Krooninen sairaus

tiivistelmä

ekspressiotasot ja sääntelyn roolit miR-497 haimasyövän ovat epäselviä. Kliininen arvo plasman insuliinin kaltaisen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF-1 R) haiman syövät ei ole tutkittu. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että miR-497 oli merkittävästi vaimentua haimasyövän kudoksissa. Ylössäätely miR-497 BxPC-3 ja AsPC-1 haimasyövän solulinjoissa esti lisääntymistä, parannettu apoptoosin uudelleen herkistyneet solut gemsitabiiniannokseen ja tukahdutti IGF-1 R ja p-AKT ilmaisun suoraan downregulation IGF-1 R-proteiinin ilmentymisen. Vastapäätä vaikutuksia havaittiin jälkeen downregulation miR-497. Plasma IGF-1 R määrinä potilailla, joilla haimasyöpä kasvoi merkittävästi, verrattuna potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus, muut haimatuumorien ja haiman neuroendokriinisten kasvaimet (

P = 0,006

,

P = 0,018

ja

P = 0,004

, vastaavasti), ja näytetään mahdollisten arvojen erottamiseksi haiman vaurioita. Kuitenkin tasot haimasyövän potilaat olivat verrattavissa terveillä vapaaehtoisilla (

P = 0,095

). Kasvain sijainnit ja TNM liittyivät plasman IGF-1 R tasolla (

P = 0,013

ja

P = 0,01

, vastaavasti). Ei ollut merkittävää eroa kokonaiselinaika korkean ja matalan IGF-1 R ilme ryhmiä. Lopuksi olemme osoittaneet, että miR-497 heikennetty pahanlaatuisuuden haimasyövän soluja ja edistää solujen herkkyys gemsitabiinin suoraan downregulation IGF-1 R ilmentymisen. Plasma IGF-1 R näytetään mahdollisesti arvoa erottamiseksi haiman vaurioita ja se voisi olla uusi biomarkkereiden ohjaamiseksi TNM haimasyövän.

Citation: Xu JW, Wang TX, Sinä L, Zheng LF, Shu H, Zhang TP, et ai. (2014) Insuliini kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF-1 R) tavoitteeksi asetettiin MiR-497 ja Plasma IGF-1 R pitoisuuksina, joilla on TNM Stage haimasyövän. PLoS ONE 9 (3): e92847. doi: 10,1371 /journal.pone.0092847

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 elokuu 2013; Hyväksytty: 27 helmikuu 2014; Julkaistu 25 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 81272484, 81141027), Beijing Natural Science Foundation (nro 7132179), Peking Municipal Natural Science Foundation (7100003) ja tutkimuksen Special Fund for Public Welfare Industry of Health ( 201202007). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on aggressiivinen ja tuhoisa sairaus. PDAC on erittäin huono ennuste, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1]. Vaikka mekanismit haiman Karsinogeneesin uusi merkkiaineita varhaista havaitsemista ja uusien terapeuttisten strategioiden on laajasti tutkittu [2], [3], [4], yleinen selviytyminen ei ole parantunut viimeisten 80 vuotta [5] . Molekyylimekanismeihin etenemisen PDAC, mukaan lukien proliferaatio, apoptoosin, lääkeresistenssi, jäävät epäselviksi.

miRNA ovat lyhyitä ei-koodaavat RNA: t, jotka voivat estää käännös lähetti-RNA (mRNA) proteiiniin sitoutumalla 3′-alue (3′-UTR). MiRNA voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla sääntelyssä Karsinogeneesin metastaattisen kapasiteetti ja lääkeresistensseihin [6]. Downregulation miR-497 on havaittu rinnan, peräsuolen ja kohdunkaulan syöpiä [7], [8], [9]. Kuitenkaan ole raportti miR-497 ekspressiotasot haimasyövän hetkellä. Insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF-1 R) tunnistettiin tavoitteeksi miR-497. Downregulation miR-497 edistää pahanlaatuisuuden paksusuolisyövän ja kohdunkaulan syövän säätelemällä IGF-1 R [8], [9]. Kuitenkin sääntely roolit ja mekanismit miR-497 haimasyövän ovat vielä epäselviä.

IGF-1 R on tyrosiinikinaasin reseptoria, joka liittyy sääntelyn leviämisen, apoptoosin, erilaistumista ja pahanlaatuisiin syöpäsolujen [10]. Ylössäätely IGF-1 R ihmisen PDAC kudoksissa on raportoitu [11] ja kumppaniaan korkeammat kasvaimen ja huono selviytyminen [12]. Kuitenkin, plasman IGF-1 R tasot haimasyövän potilailla ei ole havaittu aiemmissa tutkimuksissa. Kliiniset arvot plasman IGF-1 R haimasyövän ei tunneta.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-497 oli merkittävästi vaimentua haimasyövän kudoksissa. Ylössäätely miR-497 esti leviämisen, parannettu apoptoosin ja edistettävä herkkyys gemsitabiinin kautta suoraan vähen- tämisessä IGF-1 R ilmentyminen PDAC syöpäsoluissa

in vitro

. Osoitimme myös, että plasman IGF-1 R haimasyövän potilaat olivat verrattavissa terveillä vapaaehtoisilla, mutta korkeampi kuin potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus, muut haimatuumorien ja haiman neuroendokrii- kasvaimia, ja näytetään arvot erottamiseksi haiman vaurioita. Kasvain sijainnit ja TNM liittyivät plasman IGF-1 R tasoja. Ei ollut merkittävää eroa kokonaiselinaika ajan korkean ja matalan IGF-1 R ilmaisua ryhmissä.

Methods

Ethics selvitys

Tutkimukset tehtiin mukaisesti etiikan hyväksynnän Institutional Review Boards Pekingin unionin Medical College Hospital. Kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa.

tunnistus ilmaus miR-497 in situ -hybridisaatio (ISH) B

10 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut haimasyövän yksilöitä ja Hyväksytty kasvain- viereisten kudosten saatiin ja tehtäisiin kudossiruina. Ilmaisu tasot miR-497 kudoksissa todettiin käyttäen miRCURY LNA detektiokoetinta Mir-497 (Exiqon, Vedbaek, Tanska, tuotenumero: 38256-15). ISH suoritettiin seuraavan kuvauksen. Lyhyesti, objektilaseja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, poistettiin parafiini ksyleenillä, ja nestemäiseksi arvostellaan alkoholin pesee. Sitten levyt pantiin 4% paraformaldehydillä 20 min ajan vetokaapissa, ja pestiin sitten fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kolme kertaa. Levyjä käsiteltiin sitten 15 ug /ml proteinaasi K: ta 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen pestiin levyt PBS: llä ja kiinnitettiin ne 4% paraformaldehydillä 15 min jälkeen. Huuhtelun jälkeen objektilasit ennalta hybridisoitiin hybridisaatio- puskurissa 1 tunti huoneenlämpötilassa 50 ° C: ssa ja sen jälkeen hybridisoitiin yön yli 4 ° C: ssa hybridisaatiopuskurissa, joka sisältää koettimen. Tiukat pesut suoritettiin 50 ° C: ssa 20 minuutin ajan, ja sitten levyt inkuboitiin blokkausliuosta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen laseja inkuboitiin blokkausliuoksessa alkalisella fosfataasilla konjugoitua anti-DIG-Fab-fragmentti yön yli 4 ° C: ssa. Kolorimetrisesti Reaktio suoritettiin käyttäen NBT /BCIP-kittiä (ThermoFisher Scientific) mukaan valmistajan protokollaa. ISH tulokset kirjattiin prosenttiosuus positiivisten solujen.

Soluviljely ja reagenssit

BxPC-3 ja AsPC-1 PDAC solulinjat ystävällisesti professori Helmut Freiss (Heidelbergin yliopisto, Saksa ), joka saatiin American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) [13], [14], [15]. PDAC soluja viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 5% CO 2 37 ° C: ssa RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön plasman (FBS, Hyclone). Primaaristen vasta-aineiden ostettiin Cell Signaling Technology, mukaan lukien IGF-I-reseptorin β (D23H3) XP Rabbit mAb (# 9750), β-aktiini (13E5) Rabbit mAb (# 4970), Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XPRabbit mAb (# 4060), Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb (# 4685), kaspaasi-3-vasta-aineen (# 9662) ja PARP Vasta (# 9542).

Mirna transfektion

miR-497 jäljittelee (5’CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3 ’, 5′-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′), jäljittelee ohjaus (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′), miR-497-estäjän (5’ ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-3 ’) ja inhibiittorin ohjaus (5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’) syntetisoitiin Genepharma (Shanghai, Kiina). MiRNA 50-100 nM transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan.

Cellular RNA ja kvantitatiivinen RT-PCR: llä (qRT-PCR) määritys

Solut transfektoitiin 6-kuoppalevyillä. 48 tunnin kuluttua transfektion, kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. IGF-1 R kvantitatiivinen määritys, kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttämällä käänteisen transkription kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green Master Mix (Takara, Japani). GAPDH olivat toimi endogeeninen kontrolli.

IGF-1 R Forward aluke: 5′-TCTGGCTTGATTGGTCTGGC-3 ’

Käänteinen aluke: 5′-AACCATTGGCTGTGCAGTCA-3′

GAPDH forward-aluke: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ’,

Käänteinen aluke: 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′

miR-497 kvantitatiivinen määritys, TaqMan miRNA määritystä käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan (Applied Biosystems). U6 käytettiin endogeenista ohjaus. Kertamuutoksia laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmällä.

leviämisen analyysi

In vitro

leviämisen analysoitiin käyttämällä solujen määrä kit (CCK-8). BxPC-3-soluissa ja AsPC-1-solut transfektoitiin 6-kuoppalevyillä (5 x 10

5cells /kuoppa). 24 tunnin jälkeen solut trypsinoitiin ja siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille (1000 solua /kuoppa). 10 ul /kuoppa CCK-8-reagenssia lisättiin 0, 24, 48, 72 tuntia, vastaavasti, ja inkuboitiin 2,5 tuntia 37 ° C: ssa. Optinen tiheys (OD) mitattiin 450 nm: ssä ja 630 nm mikrolevylukijalla (Wellscan MK3, Thermo /Labsystems, Suomi).

Kemosensitiivisyys analyysi

BxPC-3 ja AsPC-1-soluissa transfektoitiin 24 tuntia, maljattiin 96-kuoppaisille levyille (4000 solua /kuoppa), ja sitä käsiteltiin sarjalaimennetun gemsitabiinin (Eli Lilly and Company) kolmena kappaleena. 48 tunnin kuluttua inkubaation, 10 ul /kuoppa CCK-8-reagenssia lisättiin ja inkuboitiin 2,5 tuntia 37 ° C: ssa. Optinen tiheys (OD) mitattiin 450 nm: ssä ja 630 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa.

Western blotting

48 tunnin kuluttua transfektion 6-kuoppalevyillä, solut hajotettiin trypsiinillä liuoksella ja hajotettiin RIPA-puskurilla (Applygen, Beijing). Yhteensä proteiinit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Millipore, Billerica, MA). Kun oli salvattu 5% rasvatonta kuivamaitoa huoneenlämpötilassa 1 tunti, membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Sitten membraanit pestiin ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Applygen, Beijing) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin echochemiluminescence (ECL) havaitsemisjärjestelmä, ja ekspressiotasot näiden proteiinien arvioitiin käyttäen Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmisto (Media Cybernetics, USA).

Dual-lusiferaasireportteri määritys

pmiR-RB-raportti-IGF-1 R-3′-UTR vektorit, jotka sisältävät villin tyypin tai mutantit kohdesekvenssiä rakennettiin RiboBio Co., Ltd (Guangzhou, Kiina). BxPC-3-solut maljattiin 12-kuoppaisille levyille (1 x 10

5 solua /kuoppa) ja ko-transfektoitiin miR-497 matkii ja ilmentävät mutatoitua kohdesekvenssiä tai ko-transfektoitiin matkii ja vektorit ekspressoivat villityypin kohde- sekvenssi lipofektamiinia 2000. transfektion jälkeen 48 tunnin ajan, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) mukaan valmistajan protokollan.

Potilaat ja plasman IGF-1 R ilmentymisen

Plasma kerättiin 42 haimasyövän potilaille. Plasma näytteitä potilaista, joilla muiden haiman kasvaimia (29 potilaalla, joista vakavien cystadenoma (7 tapausta), mucinous cystadenoma (8 tapausta), kiinteä pseudopapillary kasvain (10 tapausta) ja sisäiset ductal papillaarisen mucinous kasvain (4 tapausta)), krooninen haimatulehdus ( CP, 19 potilasta), haiman neuroendokriinikasvain (PNET, 19 potilasta) ja terveillä vapaaehtoisilla (30 tapausta) kerättiin kontrolleina. Haimasyöpä, PNET ja muut haimatuumorien diagnosoitiin avulla patologinen tutkimus. CP oli diagnosoitu kliinisen diagnostiset kriteerit. Verinäytteet sentrifugoitiin 3000 kierrosta minuutissa (rpm) 10 minuutin ajan. Plasma otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa ennen käyttöä. Plasman IGF-1 R tasot todettiin käyttäen ihmisen IGF-1 R ELISA Kit (Kataloginumero: CSB-E13766h, CUSABIO, Kiina) jälkeen valmistajan protokollan.

Tilastollinen

SPSS v.13.0 ohjelmisto (SPSS, Inc., Chicago, IL) käytettiin tilastollisiin analyyseihin. Jatkuvat esitettiin keskiarvo ± keskihajonta (SD) ja verrattiin varianssianalyysillä (ANOVA), opiskelijan

t

testiä tai Mann-Whitney

U

testi. Kategorinen data esitettiin prosentteina ja verrattiin käyttämällä Pearsonin χ

2 testiä tai Fisherin tarkkaa testiä, kun solumäärä oli alle 5. Kaplan-Meier menetelmää käytettiin selviytymisen analysoinnin log-rank-testi. Tilastollinen merkittävyys määritettiin

P 0.05

.

Tulokset

MiR-497 säädeltiin vähentävästi haimasyövän kudoksissa

MiR-497 tasot 10 haimasyövän yksilöitä ja sovitetun kasvaimeen viereisten kudosten havaittiin käyttäen ISH. Keskimääräinen prosenttiosuus positiivisten solujen haimasyövän kudoksissa oli 30,0% ± 35,4%, mikä oli merkittävästi pienempi kuin kasvaimia viereisten kudosten (93.5.0% ± 2,4%) (

P = 0,000

). ( Kuvio 1) B

MiR-497 tasot haiman kudoksissa havaittiin käyttämällä ISH (200 x). (A) Negatiivinen kontrolli. (B) ISH Mir-497 haimasyövän kudoksessa. (C) ISH Mir-497 kasvaimen viereiseen kudokseen. (D) keskimääräinen prosenttiosuus positiivisten solujen haimasyövän kudoksissa oli 30,0% ± 35,4%, mikä oli merkittävästi pienempi kuin kasvaimia viereisten kudosten (93.5.0% ± 2,4%). Tiedot on esitetty keskiarvona ± SD.

MiR-497 inhiboi proliferaatiota

48 tunnin kuluttua transfektion kanssa miR-497 jäljittelee tai inhibiittori, miR-497 tasot olivat merkittävästi voimistunut tai vaimentua (Kuva S1 A, B). Lisäksi miR-497 säätelyä esti merkittävästi proliferaatiota PDAC soluja (kuvio 2 A, B). Sen sijaan, miR-497 downregulation edisti proliferaatiota (kuvio 2 C, D).

Lisääntyminen analysoitiin CCK-8-määrityksessä. (A, B) Transfektio miR-497 matkii tukahdutetaan PDAC solujen lisääntymistä in AsPC-1 ja BxPC-3-soluissa, vastaavasti. (C, D) Transfektio miR-497 estäjä edistänyt PDAC solujen lisääntymistä. (*

P

0,05

).

MiR-497 edistettävä herkkyys gemsitabiinin

Kun gemsitabiinihoidon 48 tuntia, esto hinnat PDAC transfektoitujen solujen miR-497 jäljittelee olivat huomattavasti korkeampia kuin transfektoitujen solujen jäljittelee ohjaus (kuvio 3 A, B). Solut transfektoidaan miR-497 estäjä olivat vastustuskykyisempiä gemsitabiinihoidon kuin transfektoitujen solujen estäjä ohjaus. (Kuvio 3 A, C).

(A) AsPC-1-solut transfektoitiin 24 tunnin ajan, ja sitten sitä käsiteltiin 100 nM gemsitabiinin 48 tuntia. Ylössäätely miR-497 transfektoimalla jäljittelee uudelleen herkistyneet solut gemsitabiinia. Downregulation miR-497 transfektoimalla estäjä vähensi solujen herkkyys gemsitabiinia. (B) BxPC-3-solut transfektoitiin 24 tunnin ajan, ja käsiteltiin sarjalaimennetun gemsitabiinin (1 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM). Solut transfektoidaan miR-497 matkii olivat herkempiä gemsitabiinia. (C) transfektoituja soluja miR-497-estäjän olivat resistenttejä gemsitabiinia. (*

P

0,05

).

MiR-497 lisääntynyt ilmentyminen pilkotun kaspaasi-3 ja PARP aktivoidaan gemsitabiini

kaspaasi-3 ja Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ovat välttämättömiä apoptoosin. Transfektoidut solut käsiteltiin gemsitabiinin kanssa 48 tuntia ja sitten tasot pilkottiin kaspaasi-3 ja PARP havaittiin Western blot. Olemme havainneet, että ylössäätely miR-497 nostivat katkaistun kaspaasi-3 ja halkaistut PARP (kuvio 4 A, B, kuvio S2). Kääntäen, downregulation miR-497 vähensi tasot pilkkoa kaspaasi-3 ja halkaistut PARP. (Kuvio 4 A, B, kuvio S2).

Solut transfektoitiin 6-kuoppalevyille. 24 tuntia transfektion jälkeen, AsPC-1 ja BxPC-3-soluja käsiteltiin 10 uM ja 10 nM gemsitabiini, vastaavasti. Kun on kulunut vielä 48 tuntia, solut kerättiin ja koko proteiini uutettiin. (A) lisääntymisen merkkejä miR-497 transfektoimalla jäljittelee in AsPC-1-solujen lisääntyneen ekspression pilkotun kaspaasi-3 ja PARP, kun taas esto miR-497 transfektoimalla estäjä vähentynyt ilmentyminen pilkotun kaspaasi-3 ja PARP, ilman mitään vaikutusta tasoista koko kaspaasi-3 ja PARP. (B) Sama tuloksia havaittiin BxPC-3-soluissa.

MiR-497 tukahdutetaan IGF-1 R-proteiinin ilmentymisen sitoutumalla 3′-UTR

mukaan ennustamiseen avoin pääsy tietokantoihin (TargetScan, miRBase Targets, PicTarget, microRNA.org), IGF-1 R pidettiin ehdolle kohteena miR-497. Vahvista tämä ennustus, suoritimme lusiferaasireport- määritys. Olemme löytäneet lusiferaasiaktiivisuus oli merkittävästi vähentynyt, kun kotransfektoimalla miR-497 matkii ja ilmentävät villityypin kohdesekvenssin BxPC-3-soluissa, verrattuna soluihin kotransfektoitiin matkii ja vektorit ilmentävät mutatoitua kohdesekvenssiä (

P

0,05

). (B) mRNA-tasot IGF-1 R havaittiin qRT-PCR: llä. GAPDH tarjoiltiin sisäisenä kontrollina. Transfektio jäljittelee in BxPC-3-solut eivät tukahduttaa ilmaus IGF-1 R-mRNA. (C) ekspressio IGF-1 R, p-AKT ja AKT havaittiin. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Ylössäätely miR-497 transfektoimalla jäljittelee in AsPC-1cells estivät merkittävästi IGF-1 R ja p-AKT, kun taas downregulation miR-497 transfektoimalla estäjä lisäsi IGF-1 R ja p-AKT, ilman vaikutus veren kokonaiskolesterolia AKT. (D) Sama tulokset näytetään BxPC-3-soluissa.

varmistamiseksi edelleen, western-blottaus suoritettiin. Olemme havainneet, että ylössäätely miR-497 esti ilmentymisen IGF-1 R-proteiinia ilman muutoksia ilmentymisen IGF-1 R-mRNA: n (kuvio 5 B, C, D, kuvio S3). Sen sijaan, downregulation miR-497 kasvoi IGF-1 R-proteiinin ilmentymistä (kuvio 5 C, D, kuvio S3). Lisäksi tutkimme taso p-AKT välittyvät IGF-1 R. Havaitsimme, että taso p-AKT väheni merkittävästi sen jälkeen, kun ylössäätely miR-497. Päinvastoin, inhibition miR-497 lisääntynyt taso p-AKT (

P 0,05

) (kuvio 5 C, D, kuvio S3).

plasman IGF-1 R tasot potilailla, joilla on haimasyöpä

Plasma IGF-1 R tasot havaittiin ELISA: lla. Plasman IGF-1 R: potilailla, joilla on haimasyöpä, krooninen haimatulehdus, muiden haiman kasvaimet, PNET ja terveillä vapaaehtoisilla oli 0,823 ± 0,57 ng /ml, 0,472 ± 0,42 ng /ml, 0,562 ± 0,3 ng /ml, 0,460 ± 0,21 ng /ml, 1,004 ± 0,50 ng /ml, vastaavasti. Tasot potilailla, joilla haimasyöpä kasvoi merkittävästi, verrattuna potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus, muut haiman kasvaimet ja PNET (

P = 0,006

,

P = 0,018

, ja

P = 0,004

, vastaavasti.). Ei ollut merkittävää eroa plasman IGF-1 R: n välillä potilaiden haimasyöpä ja terveillä vapaaehtoisilla (

P = 0,095

). (Kuvio 6).

Plasma IGF-1 R tasot havaittiin ELISA: lla. Plasman IGF-1 R haimasyövän potilaat olivat verrattavissa terveillä vapaaehtoisilla, mutta korkeampi kuin potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus, muut haimatuumorien ja PNET. Muita haimatuumorien mukana vakavien cystadenoma, mucinous cystadenoma, kiinteät pseudopapillary kasvain ja sisäisen ductal papillaarinen mucinous kasvain. PNET, haiman neuroendokriininen kasvaimia.

diagnostinen arvo plasman IGF-1 R

diagnostinen arvo plasman IGF-1 R arvioitiin käyttäen ROC-käyrä. Osoitimme, että plasman IGF-1 R näkyy arvo erottamiseksi haimasyövän kroonisesta haimatulehdus ja PNET (AUC = 0,713, 95% CI: 0,564-0,862,

P = 0,008

; AUC = 0,711, 95% CI: 0,581-+0,840,

P = 0,009

, vastaavasti). Kun raja-arvo määritellään 0,257 ng /ml, herkkyys ja spesifisyys erottaa haimasyövän välillä krooninen haimatulehdus olivat 95,2% ja 47,3%. Kun raja-arvo määritellään 0,699 ng /ml, herkkyys ja spesifisyys erottaa haimasyövän välillä PNET olivat 47,6% ja 89,5%. Plasma IGF-1 R voidaan myös käyttää erottamaan haimasyövän muista haiman kasvaimet (AUC = 0,634, 95% CI: 0,504-0,763,

P = 0,057

). Kun raja-arvo määritellään 0,925 ng /ml, herkkyys ja spesifisyys erottamiselle haimasyövän haiman hyvänlaatuiset kasvaimet olivat 33,3% ja 89,7%.

korrelaatio plasman IGF-1 R tasoilla ja kliinis parametrit ja eloonjäämisen analyysi

Potilaat jaettiin korkea ja matala ilme ryhmiä käyttäen 75

persentiilin plasman IGF-1 R tasoja. Kasvain sijainnit ja TNM liittyivät plasman IGF-1 R tasolla (

P = 0,013

,

P = 0,01

vastaavasti. Taulukko 1). Keskimääräinen elinaika oli 18 kuukautta, ja 1-, 3- vuoden eloonjäämisluvut olivat 64% ja 23,1%, tässä järjestyksessä. Mediaani elossaoloaika korkean ja matalan ilmaisun ryhmät olivat 11 ja 18 kuukautta. Ei merkittävää eroa kokonaiselinaika ajan korkean ja matalan ilmaisua ryhmissä havaittiin (

P = 0,366

).

Keskustelu

Vähentynyt miR-497 ilmaisu on osoitettu rinta-, peräsuolen ja kohdunkaulan syöpiä [7], [8], [9]. Kuitenkaan ole raportti miR-497 ekspressiotasot haimasyövän kudoksissa. Ylössäätely miR-497 voi estää syöpäsolujen lisääntymistä, edistää apoptoosia, vähentää muuttoliikettä ja invaasiota valmiuksia ja lisätä kemosensitiivisyys [16], [17], [9]. Kuitenkin roolit ja mekanismit miR-497 haimasyövän ole tiedossa. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, miR-497 oli merkittävästi vaimentua haimasyövän kudoksissa. Ylössäätely miR-497 esti solujen lisääntymistä, parannettu apoptoosin ja edistettävä herkkyys gemsitabiinin suoraan vähen- tämisessä IGF-1 R-proteiinin ilmentymisen.

Tutkimuksemme tunnistettu rooli miR-497 säätelyssä maligniteetti haimasyövän. Tulokset tukivat että miR-497 esti syöpäsolujen lisääntymistä, edistänyt apoptoosin ja lisääntynyt kemosensitiivisyys ilmoituksen mukaan kirjallisuudessa [9], [16], [17].

Sitten tutkimme mekanismeista miR-497 säätelyssä etenemistä haimasyövän. Löysimme IGF-1 R oli välittömänä kohteena miR-497 by lusiferaasireport- määritys, joka myös raportoitu kolorektaalisyövissä ja kohdunkaulan syöpiä [8], [9]. Olemme myös suorittaa western blotting edelleen vahvistusta. Osoitimme, että ylössäätely miR-497 laski IGF-1 R-proteiinin tasot ilman muutoksia mRNA ilmaisun. Downregulation miR-497 kasvoi IGF-1 R-proteiinin tasoja. Lisäksi olemme tutkineet ilmentymisen IGF-1 R-välitteisten alavirtaan molekyyli. Löysimme taso p-AKT väheni merkittävästi sen jälkeen, kun ylössäätely miR-497. Esto miR-497 lisääntynyt ekspressio p-AKT. Siksi me arveltu, että miR-497 heikennetty pahanlaatuisuuden haimasyövän mukaan osittain tukahduttamalla IGF-1 R /AKT-reitin.

IGF-1 R /AKT-reitin on todettu ottamaan säätelyssä useiden biologisten prosessien syöpien [18], [19]. AKT voi aktivoida BAD fosforylaatio on Ser136 [20] tai aktivoi NF-KB: n välityksellä säätelevä IKB kinaasi (IKK) [21], mikä johtaa antiapoptoottisia vaikutuksia. AKT polku liittyy myös in chemoresistance. AKT2 esto kumotaan gemsitabiinia aiheuttaman aktivaation AKT2 ja NF-KB: n, ja lisää gemsitabiinin aiheuttama PUMA (p53-ilmen- tymisen lisääntymisen modulaattori apoptoosin) säätelyyn ylöspäin, jolloin Chemosensiti- haiman syövistä gemsitabiiniannokseen [22]. Yhdenmukainen Näiden tutkimusten meidän tiedot osoittivat, että IGF-1 R /AKT-reitin saattaa osittain selittää vaikutusten miR-497 haiman syöpäsoluja. Kuitenkin miR-497 voi myös vaimentaa pahanlaatuisen syöpien säätelemällä muiden tavoitteiden, kuten TARBP2, Dicer, BCL2, CCND1, CCNE1, CDC25A, CCND3, CDK4. [23], [24], [25].

Lisääntynyt IGF-1 R ilmentyminen on todettu monissa syövissä [26] ja näyttää prognostiset arvot [27]. Korkea ilmentyminen IGF-1 R ihmisen PDAC kudoksissa on myös raportoitu [11] ja kumppaniaan korkeammat kasvaimen ja huono selviytyminen [12]. Kuitenkin plasma IGF-1 R tasot haimasyövän potilailla ei ole havaittu. Tutkimuksemme osoitti, että plasman IGF-1 R määrinä potilailla, joilla haimasyöpä kasvoi merkittävästi, verrattuna potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus, muut haimatuumorien ja PNET. Mutta ei ollut merkittävää eroa plasman IGF-1 R: n välillä haimasyövän potilaiden ja terveiden vapaaehtoisten, jotka voidaan selvitetty osittain, että IGF-1 R on yleensä ilmentyy normaaleissa kudoksissa, kuten maksassa, kohdun limakalvossa ja hermosoluja [28]. Arvo plasman IGF-1 R on diagnoosi haimasyövän arvioitiin olevassa tutkimuksessa. Oli mahdollista arvoa erottamiseksi haimasyövän alkaen krooninen haimatulehdus, PNET ja muita haiman kasvaimia. Mutta diagnostisen herkkyyden tai spesifisyyden ei ollut täydellinen, suuri näyte löydöistä tarvittiin edelleen tunnistaa diagnostinen arvo plasman IGF-1 R.

TNM liittyi plasman IGF-1 R tasot tutkimuksessamme. Potilailla, joilla on pitkälle kasvaimia oli korkeat plasman IGF-1 R. Plasma IGF-1 R voi olla uusi biomarkkereiden ohjaamiseksi TNM haimasyövän. Yllättäen korkea ilmentyminen plasman IGF-1 R ei ollut haitallista ennustetekijä tässä tutkimuksessa.

Johtopäätös

MiR-497 oli merkittävästi vaimentua haimasyövän kudoksissa. Ylössäätely miR-497 tukahdutti pahanlaatuisuuden haimasyövän ja uudelleen herkistyneet PDAC solujen gemsitabiinin suoraan vähen- tämisessä IGF-1 R-proteiinin ilmentymisen. Plasma IGF-1 R tasot haimasyövän potilaille lisääntynyt, ja näytetään mahdollisten arvojen erottamiseksi haiman vaurioita. IGF-1 R voi olla myös uusi plasma biomarkkereiden ohjaamiseksi TNM haimasyövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

ekspressiotaso miR-497 transfektion jälkeen jäljittelee tai inhibiittori. MiR-497 ilmentymistä havaittiin qRT-PCR: llä. U6 tarjoiltiin sisäisenä kontrollina. (A) BxPC-3-solut transfektoitu miR-497 jäljittelee osoitti kasvua miR-497 ilme. (B) Soluja transfektoitiin miR-497-estäjän väheni miR-497 ilmentymistä. Tietoja on esitetty keskiarvona ± SD. (*

P 0,05

).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0092847.s001

(TIF) B Kuva S2.

Suhteellinen ekspressiotasot katkaistun kaspaasi-3 ja PARP. Tietoja on esitetty keskiarvona ± SD. (A) Suhteellinen ekspressiotasot proteiinien AsPC-1-soluissa. (B) suhteelliset ekspressiotasot proteiinien BxPC-3-soluja. (*

P 0,05

).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0092847.s002

(TIF) B Kuva S3.

suhteellinen ekspressio IGF-1 R: ja p-AKT. Suhteellinen ilmentymistasot on esitetty keskiarvona ± SD. (A) suhteellinen IGF-1 R: ja p-AKT in AsPC-1-soluissa. (B) suhteelliset tasot proteiinien BxPC-3-soluja. (*

P 0,05

).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0092847.s003

(TIF) B