Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka PCTAIRE1 /PCTK1 /Cdk16 yliekspressoituu pahanlaatuisten solujen ja on ratkaisevan tärkeää kasvainten synnyssä, sen tehtävä apoptoosin edelleen epäselvä. Tässä olemme tutkineet rooli PCTAIRE1 apoptoosissa, erityisesti ulkoista solukuolemareittiin. Gene-pudotus on

PCTAIRE1

valonherkkien eturauhassyövän PPC1 ja DU145-soluja, ja rintasyöpä MDA-MB-468-solujen TNF-perheen sytokiinit, mukaan lukien TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL). Samaan aikaan PCTAIRE1-knockdown ei herkistä ole pahanlaatuisia soluja, mukaan lukien diploidit fibroblastit IMR-90 ja kuolemattomaksi eturauhasen epiteelisolujen linja 267B1. PCTAIRE1-Knockdown eivät säätää ylös kuoleman reseptorin ilmentymisen solun pinnalla tai vaikuttaa kaspaasin 8, FADD ja FLIP ekspressiotasoja. PCTAIRE1-Knockdown teki edistää kaspaasin 8 pilkkominen ja RIPK1 hajoaminen, kun taas RIPK1 mRNA Knockdown herkistyneet PPC1 solujen TNF-perheen sytokiinien. Lisäksi estäjät SNS-032, joka estää PCTAIRE1 kinaasiaktiivisuuden herkistyneet PPC1 solujen TRAIL: n indusoiman apoptoosin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PCTAIRE1 edistää vastustuskykyä syövän solulinjojen indusoiman apoptoosin TNF-perheen sytokiinit, mikä tarkoittaa, että PCTAIRE1 estäjät voivat olla synergistisiä vaikutuksia TNF-perheen sytokiinit cytodestruction syöpäsoluja.

Johdanto-osan : Yanagin T, Shi R, Aza-Blanc P, Reed JC, Matsuzawa Si (2015) PCTAIRE1-knockdown herkistää syöpäsolut TNF-perheen sytokiinit. PLoS ONE 10 (3): e0119404. doi: 10,1371 /journal.pone.0119404

Academic Editor: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 01 lokakuu 2014; Hyväksytty: 12 tammikuu 2015; Julkaistu: 19 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Yanagin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Teruki Yanagin tukee JSPS apurahat tutkimukseen ulkomailla, Kanae perusta, ja Sumitomo elämä sosiaali- huoltoperustus. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: John C. Reed on työntekijä Roche Group, AG. Toinen kirjoittajat ei ole taloudellisia eturistiriitoja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

PCTAIRE perhe on haara kinaasien liittyvien CDK perhe, joka sisältää PCTAIRE1 (myös tiedossa kuten Sykliinistä riippuvaisen kinaasin 16 (Cdk16) ja PCTK1), PCTAIRE2 ja PCTAIRE3 [1]. PCTAIRE1 ilmentyy laajasti koko elimistöön, korkeimmat tasot nähty aivoissa ja kiveksissä [2]. PCTAIRE1 on osoitettu osallistua spermatogeneesin [3] ja sääntelyn solunsisäisten rakkuloiden [4,5], samoin kuin translokaatio glukoosin kuljetuksen proteiinien [6] ja neuriitin kasvua [7]. PCTAIRE1 on keskeinen kinaasidomeeni, joka osoittaa aminohapposekvenssin samankaltaisuuden CDK, ja tämä alue on reunustavat ainutlaatuiset N-terminaaliset ja C-terminaaliset domeenit. Mekanismien vastaava PCTAIRE1 aktivointia ei tunneta, mutta todetaan, että poistetaan N-terminaalinen domeeni poistetaan kinaasiaktiivisuuden

in vitro

merkitsee sitä, että tämä alue on tärkeä, ja se voi sitoa tuntematon kofaktori tai vuorovaikutuksessa sisäisen molekyylitasolla kanssa Keski kinaasidomeeni edistää aktiivista konformaatioita katalyyttisen domeenin [1,7]. N-terminaalinen domeeni PCTAIRE1 fosforyloituu proteiinikinaasi A (PKA), joka estää sen aktiivisuuden [3,8], kun taas vuorovaikutus N-terminaalisen domeenin PCTAIRE1 sykliini Y on osoitettu stimuloivan kinaasiaktiivisuuden [3]. PCTAIRE1 myös vuorovaikutuksessa Copii monimutkainen mukana vienti eritettyjen proteiinien solulimakalvostosta [5].

Havaitsimme äskettäin, että PCTAIRE1 on korvaamaton rooli syövän solujen lisääntymisen [9,10]. Osoitimme myös, että PCTAIRE1-Knockdown syöpäsolujen edistänyt mitoosi pidätys liittyy puutteita sentrosomimäärän dynamiikkaa. Lisäksi PCTAIRE1 fosforyloi p27 at Ser10, joka helpottaa p27 hajoamista. Kuitenkin toiminta PCTAIRE1 apoptoosin ei ole selvitetty.

indusoiman apoptoosin TRAIL, Fas-ligandin (FasL) ja TNF-alfa etenee läpi sarjan reseptorivälitteisen proteiini-vuorovaikutusten, että mahdollisimman vähän vaativat adaptoriproteiini FADD ja kysteiiniproteaasien kuten kaspaasi-8 tai-10. Vaikka nämä kuoleman reseptori signalointikompleksiin osat pysyvät useimmat syövät, vastustuskykyä apoptoosin edelleen yleistä. FADD ja kaspaasi-8 ovat välittäjiä ulkoista polku, joka tiedetään moduloidaan proteiinin fosforylaation, mikä viittaa rooli kinaasien vastustuskyky pro-apoptoottisten TNF-perheen sytokiinit. Proteiinikinaasien myös houkuttelevia kohteita syöpään lääkekehityksen. Lisäksi huomattavaa näyttöä on ehdottanut rooli proteiinin fosforylaatiota moduloinnissa proksimaalisessa signalointi tapahtumien aiheuttamien TNF-perheen kuolemareseptorien [11-19], sekä muuttamalla aktiivisuuden hyvin tunnustettu loppupään apoptoosin estäjiä, kuten FLIP ja Bcl-2- ja IAP-proteiinit [18,20-24]. Tässä suhteessa, fosforylaatio kuoleman indusoimiseksi signalointikompleksiin (DISC) komponentit Fas, FADD ja kaspaasi-8, sekä kaspaasi-8 substraatin Bid ja anti-apoptoottisen vaimentimet kuoleman reseptori-indusoitua apoptoosia (c-FLIP, XIAP) on raportoitu liittyneen kasvaimen vastustuskykyä TRAIL tai Fas [20-22,25].

tässä tutkimuksessa olemme edelleen tunnettu roolia PCTAIRE1 syöpäsoluissa, ja erityisesti sen funktio extrinsic solukuoleman polku. Tarjoamme näyttöä siitä, että PCTAIRE1 on keskeisessä asemassa resistenssiä TNF-perheen sytokiinien syöpäsoluissa. Gene pudotus on

PCTAIRE1

säteilyherkälle eturauhas- ja rintasyövän solujen TNF-perheen sytokiinit, mukaan lukien TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) ja Fas, mutta ei herkistä normaali tai ei-transformoitujen solujen TRAIL. PCTAIRE1-pudotus edistää kaspaasi-8 lohkominen ja hajoamista reseptorin kanssa vuorovaikutuksessa olevan seriini-treoniini-proteiinikinaasi 1 (RIPK1). SiRNA-välitteinen knockdovvn RIPK1 mRNA myös herkistyneet PPC1 solujen TNF-perheen sytokiinien. Tulosten perusteella näyttää, että PCTAIRE1 voisi olla tärkeä tavoite syöpähoidon, ja että PCTAIRE1 estäjät voivat olla synergistisiä vaikutuksia TNF-perheen sytokiinien tappaa syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

solunelinkykyisyysmäärityksen kit Cell Titer Glo hankittiin Promega. RNAiMAX saatiin Life Technologies. Ennalta suunniteltu lyhyt häiritsevä RNA (siRNA) on suunnattu ihmisen PCTAIRE1 (siRNA IDS: 1472, 1566, 1656), PCTAIRE2 (s10160), PCTAIRE3 (s10162), kaspaasi-8 (s2427), RIPK1 (s16653), p27 (s2837 ) ja scramble-ohjaus (# 1, # 2) hankittiin Life Technologies. Rekombinantti TRAIL ostettiin Enzo Bioscience. SNS-032 ostettiin Selleck Chemicals. Vasta-aineet PCTAIRE1 (kanin polyklonaalinen: HPA001366, Sigma), RIPK1 (610458, BD Transduction Lab), kaspaasi-8 (1C12, # 9746, Cell Signaling Technology), pilkotaan kaspaasi-8 (# 9496, Cell Signaling Technology), fosforia kaspaasi-8 (Ser387, # 710535, Life technologies), FADD (06-711, Millipore), fosfori-FADD (# 2781, Cell Signaling Technology), Fas /CD95 (CH-11, SY-001, MBL), DR4 (H-130, Santa Cruz), DR5 (N-19, Santa Cruz), FLIP (F6550, Sigma), fosfoseriini- (kanin polyklonaalinen, 61-8100, Life Technologies), p27 (hiiren monoklonaalinen G173-524: BD Pharmagen tai kanin polyklonaalista C-19, Santa Cruz), HA (Rat, 3F10, Roche), HA (hiiri, 12CA5, Roche), Myc (hiiri, 9E10, Roche), beeta-aktiini (hiiren monoklonaalinen, Sigma), alfa-tubuliinin (hiiren monoklonaalinen, B-7, Santa Cruz) ja piparjuuri-peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (GE Healthcare) ostettiin ilmoitetuista lähteistä.

siRNA näyttö ja tietojen analysointi

Ambion Äänenvaimennin Human Druggable Genome siRNA Kirjasto V2 toimitettiin osaksi PPC1 soluihin käänteisellä transfektiolla 384-kuoppaisen 10 nM siRNA avulla RNAiMAX (Life Technologies). 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin 3 ng /ml anti-FAS-vasta-ainetta (CH-11) tai DMSO: ssa vielä 24 tuntia, aika, jonka jälkeen elinkelpoisuus luettiin käyttäen ATP-lite (Perkin Elmer) kanssa Envision Plate reader (Perkin Elmer Inc.). Raakadataa lukemat normalisoituivat keskiarvoa negatiivisista kontrolleista sisällytetty kullekin levylle ja kaksoiskappaleet keskiarvo. Vaikutus FAS aktivaatio mitattiin laskemalla elinkelpoisuusaste CH-11 /DMSO kunkin siRNA. Tukeva

Z

-score sitten kullekin siRNA. P-arvot laskettiin myös jokaisen siRNA käyttäen 2-tail T-testiä olettaen normaalijakaumaa datan. Siten, että lopullisessa geeni pisteet, me keskimäärin Z arvot 2 tai 3 siRNA kohdistaminen kunkin geenin sekä P-arvo käyttämällä elinkelpoisuusaste. Arvot siRNA osoittaa korkea keskihajonnan ( 0,25) päällekkäisistä joko DMSO tai CH-11 käsitellyt solut poistettiin analyysistä.

Plasmidit

pistemutaatioita PCTAIRE1 (K194M) oli tehty PCR-pohjainen mutageneesillä menetelmällä käyttämällä

Pfu

polymeraasia (Agilent). IImentämisplasmidien erilaisia ​​proteiineja rakennettiin pcDNA3 vektori transfektioon tai pRDI292-puro vektori lentiviruksen infektio. Asianmukainen plasmidi rakentaminen varmistettiin restriktioentsyymidigestiolla ja DNA-sekvensoinnilla. Yksityiskohdat alukesekvensseissä käytetään tuottamaan pistemutaatiot ovat saatavilla pyynnöstä.

Solulinjat ja soluviljelmä

PPC1, DU145, MDA-MB-468, T47D, MCF7, IMR- 90, HeLa ja HEK293T solut hankittiin ATCC. 267B1 ja 267B1 /K-ras-solut olivat ystävällisiä lahjoja tri Dritschilo [26]. Kaikki käytetyt solut olivat vähemmän kuin kuusi kuukautta jatkuvan passage.

Solujen elävyys joissa käytetään ATP mittaus

Cell Titer Glo käytettiin solujen elinkelpoisuuden arviointi. Solut maljattiin 96-kuoppaisille kiinteä valkoinen levyille tiheytenä 5000 ~ 10000 solua per kuoppa 100 ul: ssa täydellistä alustaa tai ilman siRNA: t ja viljeltiin 48 tunnin ajan. Solut käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla sytokiinien tai yhdisteitä 24 tuntia. Cell titraaminen Glo lisättiin 100 ui kuoppaa kohti ja maljoja pidettiin pimeässä 15 minuuttia ennen mittausta luminenssi luminometrillä (Luminoskan Ascent, Thermo Scientific).

analyysi apoptoosin

Solut käsitellään käyttäen anneksiiniV-PI apoptoosin havaitsemiseen mukainen pakkaus valmistajan protokollan (Life Technologies), ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACS Canto laite (Becton Dickinson).

RNA-interferenssi

ohimeneviä pudotus, solut transfektoitiin siRNA dupleksit käänteisellä transfektio menetelmällä käyttäen Lipofectoamine RNAiMAX mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Life Technologies).

Tet-indusoituvan lyhyt hiusneula-RNA-konstrukteja, lentivirus ja infektio

PCTAIRE1 shRNA # 1 (GCTCTCATCACTCCTTCACTT), PCTAIRE1 shRNA # 2 (GACCTACATTAAGCTGGACAA), ja sekoituskoodin-ohjaus (CAACAAGATGAAGAGCACCAA) kloonattiin indusoitavissa pLKO-Tet-On puromysiini vektori [27]. Lentivirusvektorikonstruktit supernatantit tuotettu mukaan vakiintuneen protokollan [27]. Solut valittiin 2 ug /ml puromysiiniä (MP Biomedicals). Induktio shRNA saatiin aikaan lisäämällä 100 ng /ml doksisykliiniä väliaineeseen.

uutto Kokonais-RNA ja kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista käyttämällä RNeasy plus mini (Qiagen). RNA-pitoisuus mitattiin spektrofotometrisesti ja näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti RT-PCR: llä. RNA käänteistranskriboitiin käyttäen Superscript III (Life Technologies) ja komplementaarisen DNA-näytteet analysoitiin SYBR vihreä (Promega). Alukkeita, jotka ovat spesifisiä ihmisen PCTAIRE1, PCTAIRE2, PCTAIRE3, RIPK1 ja valvonta siivous ihmisen GAPDH on lueteltu alla.

Human PCTAIRE1

Forward: 5′-GCAGTGACCCTGGAGAGG-3 ’

Käänteinen : 5′- TCAAGTCCTCGTGCACAATC-3 ’

Human PCTAIRE2

Forward: 5’TGTTATTGGAGGGAGCCTTG-3′

Reverse: 5’TCTCACCATCTGATGCCATTT-3 ’

Human PCTAIRE3

Forward: 5’ATGGCATCCACCTCCTGA-3 ’

Reverse: 5’TCTGCTGACATGCGACTCTT-3′

Human RIPK1

Forward: 5’GTGTACAAGGGGCCCAACT-3 ’

Reverse: 5’CGGCTGTGTCTCAGTCTGTT-3′

Human GAPDH

Forward: 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ’

Reverse: 5′-ATGGGATTTCCATTGATGAC-3 ’

Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena ja normalisoitiin suhteessa GAPDH-tasojen.

SDS-PAGE, immunoblottauksen ja immunosaostus

Soluja pestiin kahdesti PBS: llä ja kerättiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA), joka sisälsi 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS: ää, 5 mM NaF ja EDTA-vapaata Complete proteaasi cocktail tabletti (Roche). Solut jätettiin jäille 20 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 14000 x

g

10 minuuttia. Proteiinikonsentraatiot mitattiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit (Bio-Rad). Sillä Laemmli SDS-PAGE, proteiinit erotettiin SDS-PAGE 4-15% gradienttigeeleillä (Life Technologies) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad). Phos-tag SDS-PAGE suoritettiin esivalettuja phostag geelejä (12,5% polyakryyliamidigeeleillä, jotka sisälsivät 50 uM Phos-tag akryyliamidi, Wako). Elektroforeesin jälkeen, phos-tag akryyliamidigeelejä pestiin juoksevalla puskurilla (25 mM Tris, 192 mM glysiini, 0,1% SDS), joka sisälsi 5 mM EDTA: ssa 10 minuuttia varovasti ravistellen, ja pestiin sitten taas juoksevalla puskurilla ilman EDTAa 10 minuutin ajan mukaan valmistajan protokollan (Wako Chemical). Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Blokkauksen jälkeen 1 tunnin ajan Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), jossa oli 0,05% Tween-20 ja 5% rasvatonta kuivamaitoa, membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden laimennettuna blokkauspuskuriin. Kalvoja huuhdeltiin kolme kertaa TBS: ssä, jossa oli 0,05% Tween-20, ja inkuboitiin toissijaisen HRP-konjugoitua vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa. Tehostetun kemiluminesenssin (ECL) menetelmällä (GE Healthcare) käytettiin havaitsemiseen.

immunosaostuksella (IP), solut hajotettiin 1% NP40, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl: a , 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5 mM NaF ja EDTA-vapaa täydellinen proteaasi cocktail tabletti. Kolme milligrammaa proteiinia lysaattia käytettiin immunosaostuksella inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa ja 2 ug tietyn vasta-aineen. Seuraavana päivänä, 30 ui proteiini G hartsia (Life Technologies) lisättiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. IPS pestiin sitten neljä kertaa hajotuspuskurilla, minkä jälkeen näyte puskuria lisättiin, ja helmet keitettiin 10 minuuttia 100 ° C: ssa.

klonogeeninen määritys arvioimiseksi Fas /TRAIL herkkyys

solut siirrostettiin 35 mm: n annoksia 1,0 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja transfektoitiin sitten ohjaus tai PCTAIRE1 kohdistaminen siRNA. 2 päivän jälkeen, agonistinen anti-Fas-ab (CH-11) tai TRAIL lisättiin ja soluja viljeltiin 3 päivää ennen vahvistamista ja värjäämällä 0,5% kristallivioletilla väriainetta. Kiinnitykseen, soluja inkuboitiin metanolin kanssa -20 ° C: ssa 20 minuutin ajan, pestiin PBS: llä, ja niitä inkuboitiin 0,5% kristallivioletilla väriaineen 25% metanolia 15 minuutin ajan.

FACS-analyysi Fas /DR4 /DR5 ilme solun pinnalla

PPC1 ja MDA-MB-468-soluja (1,0 x 10

5), jotka olivat käännetyn transfektoitu siRNA: t kohdistamista PCTAIRE1 ja scramble-ohjaus istutettiin 6 cm ruokia. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia sen jälkeen, kun käänteisen-transfektion, kiinnittyneet solut pestiin kerran PBS: llä, irrotettiin käyttäen TripleExpress (Gibco), ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään FACS-puskurissa (1% FBS PBS: ssä). Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen FACS-puskuriin 3,0 x 10

5 solua /100 ui. Sitten soluja inkuboitiin pimeässä jäällä kyllästää pitoisuudet fykoerytriini-leimatun anti-DR4, anti-DR5 (eBioscience), FITC-leimattu anti-Fas (BD Pharmagen), tai immunoglobuliini G1 isotyypin kontrollivasta-aineita 1 tunti kohti valmistajan ohjeita. Kaikkiaan 10.000 tapahtumaa analysoitiin virtaussytometrialla kullekin käsittelylle.

Synkronointi

pidättämään HeLa-soluja alussa S-vaiheeseen, kaksinkertainen tymidiini lohko menetelmää sovellettiin [10]. Lyhyesti, tymidiiniä (2,5 mM) lisättiin kulttuurin 14 tuntia, ja solut vapautettiin lohkon pesemällä kolme kertaa PBS: llä. 8 tunnin kuluttua, tymidiiniä lisättiin uudelleen. Sen jälkeen toinen käsittely 14 tuntia, solut vapautettiin lohkon.

kvantitatiivinen mittaus ja tilastollinen analyysi

Keinot ja keskihajonta (SD) laskettiin tilastollisesti kolmesta määrityksen. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Erojen tilastollinen merkitsevyys eri näytteissä määritettiin Studentin t-testillä. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

tunnistaminen PCTAIRE1 kinaasin siRNA kirjaston seulonta

Tunnistaa ehdokas vaimentimet tai parantajia Fas- aiheuttaman apoptoosin kasvainsoluissa, me optimoitu kaksi tyyppisiä tehoseulonnan (HTS) määritykset siRNA kirjaston seulontaan. Käyttämällä PPC1 eturauhassyövän solut, olemme päättäneet, että stimulointi pieniannoksisen anti-Fas-vasta-CH11 (3 ng /ml) ei aiheuttanut sytotoksisuutta, kun taas stimulaatio suurina annoksina anti-Fas-vasta-ainetta (25 ng /ml) tappoi nämä syöpäsoluja. Käyttämällä ohjaus siRNA vahvistaa määrityksen, huomasimme, että 3 3 siRNA: iden kohdistaminen FLIP herkistyneet PPC1 solujen pieniannoksisen (3 ng /ml) anti-Fas-vasta kun taas 3 3 siRNA: iden kohdistaminen FADD esti PPC1 tappaminen aiheuttama suuren annoksen ( 25 ng /ml) anti-Fas-vasta-ainetta. Käytön jälkeen nämä ohjaus siRNA optimoida HTS määrityksissä Z ”tekijä 0,5, me sitten seulotaan kirjasto 16800 siRNA: iden kohdistaminen 5600 geenejä (3-kertainen kattavuus), joka muodostaa niin sanotun ”druggable genomin”. PPC1 solut 384 kuoppalevyillä ”käänteinen” transfektoitu siRNA: t, ja sitten 2 päivää myöhemmin CH11 vasta-ainetta lisättiin ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä bioluminisenssimääritykseen määrittää ATP-tasot päivää myöhemmin (S1 Kuva., S1 aineisto). Vaikutus FAS aktivaatio mitattiin laskemalla elinkelpoisuusaste Fas /DMSO kunkin siRNA. Siten, että lopullisessa geeni pisteet, me keskimäärin Z arvot 2 tai 3 siRNA kohdistaminen kunkin geenin. Jotta pienen annoksen (3 ng /ml) näyttö, PCTAIRE1 kinaasi tunnistettiin vaimennin Fas- aiheuttaman apoptoosin.

Gene knockdovvn PCTAIRE1 herkistää syöpäsolut TNF-perheen sytokiinien

lisäarvioimiseksi roolin PCTAIRE1 TNF-perheen sytokiinien eturauhassyövässä PPC1 soluja, käytimme siRNA kohdistamista PCTAIRE1. Immunoblottaus kantaesitettiin vahvistaa Knockdown proteiinitasolla (Fig. 1A). Käyttäen 3 siRNA: t, jotka ovat onnistuneet tippuu alas PCTAIRE1 ilmaisu, havaitsimme herkistyminen PPC1 solujen anti-Fas-vasta-ainetta (CH-11), TRAIL, ja TNF-alfa (Fig. 1 B ja C, ja S2A kuviossa.). AnneksiiniV värjäystä kokeet itsenäisesti vahvistaneet nämä tulokset, ja näyttöä siitä, että apoptoottinen mekanismi oli mukana (Kuva. 1 D). Toisin kuin Fas (CH-11), TRAIL: n ja TNF, PCTAIRE1 pudotus ei herkistää PPC1 solujen muihin solukuolemareittejä, mukaan lukien ärsykkeitä, jotka käynnistävät apoptoosin reitit solulimakalvostosta (thapsigargin) ja mitokondrioita (staurosporiini) (S2B Fig. Ja dataa ei esitetty). Samanlaisia ​​tehty päätelmiä kun klonogeeniset eloonjäämistä arvioitiin, jossa kaikki 3 siRNA kohdistaminen PCTAIRE1 herkistävät PPC1 solujen Fas (CH-11) ja TRAIL (Fig. 1 E ja F). Sen sijaan, siRNA-välitteisen knockdovvn PCTAIRE2 tai PCTAIRE3 ei herkistää PPC1 solujen Fas, TRAIL: n tai TNF (S2C-H kuvion.). Olemme myös arvioitiin vaikutusta PCTAIRE1-Knockdown on kemosensitiivisyys solujen sisplatiinin ja paklitakselin. PPC1 solujen PCTAIRE1-pudotus inkuboitiin eri sisplatiinin ja paklitakselin, ja solujen elinkelpoisuuden arviointi ei osoittanut mitään merkittäviä synergistisiä sytotoksisia vaikutuksia PPC1 soluissa (S2I-N kuvion.). Olemme edelleen arvioitu siRNA-välitteinen PCTAIRE1-knockdovvn muissa solulinjoissa, ja totesi, että rintasyöpä MDA-MB-468-solujen PCTAIRE1-Knockdown oli tehokas palauttaminen herkkyys Fas- tai TRAIL (S3A-F Fig.). Kuten voidaan odottaa, heterogeenisyys nähdään ihmisen syövissä, vaikutus PCTAIRE1 Knockdown ei ollut tasainen, että vähemmän kiinteää vaikutuksia havaittiin ihmisen rintasyövän MCF7-solut (S3G-I Fig.).

( A) PPC1 solut transfektoitiin salattu RNA tai kolme eri siRNA: ita kohdistaminen PCTAIRE1 (siRNA: t 1472, 1566, 1656). Lysaatit soluista 48 tunnin kuluttua siRNA transfektion valmistettiin, normalisoidaan proteiinin kokonaismäärästä, ja pienet määrät analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-PCTAIRE1 (ylhäällä) tai anti-alfa-tubuliinin (alhaalla) vasta-aineita. (B, C) PPC1 solut transfektoitiin kontrolli-RNA (violetti ”x”) tai eri siRNA kohdistaminen PCTAIRE1 (sininen ruutu, 1472, punaiset neliöt, 1566, vihreä kolmio, 1656). 48 tunnin jälkeen, soluja stimuloitiin joko anti-Fas-vasta-ainetta (CH-11) (B) tai TRAIL (C) eri pitoisuuksina, kuten on ilmoitettu. 24 tunnin kuluttua, solujen ATP-tasot mitattiin korvikkeena indikaattorina solujen elinkelpoisuus käyttäen Cell Titer Glo reagenssit, ja tulokset on ilmoitettu suhde viljeltyjen solujen kanssa ja ilman anti-Fas (B), ja TRAIL (C). (D) Apoptosis analyysit tehtiin käyttäen anneksiiniV kit. PPC1 solut transfektoitiin hajotus- RNA siRNA: iden kohdistaminen PCTAIRE1. 48 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin anti-Fas-vasta-ainetta (100 ng /ml) tai TRAIL (50 ng /ml) 4 tuntia. * P 0,05, *** P 0,001 t-testillä. Kaikki tiedot edustavat keskiarvoa ± SD (n = 3). (E, F) klonogeeninen selviytymisen määritykset. PPC1 solut ympättiin 6 hyvin (35 mm) ruokia 1,0 x 10

5 solua per kuoppa ja sitten kääntää transfektoitiin scramble-ohjaus tai PCTAIRE1 kohdistamisen siRNA kuten. 48 tunnin kuluttua, anti-Fas-vasta-ainetta (E, 10 ng /ml) tai TRAIL (F, 20 ng /ml) lisättiin ja soluja viljeltiin 3 päivää ennen vahvistamista ja värjäämällä 0,5% kristallivioletilla väriainetta. (G, H) PPC1 solut transfektoitiin kontrolli-RNA tai kolme eri siRNA kohdistaminen PCTAIRE1. 48 tunnin jälkeen solut stimuloitiin Fas (G, 10 ng /ml) tai TRAIL (H, 10 ng /ml). 3 tunnin kuluttua, solujen lysaatit valmistettiin, normalisoidaan proteiinin kokonaismäärästä, ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen spesifistä vasta-ainetta lohkaistaan ​​kaspaasi-8. Osittain pilkotaan 43/41 kDa bändejä ja täysin pilkottu 18 kDa on merkitty, samoin kuin molekyylipainomerkkiaineet (kDa). Blotti uudelleenseulottiin beeta-aktiini-vasta-aine latauskontrollina. (I) PPC1 solut transfektoitiin sekoituskoodin-ohjaus tai siRNA kohdistaminen PCTAIRE1 (si-1472). 48 tunnin jälkeen, solut tai niitä ei stimuloitu anti-Fas-vasta-ainetta (CH-11, 10 ng /ml). 3 tunnin kuluttua, solulysaatit kerättiin ja immunosaostettiin anti-kaspaasi 8-vasta-ainetta, jota seurasi immunoblottaus mainituilla vasta-aineilla. Punainen nuolenpää osoittaa ei-spesifistä vyöhykettä.

kaspaasi-8 indusoi TNF-perheen kuolemaa reseptoreihin on liitetty proteolyyttinen prosessointi on ~ 50 kDa: n pro-kaspaasi-8-molekyylin aluksi, jolloin saatiin ~ 43/41 kDa osittain jalostettua molekyylejä ja lopulta tuottaa ~ 18 ja ~ 10 kDa: n alayksiköt katalyyttisesti aktiivisen proteaasin. Käytimme immunoblottaus seurata vaikutuksia siRNA-välitteisen knockdovvn PCTAIRE1 on proteolyyttinen prosessointi pro-kaspaasi-8. SiRNA-välitteinen vaiennettu PCTAIRE1 vuonna PPC1 soluissa todellakin kasvanut Fas- ja TRAIL aiheuttama käsittely kaspaasin 8 verrattuna ohjaamaan RNA (Fig. 1 G ja H). Havaitsimme myös kokoonpanoon FADD /kaspaasin 8 kompleksi (kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin: DISC) Fas-käsiteltyjen PPC1 solujen PCTAIRE1 taintumisen (Fig. 1I). Toisaalta, pudotus kaspaasi-8 confered Fas-vastus PPC1 solujen PCTAIRE1-pudotus (tuloksia ei ole esitetty).

siRNA-välitteinen PCTAIRE1-pudotus vaikutuksia ulkoista solukuolemareittiin myös toistettu käyttäen tetrasykliiniresistenssigeenit indusoituva shRNA vektorit käyttöön lentivirukselle infektion [27]. Vuonna PPC1 soluja, jotka oli stabiilisti infektoitiin kahdella eri shRNAs kohdistaminen PCTAIRE1 (shRNA # 1 ja # 2), viljellään tetrasykliini analogista doksisykliini vähensivät PCTAIRE1 proteiinin tasot (Fig. 2A). Joka korreloi nämä vähennykset PCTAIRE1 proteiinia, doksisykliini palautti myös PPC1 herkkyys Fas ja TRAIL, kuten solujen elinkelpoisuuden määrityksen tulokset (Fig. 2B-E). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kahdella muulla kasvainsolulinjoja (MDA-MB-468 ja DU145-soluja), jotka oli transdusoitu stabiilisti tetrasykliini-indusoituva PCTAIRE1 shRNA vektorit (S4 ja S5 kuvioissa.). Näistä tuloksista päättelemme, että PCTAIRE1 antaa Fas /TRAIL vastus epiteelisyöpäsolujen.

(A) PPC1 solut stabiilisti sisältävät indusoituvia shRNAs kohdistettu eri kohtaan PCTAIRE1 mRNA (shRNA # 1, # 2) tai scramble- ohjaus viljeltiin 48 tuntia doksisykliini (Dox, 100 ng /ml). Proteiini lysaatit syntyy, normalisoidaan kokonaisproteiinipitoisuus, ja analysoitiin SDS-PAGE /immunoblottauksella käyttäen vasta-aineita PCTAIRE1 (ylhäällä) ja beeta-aktiini (alhaalla). (B, C) PPC1 soluja viljeltiin (ON) tai ilman sitä (OFF) 100 ng /ml Dox 48 tuntia, sitten stimuloitiin eri pitoisuuksilla joko anti-Fas-vasta-ainetta CH-11 (B) tai TRAIL (C). 24 tunnin kuluttua, solujen ATP-tasot mitattiin, ja tulokset ilmaistiin suhteena suhteessa soluja viljeltiin ilman anti-Fas tai TRAIL (keskiarvo ± SD, n = 3). (D, E) klonogeeninen selviytymisen määritykset. PPC1 solut stabiilisti sisältävät indusoituvan shRNAs (sekoituskoodin tai shRNA # 2) viljeltiin (ON) tai ilman sitä (OFF) 100 ng /ml Dox 48 tunnin ajan, sitten niitä stimuloitiin anti-Fas-vasta-ainetta (CH-11, 10 ng /ml) tai TRAIL (20 ng /ml). Soluja viljeltiin 3 päivää ennen vahvistamista ja värjäys 0,5% kristalliviolettia väriainetta.

Transformoidut solut ovat ensisijaisesti riippuvaisia ​​PCTAIRE1 vastustuskyvyn Trail

joukossa TNF-perheen sytokiinien, TRAIL pidetään lupaavin ase torjumiseksi syöpäsoluja koska TRAIL herkkyys havaittiin etupäässä kasvain, mutta ei normaaleissa soluissa [28,29]. Lisäksi histopatologiset analyysit ensisijainen eturauhasen ja rintakudosten paljasti, että PCTAIRE1 immuunivärjäysmenetelmällä oli hyvin alhainen normaaleissa kudoksissa, mutta huomattavasti korkeampi syövissä [10]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että PCTAIRE1-Knockdown ei vaikuta ulkoista solukuolemareittiin normaaleissa soluissa. Tukeakseen tätä mahdollisuutta, tutkimme knockdovvn PCTAIRE1 ihmisen diploidi fibroblasti linja IMR-90. Näissä soluissa siRNA-välitteinen PCTAIRE1-knockdown ei vaikuttanut TRAIL herkkyyttä, jota arvioidaan mittaamalla ATP-tasot (kuvio. 3A ja D). Tutkimaan edelleen roolia PCTAIRE1 normaaleissa verrattuna transformoiduissa soluissa, haimme PCTAIRE1-siRNA on ikuistettu 267B1 normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen ja niiden K-ras (V12) muunnettava isogeenisiin vastine, 267B1 /K-ras-solut [26], sen jälkeen vahvistus siRNA tehoa käyttäen immunoblottauksella (Fig. 3B ja C). Herkkyys TRAIL arvioitiin ATP-tasot, mikä osoitti, että 267B1 /K-ras-solujen PCTAIRE1 Knockdown olivat huomattavan herkkiä Trail vertailuryhmän 267B1 /K-ras-solujen scramble-siRNA (Fig. 3F). Sen sijaan ei-transformoidut 267B1 soluja PCTAIRE1-Knockdown ei osoittanut merkittävää muutosta TRAIL herkkyys verrattuna muokkaamaan-ohjaus soluja (Kuva. 3E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että transformoituneet solut ovat edullisesti riippuvaisia ​​PCTAIRE1 resistenssiä TRAIL.

(AC) Human diploidit fibroblastit IMR-90 (A), 267B1 immortalisoidut normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (B), ja K-ras muuttaneet 267B1 (267B1 /K-ras) soluja (C) transfektoitiin salattu RNA tai kolme eri siRNA kohdistaminen PCTAIRE1 (siRNA: si-1472, si-1566, si-1656). Lysaatit soluista 72 tuntia transfektion jälkeen valmistettiin ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen kaniinin anti-PCTAIRE1 (ylhäällä) tai anti-beeta-aktiini (alhaalla) vasta-aineita. (D-F) IMR-90, 267B1 ja 267B1 /K-ras-solut transfektoitiin siRNA: illa. 48 tunnin jälkeen, soluja stimuloitiin TRAIL eri pitoisuuksina, kuten on ilmoitettu. 24 tunnin kuluttua, solujen ATP-tasot mitattiin, ja tulokset ilmaistiin suhteena välillä viljeltyjen solujen kanssa ja ilman TRAIL (keskiarvo ± SD, n = 3).

PCTAIRE1-pudotus moduloi RIPK1 proteiinin ilmentymisen

tutkia mekanismia, jolla PCTAIRE1 estää indusoiman apoptoosin TRAIL /Fas, tutkimme vaikutus PCTAIRE1 pudotus ekspressioon eri proteiineja, jotka ovat osallisena TNF-perheen sytokiinien signalointireitin agonisti. Koska PCTAIRE1-Knockdown herkistyneet PPC1 solujen kuolemaan reseptoriin ärsykkeitä (Fas, TRAIL), mutta ei aineita, jotka laukaisevat muiden solukuolemareittejä, epäilimme että PCTAIRE1 voivat estää proksimaalisen askel Fas ja TRAIL reseptorin signalointi. Kriittinen tapahtuma aloittamisen apoptoosireittiä indusoiman TNF-perheen sytokiinien on kaspaasi-8, joka vaatii adaptoriproteiini FADD, ja vastustaa FLIP. Kuten edellä on esitetty, PCTAIRE1-pudotus aktivoitu kaspaasi-8 käsittely (Fig. 4A), mutta PCTAIRE1-pudotus ei vaikuttanut ekspressiotasot FADD, prokaspaasi-8: n tai c-FLIP (S6A kuvio.). Mittaus solun pinnan tasoa (FACS) tai solun kokonais tasot (immunoblottauksella) Fas, TRAIL-reseptori 1 (kuolema reseptori 4, DR4) tai TRAIL-reseptori 2 (kuoleman reseptori 5, DR5) ei myöskään todettu toistettavissa eroa ohjaus ja PCTAIRE1-knockdown-soluja (S6A ja B kuviossa., ja dataa ei näytetty). Lisäksi vaikka fosforylaatio kaspaasin 8 ja FADD ovat tiettävästi mukana resistenssin TNF-perheen sytokiinien [11,12,30], emme havainneet mitään merkittävää muutosta fosforylaatiota kaspaasi-8 (Ser387) tai FADD (Ser194) in PCTAIRE1 yli-ilmentävät /pudotus PPC1 soluja (S6c-F kuviossa.).

(A) PPC1 solut transfektoitiin kontrolli-RNA tai kolme eri siRNA kohdistaminen PCTAIRE1. 48 tunnin jälkeen, solujen lysaatit valmistettiin RIPA-puskurilla, normalisoitu proteiinin kokonaismäärästä, ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (B) PPC1 solut transfektoitiin ilmoitettu siRNA: t 48 tunnin ajan, minkä jälkeen solulysaatit kerättiin 1 x Laemmli-puskuriin ja altistettiin immunoblottauksella analyysi RIPK1 (ylhäällä) ja beeta-aktiini (keskellä). (C, D) PPC1 solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA: illa. 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin proteasomin inhibiittoria MG-132 (10 uM) 5 tunnin ajan, ennen kuin valmistuksessa solulysaateista (C: 1 x Laemmli-puskuria, D: RIPA-puskuri). (E) PPC1 solut transfektoitiin kontrolli-RNA tai siRNA kohdistaminen RIPK1. 48 tunnin jälkeen, solujen lysaatit valmistettiin RIPA-puskurissa, normalisoitu proteiinin kokonaismäärästä, ja analysoitiin immunoblottauksella käyttäen mainituilla vasta-aineilla. (F, G) PPC1 solut transfektoitiin kontrolli-RNA tai siRNA kohdistaminen RIPK1. 48 tunnin jälkeen, soluja stimuloitiin joko anti-Fas-vasta-ainetta (CH-11) (F) tai TRAIL (G) eri pitoisuuksina, kuten on ilmoitettu.