Krooninen sairaus

tiivistelmä

proteolyyttisen aktiivisuuden furiinin käsittelystä vastaava täyspitkä Notch-1 (p300) on keskeisessä asemassa Notch signalointi. Amplitudi ja kesto Notch aktiivisuutta voidaan säädellä eri kohdissa reitin, mutta ei ole raportti koskien sääntelyn Notch-1-furiinin vuorovaikutus, vaikka sen merkitys. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että Notch-1-furiinin vuorovaikutus säätelee ei-reseptori-tyrosiinikinaasin c-Src. c-Src ja Notch-1 ovat fyysisesti liittyvien, ja tämä yhdistys on vastuussa Notch-1 käsittely ja aktivointi. Olemme myös havainneet, että kasvutekijä TGF-α, EGFR-ligandi, ja PDGF-BB, joka on PDGFR ligandi, indusoi Notch-1-furiinin vuorovaikutus välittyy c-Src. Tuloksemme tukevat kolme uutta ja provosoiva johtopäätökset: (1) välinen yhteys Notch-1 ja furiinin on hyvin säännelty prosessi; (2) Extracellular kasvutekijä signaalit säätelevät tämän vuorovaikutuksen, mikä välittyy c-Src; (3) on cross-talk välillä plasman kasvutekijän reseptorin, c-Src ja Notch polkuja. Kolokalisaation Notch-1 ja C-Src vahvistettiin ksenograftin kasvaimen kudosten ja kudoksissa haimasyövän potilaille. Meidän havainnot vaikuttavat mekanismin, jolla Notch ja kasvutekijän reseptori-c-Src signalointireitteihin säädellä syövän synnyn ja syöpäsolujen kasvua.

Citation: Ma YC, Shi C, Zhang YN, Wang LG, Liu H Jia HT, et ai. (2012) tyrosiinikinaasin c-Src suoraan välittää Growth Factor-Induced Notch-1 ja furiinin vuorovaikutus ja Notch-1 aktivointi haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (3): e33414. doi: 10,1371 /journal.pone.0033414

Editor: Laszlo Buday, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 03 marraskuu 2011; Hyväksytty: 08 helmikuu 2012; Julkaistu: 30 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusmäärärahat National Natural Science Foundation of China (30873033 on YXZ) ja Major State Basic Research Development Programs (2009CB521800 ja 2010CB529400 sen YXZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: FHS nyt toimii editori PLoS ONE. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haimasyöpä on pahin ennuste kaikkien tärkeimpien syöpien ja edelleen neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvän kuoleman Yhdysvalloissa ja muualla maailmassa [1]. Tämä voi johtua siitä, että ei ole tehokkaita menetelmiä varhaisen diagnoosin ovat tällä hetkellä saatavilla, sekä tehokkaiden hoitojen puute. On raportoitu, että Notch signalointi verkko on usein vapautettiin ihmisen maligniteettien kuten haimasyöpä, jopa-säädellyn ekspression Notch ja niiden ligandien [2]. Notch signalointi on osallisena solujen lisääntymisen ja apoptoosin, jotka vaikuttavat kehitystä ja toimintaa useiden elinten.

Notch

koodaavat proteiineja, jotka voidaan aktivoida vuorovaikutus perheen ligandien [3] . Notch-1 on läsnä solun pinnalla kuin heterodimeerinen molekyyli (p120 /P200), kun taas loidiprekursoriproteiinin (P300) ei todennäköisesti pääse solun pintaan ja pilkkoutuu p120 ja P200 trans-Golgi verkon (TGN) by furiinin (S1 pilkkominen) [4], [5]. Ligandin sitoutumisen indusoi peräkkäinen lohkaisu Notch-reseptorien, ensimmäinen lohkaisu solunulkoisen domeenin (ECD), jonka ADAM (a disintegriini- ja metalloproteaasi) proteinaasi TACE (S2 pilkkominen) ja sitten transmembraanidomeeni, jonka γ-sekretaasi-entsyymin kompleksi (S3 pilkkominen), vapauttaen solunsisäisen domeenin (NICD) [3], [6]. Tämä jälkimmäinen sitten siirtyy tumaan, jossa se on yhteydessä DNA-sitovan proteiinin CSL (CBF1 /RBPJ-κ) säädellä transkription useiden tiedoksiannon geenejä, mukaan lukien jäsenten HES /HEI perhe [7]. Äskettäin Järvi ym kerran osoittanut korrelaatiota menetys katkaisun furiinin ja menetys

in vivo

funktiona Notch-reseptorin, joka tukee käsitystä siitä, että S1 lohkaisu on

in vivo

mekanismi valvoa Notch-1 signalointi [8]. Siten proteolyyttinen aktiivisuus vastaa p300 käsittelystä on keskeisessä asemassa Notch-1 signalointi, sillä se määrää rakennetta reseptorin. Kuitenkin, ei ole selvää, onko pilkkominen Notch jonka furiinin on stokastinen, tai tiukasti säädellä prosessin.

seulottiin useita estäjät ja totesi, että Src-inhibiittorit inhiboivat Notch-1 ja furiinin sitovia. c-Src on Mr 60000 ei-reseptori-tyrosiinikinaasin tuote proto-onkogeenin c-Src, ja solujen homologi Rousin sarkoomaviruksen transformoiva proteiini, v-Src [10] (Ishizawar ja Parsons, 2004). Kertyvät todisteet syytöksiä Src koska tärkeä tekijä kasvaimen invaasio, ja etäpesäkkeiden [9]. c-Src on yli-ilmentynyt yli 70%: haimakarsinooma solulinjojen, ja Src-kinaasiaktiivisuuden on usein koholla [10]. Näin ollen, Src ja Notch-1 ovat tärkeitä proteiineja, jotka vaikuttavat haimasyöpä solujen kasvua, invaasio ja metastaasi. Nykyisessä tutkimuksessa olemme havainneet suoraan näiden proteiinien vuorovaikutus. Huomasimme myös, että vuorovaikutus Notch-1 ja furiinin ei ole stokastinen, vaan pikemminkin hyvin säännelty, koska c-Src sitoutuu Notch-1 ja stimuloi Notch-1 ja furiinin vuorovaikutusta. Huomasimme, että sitoutuminen EGFR ja PDGFR niiden ligandit myös edistänyt Notch-1-furiinin vuorovaikutusta, mikä osoittaa, että solunulkoinen kasvutekijä signaalit voidaan suoraan säädellä Notch-1 aktivaatio trans-Golgin laitteen.

Tulokset

1. Vaikutukset Src estäjien furiinin aiheuttama Notch-1 pilkkominen

tutkimiseksi joka kinaasia tai kinaasi- perhettä osallistuu säätelyyn furiinin aiheuttaman Notch-1 pilkkominen, useita estäjät testattiin. Lisääntyvän BxPC-3 ja LVI-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla PP2 tai SU6656 ja uutteet elektroforeettisesti ja siirrettiin havaitsemiseksi Notch-1. Src estäjä PP2 vähensi pilkkominen täyspitkä Notch-1 yli kaksinkertaiseksi. Esikäsittelyn jälkeen PP2 20 min, 120 kD: n pilkkoutumistuotteet Notch-1 väheni ja täyspitkä Notch-1 proteiinin lisääntyminen (kuvio 1A). Olemme myös kevyempi altistuminen samanlaisen Western blot alemmassa paneelissa kuvion 1A osoittaa lasku 120 kD hajoamistuotteessa selvemmin. PP2-inhiboivan vaikutuksen täyspitkä Notch-1 pilkkominen näytti olevan annoksesta riippuva (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Src: n estäjät PP2 ja SU6656 indusoi inhibition täyspitkän Notch-1 käsittely furiinin vuonna LVI haiman syöpäsoluja. HPAC-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Soluja käsiteltiin 10 uM PP2 tai SU6656 60 minuuttia. Western blotit suoritettiin anti-Notch-1-vasta-aine. Alempi paneeli, lasku Notch-1 /p120 osoitettiin kevyemmän altistuminen samanlainen Western blot. Notch-1 p300, FL täyspitkä Notch proteiinit; Notch-1: p120, pilkottiin Notch proteiineja. (B) EGFR-ligandi TGF-α indusoi täyspitkän Notch-1 pilkkominen, jota pienennetään c-Src-estäjällä PP2 sekä LVI ja BxPC3 haimasyövän soluja. Soluja seerumia starvated 48 tunnin ajan, käsiteltiin 10 uM PP2 60 min, ja sitten käsiteltiin 7 nM TGF-α 20 min. Western blotit suoritettiin anti-Notch-1, fosfo-c-Src, c-Src, ja β-aktiini-vasta-aineita. p-c-Src, fosfo-c-Src.

Vaikka on totta, että PP2 estää selektiivisesti Src kinaaseja, suurempina pitoisuuksina, PP2 tunnetaan myös n estäjä EGFR. Teimme annos-vaste-kokeita ja havaitsivat, että PP2 inhiboi c-Src, jonka IC50 on 4 uM LVI-soluissa (kuvio S1), mutta 10 uM PP2 ainoastaan ​​inhiboi EGFR-aktiivisuuden 45%, mikä osoittaa, PP2 estää EGFR aktiivisuuden IC50 on yli 10 uM soluviljelmässä (kuva S2). Kuten 10gM PP2 esti c-Src aktiivisuutta 77%, näyttää siltä PP2 estää Notch-1 pilkkominen pääasiassa c-Src, mutta ei läpi EGFR, vaikka emme voi sulkea pois MAHDOLLISUUDESTA että suora EGFR hieman osaltaan PP2 indusoimaan alas-säätely Notch-1 pilkkominen. SU6656, joka kuuluu eri rakenteellisen luokan Src-inhibiittorit oli samanlainen vaikutus Notch-1 hajotukselle PP2 (kuvio 1A).

Testasimme myös, onko kasvutekijän indusoimaa c-Src toiminta vaikuttaa Notch- 1 aktivointi. Lisääntyvän LVI ja BxPC-3-solut maljattiin standardin kasvualustaan ​​24 tuntia ja siirrettiin seerumittomaan DMEM: ssa 48 tuntia, jotta reseptorit tasapainottua solun pinnalla. Ne käsiteltiin sitten 60 minuutin PP2 ennen stimulaatiota 7 nmol /L TGF-α. 20 minuutin kuluttua, koko solun lysaatit valmistettiin, ja uutteet elektroforeesi ja siirrettiin havaita Notch-1, p-c-Src, ja β-aktiini. Kuvio 1B osoittaa selvästi aktivointi c- Src koealuerahastoon-α-käsitellyt solut. Solujen esikäsittely 10 uM PP2 60 minuuttia johti lähes täydelliseen estymiseen c-Src: n fosforylaatiota kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio 1 B). Vuonna LVI ja BxPC3 solut altistettiin TGF-α lohkaisu Notch-1 kasvoi noin 2 ja 3-kertaiseksi, ja nämä korotukset myös esti esikäsittelemällä PP2 (kuvio 1 B).

2. TGF-α kasvaa CSL sitoutumaan HES-1: n promoottori

Kun peräkkäiset pilkkomisen furiinin, TACE ja γ-sekretaasi, Notch-1 NICD vapautuu solukalvon ja kuljetetaan tumaan, jossa se yhdistää kanssa DNA-sitovan proteiinin CSL (CBF1 /RBPJ-κ) ja indusoi transkriptio useita efektori- geenejä, mukaan lukien HES-1. Sen testaamiseksi, TGF-α indusoi sitoutumisen CSL on Hes-1 promoottori suoritimme CHIP määrityksiä. Ennen TGF-α hoitoa, pieni määrä CSL havaittiin CSL sitoutumiskohdan HES-1, ja tämä lisätään asteittain seuraavat TGF-α hoito 30 ja 60 min (kuvio 2A). Paremmin määrällisesti muutoksia CSL sitoutumaan Hes-1 promoottori, suoritimme Q-PCR-määrityksissä sirulle näytteistä. CSL sitoutuminen HES-1 kasvoi jälleen 30 min ja 60 min jälkeen TGF-α hoitoa (kuvio 2B).

(A) CSL Chip määrityksessä. HPAC-solut kasvatettiin seerumittomassa väliaineessa 48 tunnin ajan, sitten sitä käsiteltiin 7 nM TGF-α 0, 30, 60 min. Kromatiinin näytteitä immunosaostettiin CSL-vasta-aineen, DNA uutettiin ja monistettiin käyttäen HES-1: n promoottori-alukkeita 35 syklin ajan PCR: llä. M, 100 emäsparin DNA-tikkaat. (B) Q-PCR-analyysi sirujen DNA-näytteiden osoittaa, että TGF-α aiheuttama yhdistys CSL-1 kanssa Hes-1 promoottori, jolloin noin 0,5, ja 2-kertainen kasvaa 30 min ja 60 min aika kohta vastaavasti. Standard poikkeamat voidaan osoittaa (n = 3).

Olemme aiemmin osoittaneet, että yli-ilmentyminen NICD lisää haimasyövän solujen lisääntymistä ja invaasiota [11]. Tässä tutkimuksessa olemme tehneet colonigenic määrityksessä ja havaittiin, että yli-ilmentyminen aktiivinen muoto Notch-1, Notch Ekstrasellulaarinen katkaisu (NEXT), lisäsi merkittävästi LVI solujen pesäkkeiden muodostumisen (kuva S3).

3. Effects of c- Src-inhibiittorit ja kasvutekijöiden Notch-1 ja furiinin vuorovaikutusta

Voit selvittää, c-Src vaikuttaa furiinin aktiivisuutta mittasimme vaikutuksia PP2 ja SU6656 on furiinin toimintaa BxPC3 ja LVI-soluihin käyttäen fluoresenssin määritystä. PP2 ja SU6656 vain vähennetään furiinin aktiivisuutta 30% (tuloksia ei esitetty), jota ei selitä 2-kertainen väheneminen Notch-1 pilkkominen. Siksi perusteltu, että c-Src-inhibiittorit saattavat vaikuttaa vuorovaikutusta Notch-1 ja furiinin. Käsittelimme solut 10pM PP2 tai SU6656 20 min ja sitten suoritetaan immunopresipitaatiomäärityksiä katsoa yhdistyksen välillä furiinin ja Notch-1. PP2 ja SU6656 todellakin merkitsevästi inhiboi furiinin-Notch-1: een sitoutuvien (kuvio 3A). Määrällinen densitometrian varten kuviossa 3A on esitetty kuvassa S4. Pitoisuutena 10 uM, PP2 ja SU6656 vähensi furiinin-Notch-1 -alueella 53% ja 43%, vastaavasti (kuva S4).

(A) Src-estäjällä PP2 tai SU6656 estää Notch-1 ja furiinin -alueella. HPAC-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ilman seerumia nälkään. Soluja käsiteltiin 10 uM PP2 tai SU6656 60 minuuttia. Normaali kaniinin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Densitometrian varten kuviossa 3A on esitetty kuvassa S4. (B) PDGF-BB indusoi furiinin ja Notch-1 vuorovaikutusta. Lisääntyvät HPAC-solut pidettiin seerumin starvated 48 tunnin ajan, käsiteltiin sitten 20 ng /ml PDGF-BB: 20 ​​min. Normaali kaniinin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. (C) SU6656 estää PDGF aiheuttaman furiinin-Notch-1 -alueella. Lisääntyvät HPAC-solut pidettiin seerumin starvated 48 tunnin ajan, käsiteltiin SU6656 60 min, ja sitten käsiteltiin 20 ng /ml PDGF: n 20 min. SS seerumistarvaatio; PDGF, PDGF-BB; FBS, soluja viljeltiin normaalissa väliaineessa, DMEM, jossa on 10% FBS: ää ilman seerumia nälkään; Notch-1 p120, halkaistut Notch proteiinit; Notch-1 p300, FL Notch proteiineja. (D) EGFR ligandi TGF-α indusoi Src aktivointi Golgin. RFP-B4GLT1-transfektoituja HPAC-solut pidettiin seerumin starvated 48 tuntia ja sitten käsiteltiin 7 nM TGF-α. Solut värjättiin anti-fosfo-Src (

vihreä

) vasta visualisoida kolokalisaation fosfo-Src (vihreä) ja RFP-asemassa olevilla TGN merkki B4GALT1.

Bar,

10 um.

Sen testaamiseksi, onko kasvutekijän indusoiman Src toiminta vaikuttaa Notch-1 aktivaatio ja Notch-1-furiinin vuorovaikutusta, BxPC-3 ja LVI-soluja seerumia 48 tuntia ja sen jälkeen inkuboitiin 20 ng /ml PDGF-BB: ssa 20 minuuttia. Tulokset kuviossa 3C paljastaa merkitty aktivointi c- Src PDGF-BB-käsitellyt solut. Näissä soluissa samanaikainen immunosaostus täyspitkän Notch-1 furiinin kasvoi yli 5-kertainen (kuvio 3B). Tärkein muoto Notch-1 liittyy furiinin oli täyspitkä (kuvio 3B), toisin kuin Notch-1, joka on vuorovaikutuksessa c-Src, joka oli pääasiassa p120 (kuvio 4A). Käsittely 7 nmol /L TGF-α oli samanlainen vaikutus kuin PDGF-BB: tä (tuloksia ei ole esitetty).

(A) c-Src associatesd jossa Notch-1: BxPC3 soluissa. Solulysaatit immunosaostettiin anti-c-Src-vasta-aineita, ja immunoblotteding (IB) suoritettiin anti-Notch-1 ja anti-c-Src-vasta-aineita. Normaali kanin IgG: itä käytettiin negatiivisina kontrolleina. (B) PP2 inhiboi TGF-α aiheuttama c-Src ja Notch-1 -alueella. Seerumin starvated LVI-soluja käsiteltiin 10 uM PP2 60 min, käsiteltiin sitten 7 nmol /L TGF-α 20 min. Normaali kanin IgG: itä käytettiin negatiivisina säätimet IP. -Soluja kasvatettiin normaaleissa (DMEM, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia) ilman seerumia nälkään käytettiin positiivisina kontrolleina. N, normaali välineellä. (C) SU6656 inhiboi TGF-α aiheuttama c-Src ja Notch-1 -alueella. Notch-1 /p300., FL Notch proteiinit; Notch-1 /p120, pilkottiin Notch proteiineja. (D) Association of c- Src kanssa Notch-1 on riippuvainen sen kinaasiaktiivisuutta. Villityypin, Y416F, ja Y527F fuusioitunut HA-tag transfektoitiin ohimenevästi HeLa-soluihin. Kokosolulysaateista valmistettiin sitten, immunosaostettiin anti-Notch-1-vasta-aineita, ja immunoblottedting (IB) suoritettiin anti-HA ja anti-Notch-1-vasta-aineita. Normaali kaniinin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina.

testataan vaikutuksia c-Src-inhibiittorit on PDGF-BB-indusoitu kasvu Notch-1 ja furiinin sitovia. Solujen esikäsittely 10 uM PP2 tai SU6656 60 minuuttia johti lähes täydelliseen estymiseen PDGF-BB-indusoitu kasvu Notch-1 ja furiinin sitoutumisen (kuvio 3C). Nämä havainnot osoittavat, että solunulkoinen kasvutekijä signaalit välittyvät c-Src indusoi Notch-1 ja furiinin sitova ja aktivoi Notch-1.

On hyvin hyväksyttyä, että täyspitkä Notch-1 ensimmäinen cleavaged jonka furiinin vuonna TGN. Kuten kasvutekijä TGF-α ja PDGF-BB indusoi Notch-1-furiinin vuorovaikutus, kysyimme kasvutekijä indusoi c-Src aktivaatio TGN. Transfektoimme LVI solujen RFP-asemassa olevilla B4GALT1 kuin TGN merkki. Osoitettiin, että B4GALT1 pääasiassa sijaitsee TGN, ja jossain määrin mediaaliset Golgi [12]. B4GALT1-transfektoidut HPAC-solut pidettiin seerumin starvated 48 tuntia ja 7 nM TGF-α lisättiin 30 min. Voit selvittää, CSRC aktivoituu TGN, tarkastelimme kolokalisaation fosfo-Src ja B4GALT1 avulla konfokaalimikroskopialla. Olemme osoittaneet, rinnakkais- ja RFP-asemassa olevilla B4GALT1 ja fosfo-c-Src immunoreactivty TGF-α-käsiteltyjä soluja, mutta ei verrokkisoluissa (kuva 3D). Tulokset osoittavat, että TGF-α voisi nopeasti indusoi c-Src aktivaation TGN.

4. c-Src suoraan assosioituu Notch-1

kysyttiin c-Src vaikuttaa Notch-1 aktivointi suoraan tai toimii epäsuorasti toisen efektoreja. BxPC3 solut hajotettiin, ja lysaattia immunosaostettiin anti-c-Src-vasta-aineita, ja Notch-1 detektoitiin Western-blottauksella. Jotkut Notch-1, sekä täyspitkät Notch-1 /p300 ja Notch-1 /p120, liittyi c-Src (kuvio 4A). Olemme myös immunosaostettiin Notch-1 ja todettu merkittäviä määriä c-Src, että Notch-1 immunosaostumissa (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että c-Src fyysisesti kumppaniaan Notch-1.

kysytään kasvutekijä stimuloi c-Src aktivointi saattaa lisätä yhdistyksen c-Src ja Notch-1. HPAC-solut ilman seerumia 48 tuntia ja sen jälkeen inkuboitiin 7 nmol /L TGF-α 30 minuuttia. Käsitellyissä soluissa TGF-α, samanaikainen immunosaostus sekä täyspitkän Notch-1 ja Notch-1 /p120 c-Src kasvoi noin 3-kertaiseksi, ja estyi esikäsittelyn PP2 (kuvio 4B) tai SU6656 (kuvio 4C ).

Sen osoittamiseksi, että src on olennaisen tärkeää yhdistys c-src kanssa Notch-1, me syntyy kinaasi kuolleita ja konstitutiivisesti aktiivinen src mutantteja. Kinaasiaktiivisuutta käytöstä muta- Y416 tyrosiinin sivuston fenyylialaniinin (c-Src-Y416F), kun taas konstitutiivisesti aktiivinen Src Y527F tuotettiin mutatoimalla estävää tyrosiini 527 fenyylialaniinin. Olemme yli-ilmentynyt näiden mutanttien HeLa-soluissa, ja arvioitiin kyky eri c-Src-konstrukteja yhdistää Notch-1. Notch-1 sitoutuu villityypin ja konstitutiiviset muodot c-Src, mutta sitoutuminen kinaasi kuollut mutantti vähentää enemmän kuin 3-kertainen (kuvio 4D). Nämä tulokset osoittavat, että kinaasiaktiivisuus c-Src tarvitaan tehokkaan sitoutumisen Notchiin-1.

5. Kolokalisaation c-Src kanssa Notch-1

in vivo

Voit selvittää c-Src ja Notch-1 kolokalisoituvat

in vivo

teimme immunovärjäykseen . Rinnakkaispaikantumisen Notch-1 ja C-Src immunoreaktiivisuus voitiin nähdä keltainen fluoresenssi, kun kuvia Cy3-värjätty anti-Notch-1 ja FITC-värjättiin anti-c-Src immuunivaikutukset yhdistettiin (kuvio 5A). Sitten testattiin kolokalisaation HA-tagged c-Src ja endogeenisen Notch-1. Villin tyypin HA-c-Src ekspressoitiin HeLa-soluissa. Konfokaalinen fluoresenssimikroskopia osoitti, co-localization c-Src-HA ja Notch-1 (kuvio 5B), ja ekspressio FLAG-merkitty NEXT HeLa-soluissa paljasti kolokalisaation NEXT-FLAG ja c-Src (kuvio 5C).

(A) solunsisäinen vuorovaikutus c-Src ja Notch1. c-Src ja Notch-1 visualisoitiin konfokaalimikroskoopin.

Bar,

10 pm. (B) Co-paikallistaminen HA-tagged c-Src ja Notch-1. LVI solu transfektoitiin pcDNA3-c-Src-HA-plasmidin, ja yhteistyö värjättiin anti-Notch-1 (

punainen

) ja anti-HA (

vihreä

) vasta visualisoida endogeenisen Notch-1 ja HA-tagged c-Src, vastaavasti.

Bar,

10 pm. (C) Co-lokalisointi endogeenisen c-Src ja FLAG-merkittyä Notch solunulkoisen katkaisu (NEXT) fragmentti. LVI solu transfektoitiin pcDNA3-NEXT-FLAG plasmidi, co-värjättiin anti-c-Src (

punainen

) ja anti-FLAG (

vihreä

) vasta visualisoida endogeenisen c-Src ja FLAG-merkitty Notch-1 NEXT fragmentti, tässä järjestyksessä.

Bar,

10 pm.

6. Proteiini domeenit osallistuvat c-Src-Notch-1: een sitoutuvien

c-Src koostuu SH3, SH2 ja kinaasin domeenit, joiden kyky sitoa erilaisia ​​proteiineja on karakterisoitu. Olemme esittäneet sarjan c-Src deleetiomutantteja HeLa-soluissa tunnistamaan alueita tarpeen yhdessä Notch-1 (kuvio 6A). Assosiaatio Notch-1 vähentää, jos kinaasidomeeni c-Src poistettiin (kuvio 6B). Sen sijaan, poistetaan SH3 tai SH2 domeeni ei merkittävästi vaikuta yhdessä Notch-1 (kuvio 6B). Sen määrittämiseksi, onko c-Src KD-domeeni on riittävä vuorovaikutukseen Notchin kanssa-1, teimme immunosaostuksella ja Western blot analyysit, jossa on c-Src KD-HA-fuusioproteiinin HeLa-solulysaateista. Notch-1 sitoutuu spesifisesti c-Src KD mutta ei c-Src SH3 domain, ja vain heikosti SH2-domeenin (kuvio 6B). Siten KD domain olevan tarpeen ja riittävä c-Src vuorovaikutus Notch-1.

Kinaasidomeeni c-Src sitoutuu Notchiin-1. (A) Kaavamainen esitys rakenteesta c-Src deleetiorakenteita. (B) KD domain c-Src sitoutuu Notch-1

in vitro

. Ilmoitettu fragmentit c-Src oli fuusioitunut HA-tag ja transfektoitiin ohimenevästi HeLa-soluihin. Kokosolulysaateista valmistettiin sitten, immunosaostettiin anti-HA-vasta-aineita, ja immunoblotteding (IB) suoritettiin anti-Notch-1 ja anti-HA-vasta-aineita. Normaali kaniinin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. (C) Co-FLAG-merkittyjen Notch-1 NEXT ja HA-tagged c-Src. (D) Kaavamainen esitys rakenteen Notch-1 deleetiorakenteita. (E) Minkään ankyriiniproteiinista toista verkkotunnus Notch-1 sitoutuu c-Src. Ilmoitettu fragmentit Notch-1 oli fuusioitu FLAG-tag ja transfektoitiin ohimenevästi HeLa-soluihin. Kokosolulysaateista valmistettiin sitten, immunosaostettiin anti-FLAG-vasta-aineita, ja immunoblotteding (IB) suoritettiin anti-FLAG ja anti-c-Src-vasta-aineita. Normaali kaniinin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. (F) Notch-1 on tyrosiini-fosforyloituu. Notch-1 immunosaostettiin anti-fosfo-tyrosiini Ab 4G10. Kokosolulysaateista LVI valmistettiin, ja immunosaostettiin anti-fosfo-tyrosiini (4G10), ja anti-Notch-1-vasta-aineita, ja immunoblotteding (IB) suoritettiin anti-Notch-1. Normaali kaniinin IgG: tä käytettiin negatiivisena kontrollina. (G) Detection tyrosiinifosforylaation anti-Notch-1 immunopresipitaatit. Ylempi paneeli: kokosolulysaateista LVI immunosaostettiin anti-IgG ja anti-Notch-1-vasta-aineita. Immunopresipitaatit alistettiin immunoblottauksella analyysi anti-fosfotyrosiini-vasta-ainetta 4G10. Alempi paneeli, sama blot oli riisuttu, ja havaittiin anti-Notch-1 vasta-aineella. (H) Src-estäjällä SU6656 tai PP2 laskee fosfo-tysosine liittyvä Notch-1. Kokosolulysaateista LVI immunosaostettiin anti-IgG ja anti-fosfotyrosiini 4G10-vasta-aineita. Immunopresipitaatit alistettiin immuuniblottausanalyysi anti-Notch-1.

Myös kotransfektoitiin FLAG-merkittyä Notch-1 NEXT ja HA-tagged c-Src HeLa-soluissa. Tuloksemme osoittavat, että NEXT liittyy HA-tagged c-Src (kuvio 6C).

havainto, että molemmat täyspitkät Notch-1 (p300) ja pilkotun Notch-1 (p120) liittävät c- src osoitti, että Notch-1 intrasellulaarisen domeenin (NICD) on c-src sitoutumiskohdan. Tunnistaa domeeni (t) Notch-1 vastaa c-Src sitova, me syntyy deleetiorakenteita on NICD (kuvio 6D), ja suoritetaan samanaikainen immunosaostus analyysit anti-FLAG tag ja c-Src-spesifisiä vasta-aineita. Tulokset osoittavat, että ankyriiniproteiinista toista (ANK) -nykyisen mutantti oli suuresti vähentynyt sitoutumisaffiniteetti c-Src, mikä viittaa siihen, että ANK domeeni Notch-1 on vastuussa sitoutumisesta c-Src (kuvio 6E). Siksi Notch-1 ja C-Src osakkuusyrityksen kautta ANK domain of Notch-1 ja KD domain c-Src.

Voit testata Notch-1 on fosforyloitu tyrosiinitähteitä, me immunosaostettiin LVI solulysaateista anti-fosfo-tyrosiini-vasta 4G10, ja havaittiin Notch-1 Western-blottauksella. Jotkut Notch-1 /p120 oli läsnä immuunisaostumassa (kuvio 6F). Myös immu- LVI solulysaateista anti-Notch-1-vasta-aine ja havaitaan tyrosiinia fosforylaatiossa kanssa 4G10 anti-fosfo-tyrosiini vasta-aine. Sekä Notch-1 /p300 ja Notch-1 /p120 fosforyloitiin tyrosiini (kuvio 6G). Käsittelimme HPAC-solut 10 uM SU6656 tai PP2 30 min, ja immunosaostamiseksi solulysaatti anti-fosfo-tyrosiini-vasta-ainetta 4G10, havaitaan sitten fosfo- tyrosiinia liittyy Notch-1 (kuvio 6H). Olemme havainneet, että SU6656 tai PP2 merkittävästi vähentynyt fosfo-tyrosiini-associated Notch-1 (kuvio 6H). Tulokset osoittivat, että Notch-1 on mahdollisesti fosforyloituu c-Src.

7. Kolokalisaation c- Src ja Notch-1 vierassiirrekokeissa haimasyövän malli

onko systeeminen hoito PP2 voivat vaikuttaa Notch-1-c-Src vuorovaikutus ksenograftikasvaimissa

in vivo

, loimme LVI ihmisen haimasyövän nude-hiirissä. Kun LVI köynnöksen oli kehittynyt palpoitavissa kasvaimia (200 mg), PP2 annettiin 4 mg /kg s.c. injektioita yhteensä 8 injektioita joka toinen päivä. PP2 pienensi kasvaimen kasvua (

P

= 0,0007 versus ajoneuvo) verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (kuvio 7A B).

(A) Vaikutukset PP2 kasvaimen kasvua LVI haimasyöpä vierassiirrännäiset paljaiden hiirien kylkiin. Edustava valokuva yhdellä hiiren kustakin ryhmästä näkyy., Kasvaimia sijaitsevat niiden kyljissä. (B) Alennettu kasvu ksenografteista LVI haimasyöpäsoluissa immuunivajaissa hiirillä johtuen PP2 hoitoon. Kasvainten tilavuuden olivat 200-300 mm

3 alussa lääkkeiden hoitoon. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD kasvainten. Erotus DMSO ja PP2 ryhmien välillä oli erittäin merkitsevä (

P

0,01; n = 10). (C) Kasvaimet resekoitiin ja käsitellään, ja levyt värjättiin H

P

0,01, n = 10; Kuva 7E).

keskustelu

Vaikka pilkkominen Notch-1 S1 sivuston furiinin on välttämätöntä Notch-1 aktivointi mekanismi hallintoelimen Notch-1-furiinin yhdistys ei ollut selvä. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että Notch-1 aktivointi säätelee tyrosiinikinaasi. Osoitimme myös, että c-Src liitetään fyysisesti Notch-1; c-Src vuorovaikutuksessa Notch-1 kautta KD domain, ja kinaasiaktiivisuuden tarvitaan tehokasta yhdistys c-Src kanssa Notch-1. Solunulkoinen kasvutekijät vaikuttavat suoraan säädellä Notch-1 katkaisuun proteiinin tason kautta c-Src.

Direct cross-talk välillä kasvu reseptorin-c-Src ja Notch polku

Src-ryhmän kinaasit (SFKs) ovat ei-reseptorien kinaasit yli-ilmentyy useimmissa haimasyövässä ja osallisina syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [9]. Esto Näiden kinaasien on osoittanut lupaus prekliinisissä syövän malleissa. Tuloksemme osoittavat, että Notch-1 ja C-Src proteiinit ovat fyysisesti liittyvien ja että tämä yhdistys välittää Notch-1 käsittely ja aktivointi. On raportoitu, että Notch-1 liittyy seriini /treoniini-kinaaseja GSK3beeta ja CDK8 [13], [14]. Tuloksemme osoittavat, että Notch-1 säätelee myös tyrosiinikinaasin.

Notch-1 on mahdollisesti alavirtavaikuttajainhibiittorit EGFR /PDGFR haiman syöpäsoluissa

EGFR signaloinnin vaikutukset monia näkökohtia kasvaimen biologia, mukaan lukien proliferaatio, invaasio, levittää, ja apoptoosin [15]. Aktivointi EGFR edistää kasvaimen kasvua, invaasio, ja levittää; se estää myös apoptoosia. Valtaosa haimasyövistä yliekspressoimaan EGFR, ja tämä on korreloinut kehittynyt taudin esittelystä ja vähennetään Keskimääräinen elinaika [16]. EGFR tuottaa sen vaikutus pahanlaatuisiin soluihin kautta autokriininen ja parakriininen silmukoita ja sen on osoitettu sitoutuvan TGF-α ja EGF. EGFR Sitten autofosforyloidun ja transphosphorylated on tyrosiinitähteitä, jolloin sen yhdessä adapterin ja molekyylejä ja aktivoitumiseen johtavat useiden solunsisäisten signalointikaskadien, joihin kuuluvat myös Src, AKT ja ras /MAPK1 /2 [15].

PDGFR-α ja PDGFR-β ovat rakenteellisesti samanlaisia ​​reseptorityrosiinikinaasien aktivoidaan verihiutaleperäinen kasvutekijä [17]. PDGF indusoi solujen kasvua, selviytymistä [18] ja transformaatio [19]. Aktivointi PDGFR kasvaimissa voi tapahtua myös autokriinisella tai parakriinistä stimulaation sekä kasvain ja normaali solujen strooman erittää PDGF. Yli-ilmentyminen PDGFR on todettu haimasyöpä [20]. Kuten EGFR, PDGFR stimulaatio johtaa aktivoitumiseen solunsisäisen signaloinnin, erityisesti Src, AKT, ja ras /MAPK1 /2.

Olemme aiemmin havaittu, että yli-ilmentyminen Notch-1 solunsisäinen domeeni (NICD) lisää haimasyöpä solujen kasvua, ja kaatamalla Notch-1 estää solujen kasvua [11]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että yli-ilmentyminen Notch-1 lisää pesäkkeiden muodostumisen LVI haimasyövän soluja. Olemme osoittaneet, edellä, että aktivaatio joko EGFR tai PDGFR stimuloi Notch-1 aktivaatio, mikä välittyy c-Src. Siten Notch-1 aktivaatio on tärkeä rooli kasvun haimasyövän soluja ja solujen lisääntymisen stimuloi aktivoimalla EGFR tai PDGFR.

Aiemmassa raportissa todettiin, että alas-säätely Notch-1 vähentynyt soluinvaasiota, kun taas Notch-1 yliekspressio cDNA transfektiolla lisännyt kasvainsolujen invaasio [11]. Olemme myös havainneet, että alas-säätely Notch-1 vähensi NF-KB: n DNA-sitoutumisaktiivisuutta ja ilmentyminen matriksimetalloproteinaasi-9 (MMP-9) ja VEGF [21]. Siten Notch-1 voi toimia alas-stream efektori EGFR /PDGFR signalointi ylös säätelevä MMP-9: n ja VEGF ilmaisun, ja stimuloi solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden.