Krooninen sairaus

tiivistelmä

Potilaat, joilla on edenneen eturauhassyövän lähes poikkeuksetta kehittää luinen etäpesäke. Vaikka monet tutkimukset osoittavat, että NF-KB: n signalointi näyttää korreloivan edennyt syöpä ja edistää kasvaimen etäpesäkkeiden vaikuttamalla kasvain solujen vaeltamiseen ja angiogeneesiä, vaikutus muuttuneen NF-KB signalointi eturauhassyövän solut boney etäpesäkeleesioita ei ole selvästi ymmärsi. Vaikka C4-2B ja PC3 eturauhassyövän solut kasvavat hyvin luun, LNCaP on vaikea kasvaa hiiren luu- seuraavissa intraskeletal injektion. Tutkimuksemme osoittavat, että verrattuna LNCaP, NF-KB: n aktiivisuus on huomattavasti korkeampi C4-2B ja PC3, ja että NF-KB: n signaloinnin eturauhassyöpäsoluissa johti lisääntynyt ilmentyminen osteoklastien indusoivan geenejä PTHrP ja RANKL. Lisäksi väliaine johdettu NF-KB aktivoituu LNCaP solut indusoivat osteoklastien. Lisäksi, inaktivaatio NF-KB: n signaloinnin eturauhassyöpäsoluissa inhiboi kasvaimen muodostumista luun, niin osteolyyttisiä PC3 ja osteoblastisten /osteoklastien sekoitettu C4-2B-solut; kun NF-KB: n signalointi LNCaP edistänyt kasvain perustaminen ja leviämisen luun. NF-KB: n LNCaP-soluissa johti muodostumista osteoblastien /osteoklastien sekoitettu kasvain kasvoi osteoklastien ympäröivästä uuden muodostuneen luun, joka on samanlainen etäpesäkkeitä esiintyy tavallisesti potilailla, joilla on eturauhasen syöpä. Nämä tulokset osoittavat, että osteoklastien reaktio tarvitaan jopa osteoblastic syöpäsoluissa ja NF-KB: n signalointi eturauhasen syöpäsolujen kasvaa osteoklastigeneesin jopa säätelevä osteoklastigeenisen geenejä, mikä edistää luun metastaattisen muodostumiseen.

Citation: Jin R, Sterling JA, Edwards JR, DeGraff DJ, Lee C, Park SI, et al. (2013) NF-kappa B Signaling edistää kasvua eturauhassyöpäsolujen in Bone. PLoS ONE 8 (4): e60983. doi: 10,1371 /journal.pone.0060983

Editor: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 elokuu 2012; Hyväksytty 5 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 05 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Jin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin RJ Department of Defense (DOD) Eturauhassyöpä Research Program (PCRP) (W81XWH-10-1-0236); JAS jonka TMEN (5U54 CA 126505), Vanderbilt University Bone Centerin PPG (5P01 CA40035) ja veteraaniviraston urakehityssuunnitelmaan Award; ja RJM National Cancer Institute (4R01 CA076142-14) ja Frances Preston Laboratories ja T.J. Martell Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Melkein kaikilla potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä (PCA) kehittää osseus etäpesäke. Kehittäminen kasvaimen kasvua luussa on kriittisin komplikaatio kehittyneitä Eturauhassyövän, usein tuloksena huomattavaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta [1]. Toisin kuin muiden syöpien, ensimmäinen metastaattisen talletus PCa solujen lähes rajoitetaan tiukasti luuhun ja on usein ainoa sivusto distaalisten levisi jopa loppuvaiheissa tauti [2]. Kun eturauhaskasvainsoluissa tulla luuranko, tuhoisa sykli brutto luustovaurioita ja kasvaimen kasvua tapahtuu, missä vaiheessa parantavaa hoitoa ei ole enää mahdollista ja lievittävän hoidon tulee ainoa vaihtoehto. Mediaani aika välillä diagnoosin kliinisesti todettu luuston etäpesäkkeiden ja kuolema kestää noin 3-5 vuotta [3]. Siksi ymmärtäminen mekanismia, jolla PCA solut viihtyvät luuhun ympäristössä ja kehittää tehokas menetelmä (t) ehkäistä tai hoitaa PCa luumetastaasipotilailla on kriittinen lisätä eloonjäämisaste kehittyneitä Eturauhassyövän potilaista.

Toisin kuin muut kiinteät kasvaimia, jotka liittyvät osteolyyttiset etäpesäkkeet PCA luumetastaasin liittyy osteoblastisia etäpesäkkeitä. Kuitenkin onnistunut kolonisaatiota luun PCA solut vaatii sekä osteolyyttinen ja osteoblastisissa prosesseja. Tämä tapahtuu osittain koska PCa solut kykenevät tuottamaan kasvutekijöitä, jotka voivat vaikuttaa sekä osteoblastien ja osteoklastien, jolloin osteoblastien luun muodostumista ja luun liiallinen resorptio [1], [4]. Vaikka rooli osteoblastien PCA luumetastaasipotilailla on hyvin tunnustettu, useat havainnot viittaavat vahvasti siihen, tärkeä rooli osteoklastien toiminnon onnistuneen muodostumiseen PCa luuetäpesäkkeistä [5] – [10]. Esimerkiksi kun PCa solut ensin asuttaa luun, kyseessä arvellaan ensimmäiseen aiheuttaa osteoklastigeneesin [11], ja myöhemmät luun hajoamista. Histomorfometrinen todisteet osoittavat, että osteoblastisissa etäpesäkkeitä muodostavat trabekulaarisen luun sivustoja aiempien osteoklastien resorption ja tällainen Imeytymistä tarvita myöhemmissä osteoblastic luun muodostumista [12]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että PCa indusoi luun laskeuman kautta yleiseen lisääntymiseen luun. Lisäksi osteoklastien luun hajoamista edistää enemmistön luuston jälkitauteja, tai luustoon liittyvien tapahtumien (SRE, kuten murtuma ja kipu), potilailla, joilla on luumetastaaseja. Edelleen, osteoklastien luun hajoamista edistää myös perustamalla kasvaimia luuranko. Siksi osteoklastigeneesin aiheuttama PCa solujen ehdotettu olevan varhainen tapahtuma luun etäpesäke ja on välttämätön alustava edellytys PCA luun kolonisaatio. Vaikka käsite osteoklastien aktivoinnista taustalla komponentti Eturauhassyövän kasvun luun on jo hyvin tunnustettu, mekanistinen yksityiskohdat, joita PCA solut lisäävät osteoklastien aktivoitumisen ja myöhemmin aiheuttaa etäpesäke luuhun ympäristöön ovat vielä epäselviä.

nyt yleisesti uskotaan, että molekyyli- kolmikko – Receptor Activator of NF-KB ligandia (RANKL), sen reseptori RANK, ja potilaan oman liukoisen RANKL estäjä, osteoprotegeriini (OPG) – on olennaiset ja suora rooleja muodostumiseen, funktio, ja selviytyminen osteoklastien. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että RANKL /RANK /OPG ovat keskeisiä säätelijöitä luun aineenvaihdunnan sekä normaaleissa että patologisissa olosuhteissa, kuten PCa luuetäpesäkkeistä [13], [14]. Toinen tärkeä geeni, Lisäkilpirauhashormonin kaltainen proteiini (PTHrP), tiedetään olevan osallisena ja osteoklastien erilaistumista. PTHrP tuotetaan lähes kaikki tuumorit, jotka etäpesäkkeitä luuhun, ja lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet korrelaation PTHrP ilmaisun ja luuston lokalisointi kasvaimia. PTHrP on merkittävä vaikutuksia luun kautta vuorovaikutusta PTH-1 reseptorin osteoblastisolujen. Epäsuorilla keinoilla, FTHrP tukee osteoklastigeneesin jopa säätelevä RANKL osteoblastien [15]. PCa-solujen on osoitettu ilmentävän useita tekijöitä, jotka säätelevät osteoklastogeneesiä, mukaan lukien PTHrP, makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (M-CSF), jäsenet transformoivan kasvutekijä β (TGF-β) superperheen, ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA- plasmiini), jolloin aktivointi matriisin metalloproteinaasien (MMP: t, erityisesti MMP-2 ja MMP-9) sekä interleukiini-1 (IL-1) ja interleukiini-6 (IL-6) [16]. Kuitenkin tunnistaminen kriittisen mekanismin (t) tai ensisijainen reitin (t), joka vastaa alustavasti osoittaneet osteoklastigeenisen geeni (t) ja liiallinen resorptio johtaa edistämisessä PCa luumetastaasin edelleen heikko.

On yleisesti tunnustetaan, että RANKL /RANK /OPG ovat keskeisiä säätelijöitä luun aineenvaihdunnan ja FTHrP on yksi tärkeä avain sääntelyviranomaisten osteoklastien ja osteoblastien erilaistumista. Siksi tässä esillä olevassa tutkimuksessa olemme keskittyneet ymmärtämään, miten RANKL ja FTHrP säännellään PCa soluissa NF-KB. NF-KB proteiinit ovat tärkeä luokka transkription sääntelyviranomaisten PCA. Runsaat data tukee avainrooli NF-KB-signalointireitin säätelyssä taudin alkamisen ja etenemisen ihmisen syövän [17] – [20]. Yli-ilmentyminen NF-KB tumassa Eturauhassyövän soluja näyttää korreloivan PCA chemoresistance, pitkälle, PSA uusiutuminen ja metastaaseja [21] – [27]. Useat tutkimukset ovat julkaisseet näyttöä NF-KB-reitin on myötävaikuttamassa sisäelinten tai ”pehmytkudoksen” etäpesäke PCA [18], [19], [28], [29]. Aiemmin olemme raportoineet, että NF-KB: n signalointi edistää kastraatiotason kestävä kasvu Eturauhassyövän [30]. Tässä tutkimuksessa selvitimme rooli NF-KB signaloinnin asuttaminen PCa solujen sisällä luuhun ympäristössä ja rooli tämän mekanismin pelaa luuston tuhoutuminen ja siihen liittyvä PCa luun etäpesäke. Me raportoimme, että NF-KB: n signaloinnin lisää ilmentymistä osteoklastigeenisen geenien PCa-soluissa, joka on riittävä syövän solut voivat kiinnittyä ja kasvaa luun ympäristössä ja parantaa leesion muodostumista. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, että NF-KB: n signalointi PCA soluissa lisääntyy osteoklastigeneesin jopa säätelevä osteoklastigeenisen geenejä, mikä edistää luun metastaasien muodostumista. Tutkimuksemme osoittaa, että kohdistaminen alas-säätely NF-KB voi olla merkittävä vaikutus vähentää tuskallinen luumetastaasipotilailla pitkälle PCa potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja materiaalit

ihmisen eturauhasen sinoomasolulinjoja LNCaP ja PC-3 saatiin ATCC (Manassas, VA). C4-2B solut lahja tri Leland Chung (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA) [31]. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa. Solulinjoja viljeltiin rutiininomaisesti RPMI 1640 (Gibco-BRL), elatusaineessa, joka sisälsi 5% vasikan sikiön seerumia (FBS) (Hyclone), 0,1%: sen ja 0,1% glutamiinia (Gibco-BRL).

Generation of NF KB-signalointia jatkuvasti päällä /inaktivoitu PCa solulinjoilla

Voit luoda konstitutiivisesti aktivoitua NF-KB signalointi PCa solulinjan, LNCaP-solut stabiilisti infektoitiin IKK2-EE retrovirusvektori tuloksena LNCaP-EE, jossa NF-KB aktiivisuus aktivoitiin konstitutiivisesti aktiivinen (EE) mutantteja IKK2 [32], [33]. Tuottaa NF-KB: n signaloinnin jatkuvasti inaktivoidun PCa solulinjat, C4-2B ja PC3-solut stabiilisti infektoitiin IKK2-KD retrovirusvektorin (C4-2B-KD ja PC3-KD), jossa NF-KB: n aktiivisuus inhiboitui kinaasin kuollut (KD) IKK2 mutantti [32], [33]. Solut infektoitiin tyhjää vektoria käytettiin verrokkeina (LNCaP-EV, C4-2B-EV ja PC3-EV). Kaikki retrovirusvektorit olivat lahja tri Martin Leverkus, University of Magdeburgissa Saksassa.

Käänteinen transkriptio ja Reaaliaikainen PCR

Yhteensä RNA: iden LNCaP, LNCaP-EE, C4-2B ja PC3-soluja uutettiin käyttäen Trizol (Gibco-BRL), ja jäljellä genominen DNA poistettiin DNaseI (Invitrogen) hoitoon. RNA: t käänteistranskriptoitiin käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja Superscript II (Gibco-BRL) mukaan valmistajan protokollaa. Alukkeet, joita käytettiin monistamaan RANKL olivat 5′-TGGAAGGCTCATGGTTGGAT-3 ’(eteenpäin), 5′-CATTGATGGTGAGGTGTGCAA-3′ (taaksepäin); PTHrP olivat 5’-TTAAAGCAGTACCCCCCTACCA-3 ’(eteenpäin), 5′-ATGGGCTCTAGCGCCTCTCT-3’ (reverse). Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin 20 ul: n tilavuudessa käyttäen 96-kuoppaisen levyn muodossa ja fluoresenssi havaittiin käyttäen Bio-Rad I-Cycler IQ reaaliaikainen havaitseminen järjestelmä. Geenien ilmentyminen normalisoitiin 18s rRNA jonka 2

-ΔΔCt menetelmä [34].

RANKL ELISA ja FTHrP Radio-immunologisia menetelmiä (RIA) B

määrittämistä RANKL ja PTHrP tasot erittämät PCA solut, LNCaP-EV, LNCaP-EE, PC3-EV ja PC3-KD soluja viljeltiin erikseen 48 tunnin ajan; solujen lukumäärät laskettiin. 40 ja 100 ui viljelyalustaa käytettiin ELISA (MyBioSource) ja RIA (Beckman Coulter) kohti valmistajan ohjeiden, vastaavasti. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena ELISA-lukijalla tai gammalaskurilla (Beckman Coulter), ja konsentraatiot määritettiin kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western blot-analyysi

Kokosolulysaatti uutettiin NF-KB aktivoitu /inaktivoitu PCa soluja. 20 ug: n erä kutakin proteiinia näytettä erotettiin 4-12% Tris-glysiini-gradienttigeelissä (Novex ™), ja sitten siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Schleicher PC3-EV ja PC3-KD solut). Tuottaa elatusaine sisälsi eritteet PCa solujen, RPMI 1640-alustassa (joka sisälsi 5% FBS: ää, 0,1% ITS ja 0,1% glutamiinia) lisättiin PCA soluviljelymaljoille. 24 tunnin kuluttua väliaine otettiin talteen ja siirrettiin kohdesoluihin (osteoblastit). MTT-analyysi suoritettiin 48 tunnin kuluttua hoidon.

Hiiri malli kasvainten aiheuttaman luuston sairaus

Kaikki eläinkokeet suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas Care ja käyttö of Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Vanderbilt Institutional Animal Care Käytä komitea (Luvan numero: M /09/387). Sekä NF-KB aktivoituu (PC3-EV, C4-2B-EV ja LNCaP-EE) ja inaktivoituja (PC3-KD, C4-2B-KD ja LNCaP-EV) PCa soluja käytettiin sen tutkimiseksi, NF-KB KB: n signaloinnin vaikuttavan PCa kasvaimen perustamista ja kasvua luun ympäristössä. Vähentää välinen isäntä vaihtelu verrattaessa ohjaus ja testi ryhmiä, NF-KB aktivoituu ja inaktivoituja PCa soluja ei siirretty samassa hiiri. Jokaisessa yksittäisessä isäntä, vasen sääriluu injisoitiin NF-KB aktivoituu PCa (PC3-EV, C4-2B-EV ja LNCaP-EE) soluihin, kun taas oikean säären injektoitiin NF-KB inaktivoitu PCa (PC3-KD, C4-2B-KD ja LNCaP-EV) soluissa, vastaavasti. Tarkemmin sanottuna yksisoluiset keskeyttäminen 2 x 10

5 PC3-EV tai PC3-KD; C4-2B-EV tai C4-2B-KD; LNCaP-EV tai LNCaP-EE solua /10 ui PBS laitettiin suoraan 6-7 viikkoa vanha mies kateenkorvattomia nude-hiirten (BALB /c-kanta) luun sääriluunsisäinen pistoksena isofluraanianestesiassa, vastaavasti. Jokainen ryhmä oli vähintään 4 hiirtä. Osteoblastic vauriot arvioitiin käyttäen pieneläinten röntgen- röntgenkuva kuvantaminen (Faxitron-yksikköön LX-60, Lincolnshire). Lopettamisen jälkeen, luun tilavuus arvioitiin mikro CT skannaus ja histologinen analyysi 3 (PC3-EV ja PC3-KD-solut injektoidaan hiiriin) ja 10 (LNCaP-EV, LNCaP-EE, C4-2B-EV ja C4-2B -KD solut injektoidaan hiiret) viikon kuluttua kasvaimen istuttamisen jälkeen. Hakkuut sääriluut fiksoitiin 10% neutraalipuskuroituun-formaliiniliuokseen 24 tuntia ja kalkittomat 0,5 mol /l EDTA Ca

2 + – ja Mg

2 + vapaata Dulbeccon PBS viikon ajan ennen parafiiniin. Kuusi mikrometrin pitkittäinen sarja kohdat leikattiin sääri- ja värjättiin H Fox A1: 1:1000) yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sekundaarinen vasta-ainetta inkuboitiin 60 minuuttia, käyttäen joko piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani-tai vuohen anti-hiiri (1:1000), vastaavasti. Leikkeet huuhdeltiin laajasti vesijohtovedessä, vastavärjätään Mayerin hematoksyliinillä ja asennettu.

Tilastollinen ja kuva-analyysi

Tarvittaessa koeryhmään verrattiin käyttämällä kahden otoksen

t

– testi, jossa merkitys määritellään

P

0,05.

tulokset

NF-KB signalointi lisää ilmentymistä osteoklastigeneesin liittyvien geenien PCa soluissa

IκBα estää NF-KB: n signaloinnin sitoutumalla NF-KB ja estää ydinvoiman lokalisointi [38], [39]. Siksi alas säätely IκBα johtaa jatkuvaan NF-KB: n signalointi [40], [41]. Tutkiakseen rooliin NF-KB signalointi eturauhaseen /PCa kehittymistä ja etenemistä, suoritimme RNA mikrosirujen vertailla suoraan eturauhasen kudoksia IκBα knock out (KO) hiiren [40], [41] (mukaan lukien IκBα – /- ja IκBα +/- hiiret) kanssa normaalin hiiren eturauhaskudoksiin. Tulokset microarray-analyysi osoitti, että ekspressio monissa osteoklastigeneesin liittyvien geenien, kuten RANKL, PTHrP, GM-CSF: n ja uPA, kasvoi yli 2-kertainen sekä IκBα – /- ja IκBα +/- eturauhaskudoksista, verrattuna normaalin eturauhasen (tuloksia ei ole esitetty). Jotta edelleen vahvistamaan, NF-KB signalointi on osallisena säätelyssä osteoklastigeneesin liittyvien geenien PCa soluissa, aktivoimme NF-KB signalointia LNCaP infektoimalla kanssa IKK2-EE retrovirusvektorin, jossa NF-KB-aktiivisuutta aktivoitiin konstitutiivisesti aktiivinen mutantteja IKK2 [32], [33]. NF-KB: n signalointi vahvistettiin käyttäen NGL toimittaja, joka on NF-KB: n toimittaja plasmidi, joka on NF-KB: n vastaava elementti, joka on kytketty GFP /lusiferaasireporttiterilla [35] (Fig. 1A). qRT-PCR-analyysi osoitti, että RANKL ja FTHrP ilme ovat merkittävästi lisääntyneet NF-KB aktivoituu LNCaP verrattuna tyhjät vektorisäädön soluja (Fig. 1 B ja 1 C). RANKL ja PTHrP tunnetaan avaintekijöitä osteoklastigeneesia luun, ja niillä on keskeinen merkitys luun etäpesäke monien syöpien [15], [42] – [45]. Tämän vuoksi tulokset meidän qRT-PCR osoittavat, että NF-KB signalointi on osallisena säätelyssä RANKL ja PTHrP The osteoklastigeneesin liittyvien geenien PCa soluissa.

NF-KB signalointi aktivoitiin LNCaP-soluissa tartuttamisesta kanssa IKK2-EE retrovirusvektorin (LNCaP-EE), kun taas LNCaP infektoitu tyhjän vektorin käytettiin hallintalaitteiden (LNCaP-EV). NF-KB: n aktiivisuus LNCaP-EV ja LNCaP-EE-solut mitattiin käyttämällä NF-KB-reagoiva NGL toimittaja (A). RANKL: in ilmentyminen (B) ja PTHrP (C) mitattiin qRT-PCR: llä. Arvot piirrettiin edustavat keskiarvoa vähintään kolmen yksittäisten näytteiden ± SEM. Tilastollinen merkittävyys määritettiin kahden otoksen

t

-testi. **,

P

0,01.

Eturauhassyövän soluja kykenee kasvamaan luun mikroympäristössä on suurempi NF-KB aktiviteetti

On todettu, että C4- 2B ja PC3 PCa solut kasvavat hyvin, mutta LNCaP-solut ovat vaikea kasvaa hiiren luu- seuraavissa sääriluunsisäinen /intrafemural injektio [46]. Tämä osoittaa, että soluspesifisestä geeniekspression tapahtumia osaltaan onnistunut kolonisaatiota luun PCA soluja. Sen määrittämiseksi, onko NF-KB aktiivisuus heijastaa PCa solujen kasvua luussa, endogeenisen NF-KB aktiivisuus LNCaP, C4-2B ja PC3-soluissa mitattiin käyttämällä NGL toimittaja [35]. Mielenkiintoista on, että NF-KB: n aktiivisuuden C4-2B ja PC3-solut (jotka kasvavat hyvin luun) on huomattavasti suurempi kuin LNCaP-soluja (Fig. 2A). Lisäksi qRT-PCR osoittaa PTHrP (mRNA) ilmentyminen on huomattavasti suurempi NF-KB aktivoituu LNCaP-EE, C4-2B ja PC3-soluissa, verrattuna LNCaP-soluissa (kuvio. 2B). ELISA ja RIA määritykset osoittavat, että NF-KB: n signaloinnin kasvoi RANKL ja PTHrP (proteiini) erityksen merkittävästi LNCaP-EE-soluissa, verrattuna tyhjällä vektorilla kontrollisoluja (Fig. 2C, D ja E). Kuitenkin inaktivaatio NF-KB signalointia PC3-soluissa (PC3-KD) infektoimalla niitä IKK2-KD retrovirusvektori, jossa NF-KB-aktiivisuus estyi kinaasilla kuollut (KD) IKK2 mutantti [32], [33] ( Fig. 2C), johti merkittävään väheneminen RANKL ja FTHrP tasolla verrattuna tyhjän vektorin ohjaus soluja (PC3-EV) (kuva 2D ja E). Western blotting-analyysi vahvisti lisäksi, että ilmaus RANKL ja FTHrP nostettiin NF-KB aktivoituu PCa soluja (LNCaP-EE), kun taas vähentynyt vuodesta NF-KB inaktivoituja PCa soluja (PC3-KD) verrattuna tyhjät vektorisäätö soluja ( LNCaP-EV ja PC3-EV) (Fig. 2F). Nämä tulokset osoittavat, että PCa solut, jotka pystyvät kasvamaan luun mikroympäristössä on suurempi NF-KB: n aktiivisuutta ja NF-KB: n signalointi up-regulation osteoklastigeneesin liittyvien geenien PCa soluissa, mahdollisesti parantamalla niiden kykyä kiinnittää ja kasvaa luun microenvironment.

(A) PCa kykenevien solujen kasvua luussa mikroympäristössä näytteille lisääntynyt NF-KB: n aktiivisuutta. NF-KB: n aktiivisuus LNCaP, C4-2B ja PC3-soluissa mitattiin käyttämällä NF-KB-reagoiva NGL toimittaja. (B) ekspressio FTHrP korreloi aktiivisuutta NF-KB: n signalointi PCA soluissa. Expression of PTHrP LNCaP, NF-KB aktivoituu LNCaP-EE, C4-2B ja PC3-soluissa mitattiin qRT-PCR. (C) Generating NF-KB inaktivoitu PCa solulinjoissa. NF-KB signalointi inaktivoituu C4-2B ja PC3-soluissa infektoimalla kanssa IKK2-KD retrovirusvektorin (C4-2B-KD ja PC3-KD), kun taas PCa solut infektoitu tyhjän vektorin käytettiin hallintalaitteiden (C4-2B ja PC3-EV). NF-KB: n aktiivisuus mitattiin käyttäen NF-KB-reagoiva NGL toimittaja. (D ja E), RANKL: in ilmentyminen (D) ja PTHrP (E) proteiinien NF-KB aktivoituu LNCaP-EE: n ja NF-KB: n inaktivoituja PC3-KD-soluja mitattiin ELISA: lla ja RIA määrityksissä, vastaavasti. Solut infektoitiin tyhjän vektorin (LNCaP-EV ja PC3-EV) käytettiin kontrollina. (F) RANKL: in ilmentyminen ja PTHrP korreloivat aktiivisuutta NF-KB: n signalointia PCa soluissa. RANKL ja PTHrP ilmentymistä arvioitiin Western blot -analyysillä. Arvot piirrettiin edustavat keskiarvoa vähintään kolmen yksittäisten näytteiden ± SEM. Tilastollinen merkittävyys määritettiin kahden otoksen

t

-testi. **,

P

0,01.

NF-KB signalointi PCA soluissa osallistuu osteoklastigeneesin

Osteoklastit ovat erittäin erikoistuneita monitumaisia ​​soluja vastuussa luun resorptio, prosessi kriittinen ylläpitoon luuston ja kalsiumin homeostaasiin. Kuitenkin patologinen aktivoituminen osteoklastien johtaa luun häviämisen, joka liittyy tulehduksellinen niveltulehdus, parodontiitin, ja syövän etäpesäkkeiden luun. Osteoklastit ovat peräisin monosyytti /makrofagilinjan esiasteita vaikutuksen alaisena sytokiinin RANKL [47]. Sen määrittämiseksi, onko NF-KB: n signalointia PCa soluissa vaikuttaa osteoklastigeneesia luuytimessä, monosyytti /makrofagilinjan progenitoreja ensisijainen luuytimen soluja käsiteltiin saadun sopeutetun elatusaineen NF-KB aktivoituu /inaktivoituja PCa soluja, ja seurataan osteoklastien erilaistumista. Tuloksemme osoittavat, että kasvualusta peräisin NF-KB aktivoituu LNCaP-soluja (LNCaP-EE) aiheuttama TRAP-positiivisten Monitumaisia ​​solujen muodostumista ominainen osteoklastien, kun väliaine LNCaP ole tehnyt niin (Fig. 3A ja taulukko 1). C4-2B ja PC3 soluravintoliuoksista indusoi myös TRAP-positiivisia monitumaisia ​​solujen muodostumista (Fig. 3A ja Taulukko 1). Edelleen ymmärtää, miten NF-KB: n signalointia PCa soluissa vaikuttaa solukomponenttien luun microenviornment, osteoblastien primaarisesta viljelmistä hiiren luuytimen soluja käsiteltiin saadun sopeutetun elatusaineen NF-KB aktivoituu /inaktivoituja PCa soluja. Tuloksemme osoittavat, että kasvualusta on johdettu NF-KB aktivoituu PCa soluja ei ollut merkittävää vaikutusta osteoblastien muodostumista (Kuva. 3B). Nämä tulokset osoittavat, että NF-KB: n signalointia PCa soluissa edistää osteoklastogeneesiä, mutta ei osteoblastien proliferaatiota.

(A) väliaine NF-KB aktivoituu PCa solujen indusoi osteoklastien tyyppisten solujen muodostumista

in vitro

. Luuytimestä peräisin makrofagien käsiteltiin vakioitua elatusainetta LNCaP, NF-KB aktivoituu LNCaP-EE, C4-2B ja PC3-soluissa. TRAP värjäys suoritettiin 10 päivän jälkeen ylimääräistä kulttuurin vakioidun alustan. Nuolet osoittavat osteoklastien kaltaisia ​​soluja. (B) NF-KB signalointi PCA soluissa ei ole merkittävää vaikutusta osteoblasteihin leviämistä. Ensisijainen viljellyt osteoblastien hoidettiin vakioitua elatusainetta NF-KB aktivoituu (LNCaP-EE, C4-2B-EV ja PC3-EV) tai inaktivoidaan (LNCaP-EV, C4-2B-KD ja PC3-KD) PCa soluja. Lisääntymisen määritys (MTT-määritys) suoritettiin 48 tunnin kuluttua hoidon.

antagonointi NF-KB signalointi estää PCa kasvaimen perustamista ja kasvua luun

Sen määrittämiseksi jos vastavaikuttamalla NF-KB signalointi estää PCa kasvaimen perustamista ja kasvua luun mikroympäristössä, me syntyy NF-KB signalointi inaktivoitu PCa solulinjoissa stabiilisti tartuttamisesta kanssa IKK2-KD vektorit (PC3-KD ja C4-2B-KD) (Fig. 2C ). Vaikka NF-KB saarto hieman muuttunut leviämisen hinnat (Fig. 4), kaikki muokatut solut kasvoivat hyvin (hengissä)

in vitro

jälkeen säätelyä alaspäin NF-KB: n aktiivisuutta. NF-KB: n inaktivoituja PC3 ja C4-2B soluja (PC3-KD ja C4-2B-KD) ympättiin luun hiirten sääriluunsisäinen injektio, ja pieni eläin X-ray röntgenkuva kuvantaminen suoritettiin seurata luuvaurion kehitystä. Hiiret lopetettiin histologista analyysiä 3 viikon (for PC3-EV ja PC3-KD-solut injektoidaan hiiriin) ja 10 viikon ajan (for C4-2B-EV ja C4-2B-KD solut ruiskutetaan hiiret) inokulaation. Kaikki kasvaimet oksastettu PC3-EV ja C4-2B-EV-solut (PC3 ja C4-2B infektoimia soluja tyhjän vektorin, käytettiin verrokkeina) kasvoi hyvin luun; katsoo, NF-KB inaktivoitu PC3-KD ja C4-2B-KD solujen kasvua ei havaittu (0/4 kummassakin ryhmässä) X-ray röntgenkuva kuvantamisen tai histologinen analyysi (Fig. 5A ja 5B). Histomorfometrinen analyysit osoittivat, että keskimääräinen BV /TV on 5,3% PC3-EV ja 13,9% for C4-2B-EV kasvaimia. Nämä tulokset osoittavat, että inaktivointi NF-KB signalointi estää sekä osteolyytti- (PC3) ja osteoblastien /osteoklastien sekoitettu (C4-2B) PCa kasvaimen perustamista ja kasvua luussa ympäristössä.

NF-KB aktivoituu /inaktivoitu PCa solu linjat muodostettiin vakaasti tartuttamisesta kanssa IKK2-EE /IKK2-KD vektoreita. IKK2-EV käytettiin kontrollina vektori. Proliferaationopeus määritettiin MTT: llä.

NF-KB inaktivoitu PC3-KD ja C4-2B-KD-soluja ei siirretty osaksi hiiren luiden sääriluunsisäinen injektiona.