llä (katso kuvio 1 a), Western blot suoritettiin ja kuvio 1 b esittää ilmentymisen SP17 proteiinitasolla. ID8 solulinja edelleen ominaista immunosytokemialla (ICC) ja immunofluoresenssilla (IF). Kuvassa on Sytospin on ID8 soluja läpäiseviksi (P) ja positiivinen värjäytyminen SP17 on solulimaan tasolla. Lisäksi SP17 vahvistettiin IF sytoplasmassa. Lisäksi kuvassa 1c, ei läpäiseviksi (NP) solut näyttävät selvä osoitus kautta IF ja vähemmän ICC. Paneeli d osoittaa ID8 luonnehdintaa pinnan ilmentyminen SP17 ja MHC-I; isot. ctrl, isotyyppiset kontrollivasta-aine; prosenttiosuus osoittavat positiivista värjäämällä solut. MHC-I ilmentyminen arvioitiin kanssa tai ilman IFN-g stimulaatiota.

In vivo

kasvua ID8 solujen intraperitoneaalisen injektion jälkeen

neljä erilaista annosta ID8 solujen (10

5, 5 x 10

5, 10

6 ja 2 x 10

6) injektoitiin neljään ryhmään hiirten (viisi per ryhmä) määrittää optimaalisen annoksen induktioon kasvaimen /askites muodostumista. Kukin joukko kokeellisia rokotteita eri annoksilla ID8 solujen suoritettiin vähintään kolme kertaa. Eläimet kustakin kasvain titrausta ryhmä tapettiin eri ajankohtina, jolloin kuolinsyytutkimus tehtiin kokonainen eläin ja leikellään elimet (ei esitetty). Optimaalinen kasvaimen kasvua (perustuu aika ja ulottuvuus) havaittiin 1 4 olosuhteissa (2 x 10

6 ID8 solua) testattu. Kuva 2a osoittaa, että i.p. injektio 10

5 ID8 solut tuottivat kasvaimen kasvun jälkeen 120 päivää, kun taas 5 x 10

5 ID8 solujen tuottamat tuumorimassan /askiteksena 90 päivää (kuvio 2b). Annos 106-solut osoittivat merkittävää kasvaimen massa /askites kasvua noin 60 päivää (kuvio 2c) ja kun 2 x 106 ID8 solua injektoitiin, optimaalinen syöpäkasvain /askitesta saavutettiin 40-45 päivää (kuvio 2d), ja eniten kuolemantapauksia tapahtui välillä 50-65 päivää, johtuvat joko kasvaimen massan tai uhrata välttää liiallista epämukavuutta hiirillä. Kuvio 3a esittää hiiri injektoitiin optimaalinen annos (2 x 10

6) on ID8 solujen tuottamiseksi kasvain massa /askites (44 mm leveä) alle 45 päivää, ja ohjaus hiiri (20 mm leveä) että ei injektoitu ID8 soluihin. Kuvio 3b esittää sukupolven vesivatsoja ip-injektion 2 x 10

6 ID8 solujen alle 40 päivää, ja näyttää myös yksityiskohtaisen kuvan vatsaonteloon hiiren jälkeen imemällä 22 ml askites, paljastaa useita metastaattisen solmut ja kasvaimen massoja. Lisäksi kuvio 3 vahvistaa, että solut vatsakalvon injektoitujen hiirten kanssa ID8 solut ilmentävät SP17 immunohistokemialla (IHC), kun taas solut hiirestä ilman kasvaimen injektiota olivat negatiivisia SP17 (luvut 3e, f ja g). Nämä tulokset osoittavat, että SP17 ilmaistaan ​​ID8 solulinjassa,

in vivo

. Vahvistaa kasvaimen massa /askites peräisin ID8 solut, yksilöt vatsakalvon, syöpäkasvaimen /solmut, keuhkot, maksa, askites, perna ja munasarjat tutkittiin RT-PCR: llä. Tulokset näytetään kuviossa 3d, (edustava kuva 5 hiirtä koetta kohti, toistettiin kolmena kappaleena) ja ID8 injektoitu hiiriin (kuva 3d-1) ja kontrollihiiret (kuva 3d-2). Edelleen fluoresenssipohjaiset lokalisointi määritys suoritettiin havaitsemiseksi GFP-positiivisten ID8 solujen

in vivo

, ja vahvisti vatsakalvon lokalisoinnin ID8 soluja (kuvio 3h).

Näyttää asteittainen muodostuminen askites /kasvaimia ip ruiskutettiin ID8 soluihin. ID8 injektiona saaneiden hiirien esitetään m1-m5. Verrokkihiiret injektoitiin pelkkää PBS: ää. 1 a esittää hiiriin ruiskutettiin 10

5 ID8 soluja. Kasvaimet eivät pääse merkittävän suuruinen vasta 150 päivää. 2b esittää asteittaisen muodostumisen askitesta /kasvaimia i.p. pistetään 5 x 10

5 ID8 soluja. Kasvaimet eivät pääse merkittävän suuruinen vasta 120 päivän kuluttua. 2c esittää asteittaisen muodostumisen askitesta /kasvaimia i.p. ruiskutetaan 10

6 ID8 soluja. Kasvaimet saavuttivat merkittävän koon 90-120 päivää. 2d esittää asteittainen muodostuminen askitesta /kasvaimia i.p. injektoitu 2 x 10

6 ID8 soluja. Kasvaimet saavuttivat merkittävän koon 35-60 päivää (p 0,0001); näkyvä laajeneminen hiirillä havaittiin 30 päivää.

la esittää vasemmalla puolella ohjaus hiiri (leveys hiiren 20 mm) ei injektoitu ID8 solujen ja oikealla puolella hiiren ruiskutetaan 2 x 106 ID8 solua 40 päivän jälkeen (leveys hiiri 44 mm). Nämä hiiret ovat kokeita samanlaisin tuloksin. b esittää koko vatsaonteloon askites indusoida ip injektion 2 × 106 ID8 40 päivää (vasemmalla) ja avoin näkymä ontelon useita metastaattisen solmuja ja kasvain massat (keskimmäinen ja oikea, kun imemällä 22 ml askites) . c esittää vatsakalvon negatiivinen SP17 vertailuliuoksesta hiiri ei injektoitu ID8 soluihin. f osoittaa positiivista ilmentymistä SP17 on vatsakalvon hiiren injektoitu 2 x 106 ID8 solun jälkeen 40 päivää. Kives on positiivinen ohjaus SP17 Ich (g). Kuvio d esittää PCR SP17 DNA: ta (ja B-aktiini-ohjattu): kudoksen paneelin johdettu (1) elinten 2 x 106 ID8 ruiskutettiin hiirtä oli positiivinen SP17 ja paneelin kudosten, jotka ovat peräisin elinten terveen hiiren paljasti no ilmaus SP17. Positiiviset kontrollit (ID8 ja kiveksissä) ja SP17 on myös esitetty. Paneeli h näkyy in vivo fluoresenssi kuvaa ohjaus (vasemmalla) ja ID8-pistetään (oikealla) hiiren lokalisoinnin GFP-positiivisten ID8 soluja.

immunisaatiomenetelmiä ja mittaus kasvaimen kasvua

hiiret rokotettiin erilaisia ​​koostumuksia: SP17 vain; CpG vain; ja SP17 + CpG, samanaikaisesti. Yhteensä 22 hiiret immunisoitiin kukin rokoteformulaatio. Hiiret immunisoitiin lihakseen (i.m.) 50 ug SP17 proteiinia ja 20 ug CpG eri aikapisteissä kuten edellä. Arviointi kasvaimen kasvun ja /tai askitesta seurattiin kolmen viikon välein käyttämällä insinööri jarrusatulat. Survival seurasi kunnes kasvaimet olivat saavuttaneet määriä yli 1000 mm

3, mukaisesti meidän Institutional Animal Care ja Käytä komitean suuntaviivoja.

arviointi eloonjäämisluvut jälkeen profylaktisia ja terapeuttisia SP17 /CpG rokotukset

Tuumorisolut ruiskutettiin 30 päivän kuluttua 3

rd rokottamisen profylaktista hoito, tai 21 päivää ennen ensimmäistä terapeuttiseen rokottamiseen. Kaikki SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä (100%) oli kasvain-free 91 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen injektion ID8 soluja (2 x 10

6), kun taas yksikään rokottamattomien eläinten (ID8 vain) olivat elossa. Kuvio 4a näyttää eloonjäämislukuja hiirillä, jotka saivat ennalta ehkäisevää immunisointia: 12,5% of SP17 + CpG rokotetuista hiiristä kehittyi pieniä kasvainmassoja ja askites jälkeen 91 päivää ja kuoli 180 päivän kuluttua raskaalla kuormalla kasvaimia. Lisäksi, 8% rokotetuista hiiristä kehittyi kasvaimia ja askites, ja kuoli 200 päivää. Kuitenkin, nämä kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä kuin munasarjojen kasvaimia kontrollihiiret, jotka oli rokotettu vain PBS: ää. Yleinen eloonjääminen SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä oli 79% yli 300 päivää. Analyysi suoritetaan Log-rank (Mantel-Cox) Testi osoitti, että yleinen eloonjäämiskäyrien olivat tilastollisesti merkitseviä (p 0,0001) ryhmän rokotettiin SP17 + CpG verrattuna muihin rokotteen titrausten. Kuviossa 4b on esitetty eloonjäämislukuja hiirillä, jotka saivat terapeuttista immunisointia. Alle 11%: SP17 + CpG rokotetuista hiiristä kehittyi pieniä kasvainmassoja ja askites jälkeen 150 päivää ja kuoli 210 päivän raskaan kuorman kasvaimia. Lisäksi alle 10%: n rokotetuista hiiristä kehittyi kasvaimia ja askites, ja kuoli 280 päivää. Yleinen eloonjääminen SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä oli 80%, yli 300 päivää. Analyysi suoritetaan Log-rank (Mantel-Cox) Testaa ja osoitti, että kaiken kaikkiaan eloonjäämiskäyrien olivat tilastollisesti merkitseviä (p 0,0001) ryhmän rokotettiin SP17 + CpG verrattuna muihin rokotteen titrausten. Lopuksi kontrolliryhmiin rokotetut SP17 yksin ja CpG yksin esiintyi jonkin verran tai ei lainkaan suojaa, joka ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 4a ja 4b).

eloonjäämisaste hiiriä neljästä profylaksia (a) tai terapeuttisia (b ) ryhmät, tarkemmin tekstissä (kasvainta, SP17 + CpG rokotettu, rokottamattomia, SP17 tai CpG rokotettu). Kasvain hiiret olivat i.p. ruiskutetaan 10

6 ID8 soluja sekä ennalta ehkäisevään ja hoito-. Kasvaimen solua injektoitiin 30 päivän kuluttua 3

rd rokottamisen profylaktista hoito, tai 21 päivää ennen ensimmäistä terapeuttiseen rokottamiseen. Terapeuttisen ryhmän keskimääräinen painoero kasvaimen altistetuissa ja kasvaimen eläimissä oli 10 g alussa rokotusohjelmaa. Vaaka-akseli näyttää ajan ilmaistuna päivää hoidon aloittamisesta. Log-rank-testi osoitti tilastollisesti merkitsevää eroa rokottamattomia ja SP17 + CpG rokotettu versus rokottamattomiin tai CpG hoidetussa ryhmässä (p 0,0001) molemmilla annoksilla.

mittaaminen SP17-spesifejä vasta-aineita ja sytokiiniekspressiota ELISA-määritys

analyysi SP17-spesifisen vasta-ainevasteen rokotetussa hiirillä on esitetty kuvassa 5. edustaja ELISA-määritys suoritettiin analysoida immuunivasteen 3 eri rokoteformulaatioissa: SP17 + CpG; CpG vain; ja SP17 vain. Myöhemmät rokotukset lisääntynyt spesifinen anti-SP17-vasta vasteita verrattuna ensimmäisen rokotuksen. Kuviossa 5b, osoitimme suuren määrän erityisiä anti-SP17 vasta molempien SP17 muotoiluja 3

rd rokotuksen. Selvitimme toistuva rokotusohjelma, koska hoitopaikassa, potilaat, jotka ovat remissiossa usein edelleen rokottaa niin, ettei kasvaimen uusiutuminen. Oli kuitenkin lievää laskua määrästä immuunivasteen verrattuna 3

rd rokotus analysoi kaikissa kolmessa muotoiluja klo 9

th rokotuksen (kuvio 5c), mutta anti-SP17 IgG tasoilla SP17 + CpG rokotettu ryhmä olivat vielä tilastollisesti suurempi verrattuna muihin rokoteformulaatioissa (p 0,001). Terapeuttisessa hoito-ryhmä, SP17 + CpG rokotetuista hiiristä osoittivat merkitsevästi korkeampi (p 0,01) tuotanto IgG-SP17 jälkeen 270 päivää, verrattuna hiirille on annettu muita muotoiluja (kuva 5d). Kuviossa 6 osoitimme sytokiinien päivänä 270 (klo 9

th rokotus) sekä profylaktinen (6a) ja terapeuttisen (6b) hoito. Seerumi kerättiin ja analysoitiin ELISA-määrityksellä (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ: n, TNF-α, GM-CSF) hiiristä, jotka oli rokotettu SP17 + CpG ja niitä verrattiin seerumin hiiristä rokotetut SP17 yksin, CpG yksinään tai pelkkää PBS. Mielenkiintoista on, että IFN-γ päässä SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä oli kasvanut lähes kaksi taittuu verrattuna SP17 rokotettujen eläinten tai noin kolme poimuja verrattuna CpG rokotettujen eläinten (kuva 6a ja b). Profylaktisesti-rokotetuista hiiristä, TNF-α päässä SP17 + CpG formulaatio lisättiin enemmän kuin kolme taittuu, verrattuna CpG-rokotetuista hiiristä, ja vain kaksi taittuu verrattuna SP17-rokotetuista hiiristä (kuvio 6a). GM-CSF: n välein kolme taittuu korkeampi kuin CpG-rokotetuista hiiristä, ja pienempi kuin kaksi taittuu korkeampi verrattuna SP17-rokotetuista hiiristä (kuvio 6a). Terapeuttisesti rokotetuista eläimistä, TNF-α päässä SP17 + CpG formulaatio lisättiin kaksi taittuu verrattuna CpG ja SP17 yksin formulaatioiden (kuva 6b). GM-CSF näkyy kaksi-kertaiseksi ja enemmän kuin yksi-kertainen kasvu verrattuna CpG ja SP17 formulaatiot yksin, vastaavasti (kuva 6b). Jotka koskevat muiden sytokiinien, ei ollut merkittävää IL-2, IL-4, IL-5 tai IL-10 (kuvio 6a ja b).

hiiristä peräisin oleva seerumi tehty erilaisia ​​hoitoja kerättiin ja analysoitiin ELISA tasojen verenkierrossa anti-SP17 IgG. X-akseli osoittaa sarjalaimennoksia seerumia. a, b ja c esittävät saatujen tulosten ehkäisevä rokottaminen järjestelmiä, kun taas d näyttää vaste hiiriä hoito-ohjelman. Päivänä 7 (a) immuunivastetta oli alhainen SP17. Päivänä 97 (b), immuunivastetta oli suurempi kuin 7. päivänä Päivänä 270 (c), vastaus on SP17 oli hieman vähemmän kuin päivänä 97.

Päivänä 300, seerumi kerättiin ja analysoitiin ELISA: lla mittaamiseen osoitetun sytokiinin tasojen profylaktisesti (a) tai terapeuttisesti (b)-rokotetuista hiiristä. Molemmilla annoksilla, IFN-gamma, TNF-alfa: n ja GM-CSF tilastollisesti merkittäviä välein havaittiin vain SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä verrattuna kontrolleihin (PBS). Mitään merkittäviä eroja ei osoituksena IL-2, IL-4, IL-5 tai IL-10-tasoja.

CTL antitumor vasteita

Kuvassa 7a, ELISPOT-IFN -γ määritys suoritettiin päivänä 270 (9

th rokotus) käyttäen pernasoluja SP17 + CpG ennaltaehkäisevästi immunisoiduista hiiristä. Strategia toistuvien rokotusten tässä eläinmallissa on vastaavaksi ihmisen kliinisissä tutkimuksissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että taajuus SP17 CTL lisääntyivät optimaalinen ryhmässä (SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä) ja osoitti 220 ± 30 positiivista paikkoja pernasolujen vs. SP17 rokotettu (184 ± 18) ja verrattuna CpG-rokotetuista hiiristä jotka olivat jopa 9 ± 2. Kuviossa 7b, ELISPOT-TNF-α-määritys suoritettiin päivänä 270 (9

th rokottamiseen ennalta ehkäisevää aikataulu) käyttäen pernasoluja SP17 + CpG immunisoiduista hiiristä (joka oli paras formulaatio vahvan immuunivasteen). Nämä tulokset viittaavat siihen, että taajuus SP17 CTL lisääntyivät optimaalinen ryhmässä (SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä), joka osoittaa 240 ± 35 positiivista paikkoja pernasolujen vs. SP17 rokotettiin vain (200 ± 31) ja verrattuna CpG-rokotetuista hiiristä jotka olivat niinkin alhainen kuin 12 ± 2. Vastaavasti terapeuttisen rokotusohjelmaa, taajuus SP17-spesifisten CTL kasvoi SP17 + CpG ryhmä 259 ± 20 IFN-γ ja 159 ± 30 TNF-α positiivinen paikkoja, versus 100 ± 20 IFN-γ ja 70 ± 10 TNF-α positiivinen paikkoja SP17 ja CpG vain muotoiluja, vastaavasti (kuvio 6c ja d). Nämä tulokset kokonaisuudessaan viittaavat korkea ja erityinen immuunireaktion aiheuttama SP17 kun se annetaan samanaikaisesti CpG riippumatta hyväksyttyjen rokotusohjelma sytotoksisuusmäärityksen mukaan

51Cr-release mittaus pernasoluja kerättiin aikaan 1

st, 3

rd ja 9

th rokotuksista peräisin SP17 rokotetuista hiiristä, CpG-rokotetuista hiiristä, ja SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä. CTL-testi osoitti voimakkaampaa CTL-vasteita SP17 + CpG-rokotetuista hiiristä verrattuna immunisoitujen hiirien SP17 tai CpG vain, sekä profylaktinen (kuva 8) ja terapeuttisen (kuva 9) hoito. Koska normaaleissa ID8 viljelyolosuhteet

in vitro

, on alhainen MHC-luokan I molekyylien ID8 soluja käsiteltiin

in vitro

kanssa IFNy (100 IU /ml 72 tuntia) aiheuttavan korkeampia ekspressiotasoja, kuten aiemmin on raportoitu (kuva 1d, alempi paneeli). ID8 solut aktivoidaan IFN-γ käytettiin parempia tavoitteita sytotoksisuusmäärityksen.

Päivänä 270 (9

th rokote) pernasoluja erilaisia ​​koostumuksia rokotettujen hiirten ja valvonta kerättiin ja analysoitiin ELISPOT määritys. a, b) taajuus IFN-gamma ja TNF-alfa-positiivisten solujen profylaktinen rokotukset; c, d) tiheys IFN-gamma ja TNF-alfa-positiivisten solujen terapeuttista rokotuksia. Nämä tulokset on esitetty pisteitä muodostavaa solua kohti 10

6 pernasolua. Spot numerot edustavat keskiarvoa kymmenen hiirtä kussakin rokotettu ryhmä; baareja, SE.

pernasoluja kolmen eri formulaatioiden profylaktisesti rokotettujen hiirten ja valvonta kerättiin ja analysoitiin

51Chromium-release assay päivinä 7 (ensimmäinen rokote), 97 (kolmas rokote) ja 270 (yhdeksäs rokote), käyttäen pernasoluja efektorisoluina ja ID8 kohdesoluina. Nämä tulokset saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta. X-akseli osoittaa efektori: kohde-suhteilla.

pernasoluja kolmen eri formulaatioiden terapeuttisesti rokotettujen hiirten ja valvonta kerättiin ja analysoitiin

51Chromium-vapautumisen määrityksellä. Nämä tulokset osoittavat kolmen erillisen kokeen jälkeen kolmas rokote (päivä 97) ja yhdeksännen rokote (päivä 270) käyttäen splenosyyttien efektorisoluina ja ID8 kohdesoluina. X-akseli osoittaa efektori: kohde-suhteilla.

arviointi Th-17 ja T-reg solun taajuuden

Kuvio 10 esittää taajuuden Th-17 tai T-reg solujen SP17 + CpG rokotettu tai kontrollihiiriin pernasolujen, kerättiin eri aikapisteissä (ei kasvainta: päivä 0, ID8 vain: päivä 45, profylaktisia ja terapeuttisia päivä 270).

pernasoluja hiiristä, jotka saivat ennalta ehkäisevää tai terapeuttista rokotuksia tai valvontaa (hiiret, joilla ei ole kasvainta tai kasvainta kantavien hiirten ilman rokotuksia) kerättiin eri aikapisteissä (ei kasvainta: päivä 0, ID8 vain: päivä 45, profylaktisia ja terapeuttisia rokotteita: päivä 270) analysoitiin virtaussytometrialla mittaus on ) Th-17 väestöstä (CD4 /IL-17-double positiivinen) tai b) T-reg väestöstä (CD4 /Foxp3-double positiivinen) taajuudella.

sekä profylaktinen ja terapeuttinen rokotukset herättänyt merkittävää kasvua in Th-17 ja väheneminen T-reg solujen keskiarvo taajuuksilla (3-ja 1,5-taittuu vastaavasti kuva 10) verrattuna kasvaimeen haastoi rokottamattomiin eläimiin (pariton t-testi p 0,001, sillä rokotettujen versus kontrolli käsittelemätön hiiret) . Käsittely ja ennaltaehkäisevän rokotteita koostuvat SP17 tai CpG yksin aiheutti myös lisäys Th17 taajuuksilla; kuitenkin, tällainen vaikutus ei ollut merkittävä (pariton t-testi, p 0,05, sillä SP17- tai CpG- ainoastaan ​​rokotettua versus kontrolli käsittelemättömät hiiret). SP17 tai CpG annostella yksinään vähensi T-reg väestön taajuuksia korkeammalla määrin verrattuna yhdistetyn SP17 + CpG muotoiluja sekä terapeuttisia ja ennalta ehkäiseviä hoito; Tämä vähennys oli merkitsevä verrattuna kasvaimen haastoi rokottamattomat hiiret (pariton t-testi p 0,01), mutta ei verrattuna SP17 + CpG rokotukset (pariton t-testi p 0,05).

Keskustelu

kuolettavuus munasarjasyövän ensisijaisesti johtuu siitä, etteivät lääkärit havaita taudin varhaisessa elimeen rajoittunut ja yleensä oireeton vaihe yhdistettynä tehokkaiden hoitojen puute varten myöhäisvaiheen tauti [14], [33], [35], [36]. Myöhään diagnoosi ja korkea kemiallis-vastus tämän syöpä osoittautuu tarvitaan uusia terapeuttisia kohteita ja ymmärtää paremmin mekanismeja leviämisessä OC.

Tässä tutkimuksessa, arvioimme tehoa SP17 rekombinanttiproteiinin plus CpG profylaktisissa ja terapeuttisissa asetukset hiiren ID8 malli. SP17 on osoitettu tässä ilmaistaan ​​voimakkaasti sytoplasmassa ja pinnalla kalvot ID8 solujen (ICC, IF ja virtaussytometria). Pystyimme seurata kasvaimen kasvua käyttämällä SP17 biomarkkerina (luvut 1 ja 3). Tämä hiirimallissa tuottaa askites kuten kuvioissa 3a ja 3b, ja niin se tuntuu kuvastavan patologia aggressiivinen ja usein muoto ihmisen munasarjan vaiheiden III ja IV. Sukupolvi kasvain solmujen ja fuusio vatsakalvon myös muistuttavat ihmisen prosessin (katso kuva 3b), sekä tyypillinen vatsakalvon lokalisoinnin osoituksena

in vivo

fluoresenssilla kuvantamisen (kuvio 3h). Käyttö tässä eläinmallissa on raportoitu eri tutkimusten tulokset, jotka liittyvät kasvaimen kohdistus ja verisuonten kasvutekijä [23], [37], mutta tämä on ensimmäinen kerta, kun hiiri vastine ihmisen kasvaimeen liittyvä antigeeni, SP17, on osoitettu ilmentyvän OC hiirimallissa.

Yksi suurimmista perusteita päättää, mitkä ehdokas itse antigeenin kohdistaa ehkäisyyn tai hoitostrategioita luo immuunivasteen turvallisesti, ja todisteet täällä viittaa siihen, että SP17 voi olla sellainen ehdokas. Olemme aiemmin osoittaneet, että adoptiivisesti siirrettyjen SP17-T-soluja on antituumorivaikutuksen [13], [14], [21], [22], mutta SP17 kohdistettuja terapeuttista tai ennalta ehkäisevää rokotusta ei ole testattu kasvaimen malli. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että samanaikainen antaminen SP17 + CpG i.m. pistetään 30 päivän välein yhteensä kymmenen rokotukset estivät kasvaimien muodostumista jopa 300 päivää, joiden eloonjäämisaste 77% ennalta ehkäisevään ryhmässä ja 80% terapeuttista rokotusta ryhmään. Huomattavaa on, että vaikutukset rokotuksen profylaktisessa ja hoito-olivat samankaltaisia. Molempia hoitoja indusoi voimakkaan immuniteetin, joka esti kasvaimen kasvua kasvain-hiiriin. Hiiret, jotka lopulta sortunut taudin osoittivat kehityksen viivästyminen kasvaimen kasvua verrattuna rokottamattomiin hiiriin. Oletamme, että terapeuttinen hoito on tehokasta hylkäsi eri järjestetään OC, koska meidän terapeuttisia rokotuksia ei käynnisty ennen ID8 kasvaimia osoitti merkittävää kasvua, jonka ominaisuudet yleensä todetaan ihmisen III-IV OC, mukaan lukien syöpä levinnyt lantion limakalvojen vatsan tai imusolmukkeet (www.ovariancancer.org) [38]. Kasvain-pistetään, rokottamattomiin eläimiin näkyvissä kasvain leviää vatsakalvon, imusolmukkeen, keuhkot, maksa ja perna. Itse asiassa keskimääräinen painoero kasvaimen altistetuissa ja kasvaimen vapaata ryhmää oli 10 g, mikä vastaa noin 50% tarkoittaa eläimen painosta ennen kasvaimen injektiota (20 g).

aktivoituminen voimakkaan immuunivasteen SP17 osoitettiin ELISA ja ELISPOT määrityksiä, kasvua anti-SP17 vasta hiirillä seerumissa, ilmentymistä Th1 liittyvien sytokiinien ja kasvaimen sytotoksisten vastauksia. On huomionarvoista, että mitään merkittäviä serologisia reaktiivisuus SP17 oli havaittavissa ennen rokotusta, osoittaa kykyä rokotteen prime tiettyjä naiiveja B-soluja. Verrattaessa tuloksia Sp-17 erityinen vasta-ainetiittereitä saatiin eri terapeuttista rokotetta muotoiluja, löysimme vain pieni mutta selvä nousu anti-SP17-aineen tuotanto CpG + SP17 rokotetuista eläimistä verrattuna muihin ryhmiin, erityisesti sen jälkeen 9

th rokotus. Siksi emme voi arvioida, onko kasvaimen hyljinnän seuraavat CpG + SP17 rokotuksia voidaan katsoa humoraalivasteiden. Koska erot vasta-ainetitterit ryhmien välillä ovat pieniä, me päätellä, että kasvain antigeenispesifisiä immuunivasteita havaitsimme todennäköisesti tehdä suuremman panoksen kasvaimen hylkimistä CpG + SP17-rokotettuja eläimiä. On mielenkiintoista, että samanaikainen antaminen SP17 + CpG oli parempi kuin SP17 yksinään tai CpG yksinään adjuvanttina. On hyvin dokumentoitu, että i.m. injektiot proteiinit eivät indusoi merkittäviä immuunivasteita, elleivät ne sekoitetaan apuaineiden kanssa [30], [32], [39]. Tehokas apuaineita näyttö vähintään 2 vaikutusmekanismit: depot-vaikutuksen, joka johtaa pitkäaikainen antigeenin altistus isännässä, ja kapasiteetti laukaisemaan luonnollinen immuniteetti aktivoimalla dendriittisolujen (DC) kautta toll-like reseptorit (TLR) [35 ]. Kun oikea antigeenin esittelyn, aktivoidaan DC avainasemassa induktio T-soluvasteiden [29], [34], [40], [41], [42].