Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden liittyy monimutkaisia ​​remontin geenien ilmentymisen ohjelmia koskevat epiteelin homeostaasiin. Mutaatiotapahtumaa aktivointi RAS-ERK on normaalia monissa syövissä ja sen on osoitettu ajaa yli-ilmentymisen AP-1 perhe transkriptiotekijä FRA1, voimakas säätelijä muuttoliikkeen ja invaasion erilaisissa kasvainsolutyypit. Kuitenkin luonteeltaan FRA1 transkription tavoitteiden ja molekyylitason reitit, joiden kautta ne edistävät syövän etenemiseen yhä puutteellisia. Huomasimme, että FRA1 voimakkaasti ilmaistu kasvainsoluissa leviämisrintamassa ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpien (CRC), ja että sen ehtyminen tukahdutetaan mesenkymaalisten kaltaisia ​​piirteitä CRC soluissa

in vitro

. Genominlaajuisia analyysi FRA1 kromatiinin käyttöasteen ja transkription säätelyyn tunnistettu epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) liittyviä geenejä on merkittävä luokka suorien FRA1 tavoitteita CRC soluissa. Expression of pro-mesenkymaalisten osan näistä geeneistä ennustetaan haittavaikutuksia CRC potilailla, ja mukana FRA-1-riippuvaisia ​​sääntely ja yhteistyö TGFp signalointireitin. Meidän havainnot osoittavat odottamattoman laajaa ja suora rooli FRA1 hallinnassa epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä plastisuus CRC soluissa, ja viittaavat siihen, että FRA1 tärkeä rooli välittämisessä välisen ylikuulumisen onkogeenisten RAS-ERK ja TGFp signalointi verkkojen aikana syövän etenemiseen.

Citation: Diesch J, Sanij E, Gilan O, Love C, Tran H, Fleming NI, et al. (2014) laajamittainen FRA1-Dependent ohjaus mesenkyymikasvaimia Transdifferentiation sovellus peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (3): e88950. doi: 10,1371 /journal.pone.0088950

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 03 marraskuu 2013; Hyväksytty: 16 tammikuu 2014; Julkaistu: 21 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Diesch et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat kohdeapurahoja 1026228 ja 1044168 (ASD) ja erikoistutkija Yhteisöt (ja RDH, RBP ja JMM) National Health ja Medical Research Council of Australia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Paikalliset ja metastaasit paksusuolisyövän ja joidenkin muiden karsinooma tyyppien ajatellaan kuuluvan ohimenevä remontin epiteelin kasvainsolun fenotyypin invasiivisen mesenkymaalisten kaltainen tila, jolle on ominaista puutteita tiukka ja vyöliitos muodostumista, lisäävät väli- hehkulangan proteiinit (esim vimentiinista), ja kohonnut ilmentyminen proteaasien välittäjänä hajoamisen soluväliaineen. Tällaiset epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä siirtymät (EMT) ja mesenkymaalisten-epiteelin siirtymät (MET) sisältävät laajan ja pitkälle säädettyjä muutoksia geenien ilmentyminen, säätelee monimutkainen signalointi ja transkriptiotekijä verkostoja, jotka harjoittavat Master EMT transkriptiotekijöitä kuuluvat perus helix-loop-helix ( bHLH), etana, Twist ja ZEB perheiden [1] – [3].

peräsuolen syöpä (CRC) on geneettisesti heterogeeninen sairaus, jonka metastaattinen leviäminen maksan, keuhkojen, vatsaonteloon ja luut aiheuttaa suuria kliinisiä ongelmia [4]. Yli 50% CRC satama onkogeenisten mutaatioita

KRAS

tai

BRAF

geenejä, jotka ajavat pysyviä aktivoitumisen ERK MAPK-reitin. Nämä mutaatiot yleensä syntyy suhteellisen varhaisessa vaiheessa aikana adenooma-karsinooma etenemisen jälkeen menettänyt kasvain vaimennin APC, ja niiden yleisyys yhteneväinen primaarinen ja metastaattinen syövät viittaa siihen, että ne edistävät sekä kasvaimen aloittamista ja etenemiseen [5] – [ ,,,0],8]. Myöhemmissä vaiheissa, jotkut kasvaimet hankkia mutaatioita (

TGFBR2

,

Smad2

,

Smad3

tai

Smad4

), jotka haittaavat signalointi kautta TGFli reitin, joka tarjoaa kasvua estävä signaaleja normaalin suolen epiteelin.

CRC, EMT kaltaiset oireet liittyvät vahvasti orastava, patologinen ilmiö havaittiin 20-40% tapauksista, joissa kasvainsolujen irtoaa leviämisrintamassa ja hyökätä ympäröivään tyvikalvon [9], [10]. Vuorovaikutus EMT ja MET on myös ehdotettu taustalla havaintoon, että tyvikalvon ilmentyminen on usein menetetty invasiivisia edessä CRC, mutta palautettu etäpesäkkeitä [11]. Viime aikoina useat tutkimukset ovat tunnistettu EMT liittyvien geenien ilmentyminen allekirjoitusten yhteinen esiintyminen primaarisessa CRC, jotka ovat vahvasti yhteydessä huonoon ennusteeseen ja kestävyys kohdennettuja hoitomuotojen [12] – [15].

Yksi suuria reittejä mukana induktioon ja ylläpitoon EMT tapahtumien kehityksen aikana ja kasvaimen kehittymisen on TGFp polku. Vaikka aktivoituminen reitti on kasvua inhiboiva normaaleissa epiteelisoluissa, onkogeeninen RAS-ERK signalointi on raportoitu aiheuttavan paradoksaalinen kytkin sen roolin tuumorisuppressorigeenin pro-metastaattinen tekijä, osittain aktivoimalla EMT liittyviä ohjelmia [2] [16] – [19]. Mekanismit pro-pahanlaatuinen välisen ylikuulumisen RAS ja TGFp polkuja aikana CRC etenemisen ei ymmärretä hyvin. Häiritseekin TGFp reitti on yleinen tapahtuma CRC. Täydellisen inaktivoinnin TGFp signalointi mutaation kautta tyypin II TGF-reseptorin (

TGFBR2

) paikka on tavallista, että 15% on CRC näyttämään DNA mikrosatelliittien epävakaus (MSI), joka ironisesti liittyvät suotuisat ennustetekijöiden tuloksia [ ,,,0],20]. Loput 85% Mikrosatelliittimarkkerien vakaa (MSS) syövät näyttää kromosomi epävakaus (CIN), ja usein (~ 50% tapauksista) satama mutaatioita

Smad4

geeni, ja harvemmin

Smad2

ja

Smad3

geenejä [21]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että

TGFBR2

genotyyppi on tärkeä tekijä, joka määrittää puute EMT kaltaisia ​​vasteita TGFp 1 in MSI-positiivisten kasvainten, kun taas CRC solut

Smad4

mutaatiot säilyttävät kyvyn läpikäyvät EMT upon TGFp 1 hoidon kautta kytkemällä kanssa ERK-reitin [22]. Luonne ERK koulutusjakson efektorien tarvitaan näistä vastauksista tällä hetkellä epäselvä.

Activator Protein-1 kompleksi on keskeinen säätelijä transkription indusoimat vasteet eri syöpään liittyvän signalointireitteihin. Se koostuu homo- tai hetero-dimeerit Fos, Jun, ATF ja MMM perheenjäseniä, joiden toiminta vaikuttaa voimakkaasti onkogeeninen signalointi tapahtumia. Aktivoivat mutaatiot RAS reaktiotien komponentit on osoitettu aiheuttavan yliekspressio Fos perheenjäsenen FRA1, on erittäin epävakaa proteiini, joka ilmentyy alhaisilla tasoilla normaaleissa soluissa [23], [24]. Transkription induktio ja translaation jälkeiset vakauttamiseen FRA1 onkogeeninen RAS-ERK signalointi lisää suhteellinen runsaus FRA1 sisältävän AP-1-dimeerejä, joka on syy-yhteydestä lisätä maastamuuttoa ja hyökkäys CRC ja useita muita karsinooma solutyyppejä, mukaan lukien rinta-, keuhko-, virtsarakon, pään ja kaulan, kilpirauhasen ja aivot [6], [23] – [34]. Sen lisäksi, että RAS-ERK-reitin, FRA1 ilmentyminen indusoi Wnt /β-kateniinin reitin CRC-soluissa [40], [41], mikä viittaa siihen, että se voi olla tärkeä rooli yhdistetään signalointia näiden reittien aikana CRC-etenemisen.

Tässä tutkimuksessa olemme soveltaneet genominlaajuisten lähestymistapa ymmärtää paremmin luonnetta transkription ohjelmien taustalla pro-pahanlaatuinen toimia FRA1 CRC. Huomasimme, että FRA1 sitoo ja säätelee ilmentymistä kliinisesti merkittävästä kohortin liittyvien geenien EMT in invasiivisia CRC soluissa, vakaa FRA1 pudotus vetoamalla MET kaltainen fenotyypin kytkin. FRA1 voimakkaasti rikastunut orastava kasvainsoluissa leviämisrintamassa ihmisen CRC, ja ilmaus sen pro-mesenkymaalisten tavoitteita tunnistettu osajoukko primäärisyövästä huonon ennusteen. Mekanistisesti, huomasimme, että aktivaatio mesenkymaalisten geenien FRA1 riippuvia sääntely ja yhteistyö TGFp signalointi verkot. Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että FRA1 pelaa laajaa ja suora rooli transkriptionaalisen säätelyn epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä ohjelmoinnin aikana CRC etenemisen.

Tulokset

FRA1 on rikastettu kasvainsoluissa leviämisrintamassa ihmisen CRC

Vaikka aikaisemmin raportoitu, että FRA1 on pidemmälle ilmaistaan ​​CRC kuin normaali peräsuolen epiteelin [35], sen suhde kasvain patologia ei ole vahvistettu. Käyttämällä immunohistokemia Havaitsimme FRA1 immunoreaktiivisuus 20 ulos 25 primaarikasvaimen yksilöitä. Toisin kuin sen heikkoa ilmentymistä keskustassa kasvainten solujen invasiivinen edessä osoitti vahvaa FRA1 värjäytymistä (kuvio 1A-1C), mukaan lukien sytokeratiini AE1 /AE3 positiivinen soluryppäitä [36], jotka oli irrotettu kasvaimen suurin (kuvio 1D ). Tämä jälkimmäinen piirre on osoitus kasvaimen orastava, ilmiö liittyy hankintaan mesenkymaalisten kaltaisia ​​piirteitä CRC-solut, ja on itsenäinen ennustaja imusolmuke etäpesäke, verisuonten ja imusuonten invaasio, etäpesäkkeiden, paikallisen uusiutumisen ja huono tautivapaan elinajan [9].

(a) matala teho kuvan edustavan kolorektaalisyövän värjättiin vasta-aineen havaitsemiseksi FRA1. Tähti osoittaa ontelon, kun taas nuolenpää osoittaa syvän invasiivisia edessä. Mittakaava on 1 mm. (B ja C) Tehokas kuvien kasvaimen keskusta (TC) ja invasiivisia edessä (IF) on esitetty (A). Arrowheads osoittavat kasvain silmuja. Scale palkki edustaa 10 uM. (D) välinen suhde intensiteetin ydinvoiman FRA1 ilmaisun ja kasvaimen orastava merkki, sytokeratiinista Ä1 /AE3 25 CRC tapauksissa.

FRA1 säätelee mesenkymaalisten kaltaisia ​​piirteitä CRC soluissa

Aiemmat tutkimukset pro-invasiivisia toimia FRA1 CRC ovat käyttäneet BE solulinjassa malli, joissa on helposti invasiivisia mesenkymaalisten kaltaisia ​​soluja, jotka satama

KRAS Twitter /

BRAF

mutaatioita ajo korkea endogeeninen FRA1 ilmaisun [33], [37]. Yhdenmukainen rooliaan merkittävä tekijä AP-1-aktiivisuutta näissä soluissa, vakaa knockdovvn FRA1 käyttäen 2 erillistä shRNAs konstrukteja pienentää sekä perus- ja c-Jun stimuloi AP-1 reportterigeenin aktivaatio (kuvio 2A ja 2B). Fenotyypiltään FRA1 ehtyminen vedota silmiinpistävä mesenkymaalisten epiteeli- kaltainen morfologiset kytkin, jossa solut hankkimalla litistetty ulkonäkö, takaisin ilmaus epiteelisolujen differentiaatiomarkkeri E-kadheriinin ja muodostaa tiukka liittymissä värjäystä positiivisesti ZO-1 (kuvio 2A ja 2C). Lisäksi FRA1-köyhdytettyä soluja lähes täysin menettäneet kykyään vaeltaa ja hyökätä

in vitro

, mutta niiden leviäminen pysyivät ennallaan (kuvio 2D-2F). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, vaatimus FRA1 säilyttää CRC solujen mesenkymaaliset kaltainen tila.

(A) immunoblot-analyysi FRA1 ja E-kadheriinin tasot BE-soluissa stabiilisti transdusoitu ei-hiljentäminen ohjaus ( shNS) tai FRA1 kohdistamisen shRNAs (shFRA1-A ja -B). (B) vaikutus FRA1 Knockdown perustason ja c-Jun-induced AP-1 reportterigeeniaktiivisuutta BE soluissa. (C) vaihe-kontrastin kuvia (ylärivi) ja immunofluoresenssivärjäystä DAPI kanssa ZO-1 (keskimmäinen rivi) tai vimentiinista (alin rivi) on soluja (A). Scale palkki edustaa 10 uM. (D-F) analyysi

in vitro

muuttoliike, invaasion ja proliferaatioon soluja (A). Virhe pylväät edustavat S.E.M. 3 itsenäistä koetta.

EMT liittyvät geenit ovat merkittävä luokka suorien FRA1 tavoitteiden CRC soluissa

tunnistamiseksi suoraan transkription tavoitteet ja molekyylitason reitit, joiden kautta FRA1 ohjaa mesenkymaaliset kaltaisia ominaisuuksia kasvainsoluissa, suoritimme genomin laajuinen ChIP-sekvenssi ja transcriptome analyysi etsiä geenejä, jotka FRA1 sitoutuminen rikastunut, ja jonka ekspressio säätelee FRA1 BE-soluissa. Huolimatta useista yrityksistä optimoida sirun määrityksessä käytetään vasta-aineita, kohdistaminen endogeenista FRA1, emme voineet palauttaa riittävä kromatiinin suorittaa myöhemmin suuren suoritustehon sekvensoinnin. Siksi syntyy BE solulinjoja kohtalaisesti (-5-kertaa korkeampi kuin endogeeninen FRA1) ilmentämään FLAG-FRA1 proteiinia, joka tumassa (kuvio 3A, B). Toisin kuin DNA: ta sitova viallisen variantti, villityypin FLAG-FRA1 osoittanut voimakasta rikastumiseen promoottori

VIM

, joka on aiemmin tunnistettu suoraa FRA1 kohde (kuvio 3C) [38].

(A) immunoblottianalyysi FRA1 ilmaisun BE soluissa stabiilisti transdusoitu FLAG-FRA1 ekspressiokonstrukti vektorin (PBP) kontrolli. (B) Immunofluoresenssianalyysi FLAG-FRA1 lokalisointi solut (A). (C) pelimerkin analyysi verrataan sitoutumisen villityypin ja DNA: ta sitovan vialliset (DBD) FLAG-FRA1 proteiinien

VIM

promoottori BE soluissa. (D) leikkauspiste tietojen microarray (FRA1 shRNA) ja siru-Seq (FLAG-FRA1) analyysi BE soluissa. Siru-Seq tulokset edustaa geenejä, joiden FRA1 sitoutuminen rikastettu 5-kertaisesti suhteessa tulo-ohjausyksikköön 5 kb transkription aloituskohdasta (TSS). Vain selityksin geenit käynnissä ainakin 2-kertainen muutos ilmaisun upon FRA1 hiljentäminen (p 0,05) tutkittiin ja geenejä, jotka liittyvät useiden FLAG-FRA1 piikkiä vain kerran. (E) Ontologinen analyysi geenien tunnistettu jälkeen risteyksessä microarray ja siru-Seq aineistoja. Geenejä ryhmittyneet oleellista biologista reittejä käyttäen GeneGo.

Käyttäen mikrosiruja, huomasimme, että FRA1 Knockdown BE soluissa merkittävästi sääteli ilmentymistä 1392 geenien ja vähentää ilmentymistä 832 geenien vähintään 2-kertainen (Kuva 3D). ChIP-Seq analyysi paljasti, että 72% prosenttia FRA1 geenien sisälsivät loci merkittävästi rikastettu FRA1 sitovia ( 5-kertainen) 5 kb niiden transkription aloituskohdasta (TSS). Tunnistaa merkittäviä toiminnallisia luokkien FRA1 kohdegeenien, me leikkaavat microarray ja siru-Seq data ja kuulusteltiin päällekkäisten geenien rikastuminen geenin ontologian ehdot (käyttäen GeneGo). Top 6 tunnustautuvista käyttäen tätä lähestymistapaa, 3 merkittävästi rikastettiin liittyviä geenejä EMT liittyvät prosessit, kun taas vielä 3 ryhmää varustellun tarttuvuusongelmat geeneistä (kuvio 3E). Nämä havainnot osoittivat, että EMT ja tarttuvuus ovat kaksi suurta prosesseja suorassa FRA1 transkriptionaalisen valvonnan CRC soluissa.

Perustuu fenotyypin muutosten johtuvat FRA1 Knockdown BE soluissa, ja yhdistyksen välillä kasvaimen orastava ja EMT CRC [ ,,,0],9], päätimme keskittyä osallistumista FRA1 säätelyssä EMT tapahtumia CRC. Yhdessä EMT liittyviä geenejä sidottu ja säätelee FRA1 (tässä kutsutaan FRA1

EMT geenejä) koodattuja monipuolisista osallistuvien proteiinien solun tarttumista, signaalitransduktion, transkriptio, solun tukirangan ja soluväliaineen remodeling sekä komponenttien TGFp signalointi verkkojen (kuvio 4A ja taulukossa S1 File S1). Nämä geenit laajasti käsitti pro-mesenkymaalisten osajoukko, joiden ilmentymistä edistettiin FRA1 ja epiteelin osajoukko, joka oli tukahdutettu FRA1. Monet geenit oli useita loci käytössä FRA1, jotka pääasiallisesti sijaitsevat introni alueilla geenin rungon ja distaalisen alkupään sivustoja (kuva 4B ja taulukko S2 File S1). Motiivi-analyysi paljasti, että 58%: n geenien sisältää vähintään yhtä FRA1 sitoutumiskohdan merkittävästi rikastettu yksimielisyyteen AP-1 sitoutuva sekvenssi (p 0,0001, taulukko S3 File S1). Totesimme myös merkittäviä rikastus (p 0,001) luulotellun MEF-2 motiiveja EMT liittyvät tavoitteet tunnistettu chip Seq analyysi. Lopuksi suoritetaan siru ja qRT-PCR-analyysi vahvistaa rikastamisen FRA1 useissa loci tunnistetaan ChIP-Seq (kuvio 4C) ja FRA1 riippuva sääntely valittujen tavoitteiden BE soluissa (kuvio 4D).

( A) Heat kartan eri funktionaaliset ryhmät EMT liittyvien geenien sidottu ja säätelee FRA1 (FRA1

EMT geenejä). Tiedot RNA-sekvenssi-analyysi kahden kloonin BE shFRA1-A-soluja (n = 4 kullekin solulinja) normalisoitiin suhteessa shControl soluihin. Alueet punaisella edustavat geenejä liittyy epiteelin tila, joka oli voimistunut kun FRA1 hiljentäminen (log kertamuutosta -1, p 0,05), kun taas vihreät alueet edustavat mesenkymaalisten-tyyppiä geenien tukahdutettu FRA1 hiljentäminen (log kertamuutosta 1 , p 0,05). (B) jakauma genomista FLAG-FRA1 sitoutumiskohdat tunnistetaan chip Seq suhteessa vastaavan geenin. Määrä lukee tunnistaa kunkin alueen ilmaistaan ​​prosentteina. (C) chip qPCR analyysi FLAG-FRA1 sitoutumisen genomialuetta valikoiduilla FRA1

EMT geenejä. Data edustaa suhteellista rikastumista verrattuna vanhempien BE soluihin. Alueella on miRNA-21-geenin ei sido FLAG-FRA1 käytettiin negatiivisena kontrollina (

CTRL

). (D) qRT-PCR-analyysi valituista FRA1

EMT geenejä BE soluissa stabiilisti transdusoitu yksi kahden itsenäisen shRNAs kohdistaminen FRA1. Data esitetään suhteessa ilmentymistasoihin soluissa shNS soluissa. Studentin t-testiä käytettiin kaikissa vertailuissa (

* p 0,05,

** p 0,01,

*** p 0,001). Virhe pylväät edustavat S.E.M. 3 itsenäisestä kokeesta. (E) FRA1 proteiinin tasot ja (F) ekspressio epiteeli- ja mesenkymaalisten markkerigeenit paneelissa CRC-solulinjoissa.

Expression of pro-mesenkymaalisten FRA1 tavoitteet ennustaa huono kliinisiä tuloksia

voidaan arvioida kliinistä merkitystä EMT liittyvien FRA1 tavoitteet, tutkimme suhdetta niiden ilmaisun ja CRC ennusteen kyselemällä nykyisten microarray tietoja 185 vaiheessa B ja C tapauksia [12]. Valvomaton ryhmittely tietojen mukaan kasvaimia voitaisiin luokitella epithelial- ja mesenkymaalisten kaltaisten alaryhmien näyttämällä geeniekspression eroja erittäin yhtäpitävä kanssa FRA1

EMT allekirjoitus (kuvio 5B ja taulukossa S4 File S1), jossa on 77% geenejä ( 137 probesets) osoittaa suuntaava muutokset, jotka mainittuja kun FRA1 knockdown BE soluissa.

(A) Kaplan-Meier tontteja toistumisen elinaika vaiheessa B ja C CRC potilaat mukaan ilmentymisen FRA1 geenin (

FOSL1

). (B) valvomaton klusterointi vaiheen B ja vaiheen C CRC perustuu FRA1

EMT geenien kattava yhtäpitävät probesets näytteille merkittävä ilmaisu eroja kahden pääryhmää. Klusterointi jakaa syöpiä ryhmiin mesenkymaalisten ja epiteelin profiileja. Näytteet on järjestetty pitkin X-akselia ja geenien pitkin Y-akselia. Geenit ryhmitellään ne vaimentua (sininen) tai voimistunut (oranssi) kun FRA1 Knockdown BE soluissa suhteessa merki- ja näytteen keskitetty skaalata ilme. (C) Kaplan-Meier tontteja toistumisen elinaika vaiheessa B ja C CRC potilaiden perustuen ilmaisun sekä

FOSL1

(matala vs korkea) ja mesenkymaaliset (Mes, tummanvihreä) tai epiteelin (Epi, kevyt vihreä) osajoukot FRA1

EMT geenejä. Log-rank-testiä käytettiin vertailussa.

Olemme myös havainneet, että korkea FRA1 geenin (

FOSL1

) ilmaisu itsenäisesti ennusti huono uusiutumista elinaika ja liittyi suuremmat T-vaiheessa indeksi kehittyneitä kasvaimen invaasion (kuvio 5A ja taulukossa S5 File S1). Vaikka

FOSL1

ekspressiota havaittiin sekä epithelial- ja mesenkymaaliset-kasvaimia, sen ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi (p 0,05) jälkimmäisessä ryhmässä. Expression of pro-mesenkymaalisten FRA1 tavoitteet rikastui 48,6% (90/185) primaarikasvainten, joka oli aiemmin diagnoosi ikä (mediaani 64 vs. 70 vuoden p = 0,005) ja suurempi imusolmukkeesta vaiheessa (N2 76% vs. 24% , p = 0,0098) verrattuna epiteelin-tyypin kasvaimet (taulukko S6 File S1).

integrointi tiedot

FOSL1

ilmaisun ja FRA1

EMT allekirjoitus paransi ennustaminen toistumisen riskiä pääpiirteissään erottamalla potilaita 3 tulospohjaisia ​​ryhmät (kuvio 5C ja taulukko S7 File S1): (i) hyvä ennuste ryhmästä

FOSL1

matalan epiteelin-tyypin syöpiä, (ii) väli ennusteen ryhmästä, joka käsittää

FOSL1

matalan mesenkymaalisten-tyypin syöpien ja

FOSL1

high epiteelin-tyypin syöpiä, ja (iii) huono ennuste ryhmä

FOSL1

korkea mesenkymaalisten-tyypin syöpiä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että yhdistelmä kohonnut

FOSL1

ja pro-mesenkymaalisten FRA1 kohdegeenin ilmentymisen primaarikasvainten tarjoaa vankan ennustaja haittavaikutuksia CRC potilailla.

Cross talk välillä FRA1 ja TGFp signalointi säätelee mesenkymaaliset geenien ilmentyminen

Koska niiden ja kliinisiä tuloksia (kuva 5), ​​me vieressä pyrki syvällisempää mekanistinen käsityksen FRA1 riippuva valvonta mesenkymaalisten ilmaisun ohjelmia CRC soluissa. Erityisesti olemme miettinyt, jos lisäksi suoraan sitovia ja säätelevät niiden transkriptio, FRA1 voisi edistää ilmentymistä pro-mesenkymaalisten geenien moduloimalla toimintaa EMT liittyvien signalointireittien jonka komponentit olimme tunnistettu suoraan FRA1 tavoitteita. Voimakkaimmin edustettu näistä olivat geenien toimii TGF signaloinnin verkkojen, mukaan lukien koodaus aktivoimalla (

TGFB2

) ja estävä ligandit (

BMP4

,

BMP7

), jonka ilmentyminen edistettiin tai tukahdutettu FRA1, vastaavasti (kuvio 4A, 4C ja 4E). Ainoana aktivoiva ligandi tunnistetaan FRA1 tavoite, päätimme tutkia mahdollisen panoksen TGFβ2 signaloinnin säätelyssä ilmaus valikoima FRA1

EMT tavoitteita. Ohimenevä knockdovvn

TGFB2

vanhempien BE soluissa vähensi merkitsevästi ilmaus useiden pro mesenkyymisoluyhteisviljelmissä (

AXL

,

VIM

) muttei epiteeli- (

CDH1

CLDN7

) FRA1 kohdegeenien (kuvio 6A). Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin myös, kun ohimenevää pudotus toisen FRA1 sitoutuneen kohteena toimivalla polku, joka koodaa transkriptiotekijää Smad3 (kuvio 6B). Suoraan tutkia mahdollisuutta, että FRA1 riippuvainen autokriinisen TGFβ2 silmukka toimi näissä soluissa, niitä käsiteltiin tyypin 1 TGFp-reseptorin estäjä SB43152 estää transduktiota TGFβ2 signaaleja. Yhdenmukainen vaikutukset

TGFB2

Knockdown, huomasimme, että ilmentyminen useiden pro mesenkyymisoluyhteisviljelmissä FRA1 tavoitteet (

AXL

,

VIM

,

TGFBI

) väheni huomattavasti 3 päivän kuluttua SB43152 hoidon.

(A ja B) ilmentäminen valittujen mesenkymaalisten (

TGFBI

,

AXL

) ja epiteelin (

CDH1

,

CLDN7

) FRA1

EMT geenejä päälle ohimenevä knockdown TGFp reitin FRA1 tavoitteet

TGFB2

ja

Smad3

käyttämällä siRNA altaat BE soluissa. Data esitetään suhteessa tasoon, näiden geenien transfektoiduissa soluissa siRNA kohdistaminen GFP. (C) vaikutukset TGFp -reseptoriestäjä SB43152 (10 uM 72 tuntia) ilmentymiseen valitun mesenkymaalisten FRA1

EMT (

TGFBI

,

AXL

) geenejä BE soluissa. Studentin t-testiä käytettiin kaikissa vertailuissa (

* p 0,05,

** p 0,01,

*** p 0,001). Virhe pylväät edustavat S.E.M. 3 itsenäistä koetta.

tutkimiseksi edelleen laajuuden rajat puhua välillä FRA1 ja TGFp polku, arvioimme ilmaus useiden mesenkymaalisten ja epiteelin FRA1 tavoitteet toisessa

KRAS

mutantti TGF-reagoiva CRC solulinjassa, SW837. Vaikka FRA1 tasot on koholla näissä soluissa (kuvio 7A), niiden ilmentyminen pro-mesenkymaaliset geenien

VIM

ja

Axl

oli alhainen verrattuna BE-soluja, kun taas epiteelin geenit

CDH1

ja

CLDN7

olivat erittäin ilmaistaan ​​(kuvio 7B). Hoito ligandin TGFp 1 voimakkaasti indusoima

VIM

, vastauksen, joka oli merkittävästi heikentynyt päälle ennen FRA1 taintumisen (kuvio 7C). Sitä vastoin ilmaus epiteelin FRA1 tavoitteet

CDH1

ja

CLDN7

ollut vaikutusta samoissa olosuhteissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että FRA1 ilmentyminen moduloi missä määrin TGF signalointi voi indusoida pro-mesenkymaalisten transkription vasteita CRC-soluissa.

(A) immunoblot-analyysi endogeenisen FRA1 ilmentymisen BE ja SW837 CRC-soluja. (B) qRT-PCR-analyysillä vertaamalla suhteellisia ekspressiotasoja valikoima mesenkymaaliset (

Axl

,

VIM

) ja epiteelin (

CDH1

,

CLDN7

) FRA1

EMT geenien BE ja SW837 CRC soluja. (C) vaikutukset ohimenevä FRA1 Knockdown on TGFp 1 aiheuttama (10 ng /ml 48 h) ilmentymä

VIM

,

CDH1

ja

CLDN7

in SW837-soluissa. Studentin t-testiä käytettiin kaikissa vertailuissa (

* p 0,05). Virhe pylväät edustavat S.E.M. 3 itsenäistä koetta.

Keskustelu

Paikallinen hyökkäys ja metastaattisen leviämisen syövät liittyy erityisiä, hyvin koordinoitua ja dynaamista remontin tuumorisolujen geenin ilmentymisen kautta kaksisuuntainen välisen ylikuulumisen signalointi ja transkription verkoissa. Paljon on vielä ymmärtää, miten näitä verkkoja säätelevät kasvaimeen liittyvien geneettisten ja epigeneettiset vaurioita, ja mekanismeista, joiden avulla ne sovitetaan yhteen aiheuttavan erityisiä muutoksia geenien ilmentyminen aikana hyökkäystä.

transkriptiotekijä AP-1 on pitkään ollut mukana keskeisenä säätelijänä kasvainsolun invaasiota [39]. FRA1 on yksi yleisimmin yli-ilmentynyt AP-1 proteiinien kiinteät syövät, ja sen kyky edistää muuttavien ja invasiivisen piirteitä erilaisia ​​kasvainsolutyypit [26] – [32] viittaa siihen, että sen toiminta liittyy sitoutuminen yhteisiin tavoitteisiin ja reittejä. Identiteetti näistä reiteistä on tällä hetkellä epäselvä, vaikka vain kourallinen sen suoran transkription tavoitteensa karsinoomasoluja tunnistettu tähän mennessä. Analysoimalla sen genominlaajuisten chromatin käyttöasteen ja kohdegeenin sääntelyn, tässä tutkimuksessa yksilöidään geenejä ja reittejä liittyi solun tarttumiseen ja EMT pääluokkaa suoraan FRA1 tavoitteet liittyvät CRC etenemiseen.

EMT-kaltainen geeniekspression allekirjoitukset on raportoitu korreloivan huonon ennusteen ja kestävyys kohdennettuja hoitomuotojen CRC potilailla, mutta mekanismit niiden genesis tunnetaan huonosti [12] – [15]. Tulosten perusteella näyttää, että FRA1-säädellyt transkription tapahtumia on tärkeä rooli tässä prosessissa, jossa kohonneita pro-mesenkymaalisten FRA1 tavoitteet liittyvät haittavaikutuksia noin puolet kaikista vaiheen B ja vaiheen C syöpiä, kun taas korkea FRA1 geenin (

FOSL1

) ilmentymistä näissä mesenkymaalisten-tyypin tunnistamiseen syöpiä köyhimpien ennusteeseen.

Patologiset EMT CRC vahvasti sidoksissa kasvain orastava, itsenäinen prognostinen indikaattori korkeampia imusolmuke etäpesäke, verisuonten ja imusuonten invaasio, kaukainen etäpesäke, paikallisen uusiutumisen ja huono tautivapaan elinajan [9]. Vaikka FRA1 ilme näkyy suhteellisen homogeeniset tuumorisolulinjoja, huomasimme, että se oli erittäin rikastettu invasiivisia alueilla ja orastava soluissa, mutta ei keskellä ensisijainen kasvaimia. Mekanismi taustalla rajoitettua ilmaisua kasvaimissa on tällä hetkellä epäselvä, mutta samankaltainen lokalisaatio on raportoitu Wnt reitin transkription efektori, β-kateniinin [40], [41]. Koska β-kateniinin indusoi transkriptio FRA1 geenin CRC soluissa, FRA1 /β-kateniinin yhteistoiminnalla voi olla tärkeä rooli valvoa paikallisesti transkription pro-invasiivisen geenien Kolorektaalituumorien, käsite tukee löydämme että FRA1 suoraan sitoo ja säätelee useita pro-invasiivisia β-kateniinin tavoitteita, mukaan lukien

MMP14

,

LAMC2

,

VIM

ja

ZEB1

[11], [42] – [ ,,,0],46].

induktio EMT kuuluu remontin useita solun prosessien, kuten tarttuvuus, signalointi, transkriptio, ja soluväliaineen remodeling. On yhä enemmän todisteita siitä, että kasvainsolut esiintyy usein vain joitakin näistä muutoksista, esimerkiksi ilmentämään osajoukon mesenkymaalisten merkkiaineiden säilyttäen epiteelisolujen ominaisuuksia [3]. Kyky kasvainsolujen kauttakulku peräisin epiteelin ja mesenkymaaliset kaltainen tila on siis todennäköisesti erittäin asiayhteyskohtaisia, ja vaativat yhteistoiminnalla välillä useita signalointi ja transkription verkoissa. Kyky FRA1 sitoa ja säädellä geenien eri EMT liittyvien prosessien viittaa siihen, että se voi olla tärkeä rooli koordinoi EMT tapahtumiin. Mielenkiintoista on, että BE CRC soluissa, FRA1 sitominen osallistuvat sekä ylläpitää ilmentymisen pro-mesenkymaalisten geenejä, kun taas tukahduttaa epiteelin osajoukko. Useita mahdollisia mekanismeja voidaan edistää näitä vastakkaisia ​​vaikutuksia FRA1, mukaan lukien sen kokoonpano erillisiin FRA1 /kesäkuu komplekseja saman soluissa, sen kytkentä eri signalointi verkkojen ja kyky edistää ilmentymistä päällikön EMT transkriptiotekijöitä, ZEB1 ja /tai SNAI2 . Lisäksi FRA1 sitoutuminen voi aiheuttaa paikallista muutoksiin chromatin dynamiikkaa, rooli äskettäin katsoneet AP-1 säätelyssä indusoituvuus glucorticoid reseptorin tavoitteet [47]. FRA1 voi siten edistää sukupolven salliva kromatiinin yhteyksissä välttämätöntä sekä uudelleenohjelmointia CRC solut mesenkymaaliset tilaan ja sen jälkeen toiminnan ylläpitämiseksi mesenkymaalisten ohjelmissa kasvainsolujen levittämiseen. Mielenkiintoista, suuret alueet AP-1 sitoutumisen tunnistettu aiemmin lähellä glukokortikoidireseptorin tavoitteet ja esillä olevassa tutkimuksessa ilmeni ylävirtaan kohdegeenin promoottorien tai sisällä introneja, syytetään rooli FRA1 transkription valvontaa tehostaja tasolla ja /tai alavirtaan transkription aloitus- (esim venyminen).

Vaikka vakaa FRA1 knockdown vedonnut MET kaltainen fenotyypin muutos BE soluissa, olemme huomanneet, että monet FRA1 yliekspressoivia CRC solulinjoissa säilyttää epiteelin ominaisuuksia (ASD, julkaisematon). Näin FRA1 ilme ei yksin riitä ajaa EMT kaltaisia ​​solumuutoksia, mutta voi tehdä niin yhteistyössä muiden polkuja. Todellakin, tunnistimme komponentteja useiden signaloinnin verkkojen suora FRA1 tavoitteet BE soluissa, joissa pisimmälle edustettuina toimii TGFp kautta. Huomasimme, että taustalla funktio FRA1 CRC soluissa oli positiivisesti säädellä TGFli signalointia, jota se voisi tehdä useiden mekanismien kautta; in mesenkymaaliset kaltainen BE solulinjassa, sen sitovat moduloitu ilmentyminen useiden TGFp koulutusjakson komponentteja, mukaan lukien toimintaa ylläpidetään autokriini TGFβ2 silmukka, joka edistää ilmentymistä mesenkymaalisten geenejä. Kuitenkin epiteelin kaltainen SW837 CRC soluihin, joissa autokriinisella TGFli signalointi ei ole vahvistettu, FRA1 vaadittiin TGFli aiheuttama mesenkymaalisten geeniekspression vasteita. Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että FRA1 voi olla tärkeä rooli kytkin onkogeenisten RAS-ERK signalointi kanssa TGFp polku valvoa EMT kaltaisia ​​vasteita CRC soluissa. Ehdotamme, että FRA1 voi olla samanlainen toiminto muiden syöpien, jossa se on yli-ilmentynyt, kuten rinta-, jossa FRA1 on äskettäin osoitettu olevan tärkeä rooli säätelyssä EMT tapahtumiin ja etäpesäkkeiden [25], [48], ja jossa TGFp