Krooninen sairaus

tiivistelmä

Serum MikroRNA lupaavia niin helposti ja mitattavissa biomarkkereita taudin. Eturauhassyövän, seerumin miRNA allekirjoitukset on yhdistetty taudin esiintyminen sekä korreloi aiemmin validoitu riskimallien. On kuitenkin epäselvää, miRNA voivat tarjota riippumatonta prognostista tietoja kuin nykyisen riskimallien. Tässä keskitymme joukko alhaisen riskin eturauhassyövän potilailla, jotka olivat oikeutettuja aktiivinen valvonta, mutta valitsi leikkausta. Merkittävä kriteerit alhainen riskin luokkaan on Gleason pisteet 6 tai alempi perustuen ennalta kirurgisia koepala. Kuitenkin kolmannes näistä potilaista on päivittänyt Gleason 7 leikkauksen jälkeistä patologinen analyysi. Sekä löytö ja validointi kohortin, huomaamme, että ennen kirurgisia seerumin miR-19, miR-345 ja miR-519c-5p voi auttaa tunnistamaan näitä potilaita riippumatta heidän esi-kirurgisia ikä, PSA, vaihe, ja prosenttia koepala osallistuminen. Yhdistelmä kolmen miRNA lisäsi ala vastaanottimen operaattori ominaiskäyrä 0,77-,94 (

p

0,01). Myös, kun yhdessä CAPRA riskimallin Mirna allekirjoitus huomattavasti korkeampia ennustaminen potilaalla on Gleason 7 sairaus. In-situ hybridisaatio vastaavia kasvaimia osoitti miR-19 säätelyyn ylöspäin muuttaneet ja normaalissa-näkymästä kasvain epiteelin, mutta riippumaton kasvaimen viittaa vaihtoehtoinen lähde seerumin miR-19a /b tasoja tai vapauttamista ennestään solunsisäinen miR -19a /b upon etenemistä. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että seerumin miRNA voi ennustaa suhteellisen pieniä askelia kasvainprogression parantamaan kykyään ennustaa sairauden riskin ja siten mahdollisesti ajaa kliinisiä päätöksiä eturauhassyöpäpotilailla. On tärkeää vahvistaa nämä havainnot suuremmassa usean instituution tutkimus sekä riippumattomien menetelmiä.

Citation: Wang SY, Shiboski S, Belair CD, Cooperberg MR, Simko JP, Stoppler H, et al . (2014) miR-19, miR-345, miR-519c-5p seerumissa Veikkaa Haitallisia Pathology eturauhassyöpäpotilailla hyväksyttävät Active Surveillance. PLoS ONE 9 (6): e98597. doi: 10,1371 /journal.pone.0098597

Editor: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Italia

vastaanotettu: 12 elokuu 2013; Hyväksytty: 05 toukokuu 2014; Julkaistu: 03 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat National Institutes of Health R21 CA161615 ja oma lahjoitus John ja Donna Shoemaker. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka prostataspesifisen antigeenin (PSA) -screening on laskenut PCa kuolleisuus Yhdysvalloissa, se on tehnyt niin kustannuksella havaita varhaisessa vaiheessa /laatu PCa, jotka eivät välttämättä vaikuta potilaan elämän hoitamattomana (ylidiagnostiikka) [1] – [4]. Hoitoon heikosti riski taudin aiheuttaa tarpeetonta sairauksia liittyy radikaalit toimenpiteet kuten leikkaus tai sädehoito (ylihoito) [5].

Aktiivinen valvonta (AS) on strategia kehitetty vähentämään potilaiden hoitoon, joilla on alhainen riski Eturauhassyövän. Tällaisia ​​potilaita seurataan fyysinen tentit, valikoiva kuvantaminen, sarja- PSA arviointeja, ja toista koepaloja. Hoito sitten tarjotaan niille, joilla merkkejä etenemisen. Ehdokkaita aktiivinen valvonta protokollia ovat ne, joilla on koepala Gleason arvosana 6 tai vähemmän (ei kuviota 4 tai 5), PSA 10 ng /ml tai vähemmän, ja vaihe T1 tai T2 tauti [6]. Vaikka todisteita useista laitosten viittaa siihen, että AS on varteenotettava vaihtoehto miesten vähäriskisiä PCa, on huomattavia Luokitteluvirheillä hinnat kun kartoittamaan AS [6], [7]. Eräässä tutkimuksessa potilaita täyttävät kriteerit AS mutta koki välitöntä eturauhasen 28% todettiin olevan korkeampi Gleason asteen ja 21% havaittiin T3 taudin kirurginen patologia [8].

Useat riskimallien tarkoitettu ennustaa leikkauksen jälkeisen patologian matalan riskin potilailla käyttäen kliinisiä tekijöitä, kuten ikä, PSA, vaiheessa laajuus etäispesäkkeitä sisällä koepaloja on kehitetty. Kuitenkin ne osoittavat tarkkuus vain 61-79% monimutkaistaa päätöksentekoa [9]. Rajoituksista johtuen PSA korvikkeena sairauden etenemisen ja merkittävä oikeutetut huolenaiheet koepala otantavirheet, sekä potilaat ja lääkärit pelkäävät, että viivästynyttä käsittely vaarantaa kyky parantaa sairauksia [10]. Novel markkereita, jotka luotettavasti erottaa toisistaan ​​vähäriskiset versus väli- /korkean riskin tauti olisi ratkaisu optimoida AS protokollia.

Kasvavat todisteet osoittavat MikroRNA (miRNA) mahdollisesti lupaava markkereita oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [11]. Nämä pienet, yksijuosteisia, ei-koodaavat RNA-molekyylejä ovat mukana transkription jälkeinen geenisäätelyn ja omaamaan muuttunut mentymisprofiili PCA kudoksessa [12] – [14]. Lisäksi miRNA seerumissa on käytetty tunnistaa potilaat PCA, mikä viittaa niiden mahdollisuuksia osana paneelin seerumin-pohjainen merkkiaineita [15], [16]. Aiemmin käytimme mikrofluidistinen perustuva multiplex kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) menetelmää tunnistaa seerumin miRNA allekirjoitusten miehillä PCA joka yhdistää validoidun Syöpä Eturauhasen Risk Assessment (CAPRA) sijoituksen riskinarviointiin [17 ]. Tämä edellinen tutkimus ei onko mitään näistä miRNA voisi tarjota riippumatonta ennusteen arvioinnissa. Siksi täällä pyrittiin tunnistamaan seerumin miRNA allekirjoitus, joka voisi subcategorize ennalta kirurgiset potilaat, joilla on alhainen riski arvioinnin tulokset noihin kanssa enemmän tai vähemmän etenemisen riskiä. Koska pitkän seurannan tunnistamiseen tarvittavat potilaille että kliinisesti edistymistä ja suhteellisen lyhyt aikaväli, jossa AS on ollut käytännössä, arvioimme leikkauksen jälkeisen patologia korvikemarkkerina. Löysimme kolmen miRNA allekirjoitus, joka voisi ennustaa huonompi patologinen sairaus kuin oletettu perustuu ennalta kirurgisia koepala. Ehdotamme, että tällainen allekirjoitus on mahdollista tunnistaa suuri määrä potilaita, jotka eivät todennäköisesti hyötyä välittömän leikkauksen (eli alhainen kliininen tilanne yhdistettynä poissaoloon positiivisen miRNA allekirjoitus), vaikka tällainen johtopäätös odottaa suurempaa rajat institutionaalisten tutkimuksen pitkän aikavälin seurannassa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Serum ja kudosnäytteet sekä kliiniset tiedot kerättiin vuosien 2002 ja 2012. Kaikki potilaat tarjotaan kirjallinen suostumus ovat niiden näytteitä ja liittyvät kliiniset tiedot kallisteta kliinisen ja perus tutkimustarkoituksiin. UCSF komitea tutkijavoimavarojen hyväksyi suostumusta prosessi. Tätä tutkimusta varten kaikki näytteet ja tietoja de-tunnistaa ja siksi ei vaadi ylimääräisiä sisäisten luottoluokitusten hyväksyntää.

Tutkimusasetelma

Tutkimuksen suunnittelu noudatti periaatetta mahdollisille näytteenotosta ja retrospektiivinen sokaisi arviointi (Probe) suunnittelu [18] ja ilmoitetaan seuraavan REMARK suuntaviivoja [19]. Kaikki seeruminäytteet kerättiin rutiininomaisesti aikaan leikkauksen anestesian induktion jälkeen, mutta ennen tahansa menettelyyn puuttumisen ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) eturauhasen kudosblokeista oli arkistoitu analysoitaviksi.

Potilaat tutkimuksessa mukana olivat valinneet välittömästi eturauhasen täyttäneeltä UCSF matalan riskin kriteerit AS lukien koepala Gleason 2-6 (ei kuviota 4 tai 5), PSA alle 10 ng /ml, alle 34% koepala ytimien mukana, alle 50% osallistumista tahansa yhden ytimen, ja kliininen T1-T2 vaiheessa tauti. Patologinen Gleason pisteet 7 korkeamman liittyy suurentunut Eturauhassyövän kuolleisuutta [20] ja näin ollen käytettiin määrittämään haittavaikutusten patologian. Löytö kohortti koostui 48 potilaalla on postoperatiivisia patologinen Gleason pisteet 7 tai korkeampi (tapaus ryhmä) ja 48 potilasta, joilla on patologinen Gleason pisteet 6 (kontrolliryhmä). Vahvistuspiippaus kohortti koostui 25 tapauksissa ja 35 ohjaa. Potilaat valittiin saatavissa näytteistä säilytetään UCSF kudospankissa. Potilaat istuva kriteerit edellä valittiin käytettävissä altaan perustuu satunnaisen kokonaisluvun generaattori. Kaavio tutkimuksen suunnittelu on kuvattu kuviossa 1.

Microfluidics perustuu multiplex qRT-PCR profilointi miRNA

mikronestejärjestelmä perustuva multiplex qRT-PCR-menetelmää käytettiin havaitsemaan miRNA kuten aiemmin on kuvattu [17]. Kirjastot 672 kantasilmukan alukkeiden eteenpäin alukkeiden, ja Taqman edustavat tunnetuin ihmisen miRNA sekvenssit (sekvenssit https://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols/miRNAqPCRsequences.txt) käytettiin. Jokainen mikrofluidinen array arvioitiin ilmaus 96 miRNA 96 näytettä. Yhteensä 7 paneelit tehtiin löytö kohortin (672 miRNA määritykset). Yksi array suoritettiin validointi kohortin keskitytään vain ne miRNA havaittu (katso jäljempänä) löytämisen kohortissa.

Vahvistus tonttien ja kynnys (Ct) arvot, mitta PCR-syklien lukumäärän päästä kynnysviiva asetettiin eksponentiaalinen vaihe vahvistus, saatiin oma ohjelmisto on Biomark järjestelmä (Fluidigm). Korkeampi Ct heijastaa pienemmällä teholla mitattujen miRNA. Ct-arvot vahvistettiin kautta laadun analyysi vahvistusta tontteja. MiRNA joilla on korkea Ct-arvo (Ct 30) 70% näytteistä katsottiin havaitsematta ja poistettiin analyysistä. Normalisointi tehtiin keskiviivaan Ct-arvo kaikkien havaittujen miRNA sisällä array kullekin yksittäiselle potilaalle, mikä johtaa ACt-arvon (taulukot S1-2). Normalisointi tehtiin tilille järjestelmällistä vaihtelut miRNA ekspressiotasot poikki yksilöitä ja paneelit, jotta biologisia eroja voidaan helpommin erottaa [21]. Kuitenkin analyysi YK-normalisoitu data, valvottuja määrä panos seerumin johti analogisia päätelmiä. Identiteetti Näytteiden naamioitu kunnes ACt arvot saatiin.

Tilastollinen analyysi

Initial analyysit verrattuna jaettuihin normalisoidut ACt arvojen miRNA tapausten ja kontrollien välillä löytö näytteestä käyttäen graafisia yhteenvetoja ja Wilcoxonin-summa testi arvioida merkitystä. Logistinen regressiomallit Sitten asennetaan ehdokas miRNA yksittäin korjattuna ikä, PSA, vaihe, ja aste koepala osallistumisen lukien prosenttia ydintä kasvain positiivinen ja prosenttia kokonaispituus sydämiä mukana. Ehdokas miRNA sisällytettiin malleja sekä jatkuvia toimenpiteitä, ja kuten binary kategorisen muuttujia. Cut-off-arvot jälkimmäisen määritettiin käyttämällä erillistä luokitusta puu malleja tai mediaani kunkin miRNA. Sekä cut-off saatiin samanlaisia ​​tuloksia.

ennustaminen suorituskyky mallien erottui käyttäen receiver operating (ROC) käyrän alla oleva ala (AUC) arvoja. Erillinen analyysi perustuu satunnaisen metsän luokitusmalli [22] tehtiin myös kuten kaikki havaittavissa miRNA sekä ikään, PSA, vaihe, ja aste koepala osallistumisen ennustajina. Tulokset tästä analyysin käytettiin antamaan riippumattoman arvion vaihtelevasti, ja tulosten varmistamiseen yksinkertaisemmasta logistisen malleja.

validointi kohortin vain ne miRNA jotka todettiin 30% näytteet löytö kohortin mitattiin. Normalisointi kaikki havaitut miRNA ajaa yhdellä array muuttanut leveys ofΔCt arvot tietylle miRNA, usein parantaa erot tapausten ja kontrollien välillä. Analyyttinen lähestymistavat edellä on kuvattu löytö oli samalla sovellettu validointi kohortissa. Lopullinen analyysit keskittyi miRNA havaittu merkittäviä ennustajia löytö kohortin jotka olivat myös merkittäviä validointi asetettu. Vain markkereita muokatuilla

p

-arvot (perustuen väärien havaintoon rate menetelmät) korkeintaan 0,1 löytö analyysejä pidettiin. Nämä mallinnettiin yksittäin ja yhteisesti logistisen regressiomallien myös valvoa, että samat ominaisuudet huomioon analyysit löytö kohortin. Lisäksi olemme tutkineet käyttö valitun miRNA täydentää validoitu hyvin CAPRA maalin [23] indeksinä sairauden riskin kuvatulla tarkemmin tuloksia.

Muita kuvaileva analyysit tehtiin verrata valittuun potilaaseen ominaisuuksien väliset löytämisen ja validointi ikäryhmät. Muodollinen testaus perustui Fisherin testiä (kategorisen ominaisuudet) ja Wilcoxonin-sum test (kvantitatiivista ominaisuudet).

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen R (versio 3.02) ja Stata (versio 13.1).

in situ hybridisointeja

diat kohtien (5 pm) FFPE kasvain näytteet potilaasta kohortti poistettiin parafiini ksyleenillä ja sammutettua kautta vähentämällä etanolikonsentraatiot PBS. Levyjä käsiteltiin sitten 300 ui proteinaasi-K: n (15 ug /ml PK-puskurissa, 5 mM Tris-HCI pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl) 37 ° C: ssa hybridizer (Dako) 10 minuuttia . Kahden PBS pesun, leikkeet dehydratoitiin lisäämällä etanolia pitoisuuksien ja ilmakuivattiin 15 minuuttia. Double DIG-leimatun lukittu-nukleiinihappo (LNA) koettimia (Exiqon) yksittäisten miRNA denaturoitiin kuumentamalla 90 ° C: ssa 4 minuuttia, sitten se laimennettiin 40 nM käyttäen in situ hybridisaatio puskurissa (Enzo Life Sciences). Leikkeet hybridisoitiin 50 ui laimennettua koetinta 54 ° C: ssa yli yön, sitten pestiin laskeva SSC-pitoisuus on hybridisaation lämpötilassa. Seuraavat 5 minuutin inkuboinnin 0,2 x SSC huoneen lämpötilassa, levyt pestiin PBS: ssä ja blokattiin 2% blokkausliuosta (Roche) 15 minuuttia. Sitten leikkeet käsiteltiin alkalisella fosfataasilla (AP) konjugoitua anti-DIG (Roche) laimennettuna 1:800 esto- liuosta, joka sisälsi 2%: lla lampaan seerumissa 60 minuuttia. Kahden pesun jälkeen AP-puskuria (100 mM Tris ph 9.5, 50 mM MgCl2: a, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20, 2 mM leva- misolia), leikkeitä inkuboitiin BM purppura AP-substraattia (Roche) pimeässä 4 ° C yön yli. Objektilasit pestiin sitten kahdesti PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja pestiin kahdesti vedellä. Sen jälkeen 30 sekunnin hoito Nuclear-Fast Red (Vector), diat poistettiin vesi joskin yhä etanolikonsentraatiot sitten asennetaan. Värjättyjä laseja arvioitiin ja arvostellaan sokeasti.

Tulokset

Mirna profiloinnin Discovery kohortti

haluttiin selvittää, onko miRNA pre-kirurginen seeruminäytteet voisi ennustaa leikkauksen jälkeisten patologinen päivityksen. Kliininen potilaiden ominaisuuksiin meidän löytö kohortti on koottu taulukkoon 1. asiassa (leikkauksen jälkeinen Gleason 7) ja ohjaus (leikkauksen jälkeisessä Gleason 6) ryhmillä oli samankaltainen jakaumat rodun ja kliinisiä tekijöitä. Tapaukset olivat huomattavasti vanhempia kuin kontrolleilla (

p

= 0,005). PSA-pitoisuudet olivat myös jonkin verran korkeampia tapauksissa (

p

= 0,07). Niistä 672 miRNA testattu, 36 oli Ct 30 vähintään 30%: lla potilaista, joita me perustettiin cutoff havaitseminen (taulukko 2). Monet miRNA olemassa klustereita, jossa kaksi tai useampi miRNA valmistetaan yhdestä transkriptio. Yhdeksän 36 miRNA kuuluvat yhden klusterin miR17-92 klusteri. MiRNA myös ryhmitelty perheet perustuu yhteiseen sekvenssin niiden 5’kutsutaan siemen järjestyksessä, jotka suurelta osin määrittää niiden loppupään tavoitteita [24]. miR-17, miR-20a, miR-92a, ja miR-106a, esimerkiksi, ovat kaikki osa yhtä perhettä. Siksi kaikissa näissä PCa potilailla oli ilmeinen rikastamiseen tiettyjä klustereita ja perheille miRNA.

vieressä verrattuna seerumin 36 havaittujen miRNA välinen asia ja kontrolliryhmien löytö kohortissa. Neljä havaittujen miRNA osoittanut eroja seerumin välillä tapausten ja valvontaa. MiR-19a ja miR-19b näytetään alempi ACt arvot, jos ryhmässä kontrolleihin verrattuna (kuva 2a,

p

= 0,06 ja

p

= 0,07 vastaavasti), sopusoinnussa korkeammat seerumipitoisuuksilla tapauksissa. Toisaalta miR-345 ja miR-519c-5p oli merkittävästi korkeammat ACt arvot, jos ryhmässä verrattuna kontrolleihin (kuva 2a,

p

= 0,04 ja

p

= 0,02 vastaavasti) , sopusoinnussa alhaisemmat seerumin jos kyseessä ryhmässä. Logistinen regressio malleja ennustamaan tapauksessa /valvonta-asema perustuu yhteen miRNA edustettuina binary indikaattorit (cut-off-arvot valitaan käyttämällä luokitus puut) osoitti kaikki neljä miRNA kuin erittäin merkittävä ennustavia lopputuloksen tila (riskisuhde) vaikka kontrolloiden ikää, PSA , kliiniseen vaiheeseen, ja aste koepala osallistumisesta (taulukko 3). Tulokset eivät olleet herkkiä onko miRNA sisällytetty ennustusmalleja kuin jatkuvia muuttujia tai binary indikaattorit, jotka perustuvat mediaani havaittavissa (tuloksia ei ole esitetty). Parametrisen satunnainen metsä luokittelija lukien kaikki havaittavissa miRNA (edustettuina jatkuva toimenpiteet) sekä ikään, PSA, vaihe, ja koepala osallistuminen sijoittui seuraavat ennustaja muuttujia kuin kuuden merkittävimmän (alenevassa järjestyksessä): ikä, miR-519c-5p , miR_19b, miR-345, PSA: n ja miR_19a (kuvio 3). Mitään muita mitatun miRNA liittyi merkittävästi lopputulokseen asemaan.

Delta Ct edustaa eroa Ct yksittäisten miRNA ja mediaani Ct arvo joukossa havaittu miRNA kunkin potilaan. Vaakapalkeilla edustavat keskiarvoa +/- SEM.

Mukana muuttujat luetellaan pystyakselilla, jossa vastaava muuttuja tärkeää, että jokainen vaaka-akselilla, merkitys määritetään käyttämällä ”ehdollinen permutaatio tarkkuus”, laskettuna a keskimääräinen ero mallin tarkkuuden välillä sovitetun mallin ja vaihtoehtoisia versioita kautta saatuja satunnainen permutaatio muuttujan arvoista. Muuttujat pidetään merkittäviä ennustajia satunnaisessa metsässä, jos niiden vaihtelevasti arvo ylittää itseisarvo alin negatiivisen pisteytyksen muuttujan [43].

validointi miRNA allekirjoituksen riippumattomia kohortissa

vahvista meidän miRNA yhdistysten, teimme validointitutkimusta keskitytään ainoastaan ​​niihin miRNA jotka olivat toimenpiteen vähintään 30%: lla potilaista ”seeruminäytteitä (taulukko 2). Potilaat validoimiseksi kohortin on koottu taulukkoon 1. Samanlainen löytö kohortissa ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja rodun tai kliinisessä vaiheessa tapausten ja kontrollien välillä, kun taas eroja iän ja PSA oli merkittävä (

p

= 0,002 ja 0,04 vastaavasti). Kuten nähdään löytö kohortin miR-19b ja miR-19a osoittivat merkitsevästi pienempi ACt arvot, jos ryhmässä verrattuna kontrolleihin (Kuva 2b). Itse asiassa erot olivat vieläkin selvemmin validoinnissa kohortin (

p

0,001 molemmille), mikä johtuu todennäköisesti normalisoitumista perustuvat kaikki havaitut miRNA yhteen array (versus jaettu usealle taulukot löytö kohortissa) . Toisin kuin miR-19b ja miR-19a, erot ACt-arvot miR-345 ja miR-519c-5p välillä tapausten ja kontrollien eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (kuvio 2b,

p

= 0,333 ja

p

= 0,154, tässä järjestyksessä). Kuitenkin malleja korjattuna ikä ja PSA, miR-345 ja miR-519c-5p pysynyt merkittävänä, kun sisällyttää binary ennustavia (katso alla). Tulokset analyysien mukaan lukien miR-519c-5p perustuivat 55 potilasta (24 tapausta ja 31 kontrollit) puuttuvien arvojen Tämän muuttujan johtuvat epäonnistunut PCR-reaktiot 5 potilaalla.

Prognostic arvo kolmen miRNA allekirjoitus

arvioimiseksi kyky vahvisti miRNA syrjiä potilaille haitallisia patologian validointi asetettu, ne sisällytettiin logistisen regressiomallien myös säätää iän, vaiheen, PSA, ja laajuus koepala osallistumista. Kun katsotaan erikseen, kaikki neljä miRNA osoitti vahvaa yhdistysten tapauksessa asema, jossa kertoimella suhteilla 9,22, 12,67, 0,03 ja 0,06 (

p

arvojen 0,01) (taulukko 3), vaikka johtuen suhteellisen pienen otoksen koko, luottamusväli arvioitu kertoimet suhdeluvut osoitti kovin tarkkoja. Nämä miRNA erikseen myös oli parantunut syrjivä kyky kanssa AUC-arvot 0,85, 0,86, 0,84, ja 0,83 suhteessa AUC 0,77 mallin mukaan lukien vain ikä, PSA, vaihe, ja koepala osallistuminen (taulukko 3). Nämä parannukset eivät saavuttaneet merkitsevyyttä 5%: n tasolla (vaikka tulokset miR-19b ja miR-345 oli merkitsevä 10%: n tasolla). Seuraavaksi arvioitiin malleja käyttäen erilaisia ​​yhdistelmiä miRNA (taulukko 4). Varsinkin miR-19a ja miR-19b näytti olevan yhteistyön riippuvainen, yhdenmukainen sen kanssa, että ne ilmentyvät yhteisestä transkriptio, miR-17-92. Mallit jotka koostuvat joko miR-19a tai miR-19b yhdessä miR-345 ja miR-519c-5p osoitti AUC 0,94 saavuttaen vahva merkitys (

p

= 0,02 ja 0,017 vastaavasti) (taulukko 4 ja kuvio 4a).

A) ROC käyrät ikä, PSA, ja vaihe plus /miinus yksittäisten miRNA tai näiden yhdistelmää 3 miRNA. B) Niiden potilaiden osuus joko Gleason 6 (vaaleanharmaa) tai Gleason 7 (tummanharmaa) leikkauksen suhteen ennalta kirurgian CAPRA pisteet. C) Sama kuin B, mutta lisäämällä miRNA. Arvo 1 annetaan kullekin positiivisen miRNA ja lisätään CAPRA pisteet. CAPRA nomogrammi yhdistyvät seuraavat muuttujat: Ikä diagnoosi, PSA diagnoosin, Gleason pisteet ennalta kirurgisia koepala, Clinical vaiheessa ja Prosenttia mukana koepaloja.

Jotta voitaisiin tunnistaa pisteytys mekanismi saatavilla lääkäreille ja potilaille, arvioimme hyödyllisyys lisäämällä miRNA arvot vakiintunut riskin mallin CAPRA maalin [23]. Erityisesti meidän kohortti oli matala CAPRA tulokset (vaihteluväli 0-2 10) odotetusti AS-sopivaa potilasta. Lisäämällä yksi pisteestä pisteet kullekin kolmesta miRNA (miR-19a tai 19b, miR-345, ja miR-519c-5p), joka havaittiin ylittää binary kynnysarvon, potilaat voivat erottaa ne, joilla todennäköisesti on Gleason 7-ja täten väli riski-tauti verrattuna niihin, jotka eivät (kuviot 4b-c). Lineaarinen kehitys oli erittäin merkitsevä (

p

0,001). Todellakin, 100%: lla tuloksella 4 tai 5 oli Gleason 7 sairaus post-kirurgisesti versus 7 pois 24 potilailla pistein 1 tai 2.

alkuperä seerumin miRNA

Paljastui seerumin miRNA voi syntyä suoraan kasvaimeen tai kehon vastaus kasvain. Sen määrittämiseksi, onko ennustavan miRNA ovat läsnä eturauhasen kasvaimia, suoritimme in situ koettimilla miR-19b FFPE kasvain näytteitä potilaista meidän kohortin (

n

= 10). Keskityimme miR-19b kuin se saavutti merkitystä sekä löytö ja validointi sarjoiksi. Huomaa, että miR-19b anturi tuskin syrjiä miR-19a ja miR-19b johtuen niiden erittäin samanlaiset sekvenssit. Värjäys miR-19b oli voimakasta alueilla korkealaatuisesta PIN, Gleason kuvio 3, ja Gleason kuvio 4, mutta se puuttuu normaalilta näyttäviä epiteelissä (kuvio 5). Kuitenkin, ei ollut ilmeistä eroa värjäytymisen intensiteetti yhä arvosanan PIN Gleason kuvio 4. Vaikka siis miR-19 solujen tasot selvästi lisääntyneet muutos, oli epäselvää, oliko muita kasvua soluissa patologisiin etenemiseen.

kuvat osoittavat in situ värjäyksen miR-19b (vasen ja keskiosissa) ja negatiivinen kontrolli, miR-295 (oikea paneeli). Top paneelit osoittavat alueen eturauhasen intraepiteliaalisten neoplasia (PIN). Lähi paneelit osoittavat alueen Gleason 3. Pohja paneelit osoittavat alueen Gleason 4. alueet PIN, Gleason 3, ja Gleason 4 kaikki tahra voimakkaasti miR-19b anturi (sininen värjäys). Huomaa jokainen paneeli on alueella normaali-näkymästä epiteelin, selvimmin vasemmalla jokaisen keskustan paneelin. Nämä alueet osoittavat paljon pienempi värjäytymistä. Oikea ja vasen paneelit, 100-kertainen suurennus. Keskiosat, 400-kertainen suurennus. Keskiosat edustavat boxed alueita vasemmassa paneelit.

Keskustelu

Koska posttranskriptionaalisen sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen, miRNA toimivat sekä onkogeenien ja tuumorisuppressoreita [25], [26]. Poikkeava miRNA allekirjoitukset on osoitettu eturauhaskasvainnäytteissä ja on havaittu seerumissa miesten PCA [12] – [16], [27], [28]. Olemme aikaisemmin tunnistaneet miRNA allekirjoitus liittyy potilaan riskiä laskettu CAPRA tulokset, jotka ennustavat etäpesäkkeitä PCA kuolleisuus, ja kuolleisuusriskiä [17]. Kuitenkin mikään näistä aiempien tutkimusten osoitettu onko miRNA voisi antaa lisätietoja mikä voidaan ennustaa nykyisen muuttujat, kuten PSA, kuvantaminen, ja koepala. Täällä, huomasimme ja validoitu neljä seerumin miRNA, miR-19a, miR-19b, miR-345, ja miR-519c-5p jotka yhdessä ja kun lisätään nykyiset parametrit, paransi ennustaminen haitallisia patologian sisällä eturauhanen. Yksittäin vain miR-19a /b saavutettu merkitys sekä löytö ja validointi sarjoiksi.

ennustemallien kuten ikä, PSA, vaihe, ja koepala osallistuminen osoitti AUC-arvo 0,77 tunnistamisessa haitallisia patologian jälkeisissä kirurgisista näytteistä, lisäämällä 3 miRNA (miR-19a tai miR-19b plus miR-345 ja miR-519c-5p) osoittivat AUC-arvo 0,94. Lisäksi sisällyttäminen miRNA allekirjoituksen nykyisin käytössä riskiluku (CAPRA) parani ennuste leikkauksen jälkeisen päivittää tukemaan sen kliinistä hyötyä. Nämä parannukset ovat ensimmäinen osoitus tietojemme riippumattoman ennustavuutta seerumin miRNA edellä olevista kliinis toimenpiteitä erittäin relevantti skenaario. Vaikka lähes 50% vasta diagnosoiduista potilaista täyttävät nyt matalan riskin kriteerit AS protokollia, vain 10% tällaisesta potilaille tehdään AS [29], [30]. Ottaa ylimääräisiä markkereita, jotka voidaan edelleen erotella potilaat ovat kriittisiä parantaa näitä numeroita.

Serum-pohjainen merkkiaineita ovat edullisia, koska tällaiset testit ovat suhteellisen ei-invasiivisia ja voidaan kätevästi käyttää seuraamaan potilaita. Markers saatu seerumista, joita asia koskee koepala otantavirheen mikä on merkittävä rajoitus kudoksen perustuvissa määrityksissä [31], [32]. Alkuperä miRNA ihmisen seerumissa edelleen pääosin epäselvä. In situ -hybridisaatio on eturauhasessa potilailta meidän kohortin osoitti läsnäolo miR-19b kaikilla transformoitujen epiteelin korkealaatuisesta PIN Gleason 4 mallia. Toisin vähän tai ei lainkaan värjäytymistä nähtiin stroomaan tai normaalilta näyttäviä epiteelissä. Läsnäolo miR-19b sisällä huonolaatuista kasvainkudoksen, mutta vähentynyt tasolle, joka vastaa seerumin herättää kysymyksen lähde miRNA seerumissa potilailla, joilla on korkeamman asteen kasvaimet. Yksi jännittävä mahdollisuus on, että miR-19b on vain erittyy kun etenemistä, vaikka se on ilmaistu sisällä transformoitujen solujen aikaisin kasvainten kehittymiseen. Vaihtoehtoisesti solut voidaan joutua rikkomaan rakenteellisten elementtien kudosta miR-19b päästä verta. Lopuksi miRNA voi johtua elimistön vaste kasvaimen (esim immuunivastetta). Yhteenvetona solu alkuperältään muutoksia miRNA tasoja seerumissa kanssa patologinen eteneminen on vielä määrittämättä.

miR-19 on osa ryhmää miRNA jalostettujen yhdestä transkriptio, miR-17-92 cluster [9]. Tämä klusteri tuottaa kuusi kypsä miRNA (miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, miR-92) ja sijaitsee 13q31.3, alue monistettiin useita hematopoieettisten ja kiinteä kasvain pahanlaatuisia kasvaimia [ ,,,0],33] – [35]. Kun B-solulymfooman malli, yli-ilmentyminen

miR-17-92

kanssa

c-myc

edistää kasvaimen muodostumisen, osoittaa kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden klusterin [35]. miR-19 näyttää olevan olennainen onkogeenisen osa

miR-17-92

kohdistamalla tuumorisuppressori,

PTEN

, jolloin aktivointi Akt-mTOR-reitin [36], [ ,,,0],37]. Koska hyvin dokumentoitu rooli

PTEN

eturauhassyövässä ja että muutos löytyy 30-70%: lla potilaista aikaan diagnoosi, on erittäin todennäköistä, että korkeus miR-19a miR-19b nähdään kudos on toiminnallisesti liittyy kasvaimen kehitys [38] – [40].

Muut seerumin miRNA että eroavat paljastui tässä on todettu olevan koholla eturauhassyöpäpotilailla. Erityisen jännittävä esimerkki on Mir-141, joka on osoitettu olevan koholla eturauhassyövän potilailla, joilla on edennyt sairaus, kuten niillä, joilla imusolmuke tai luumetastaasipotilailla [15], [27], [28]. Tutkimuksessamme miR-141 ei havaittu potilailla, jotka täyttävät alhaisen riskin kriteerit AS. Näin ollen vaikka miR-141 voi olla mahdollinen merkki potilailla, joilla on kehittyneempi PCA se ei todennäköisesti ole arvoa ehdokkaita AS päättääkseen rajuihin hoitoon. Lisäksi tautitilan ristiriitaisia ​​tuloksia joukossa tutkimukset voivat myös johtua vaihtelut menetelmien seerumin miRNA profilointia. Yksittäiset qRT-PCR-pohjaiset protokollat ​​ja mikrosirujen määritykset voivat tuottaa eri miRNA allekirjoitukset. Vaikka tällä hetkellä ei kultakanta seerumin miRNA havaitsemista, olemme aiemmin osoittaneet, että multiplex qRT-PCR-menetelmällä on tarkka mittaamalla miRNA tasoilla tyrmäys joista puuttuu kanoninen tai molempia kanoninen ja ei-kanoninen miRNA [17].

tässä tutkimuksessa haitalliset patologia määriteltiin Gleason pisteet 7 leikkauksen jälkeiset yksilö. Gleason pisteet 7 liittyy lisääntynyt riski taudin aiheuttamaa kuolleisuutta ja edelleen paras yksittäinen ennustaja käyttäytymisestä taudin [20]. Kuitenkin Gleason pisteet 7 ei ole tae tulevasta kliinisen etenemisen. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että jopa keskitason riskin potilailla, joilla on Gleason pisteet 7 osoittavat erinomaista säilymiseen AS lyhyt väli seurantaa [41]. Kuten enemmän potilaita ilmoittautua AS ja tietoja meneillään olevat oikeudenkäynnit kypsä, tutkimukset tulee suorittaa onko miRNA ennustaa tulevaa etäpesäke tai tautikohtaisia ​​kuolleisuutta. Lisäksi mahdollisille kokeita tarvitaan, onko ne ovat arvokkaita työkaluja seurataan potilaan tehtäessä AS.

Yhteenvetona tämä tutkimus identifioi seerumin miRNA allekirjoitus, joka voi toimia itsenäisenä prognostinen markkeri PCA. Lisäksi se osoittaa, kuinka seerumi miRNA voidaan käyttää tunnistamaan suhteellisen pieniä askelia kasvainprogression mahdollistaa yhä kliinisiä tarkentaminen tautinsa. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan vahvistamaan näitä merkkiaineita suuri kohortti poikki laitoksille sekä yhdistää pitkän aikavälin tuloksia, erityisesti potilaiden sairastuvuutta ja kuolleisuutta.