PLoS ONE: miR-146a Estää Cell Growth, Cell Migration ja indusoi apoptoosia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut
tiivistelmä
Poikkeava ilmentyminen mikroRNA-146a (miR-146a) on raportoitu osallistuvan kehittymistä ja etenemistä eri syöpiä. Kuitenkin sen rooli ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ei ole selvitetty. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia osuus miR-146a eri näkökohtia pahanlaatuisen fenotyypin ihmisen NSCLCs. Vuonna toiminnalliset kokeissa miR-146a tukahdutetaan solujen kasvua, indusoi solujen apoptoosia ja estivät EGFR alavirran signalointia viidessä NSCLC solulinjoissa (H358, H1650, H1975, HCC827 ja H292). miR-146a esti myös muuttavien kapasiteetti näiden NSCLC soluja. Toisaalta, miR-146a tehosti soluproliferaation inhibointi huumausaineiden kohdentamalla EGFR, mukaan lukien sekä TKI (gefitinibi, erlotinibi ja afatinib) ja monoklonaalinen vasta-aine (setuksimabi). Nämä vaikutukset olivat riippumattomia EGFR-mutaatio tila (villityyppi, herkistäviä mutaatio tai mutaatio), mutta oli vähemmän tehokas verrattuna vaikutuksiin siRNA kohdistaminen EGFR. Tuloksemme viittaavat siihen, että nämä vaikutukset miR-146a johtuvat sen kohdentamiseen EGFR ja NF-KB: n signalointi. Olemme myös löytäneet, kliinisen formaliinilla parafiiniin upotetut (FFPE) keuhkosyöpä näytteitä, että alhainen ilmentyminen miR-146a korreloi kehittynyt kliininen TNM vaiheissa ja kaukainen etäpesäkkeiden NSCLC (
P
0,05). Potilaat, joilla on korkea miR-146a ilmentyminen niiden kasvaimia osoitti enää ilman taudin etenemistä (25,6 viikkoa miR-146a korkealla potilaista ja 4,8 viikkoa in miR-146a alhainen potilailla,
P
0,05). miR-146a on siis vahva ehdokas ennustetekijöiden biomarkkereiden NSCLC. Näin ollen indusoimalla miR-146a voi olla terapeuttinen strategia ei-pienisoluisen keuhkosyövän.
Citation: Chen G, Umelo IA, Lv S, Teugels E, Fostier K, Kronenberger P, et ai. (2013) miR-146a Estää Cell Growth, Cell Migration ja indusoi apoptoosia ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 8 (3): e60317. doi: 10,1371 /journal.pone.0060317
Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat
vastaanotettu: 04 lokakuu 2012; Hyväksytty: 25 helmikuu 2013; Julkaistu: 26 maaliskuu 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä tutkimus osittain tukee tutkimusrahasto Boehringer Ingelheim GmbH. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat saivat rahoitusta kaupallisesta lähteestä: Boehringer Ingelheim GmbH. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.
Johdanto
Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) koostuu 75-85% vasta diagnosoitu keuhkosyövässä. Yli 70% NSCLC potilaista on pitkälle edennyt tauti, ja koko 5 vuoden eloonjäämisaste NSCLC on vain 16%. Alkuvaiheen tai paikallisesti edennyt keuhkosyöpä, leikkaus on tehokkain hoito, ja yhdistelmä kemoterapia on standardi adjuvantti lähestymistapaa. Vaiheen III /IV ei-platina-pohjainen yhdistetty kemoterapia nykyinen standardi hoitoa, mutta paljon parantamisen varaa [1], [2]. Lung karsinogeneesi on monivaiheinen prosessi, joka johtuu aktivointi onkogeenien ja inaktivaation tuumorisuppressorigeeneille. Molekyylitason mekanismit kehittämiseen NSCLC ovat tällä hetkellä vielä ymmärretä. Näin ollen, ymmärtää paremmin näiden mekanismien on hyödyllistä kehittää uusia terapeuttisia kohteita ja strategioita hoitoon ihmisen NSCLC [3], [4], [5].
Viime vuosina, MikroRNA (miRNA) ovat saaneet yhä enemmän huomiota syöpätutkimukseen. Nämä pienet, ei-koodaavat RNA: t voivat estää kohdegeenin ilmentymisen sitoutumalla 3′-alueen kohde-mRNA, mikä johtaa joko mRNA: n hajoamisen tai inhibition käännös. MiRNA tärkeitä rooleja monissa normaaleissa biologisissa prosesseissa, joihin liittyy solujen lisääntymistä, erilaistumista, apoptoosia, ja kestää rasitusta [6], [7]. Kuitenkin tutkimukset ovat myös osoittaneet, että poikkeava miRNA ilmentymistä tai mutaation korreloi kehittymistä ja etenemistä syöpien. MiRNA voi olla onkogeenisiä tai kasvaimia estävä toiminta, ja siten miRNA ovat nousemassa tavoitteet syövän hoidossa [8]. Lisäksi miRNA voitaisiin käyttää prognostisia ja diagnostisia biomarkkereiden syövässä.
ilmentyminen miR-146a on havaittu olevan säädellään ylöspäin papillaarinen kilpirauhassyövän [9], anaplastinen kilpirauhassyöpä [10] ja kohdunkaulan syöpä [11], mikä viittaa miR-146a voisi toimia ”onkogeenisen” miRNA näissä syövissä. Kuitenkin pienempi ilmentyminen miR-146a on raportoitu eturauhasen syöpä [12], haimasyöpä [13] ja mahasyövän [14], [15]. Siksi rooli miR-146a voi vaihdella eri syöpiä. Lisäksi miR-146a tason on todettu korreloivan metastasointiin suun kasvaimissa [16]. Toiminnallisesti miR-146a-ilmentävien solujen osoittaneet selvää heikentynyt hyökkäyksen ja muuttoliike kyky vertailuryhmään nähden soluihin sekä rintasyövän [17] ja haimasyövän [13]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että moduloiva miR-146a tasossa on terapeuttista potentiaalia tukahduttaa hyökkäykset ja etäpesäkkeitä. Kuitenkin tietojemme mukaan ei tutkimukset ovat arvioineet assosiaatio miR-146A ja NSCLC soluja. Lisäksi ei ole saatavilla tietoa vaikutuksista miR-146a biologiaa NSCLC soluja. miR-146a voi kohdistaa EGFR, joka perustuu ennusti emäspariutumisessa käyttämällä miRBase analyysi [18], joka on toiminnallisesti vahvistettu rintasyövän [17], [19] ja haimasyövän [13]. EGFR on keskeisessä asemassa NSCLC ja aktiivisuus EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) in NSCLC, erityisesti kun läsnä on aktivoivaa EGFR mutaatioita [20]. Monimutkainen EGFR signaalinvälitysreitin sisältää Ras /MAPK cascade, inositoli-3-kinaasi (PI3K), signaali anturin ja aktivaattori transkription (stat), ja loppupään proteiinikinaasi C (PKC) [21]. Lisäksi EGFR aktivoi NF-KB: n fosforylaatio IKB [22]. Lisäksi miR-146a on rooli säätelyssä NF-KB [13], [17], [19], [23] eri pahanlaatuisia kasvaimia, vaikka NF-KB ei ole välittömänä kohteena miR-146a. Lisäksi suhde miR-146A ja signalointi EGFR tai NF-KB ei ole selvitetty.
mahdollista merkitystä tässä miRNA, miR-146a, tuli tietoomme kokeissa suoritimme ja että varhennetun löytö sen rooli muiden pahanlaatuisten kasvainten tai sen suhdetta EGFR mRNA. Näissä julkaisematon kokeissa olemme profiloitu miRNA ilmaisun Ba /F3-solut, jotka on transfektoitu villin tyypin ja mutantti EGFR-geenien vastaavasti käyttäen nestettä helmi-pohjainen array aiemmin kuvattu [24]. Vertaileva miRNA profiilit saatiin base-line olosuhteissa ja hoidon aikana EGFR TKI. Alusta oli talon omaa alustan ja mukana 425 miRNA. miR-146a oli miRNA että voimakkaimmin korreloivat mutaatiostatuksesta riippumatta EGFR, ja oli suurin vaihtelu vastauksena TKI hoitoon EGFR mutantti NSCLC solua ja Ba /F3-solut, jotka oli transfektoitu mutantti EGFR verrattuna EGFR villityypin soluista. Samalla sekvenssin homologia EGFR tunnistettiin [18].
herättämänä nämä tulokset, olemme edelleen tutkineet vaikutusta miR-146a solun kasvuun, apoptoosin ja liikkuvuus ihmisen NSCLC-solujen. Lisäksi vaikutukset miR-146a matkivat tutkittiin yhdistettynä EGFR TKI (gefitinibi, erlotinibi ja afatinib) ja monoklonaalinen vasta-aine (setuksimabi) erityisesti NSCLC solulinjoissa, jotka ovat vastustuskykyisiä EGFR TKI. Lopuksi, suhde miR-146a ilmaisun ja kliinisten parametrien ja ennuste on myös tutkittu käyttäen formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) keuhkosyöpä näytteitä.
Materiaalit ja menetelmät
Solulinjat ja reagenssit
ihmisen NSCLC solulinjat H358, H1650, H1975, HCC827 ja H292 saatiin American Type Culture Collection (
ATCC, Alankomaat
) ja viljeltiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [25], [ ,,,0],26]. EGFR-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine setuksimabi (2 mg /ml), EGFR TKI gefitinibi ja erlotinibin, ja panHER estäjä EGFR, HER2 ja HER4 kinaasit, afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25] , [26].
Re-ilmentyminen ja eston miR-146a in NSCLC soluissa
NSCLC-solut ympättiin 24-kuoppalevylle (2,5 x 10
4 solua kuoppaa kohti ) tai 96-kuoppaiselle levylle (2,5 x 10
3 solua kuoppaa kohti) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Sitten solut transfektoitiin miR-146a jäljittelevä, joka on miRNA matkivat negatiivinen kontrolli, joka on miR-146a-inhibiittori, tai miRNA-inhibiittorin negatiivinen kontrolli (
Ambion, Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia
) vastaavasti loppupitoisuuteen 60 nmol /L käyttäen Lipofectamine
TM 2000 (
Cat. No. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Belgia
). Solut transfektoitiin miRNA matkivat tai miRNA n estäjä päivittäin. Jälkeen 5 päivää transfektion jälkeen solut jaettiin ja transfektoitiin päivittäin uudelleen, päivänä 10 [13]. EGFR erityinen siRNA oli kuvattu aiemmin [25], [27] (sekvenssi: GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT). EGFR erityinen siRNA transfektoitiin NSCLC solut samalla menetelmällä kuin edellä.
kudosnäytteitä
kerääntyneet kudokset 101 peräkkäisen potilailla (ikäjakauma 29-83 vuotta, keski 68,3 vuotta) joille oli tehty kirurginen resektio tai biopsia NSCLC kahdessa toimielimissä. Näyte ei vaikuttaa normaalia keuhkokudoksessa oli myös kerätty 76 potilasta ja käytettiin pariksi ohjaus. Kaikki näytteet käsitellä patologinen tutkimus. Tutkimuksen protokolla hyväksyi paikallinen eettinen Valiokunnat ensimmäisen Affiliated sairaala, Guangxi Medical University, Kiina ja Universitair Ziekenhuis Brussel (UZ Brussel), Belgia. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin kaikilta potilailta. Kliinis parametrit on kuvattu taulukossa 1.
RT-qPCR
in vitro
kokeissa RNA: n eristys RNA normalisointi, ja käänteinen transkriptio olivat kuvattu aiemmin [25], [27], [28]. Kliinisten FFPE kudosta, lohkot leikattiin paksuuteen 10 pm (3 jaksoissa yhteensä RNA: n eristämistä). Kudos poistaa vaha ksyleenillä ja etanolilla. Kokonais-RNA eristettiin kasvaimen kohdat käyttäen miRNeasy FFPE Kit (
QIAGEN, KJ Venlo, Alankomaat
) mukaisesti valmistajan ohjeita muutoksia muuttamalla inkubaatioajan sekoittamisen jälkeen proteinaasi K: lla 36 tunnin ajan 55 ° C puolestaan lisäämällä proteinaasi K välein 12 tuntia säilyttää keskittyminen. Koosta riippuen kasvaimen näytteen RNA-pitoisuus vaihteli välillä 20 ng /ul 2 ug /ul havaita Nanodrop 2000 (
Wilmington, DE 19810 USA
). Intron-kattavat RT-PCR-alukkeet ovat spesifisiä EGFR tai GAPDH mRNA aiemmin on kuvattu [25], [28], [29]. Alukkeet miR-146A ja RNU6B sisältyivät TaqMan
® MicroRNA Analyysit (
4427975-000468, Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia
). Päinvastainen alukkeita käytettiin myös käänteistranskriptio askel TaqMan
® MicroRNA Reverse Transcription Kit (
4366596, Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia
), kokonaistilavuudessa 10 ui . Reaaliaikainen qPCR EGFR mRNA suoritettiin Roche LightCycler
® 1.5 väline SYBR vihreä havaitseminen ja sulamiskäyräanalyysi, kuten aiemmin on kuvattu [28] ja miRNA, Applied Biosystems PCR7900 käytettiin. Kohde-mRNA tai miRNA runsautta kussakin näytteessä normalisoitu sen viite GAPDH tai RUN6B raportoitu [25], [27], [30].
Solun kasvu
Solun kasvu määritettiin käyttämällä kolorimetrisen tetratsoliumia (MTS) määritys (
CellTiter96 vesikerros Solution proliferaatiomääritystä G3580, Promega, Madison, USA
). Mirna matkivat, Mirna estäjän tai siRNA transfektoitiin päivittäin 0, 5 ja 10 päivää. Kokeissa yhdistetään miR-146a matkivat ja muita aineita (EGFR TKI ja mAb), MIR-146a matkivat alun perin transfektoidaan soluihin, ja sen jälkeen soluja viljeltiin 7 päivää. Toinen aineet lisättiin sen 7
päivänä, ja soluviljelyn piteni vielä 3 vuorokautta. Protokolla oli edellä kuvatulla [25].
Solun elinkelpoisuus
edelleen varmistamiseksi tietoja MTS-määritys, solun elinkelpoisuus havaittiin fluoresenssidetektoria of resorufiini (
CellTiter-Blue solunelinkykyisyysmääritys, G8080, Promega, Madison, USA
) kuten aiemmin on kuvattu [25].
kaspaasi-3/7 activity detection
kaspaasi-3/7 aktiivisuus mitattiin käyttäen synteettinen rodamiini leimatun kaspaasi-3/7 alustan suoritetaan välittömästi havaitsemisen jälkeen solujen elinkelpoisuuden samalla kuoppiin kuten aiemmin on kuvattu [25].
fluoresenssimikroskopialla arviointi solujen apoptoosin ja morfologia
vaikutukset miR-146a matkivat tai estäjän tai EGFR siRNA apoptoosiin ja ydinvoiman morfologia soluissa arvioitiin Hoechst 33342 ja propidiumjodidilla (PI) kaksinkertainen loisteputki chromatin värjäystä kuten aiemmin on kuvattu [25].
Wound- parantava määritys
Solut ympättiin yksittäisiin kuoppiin 6-kuoppaiselle viljelylevylle. Transfektio suoritettiin kuten edellä. Ennen transfektion steriili 10 ui pipetinkärjen käytettiin pituussuunnassa raapia jatkuvasti halkaisijaltaan raita yksisolukerroksena. Keskipitkällä ja solujäte imettiin pois ja korvattiin 2 ml: lla tuoretta elatusainetta. Valokuvat otettiin 0, 36, 72 ja 108 tunnin jälkeen haavoittaen. Tilastoanalyysiin kymmenen satunnaisesti valittua kenttiä pitkin jokaisen haavan merkittiin, ja haavan alueelle mitattiin ja keskiarvo laskettiin, kun haava-alueella tämän haava. Arpeutumisprosessit alue = haavan alueen 0 h-haava-alueella 36, 72 tai 108 tuntia, vastaavasti, haavan paranemista alue ensin verrattiin haavan alueelle 0 tuntia, ja lopulta verrattuna mock valvontaa.
Western blot-analyysi
Kun hoidetaan osoitetut ajanjaksot, solut pestiin PBS: lla ja lyysattiin puskurissa, joka sisälsi Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCl 150 mM (pH 6,85), EDTA 1 mM (pH 8), TRITON-X 1%, Na-pyrofosfaatti 2,5 mM, natriumortovanadaattia (Na3VO4) 1 mM, leupeptiini 1 ug /ml, proteaasi-inhibiittori cocktailit 1% ja fosfataasinestäjällä cocktailit 1% (
Sigma -Aldrich NV /SA, Bornem, Belgia
). Lysaatteja sentrifugoitiin 12000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja keitettiin 5 min. Proteiinipitoisuus lysaatin havaittiin Bio-Rad Bradford-proteiinin määrityksen (
Nazareth Eke, Belgia
) ja 25 ug denaturoitua proteiinia tehtiin SDS-PAGE (10% SDS-akryyliamidigeelille), jossa on latauspuskuria, joka sisälsi 80 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% SDS, 10% glyseroli, 5 mM EDTA (pH 8), 5% 2-merkaptoetanolia, 0,2% Bromophenolblue ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kalvo inkuboitiin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet kuten: EGFR (
Cell Signaling
), fosfo-EGFR (Tyr1173, klooni 9H2,
Upstate
), fosfori-ERK1 /2 (pTpY185 /187,
Invitrogen
), fosfori-AKT /PKB (Ser473,
Invitrogen
), fosfori-STAT3 (Tyr705, 3E2,
Cell Signaling
), fosfori-Stat5: n ( Tyr694,
BD Biosciences
), fosfori-IκBα (Ser32 /36, 5A5,
Cell Signaling
), IκBα (L35A5,
Cell Signaling
), fosfori-NF KB p65 (Ser536,
Cell Signaling
), NF-KB (
Cell Signaling
), fosfori-IRAK-1 (Ser376,
Santa Cruz Biotechnology
), IRAK- 1 (
Santa Cruz Biotechnology
) ja β-aktiini (
Sigma-Aldrich NV
.).
tilastollinen
SPSS19.0 käytettiin Tilastollinen analyysi. Tulokset olivat edustavat kolmen erillisen kokeen, ellei toisin mainita. Arvot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD). Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) testiä käytettiin analysoitaessa merkitystä ryhmien välillä. Pienin merkitsevä ero (LSD) menetelmää useiden vertailujen vanhempien ja kontrolliryhmässä käytettiin, kun todennäköisyys ANOVA oli tilastollisesti merkitsevä. Survival analyysi suoritettiin käyttäen log-rank-testi ja Kaplan-Meier tontteja lähestymistapaa. Tilastollinen merkittävyys määritettiin
P
0,05 tasolla. Analysoinnissa additiivisuuteen ja synergian, teoreettinen nolla-vuorovaikutus (tarkalleen lisäaine) annos-vaste-käyrä jokaista miR-146a matkivat + lääkeyhdistelmä laskettiin soveltamalla Bliss Riippumattomuusedellytyksen [31], [32]. Tilastollinen arvio lisäaineen tai synergistisen vaikutuksen tehtiin vertaamalla kunkin miR-146a matkivat + huume annos-vastekäyrä kanssa Bliss itsenäisyyttä käyrä. Synergia on tehty, kun miR-146a matkivat + lääkeaineen annos-vaste-käyrä on suurempi kuin 95%: n luottamusvälit vastaaviin Bliss riippumattomuutta käyrä, kun taas additiivisuus on, kun miR-146a matkivat + lääkeaineen annos-vaste-käyrä on pienempi kuin Bliss riippumattomuus käyrä ja korkeampi kuin yksilöllisen kohtelun käyrä. Analyysi additiivisuuteen ja synergian myös arvioi Biosoft CalcuSyn- ohjelman (Ferguson, MO, USA). Yhdistymissopimus Index (CI) käytettiin ilmaisemaan synergiasta (CI 1) additiivinen vaikutus (CI = 1), tai antagonismia (CI 1) [33].
Tulokset
miR -146a estää solujen kasvua ja edistää solujen apoptoosin NSCLC soluissa
Ensimmäinen lähtöviivalle ilmaus miR-146a arvioitiin kaikissa solulinjoissa tutkittu reaaliaikaisen RT-qPCR määrityksessä. Transfektio tehokkuutta miR-146a matkivat ja estäjä myös ensin varmistettiin RT-qPCR määrityksessä. MIR-146a ekspressiotason 5 ja 10 päivää transfektion jälkeen analysoitiin. Transfektion jälkeen MIR-146a estäjä, ΔΔCq oli 1,82 (71,68% miR-146a knock-down) ja H358, 1,09 (53.02% knock-down) ja H1650, 2,4 (81,05% knock-down) ja H1975, 1,92 (73,57 % miR-146a knock-down) varten HCC827, ja 1,89 (73,02% knock-down) ja H292 10 päivää transfektion jälkeen. Sen jälkeen transfektoimalla miR-146a matkivat 10 päivää, miR-146a tasot olivat vakavasti kasvanut, jossa ΔΔCq -14,69 (26431,0372 taittuu) ja H358, -10,97 (2005,8528 taittuu) ja H1650, -12,78 (7032,3681 taittuu) ja H1975, -13,25 (9741.9847 taittuu) ja HCC827 ja -13,81 (14362,3081 taittuu) ja H292. Negatiiviset kontrollit ei ollut muutosta tason miR-146a (tuloksia ei ole esitetty). Kun miR-146a estäjä, proliferaatiota hieman parannettu kaikissa testatuissa solulinjoissa, mutta ilman merkittävää eroa verrattuna mock valvontaa. Transfektion jälkeen MIR-146a matkivat, vähennetään merkittävästi proliferaatiota merkitään 10
päivänä kaikissa viidessä solulinjoissa, vaikkakin vähemmän kuin mitä havaitaan siRNA kohdistaminen EGFR (kuva 1, kuva 2). Näiden tulosten vahvistamiseksi, vaikutus elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen Fluorimetristä resorufiini elinkyvyn (CellTiter Blue, Promega, tuloksia ei ole esitetty), ja mikroskooppisen laskenta elinkelpoisten (Hoechst 33342 positiivinen /PI-negatiivinen) soluissa (kuvio 3, kuvio 4) . Molemmissa määrityksissä tulokset olivat pitkälti samoja kuin MTS tetratsolium määrityksen tulokset. Tarkistaa, onko miR-146a pystyy aiheuttamaan apoptoosin, CellTiter Blue määritys multipleksoidaan fluoresoiva kaspaasi 3/7 määritys (Apo One, Promega). Tulokset osoittavat, että miR-146a-inhibiittori ei lisätä kaspaasi-3/7 aktiivisuutta. Kuitenkin miR-146a matkivat merkittävästi parannettu kaspaasi-3/7 aktiivisuutta kaikissa viidessä NSCLC testatuissa solulinjoissa, mutta vaikutus oli paljon vähemmän kuin mitä on nähty siRNA kohdistaminen EGFR (kuvio 5, kuvio 6). Vaikutus apoptoosiin varmistettiin mikroskooppisesti Hoechst 33342 ja PI kaksinkertainen fluoresenssivärjäys (kuvio 3, kuvio 7).
NSCLC-solut (H358, H1650 ja H1975) inkuboitiin, kun läsnä oli miR-146a estäjä, matkivat EGFR siRNA ja erilaisia tarkastuksia, 0, 5 ja 10 päivää. Solukasvu mitattiin käyttämällä kolorimetristä tetratsolium (MTS) määrityksellä (CellTiter96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay). Negatiivinen kontrolli 1 on miRNA estäjä negatiivinen kontrolli ja negatiivisen kontrollin 2 on miRNA matkivat negatiivinen kontrolli. *
P
0,05, verrattuna sokeakoe samanaikaisesti pisteen.
NSCLC-solut käsiteltiin kuten edellä kuvassa 1. *
P
0,05, **
P
0,01 verrattuna sokeakoe samanaikaisesti pisteen.
NSCLC-solut käsiteltiin kuten edellä Kuva 1, ja kaspaasi-3/7-aktiivisuus tutkittiin ja verrattiin mock valvontaa. *
P
0,05, **
P
0,01 verrattuna sokeakoe samanaikaisesti pisteen.
NSCLC-solut (HCC827 ja H292) käsiteltiin kuten edellä on mainittu. *
P
0,05, **
P
0,01 verrattuna sokeakoe samanaikaisesti pisteen.
The effect of miR-146a päälle apoptoosin H358, H1650 ja H1975 tutkittiin Hoechst 33342 ja PI kaksinkertainen fluoresenssivärjäys. *
P
0,05, **
P
0,01 verrattuna sokeakoe samanaikaisesti pisteen.
miR-146a estää motiliteettia NSCLC-solut
Seuraavaksi arvioimme vaikutus miR-146a toiminnon motiliteettia kolmen NSCLC solulinjojen H358, H1650 ja H1975. Vuonna mock valvontaa, transfektoimattomia H358 solut tarvitsevat pisimpään parantua ( 108 tuntia). Päinvastoin, H1975-solujen parantunut nopeimmin ( 72 h). MIR-146a estäjä aiheutti merkitty nopeutettu haavan paranemista korko H358-soluissa, ja oli vähän vaikutusta H1650 ja H1975 soluja. MIR-146a matkivat johti kohtalaisen vähentää haavan paranemista korko H358 ja H1650-soluissa. Kuitenkin miR-146a matkivat ei ollut vaikutusta solujen potevilla H1975 soluissa. SiRNA kohdistaminen EGFR inhiboivat haavan paranemista nopeudella kaikissa testatuissa solu- linjoissa, joilla on paljon voimakkaampi vaikutus kuin miR-146a matkivat (kuvio 8, kuvio 9).
NSCLC-soluja inkuboitiin, kun läsnä oli miR-146a estäjä, miR-146a matkivat, EGFR siRNA ja erilaisia tarkastuksia varten 0, 36, 72 ja 108 tuntia transfektion. Motiliteettia havaittiin käyttämällä haavan paranemista määrityksessä. Kuvat yhdeltä alan hyvin edustavan kymmenen näkökenttävaatimusten yhdessä hyvin näkyvät (x 100). M: mock valvonta; C: negatiivinen vertailu miRNA matkivat; Inhi: miR-146a-estäjä; Mimi: miR-146a matkivat; Si: EGFR-spesifisiä siRNA. Arpeutumisprosessit määrä on ilmaistu suhteessa mock valvontaa.
NSCLC-soluja käsiteltiin kuten kokeissa esitetty kuvassa 8. arpeutumisprosessit määrä on ilmaistu suhteessa mock valvontaa. Keskimääräinen suhde laskettiin kymmenestä alojen ja kokeet toistettiin kolme itsenäistä kuoppiin. *
P
0,05, **
P
0,01 verrattuna sokeakoe samanaikaisesti pisteen.
miR-146a aiheuttaa EGFR ja NF-KB signalointia NSCLC soluissa
roolin tutkimiseksi miR-146a säätelyssä solusignalointi, transfektoimme NSCLC soluja miR-146a estäjä ja matkivat ja viljeltiin soluja ajaksi ylös ja 10 päivää. Olemme havainneet, että lisääntyneen ekspression miR-146a on NSCLC soluissa johti alas-säätely EGFR sekä mRNA (tuloksia ei ole esitetty), ja proteiinin tasot (kuvio 10). Tärkeää on, olemme huomanneet, että fosforyloitu EGFR myös vaimentua jälkeen miR-146a matkivat transfektion samanlainen EGFR-spesifisiä siRNA eri solulinjoissa (kuvio 10). Samalla, alavirran signalointia (AKT, ERK ja stat väyliä) oli myös alas-säädellä miR-146a matkivat, jossa on heikompi vaikutus verrattuna EGFR-spesifisiä siRNA. Vahvista vaikutuksia miR-146a on EGFR, transfektoimme NSCLC-solujen kanssa miR-146a estäjä ja totesi, että esto miR-146a nostivat p-EGFR, EGFR ja alavirran signalointia (kuva 10). Nämä tulokset tukevat estäviä vaikutuksia miR-146a on EGFR autofosforylaation ja alavirran signalointia. Koska miR-146a on raportoitu myös säätelemään IRAK-1, joka voi aktivoida NF-KB: n signaloinnin [13], [34], [35], tutkimme vaikutuksia miR-146a on NF-KB: n signalointireiteissä NSCLC solulinjat. miR-146a matkivat vähentää fosforylaation NF-KB-inhibiittori IκBα, mutta ei koko IκBα. Lisäksi taso fosfo-NF-KB: n, kokonais-NF-KB: n ja kokonais-IRAK-1 oli myös vähentynyt, kun miR-146a matkivat transfektiota (kuvio 11, kuvio 12), mikä osoittaa, että miR-146a säätelee NF-KB: n ja IRAK-1 signalointi.
NSCLC solulinjat transfektoitiin miR-146a estäjä, miR-146a matkivat, EGFR-spesifisiä siRNA ja erilaiset negatiiviset kontrollit ja western blot tutkittiin 10 päivää transfektion jälkeen. Vasta-aineita mukana fosfo-EGFR (p-EGFR), EGFR, p-ERK1 /2, s-AKT, p-STAT3, p-Stat5: n ja β-Actin. M: mock valvonta; C1: negatiivinen vertailu miRNA estäjä; C2: negatiivinen vertailu miRNA matkivat; Inhi: miR-146a-estäjä; Mimi: miR-146a matkivat; Si: EGFR-spesifisiä siRNA.
NSCLC solulinjoja käsiteltiin kuten kuviossa 4. Vasta-aineita sisältyy fosfo-IκBα (p-IκBα), IκBα, p-NF-KB, NF-KB: n ja β aktiini. M: mock valvonta; C1: negatiivinen vertailu miRNA estäjä; C2: negatiivinen vertailu miRNA matkivat; Inhi: miR-146a-estäjä; Mimi: miR-146a matkivat; Si: EGFR-spesifisiä siRNA.
NSCLC solulinjoja käsiteltiin kuten kuviossa 4. Vasta mukana fosfo-IRAK-1 (S
376), IRAK-1 ja β-Actin. C1: negatiivinen vertailu miRNA estäjä; C2: negatiivinen vertailu miRNA matkivat; Inhi: miR-146a-estäjä; Mimi: miR-146a matkivat; Si: EGFR-spesifisiä siRNA.
miR-146a matkivat tehostaa solun lisääntymistä estävä vaikutus TKI ja setuksimabi
Aiemmissa työssä olemme tutkineet vaikutuksia kampaus EGFR siRNA EGFR TKI tai setuksimabi. Kaikista aineet testataan, afatinib, erbB perhe estäjä, oli voimakkainta kasvua estävä vaikutus [25]. Olemme pyrkineet selvittämään, miten tämä voisi verrata vaikutus yhdistämällä miR-146a matkivat ja TKI (gefitinibi, erlotinibi, afatinib) tai setuksimabi käyttäen kolorimetristä MTS formatsaanisakka runsaudenmäärityksessä. Inhibitio soluproliferaatiota oli paljon suurempi, kun miR-146a matkivat yhdistettiin afatinib, verrattuna yhden lääkkeen tai yhden miR-146a matkivat kaikilla testatuilla solulinjoissa, erityisesti pienellä, sub-molaarinen pitoisuudet afatinib. Kuitenkin, ei koko solun kasvukäyrän leviämisen oli suurempi kuin Bliss riippumattomuus käyrä, joka osoitti, että yhdistelmä vaikutus oli additiivinen (kuvio 13). Yhdistelmä vaikutukset miR-146a matkivat muiden TKI tai setuksimabi olivat samanlaisia, mutta heikompi kuin afatinib (tuloksia ei ole esitetty). Näin miR-146a matkivat tehostaa solun lisääntymistä estävä vaikutus TKI ja setuksimabi. Voit tarkistaa additiivinen tai synergistinen luonne yhdistää TKI /setuksimabin kanssa miR-146a matkivat, CI laskettiin [31], [32]. Tämä yksiselitteisesti osoittaa, että vaikutus on additiivinen (tuloksia ei ole esitetty).
MTS suoritettiin kuten edellä, ja proliferaation inhibitio laskettiin. *
P
0,05 verrattuna agentti yksin. Bliss Riippumattomuusedellytyksen suoritettiin laskea teoreettinen additiivinen vaikutus. – – – – -, Autuus riippumattomuus käyrä, joka osoittaa teoreettisen tilanteen, jossa yhdistetty vaikutus miR-146a matkivat ja muita aine on täsmälleen lisäaine. •, lääkkeet + miR-146a matkivat. ▾drugs + Negatiivinen kontrolli matkivat. ▪ lääkkeet yksin. ◊miR-146a matkivat yksinään (60 nM). Data pistettä edustavat keskiarvoja kolmesta kaivosta, ja virhepalkkeja ovat SD
Alkuperäinen tutkia kliinistä merkitystä miR-146a ilmentymisen NSCLC tapauksissa
vieressä tutki miR-146a ilmentyminen FFPE koepalat 101 tapauksessa NSCLC. Koepaloja otettiin ennen systeemistä hoitoa. Sarjassa, 76 tapauksessa oli saatavilla vastaavien viereisten normaali keuhkojen kudoksiin. Suhteellinen miR-146a ilmentyminen oli kaiken kaikkiaan huomattavasti pienemmät NSCLC kudoksissa kuin normaalissa keuhkojen kudoksia (5,20 vs 14,01,
P
0,001) (kuvio 14). Sarjassa 76 potilaalla on pariksi näyte, oli myös huomattavasti pienempi miR-146a ilmentyminen syövän kudoksissa verrattuna normaaliin keuhkojen (5,91 vs 14,01,
P
= 0,005, Kuvio 14). miR-146a-tasot olivat merkittävästi korkeammat (
P
= 0,001) tapauksissa kliinisen TNM vaiheissa I ja II verrattuna vaiheiden III ja IV (taulukko 1, kuvio 15A). Lisäksi miR-146a ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi (
P
= 0,001) tapauksessa ilman, etäpesäkkeiden kuin ne, joilla on etäpesäkkeitä (taulukko 1, kuvio 15B). Lisäksi 32 potilasta, joilla on korkeampi miR-146a lauseke (korkeampi kuin keskimääräinen taso) oli pitempi aika ilman taudin etenemistä kuin potilailla, joilla on alhainen ilme. Kaiken elinaika potilailla, joilla on korkea miR-146a ilmentyminen oli pidempi kuin potilailla, joilla on matala ilme (25,6 viikkoa miR-146a korkealla potilaista ja 4,8 viikkoa in miR-146a alhainen potilailla,
P
= 0,038, Kuva 15C). MIR-146a ilmentymistä eivät liity muita kliinis parametreja, kuten sukupuoli, ikä, EGFR-proteiinin ilmentyminen, EGFR geenimonistuksen tai EGFR-mutaatio tila (taulukko 1).
miR-146a tasot (normalisoitu RNU6B) käsiksi RT-qPCR 101 tapauksissa NSCLC syövän kudosten ja 76 tapausta ei-syöpä keuhkokudokset (paneeli A). miR-146a ilmentymistä verrattiin pariksi 7 tapauksessa. *
P
0,05.
miR-146a tasot käsiksi RT-qPCR vaiheittain I ja II vs vaiheiden III ja IV (paneeli A), jossa ei ole kaukainen etäpesäke ja metastasiaa (paneeli B). Kaplan-Meier eloonjäämiseen käyrät mukaan miR-146a tason paneelin C.
Keskustelu
Nykyisessä työssä olemme tutkineet rooli miR-146a ihmisen NSCLCs. Ensin itsenäisesti tunnistettu miRNA-146a vahvin korreloi miRNA EGFR aktivoinnin tilan ja farmakologinen EGFR esto on näyttö, joka osallistuu joukko 425 miRNA sarjassa NSCLC solulinjojen ja BA /F3 transfektanttien erilaisilla EGFR genomista tila (julkaisematon data Tiedostossa). Tämä sai nykyisen tutkimuksen varmistaakseen näiden havaintojen ja edelleen tutkia roolia tämän miRNA NSCLC. Toiminnallisesti miR-146a tukahdutetaan solujen kasvua, esti solujen vaeltamiseen, indusoi apoptoosia ja esti EGFR alavirran signalointia NSCLC solulinjoissa. Lisäksi miR-146a tehosti soluproliferaation inhibointi huumeiden aiheuttamia kohdentamalla EGFR, mukaan lukien TKI (gefitinibi, erlotinibi ja afatinib) ja monoklonaalinen vasta-aine (setuksimabi). Olemme myös todettu kliinisissä FFPE näytteiden alhainen ilmentyminen miR-146a korreloi kehittynyt kliininen TNM vaiheissa ja kaukana etäpesäkkeitä in NSCLC.