Krooninen sairaus

tiivistelmä

B-lymfosyytti-indusoitu kypsymisen proteiini 1 (Blimp1) on mestari säädin B-solujen erilaistumista, ja valvonta migraatio alkuitusolujen. Viime aikoina olemme havaittu poikkeavan Blimp1 ilmentyminen rintasyöpäsoluissa johtuva NF-KB: n RelB Ras-signalointireitin aktivaatio. Jotta voitaisiin käsitellä kysymystä siitä, onko odottamaton ilmentyminen Blimp1 on nähty muissa epiteelin johdettu kasvaimia, valitsimme keuhkosyövästä, koska ne ovat usein ohjaavat Ras signalointi. Blimp1 todettiin kaikissa viidessä keuhkosyövän solulinjat tutkittu ja osoitettu edistävän keuhkosyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Kuulustelu mikrosi- aineistot osoittivat kohonneet

BLIMP1

RNA ilmentyminen keuhkoadenokarsinooma, haimatiehyen karsinoomat, pään ja kaulan kasvaimet sekä glioblastoomissa. Osallistuminen

Ras

ja sen loppupään kinaasi c-Raf varmistettiin käyttämällä mutantti ja siRNA strategioita. Seuraavaksi me käsitelleet mekanismi Blimp1 aktivoinnin keuhkosyöpä. Käyttämällä Knockdown ja kohdunulkoinen ilmaisun rooli Activator Protein (AP) -1 perhe transkriptiotekijöiden osoitettiin. Lisäksi kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä vahvisti sitoutumisen tunnistettu AP-1 elementtien

BLIMP1

edistäjä ektooppisesti ilmaistaan ​​c-Jun ja endogeenisen AP-1 alayksiköiden seuraavat seerumin stimulaatiota. Propeptidi verkkotunnus lysyyli oksidaasi (LOX-PP) tunnistettiin tuumorisuppressorina, jossa kyky vähentää Ras signaloinnin keuhkojen syöpäsoluja. LOX-PP vähensi ilmentymistä Blimp1 sitoutumalla c-Raf ja estämällä aktivointi AP-1, mikä vaimentaa muuttavien fenotyyppi keuhkosyövän soluja. Siten Blimp1 on välittäjänä Ras /Raf /AP-1 signalointi, joka edistää solujen vaeltamiseen, ja on tukahdutettu by LOX-PP keuhkosyöpä.

Citation: Yu Z, Sato S, Trackman PC, Kirsch KH , Sonenshein GE (2012) Blimp1 aktivointi AP-1 Human Lung Cancer Cells Edistää vaeltavien Fenotyyppikuvaus ja inhiboi Lysyl Oksidaasi propeptidi. PLoS ONE 7 (3): e33287. doi: 10,1371 /journal.pone.0033287

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 lokakuu 2011; Hyväksytty: 10 helmikuu 2012; Julkaistu: 15 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Näitä tutkimuksia tuettiin National Institutes of Health (NIH) myöntää R01 CA143108 ja PO1 ES011624. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

B-lymfosyytti-indusoitu kypsymisen proteiini 1 (Blimp1) tai Positiivinen-Regulatory Domain I Sidonta tekijä 1 (PRDI-PN1) on sinkkisormipolypeptidiin koodaama proteiini

PRDI-PN1 ja RIZ domain 1

(

PRDM1

) tai

BLIMP1

geeni [1], [2], jota alun perin eristettiin transkription repressori on

IFNP

promoottori [3]. Useita mekanismeja Blimp1 välittämän tukahduttaminen geenikopioinnin on selvitetty: rekrytointi histoni metyylitransferaasit (HMTs) [4], histonideasetylaaseja (HDAC: t) [5] tai korepressoreiden [2] tai kilpailu kopiointiaktivaattorit [6]. Blimp1 tunnistettiin mestari säätelijänä B-solujen terminaalin erilaistumista [7], joka edistää erilaistumista B-lymfosyyttien ja plasman soluja [8]. Useat tekijät ovat sekaantuneet aktivointi transkription

Blimp1

geenin erilaistumisen aikana B-solujen, mukaan lukien NF-KB: n, AP-1, IRF4, STAT3 ja Stat5: n, vaikka niiden tarkka toimintamekanismit ovat ei täysin ymmärretä [9]. Blimp1 sittemmin osoitettu säätelevän T-solujen lisääntymistä ja homeostaasin [10]. Kehityksen aikana, Blimp1 ohjaa alkuitusolupopulaatiosta (PGC) erittely ja maahanmuuttoa Blimp1 puutosta hiiren alkioiden tuottaa PGC kaltaisia ​​soluja, jotka eivät näyttämään ominainen PGC muuttoliike [11], [12]. Hieman yllättäen, Blimp1 havaittiin ei-hematopoieettista syöpäsoluja. Laboratoriomme havaittu Blimp1 ilmentyminen rintasyöpäsoluissa, ja osoitti sen tukahdutettu transkriptio

ESR1

koodaavan geenin estrogeenireseptori alfa (ERa), mikä edistää useamman muuttavan fenotyyppi [13]. Transkription induktio Bcl-2 tasot NF-KB-RelB alayksikön palvelukseen Ras mitokondriot [14]. Saatu Ras signalointia johti poikkeava induktion Blimp1 rinta- syöpäsoluissa [13]. Tarkka transkriptiotekijä (t) alavirtaan Ras että välitteisen aktivaation Blimp1 näissä syöpäsoluissa pysyi voidaan tunnistaa. Kuitenkin osallistuminen Ras signaloinnin Blimp1 aktivoituminen johtaa meidät oletuksen, että ilmentyminen Blimp1 voi olla yleisempää syöpä kuin aiemmin toteutunut. Kolorektaalisyöpäkasvainsoluja havaittiin myös ilmaista Blimp1, joka tukahdutettu

TP53

geeni ja siten ylläpitää solujen kasvua [15].

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuoleman länsimaissa . Noin kaksi kolmasosaa potilaista diagnosoidaan jo edenneet pitkälle, ja jäljellä potilailla, joille tehdään leikkaus, 30-50% kehittää toistumisen etäpesäkkeitä [16], [17].

RAS

-onkogeeni mutatoitunut jopa -30% keuhkosyövässä, jossa suurin osa mutaatioista löytyy

KRAS

geeni [16], [17]. Onkogeeniset K-Ras altistaa siirtogeenisiä hiiriä keuhkojen kasvaimien syntyyn [18]. Ras signaaleja useita eri reittejä pitkin, kuten mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi (MAPK). Koska ydinvoiman vastaanottajia varten MAPK signa-, aktivaattori proteiini (AP) -1 perheen transkriptiotekijöiden on liitetty laajasti vaeltavien fenotyyppi keuhkosyöpään solujen [19], [20], [21].

lysyyli oksidaasi

(

LOX

) geeni eristettiin

ras recision geeni

(

RRG

) koska sen kyky palata Ras-välitteisen muutos NIH 3T3-fibroblastit [22]. Ryhmämme osoitti kohdunulkoinen Pro-LOX ilmaisun vähensi ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) ja fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /Akt signalointi ja NF-KB: n Ras-transformoituja NIH 3T3-solut [23]. Menetys

LOX

geeniekspressio nähty monissa syöpä- kudoksissa ja solulinjoissa mukaan luettuina keuhkon [24], [25], [26], paksusuolen [27], eturauhas- [28], mahalaukun [29 ] ja pään ja niskan levy- syöpiin [30]. Ektooppinen

LOX

geenin ilmentyminen vähentää pesäkkeiden muodostumista viljellyissä mahalaukun syövän solujen ja kasvaimen muodostumista ksenograftimallia [29]. Lysyyli-oksidaasi on syntetisoivat ja erittävät pro-entsyymi (Pro-LOX), ja käsitellään funktionaalisen entsyymin (LOX) ja aminoterminaalisen propeptidin (LOX-PP) [31].

RRG

aktiivisuus Pro-LOX yllättäen kartoitettu LOX-PP domeeni, kuten on päätelty inhibitio transformoidun fenotyypin NIH 3T3-Ras-soluja [32]. Myöhemmin LOX-PP osoitettiin vähentävän muuttavia fenotyyppi hiiren rintasyövän solut ohjaavat Her-2 /Neu, joka viestittää kautta Ras ja niiden kyky muodostaa kasvaimia nude hiiren ksenograftimallia [33], [34]. Vuonna H1299 keuhkosyöpä solut, jotka sisältävät mutantti

sääntelyviranomaisten

geeni, LOX-PP vähensi aktivointi ERK ja Akt, sekä kykyä kiinnittymisestä riippumatonta kasvua ja invasiivisia pesäkkeenmuodostusta Matrigel [25]. LOX-PP vähenee myös fibronektiini-aktivaatio fokaalisen adheesion kinaasin rintasyöpäsoluissa [34], [35], ja fibroblastikasvutekijä (FGF) -2-indusoitua proliferaatiota eturauhassyöpäsolujen [36]. Täällä kysyttiin Blimp1 ilmentyy keuhkosyöpään solujen annetaan tärkeä rooli Ras signalointi näissä syöpäsoluissa. Blimp1 todettiin kaikissa keuhkosyöpää linjat tutkinut ja edistänyt niiden muuttoliike ja hyökkäystä. Lisäksi

BLIMP1

RNA havaittu muissa primaarikasvainten ohjaavat Ras signalointi. Keuhkosyövän soluja, tähystyspallo 1 indusoitiin Ras /c-Raf /AP-1-reitin, joka voitiin estää LOX-PP kautta vuorovaikutus c-Raf. Siten nämä tutkimukset tunnistaa Blimp1 kriittinen välittäjänä keuhkosyöpäsolua vaeltavia fenotyyppi transformoivan Ras /c-Raf /AP-1 kaskadi.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja viljelyolosuhteet

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) A549 ja H1299 solulinjoja ystävällisesti Zhi-Xiong Jim Xiao (Boston University School of Medicine, Boston MA). Calu-1, H23 ja H441 solulinjoja jalomielinen lahjoitus Hasmeena Kathuria ja Maria Ramirez (Boston University School of Medicine). A549, Calu-1, H23 ja H441-solut ilmentävät mutantti K-Ras [37], [38] ja H1299 express mutantti N-Ras [39]. Bosc23-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin Dulbeccon Minimal Essential Medium, paitsi H441, joka pidettiin RPMI-1640. Viljelyalustaan ​​oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), suosittelemia ATCC. H1299-kloonit ekspressoivat hiiren LOX-PP on doksisykliini (Dox) indusoituva vektori luotiin ja kokonais-RNA eristettiin aiemmin kuvatulla tavalla [25]. Indusoituva vakaa A549 soluja, jotka ilmentävät V5-leimatun ihmisen tai hiiren LOX-PP määritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [33], [34]. Lyhyesti, PCL-Ampho retrovirusta pakkaavan vektori (IMGENEX, San Diego, CA) oli kotransfektoitiin BOSC 23-soluihin käyttämällä FuGENE 6 (Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN) joko tyhjiä efektori vektori pC4

bsrR (TO) (EV) tai vektori, jossa on DNA-fragmentit ihmisen tai hiiren LOX-PP C-terminaali V5 tag ja regulaattorin vektori PCX

neoTR2 (molemmat ystävällisesti Tsuyoshi Akagi, KAN, Kobe, Japani). 48 tunnin kuluttua supernatantit sisältävät viruspartikkeleita otettiin talteen ja vietiin 0,45 pm suodattimen (Corning Inc., Corning, NY). A549 keuhkosyövän soluja dually tartunnan 48 tuntia kanssa supernatanttia BOSC 23 soluista, jotka sisältävät viruksia, jotka kantavat säädin ja efektori vektoreita täydennetty 6 ug /ml polybreeniä (Sigma, St. Louis, MO). Infektoidut solut valittiin 10 ug /ml blastisidiinia (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 1,4 mg /ml genetisiini (Sigma) tuottaa erillistä allasta vakaa A549-EV, A549-ihmisen LOX-PP ja A549-hiiri-LOX-PP-soluissa .

Plasmidit ja transfektio analyysi

pcDNA3 /Blimp [2] ja 7-kB

Blimp1

-pGL3 lusiferaasireportterista (

Blimp1

-luc ) [40] vektorit ystävällisesti Tom Maniatis (Columbia University, NY) ja Kathryn Calame (Columbia University), tässä järjestyksessä. C-Jun, c-Fos, Fra-1 ja Fra-2 AP-1 konstruktioita PCI ekspressiovektoriin olivat aiemmin raportoidun [41]. Ohimenevää transfektion ekspressiovektoreita, viljelmiä 12-kuoppalevyillä inkuboitiin 48 h, kun läsnä oli 1 ug DNA: ta ja 3 ui Fugene 6 tai 2,5 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kotransfektion MSV-β-gal-vektorilla, ekspressoivat β-galaktosidaasi (β-gal) käytettiin normalisoimaan transfektion tehokkuutta. Kaikki lyhytaikaisella transfektiolla toimittaja määritykset suoritettiin kolmena kappaleena, kaksi kertaa kuten aiemmin on kuvattu [42], ja tavallinen keskivirhe (SEM) lasketaan.

BLIMP1

siRNA, ja

kesäkuu

,

FRA-1

ja

FRA-2

siRNA duplex sekvenssit aikaisemmin kuvatulla [15], [43 ]. SiRNA kohdistaminen ihmisen

KRAS

geeni (sc-35731) oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). RNA-dupleksit käytetään kohdistukseen

c-RAF

olivat kuvanneet Chadee ja Kyriakis [44] ja ostetaan QIAGEN (Valencia, CA). Ohimenevää transfektio yhdessä siRNA: iden, viljelmissä 6-kuoppaisilla levyillä inkuboitiin 24 tuntia, kun läsnä on siRNA duplex (10 nM lopullinen) ja Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), mukaisesti valmistajan protokollaa. Kun kyseessä on kotransfektoimalla kaksi AP-1 siRNA: iden lopullinen pitoisuus kunkin siRNA oli 10 nM, jolloin koko siRNA pitoisuus 20 nM. Jossa mainittu viljelmä täydennetty negatiivinen kontrolli siRNA (Qiagen), jonka lopullinen pitoisuus on 10 tai 20 nM, kuten on tarkoituksenmukaista. Ras S186 ekspressiovektori ystävällisesti Mark Philips (NYU School of Medicine, New York, NY). Rakentamiseen N-terminaalisesti glutationi

S

-transferase (GST) merkitty LOX-PP ja sen deleetiomutanttien, cDNA, joka koodaa täyspitkää LOX-PP (WT, aminohappo 1-162) ja poistetaan aminohappotähdettä 26-100 (ΔM3) monistettiin täyspitkä Pro-LOX-cDNA [33] ja insertoitiin BamHI /Clal pEBG-GST nisäkäsekspressiovektoriin, antelias lahja tri Bruce Mayer (University of Connecticut Health Center, Farmington, CT). Rakentamiseen C-terminaalisesti GST-merkitty LOX-PP, cDNA, joka koodaa GST ja LOX-PP monistettiin ja insertoitiin pcDNA3.1 (+). pBabe-puro-MEK1 S217E /S221E konstitutiivisesti aktiivinen (CA-MEK) mutantti ystävällisesti toimittanut Dr. Geoffrey M. Cooper (Boston University, Boston, MA). Koodaava cDNA MEK1 S217E /S221E liitettiin pcDNA3.1 (+).

immunoblottianalyysi

Tumauutteita (NE) ja kokosoluekstraktien (WCE) valmistettiin ja alistettiin immunoblottauksella, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Havaitsemiseksi eritettyä yhdistelmä-DNA-LOX-PP-V5, viljelyalusta (40 ui 2 ml: aan kasvatusliuosta) immunoblotat- käyttäen anti-V5-vasta-aineen (R960-25, Invitrogen). Vasta-aineita vastaan ​​Blimp1 (no. 9115s), c-Jun (no. 9165), fosfori-c-Jun (no. 9261s), MEK1 /2 (L38C12; no. 4694) fosfo-ERK1 /2 (fosfori-Thr202 /Tyr204, no. 9101s) ja ERK1 /2 (9102) saatiin Cell Signaling (Danvers, MA). Vasta-aineet GST (B-14), K-Ras (F234), B-Raf (F-7), Fra-1 (N-17), Fra-2 (Q-20) ja c-Fos (H-125 ) olivat Santa Cruz Biotechnology. Vasta-aineet β-aktiini (AC-15) ja α-tubuliinin (DM1A) olivat Sigmalta. Hsp70 /Hsc70 (SPA-820) ja Hsp90 (SPA-830) vasta-aineet hankittiin Stressgen (Victoria, BC, Kanada). Vasta-ainetta c-Raf (klooni 53) ja Ras (klooni 18 /Ras) olivat BD Transduction (Franklin Lakes, NJ). Kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan, LOX-PP valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [45]. Tulokset on vähintään kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin densitometrisesti ja normalisoidaan β-aktiinin kuormituksen valvonta ja keskiarvot suhteessa kontrolliin tyhjän vektorin (EV) soluja (asetettu 1,0) annetaan.

Migration ja invaasio määritykset

Jousitus 1 x 10

5 solua kerroksittain, kolmena kappaleena, ylemmässä osastoissa Costar siirtoaltaat (Corning, Lowell, MA) on 8 mm halkaisijaltaan polykarbonaatti suodatin (8 um huokoskoko koko), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 16 tuntia. Migration solujen alemmalle puolelle suodattimen arvioitiin fosfataasin entsymaattisella määrityksellä käyttäen p-nitrofenyylifosfaatti ja OD

410 nm määritystä, kuten aiemmin on kuvattu [13] tai värjäämällä kristallivioletilla ja OD

570 nm määritys (63). Keskimääräinen siirtymisen kolmen erillisen kokeen ± SD esitetään suhteessa kontrolliin EV, joka oli asetettu 1,0.

P

arvot laskettiin käyttäen Studentin

t

-testi. Invaasiolle määrityksiä, suodattimet esipäällystetty 10 ug Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Migration solujen alemmalle puolelle suodattimen arvioitiin värjäämällä kristallivioletilla ja OD

570 nm määrittämiseksi. Keskiarvo ± SD esitetään. Invasion määritykset suoritettiin kolme kertaa, kolmena kappaleena.

käänteistransskriptaasi (RT) -PCR analyysi

RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Invitrogen), ja näytteet A

260 /

280 suhdelukua 1,8 ja 2,0 hoidettiin RQ1 RNaasittomalla DNaasia (Promega). Superscript III RT käytettiin käänteistranskriptioon 1 ug RNA: ta, kun läsnä oli 100 ng satunnaisia ​​alukkeita (Invitrogen). Sillä Realtime kvantitatiivinen PCR (Q-PCR),

BLIMP1

alukkeet kuten aiemmin on kuvattu [46].

GAPDH

alukkeet olivat: Eteenpäin 5′-TTGCCATCAATGACCCCTTCA-3 ’; Käänteinen 5’-CGCCCCACTTGATTTTGGA-3 ’. Q-PCR suoritettiin kolmena kappaleena Roche LightCycler-480-järjestelmä.

Kromatiini immunosaostus (ChIP) määritys

ChIP-kokeet suoritettiin käyttäen EZ-ChIP kit (Millipore Corporation, Billerica, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Analysointiin ektooppisesti ilmaistuna AP-1, 24 h sen jälkeen, kun H441-soluja transfektoitiin c-Jun-ekspressiovektoriin, formaldehydi (1% lopullinen) lisättiin soluviljelyalustaan. Kokosolulysaateille tehty ja sonikoitiin on Misonix 3000 Sonicator (Misnonix, Farmingdale, NY) 15 sykliä, joissa 10 sekuntia kunkin saatiin genomi-DNA-fragmentteja noin 200 1000 bp. Sen jälkeen, kun preclearing siru luokka Protein G-agaroosin 100 ui leikattua DNA-proteiini-kompleksit immunosaostettiin vasta-aineita c-Jun (sc-1694), tai kaniinin normaalilla IgG: llä (sc-2027) (Santa Cruz Biotechnology). Silloitusta päinvastaiseksi ja puhdistettua genomista DNA-fragmentit tehtiin PCR. Ristisidoksia purettiin inkuboimalla yön yli 65 ° C: n ja genomisen DNA: n fragmentit puhdistettiin Qiaquick PCR-puhdistuskittiä (QIAGEN, no. 28104). Kaksi sitovia elementtejä AP-1, joka tunnetaan myös TPA reagoivat elementit tai TREt, aiemmin tunnistettu -1813 ja -1647 bp suhteessa

BLIMP1

transkription aloituskohdasta [47] ja todentaa Transfac ( genomatix.de) analyysi. Alueen yli kaksi TREt monistettiin PCR: llä. Alukkeet -1813 bp TRE: Eteenpäin 5′-GCCTTCTTCCCACCTCAAATATCA-3 ’, Reverse 5′-TGGCCTGCTGTTCAAACAGTCT-CA-3′; sekä -1647 bp TRE: Eteenpäin 5’- GTTGCATGATGGTGTATGTGGCCT-3 ’, Reverse 5’-ATCCAGCCTGCTCAAGAGGGTTTA -3 ”. Positiivisena kontrollina AP-1 sitova fragmentti ihmisen

kesäkuu

promoottori sisältää kahta lähellä sijaitsevaa TRE sivustoja (-120 -1 bp) samalla suoritettiin ChIP analyysi, käyttäen edellä kuvattuja alukkeita [ ,,,0],48]. Negatiivisena kontrollina, alukkeet on suunniteltu ylävirran alueen

BLIMP1

promoottori (-5508–5366 bp), joka ei sisällä TRE sites: Eteenpäin 5’TCCTTCCCTGTGTTTGGTCCCATT-3 ’, Reverse 5’-ATTGTTTCCTTCAAGCAGGCACCC- 3 ’. Sitoutumisesta endogeenisen AP-1-alayksiköt, A549-soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa 48 tuntia ja FBS: ää (10% lopullinen konsentraatio) lisätään takaisin. 30 minuutin kuluttua, WCE valmistettiin ja altistettiin ChlP määritys, kuten edellä, käyttäen vasta-aineita kaniinin normaalilla IgG, c-Jun, Fra-1 (sc-183), tai Fra-2 (sc-604) (Santa Cruz Biotechnology ).

immunosaostus ja GST vetää alas määrityksessä

H1299 tai A549-solut hajotettiin puskurilla A [25 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 150 mM KCI, 2 mM EDTA, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 mM ditiotreitolia, 0,5 ug /ml leupeptiiniä, 2 uM pepstatiini A: ta, 1 ug /ml aprotiniinia, ja 1% Triton X-100]. Lysaatit sentrifugoitiin mikrosentrifugissa 10 minuutin ajan 13000 rpm 4 ° C: ssa liukenemattoman materiaalin poistamiseksi. Immunosaostukseen, 2 ug joko kanin anti-LOX-PP [45], tai kanin kontrolli-IgG lisättiin 500 ug solulysaatti, minkä jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Proteiini-G-Sepharose-helmiä (Invitrogen) lisättiin sitten seokseen, jota seurasi inkubointi 4 ° C: ssa 2 tuntia varovasti ravistellen. Helmet pestiin neljä kertaa puskurilla A. GST-pull down määrityksessä, lysaatit inkuboitiin 20 ul: lla glutationi-Sepharose 4B (GE Healthcare) 2 h 4 ° C: ssa. Hartsi pestiin neljä kertaa puskurilla A. immuuni-kompleksien tai GST vetää alas-kompleksit eluoitiin sefaroosihelmien kanssa SDS-PAGE-näytepuskuria, ja saostunut proteiinit analysoitiin immunoblot-analyysillä.

Tulokset

keuhkosyöpä solut ilmentävät Blimp1

Viisi keuhkosyövän solulinjat vetämänä mutantti K-Ras tai N-Ras, valittiin testaamaan Blimp1 ilmentymisen: A549, H1299, Calu-1, H23 ja H441. Tumauutteet alistettiin immunoblot-analyysillä (Fig. 1A). Vertailua olemme mukana ydinaseiden otteita ERa positiivinen MCF-7 ja ERa negatiivinen MDA-MB-231 rintasyövän soluja, jotka näkyvät suhteellisesti alhaisemmat ja korkeammat Blimp1 tasoilla, vastaavasti [13]. Kaikki viisi keuhkosyövän solulinjat ilmensivät 100 kDa: n Blimp1 proteiini tunnistaa vasta-aineen vastaan ​​N-päähän ihmisen Blimp1 proteiinia. Kuten aikaisemmin on mainittu, ERa negatiivinen MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen ilmaistuna korkeampi Blimp1 kuin ERa: n positiivinen MCF-7-soluja [13]. Kaikki keuhkosyövän solut ilmensivät huomattavasti suurempia määriä Blimp1 kuin MDA-MB-231 linjan. Siten Blimp1 ilmentyy keuhkojen syöpäsoluja.

(A) Näytteet tumauutteiden (20 ug) A549, H1299, Calu-1, H23 ja H441 ihmisen keuhkojen syöpäsoluja ja MCF-7 ja MDA- MB-231 (MB-231) rintasyöpä solut altistettiin immunoblottaus varten Blimp1 ja β-aktiini, kontrollina yhtä suuri kuormitus. Kannat molekyylipainomerkit annetaan vasemmalla kaistalla. Edustaja kaksi erillistä koetta samoin tuloksin näkyy. (B) A549 ja (C) H1299-soluja transfektoitiin ohimenevästi 10 nM kutakin

siBLIMP1-1

,

siBLIMP1-2

tai sekoitetun negatiivinen kontrolli siRNA. Ylempi paneeli: Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, WCE (30 ug) altistettiin immunoblottaamalla varten Blimp1 ja β-aktiini. Bändit kvantitoitiin käyttäen NIH Image J ohjelmisto ja Blimp1 ilmaisun normalisoida p-aktiinin ilme. Normalisoitu Blimp1 ilmentyminen määritettiin kahdessa riippumattomassa kokeessa ja keskiarvot on esitetty alla blotit. Alemmat paneelit: Vaihtoehtoisesti, kun 24 h, viljelmiä käsiteltiin trypsiinillä ja 1 x 10

5-solut altistettiin migraatiokokeessa 16 h, kolmena kappaleena. Keskimääräinen Siirtyminen kolmen erillisen kokeen ± SD esitetään suhteessa negatiiviseen kontrolliin siRNA (asetettu 1,0).

P

arvot laskettiin käyttäen opiskelijan

t

-testi. *,

P

0,005; **,

P

0,0005. (D) A549-soluja inkuboitiin, kun läsnä oli 0,5 nM

siBlimp1-2

tai sekoitetun negatiivinen kontrolli-siRNA: ssa 16 tuntia. Sitten solut transfektoitiin Blimp1 ekspressiovektorilla (2 ug per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle) ja inkuboitiin 32 tuntia. (Upotus) kokosolulysaateista (20 ug) altistettiin western blot-analyysi käyttäen vasta-aineita Blimp1 tai β-aktiini. Viljelmiä käsiteltiin trypsiinillä ja 1 x 10

5-solut altistettiin migraatiokokeessa 16 h, kolmena kappaleena. Keskimääräinen Siirtyminen kaksi erillistä koetta ± SE on esitetty suhteessa negatiiviseen kontrolliin siRNA ja EV (asetettu 1,0). Esitetyt tiedot on edustaja kaksi erillistä koetta samoin tuloksin. (E) A549-soluja transfektoitiin ohimenevästi 10 nM kutakin

siBLIMP1-1

,

siBLIMP1-2

tai sekoitetun negatiivinen kontrolli siRNA. 48 tunnin kuluttua viljelmät käsiteltiin trypsiinillä ja 1 x 10

5-soluja altistetaan invaasiomääritys 16 h, kolmena kappaleena. Keskimääräinen data kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SD esitetään suhteessa negatiiviseen kontrolliin siRNA (asetettu 1,0).

P

arvot laskettiin käyttäen opiskelijan

t

-testi. *, P 0,01.

Blimp1 edistää maahanmuuttoa keuhkosyöpään solujen

puuttuminen Blimp1 hiiren alkioiden johtanut kehitystä alkuitusolujen kaltaisia ​​soluja, jotka eivät voineet siirtyä [ ,,,0],11], [12]. Sen testaamiseksi Blimp1 ilmentyminen on osallisena valvontaan keuhkosyövän solujen vaeltamiseen, knockdown strategiaa käytettiin. A549 ja H1299-soluja, jotka näytetään suhteellisen korkea Blimp1 (Fig. 1A), inkuboitiin joko

siBLIMP1-1

tai

siBLIMP1-2

, kaksi riippumatonta siRNA lajia, tai joissa on sekoitetun negatiivinen kontrolli siRNA. 48 tunnin kuluttua näytteet WCE alistettiin immunoblot-analyysillä. Molemmat

BLIMP1

siRNA johtanut tehokkaaseen knockdovvn Blimp1 proteiinin ilmentymisen kontrolliin verrattuna siRNA. Vakaampi Knockdown nähtiin

siBLIMP1-2

molemmissa solulinjoissa, eli 93%: n lasku A549 ja 88% vuonna H1299 verrattuna 30% A549 ja 48% vuonna H1299 kanssa

siBLIMP1- 1

(ylempi paneeli, kuviot. 1B ja 1C). Vaikutukset 24 tunnin inkubaatio näiden siRNA siirtolaisuudesta A549 ja H1299 solut testattiin Boyden kammioiden (1 x 10

5 per kuoppa) käyttäen FBS kuin chemo-houkutinta. Solumigraation mitattiin 16 tuntia myöhemmin. Knockdovvn

BLIMP1

ilmaus vähensivät kulkeutumista A549 (Fig. 1 B) ja H1299 (Fig. 1 C) keuhkosyövän soluja. Vuonna kolmen erillisen kokeen, suoritettiin kolmena kappaleena,

siBLIMP1-2

johti syvällisempi väheneminen kulkeutumista A549 (keskiarvo laskee 42%: n

siBLIMP1-1

vs 71% kanssa

siBLIMP1-2

) ja H1299 soluja (keskiarvo pienenivät 35%

siBLIMP1-1

vs 54% kanssa

siBLIMP1-2

). Ei merkittäviä vaikutuksia hoitojen soluproliferaatiota havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​vähentäminen tähystyspallo-1-tasot. Sen vahvistamiseksi, että vähentäminen solumigraation oli nimenomaan johtuu knockdovvn Blimp1 ilmaisun, teimme pelastus kokeen käyttäen

siBLIMP1-2

ja Blimp1 kohdunulkoinen ilmaisun A549 keuhkosyövän soluja. Lyhyesti, A549-soluja inkuboitiin joko

siBLIMP1-2

tai negatiivinen kontrolli siRNA: ssa 16 tuntia, jota seuraa ohimenevä transfektiolla ilmentävää vektoria Blimp1 tai EV DNA. Jälkeen 32 h, solut altistettiin migraatiomääritys tai näytteitä WCE alistettiin immunoblot-analyysillä.

BLIMP1

siRNA-2 johtanut tehokkaaseen knockdovvn Blimp1 proteiinin ilmentymisen verrattuna kontrolliin siRNA ja tämä vaikutus oli voitettava Blimp1 ekspressiovektori (Fig. 1 D, upotus). Kuten edellä, knockdovvn

BLIMP1

ilmaus johti 42%: n lasku solujen kulkeu- verrattuna soluihin transfektoitu negatiivinen kontrolli siRNA ja EV, ja tämä ohittaa kohdunulkoisen Blimp1 lauseke (Fig. 1 D). 33% lisäys migraatio A549-soluja oli transfektoitu Blimp1 cDNA: n ja

siBlimp1-2

havaittiin verrattuna kontrolliin siRNA ja EV transfektoituja soluja. Lisäksi, ei ole merkittäviä vaikutuksia soluproliferaatiota havaittiin yli ajan myötä (aineistoa ei esitetty). Seuraavaksi testasimme vaikutuksia Blimp1 knockdown päälle hyökkäystä. Väheneminen hyökkäystä A549 keuhkosyöpä solut merkittiin kanssa

BLIMP1

siRNA-1, joka oli vieläkin syvempi kanssa

BLIMP1

siRNA-2 verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA, sopusoinnussa maahanmuuttoa tiedot (Fig. 1 E). Siten kevyemmästä Blimp1 johtaa vähentyneeseen kykyyn A549 ja H1299 keuhkosyöpäsoluissa siirtää ja hyökätä.

vieressä suoritetaan päinvastainen kokeen ja ektooppisesti ilmaistu Blimp1 A549 ja H441-solut, jotka ilmentävät korkeampia ja kohtuullisella tasolla ja Blimp1, vastaavasti. Viljelmiä transfektoitiin ohimenevästi Blimp1 ilmentymisen cDNA tai emo tyhjän vektorin (EV) 24 tunnin ajan ja altistettiin maahanmuuton määrityksiä, kuten edellä. Kolmessa riippumattomassa kokeessa, joka suoritettiin kolmena rinnakkaisena, Blimp1 yliekspressio lisäsi migraation A549 ja H441-soluja keskimäärin 64% (Fig. 2A) ja 58% (Fig. 2B), vastaavasti. Western blottaus uutteet valmistettiin samalla tavalla transfektoituja viljelmiä vahvisti ektooppinen ilmentyminen Blimp1 (ylempi paneeli, kuviot. 2A ja 2B). Näin ollen, Blimp1 edistää useamman muuttavan fenotyypin keuhkosyövän soluja.

(A) A549-soluja tai (B) H441-soluja transfektoitiin ohimenevästi 1 ug Blimp1 cDNA: n tai EV DNA: sta käyttäen Lipofectamine 2000 Varsi paneelit: WCE eristettiin 48 tunnin jälkeen ja alistettiin immunoblot-analyysi Blimp1 ja β-aktiini. Alemmat paneelit: Vaihtoehtoisesti, 24 h transfektion jälkeen solut altistettiin migraatiokokeessa kuten kuviossa. 1. Keskimääräinen Siirtyminen kolmen erillisen kokeen ± SD esitetään suhteessa EV (asetettu 1,0).

P

arvot laskettiin käyttäen Studentin

t

-testi. *,

P

0,005. C) Box tontin Hou keuhkosyöpä microarray aineisto käyttökerroista Oncomine Database. Opiskelijan

t

-testissä varten kaksi ryhmää osoittaa

P

arvosta 0,024. D) Rasiakuvaajat päässä Badea haimasyöpä, Estilo pään ja kaulan syöpä ja Sun aivokasvaimen mikrosirujen aineistot olivat käsiksi käyttämällä Oncomine Database. Opiskelijan

t

-testaukset vertaillaan ryhmien Nämä tutkimukset osoittavat

P

arvot 8.67e

-7, 0,001 ja 3.28e

-15, vastaavasti.

Useita ensisijainen kasvaimia näyttää yli-ilmentyminen

BLIMP1

RNA

seuraava kysytään

BLIMP1

RNA havaitaan ensisijaisen keuhkokasvaimia. Kohonnut

BLIMP1

mRNA: n ekspressio havaittiin keuhkoadenokarsinooma näytteissä verrattuna normaaliin keuhkojen kudoksiin [49] (Fig. 2C). Konstitutiivinen Ras signaloinnin aiheuttama joko mutantin

RAS

geenin tai ylävirtaan aktivaattori, kuten kasvutekijän reseptori on osallisena monissa muissa kasvaimissa.

KRAS

mutaatioita on havaittu 95% haimatiehyen adenokarsinoomat [50], kun taas yli-ilmentyminen kasvutekijän reseptorin (EGFR), joka indusoi Ras signalointia, havaittiin 80-90% ihmisen pään ja kaula okasolukarsinoomia [51] ja 40% glioblastomas [52]. Erityisesti, analyysien käyttäen microarray tietojoukkoja Oncomine paljasti kohonnut

BLIMP1

RNA ilmentymisen näytteitä haiman adenokarsinooma [53], kielen okasolusyöpä [54] ja glioblastooma [55] verrattuna vastaavaan normaaleissa kudoksissa (kuvio. 2D). Siten

BLIMP1

RNA yliekspressoituu monipuolinen joukko ihmisen syövistä.

Ras c-Raf signalointi indusoi Blimp1 ilmentyminen keuhkosyöpäsoluissa

käsitellä suoraan rooli Ras signalointia Blimp1 tasoilla keuhkosyöpäsoluissa, dominantti negatiivinen mutantti käytettiin ensimmäisen. Ras S186 mutantti säilyttää kyvyn yhdistää efektori proteiinikinaasin c-Raf, mutta ei translokoituvat kalvoon ja inhiboivat aktivointi Blimp1 by Bcl-2 [13], [56]. A549-soluja, jotka ilmentävät aktivoitua mutantti K-Ras C12, transfektoitiin EV tai ekspressoivan plasmidin Ras S186 ja sen jälkeen 48 h, WCE ja RNA eristettiin. Ektooppinen ilmentyminen Ras S186, joka vahvistettiin immunoblottauksella, vähentynyt Blimp1 proteiinin ilmentymisen ~54% (Fig. 3A). Kahdessa erillisessä kokeessa,

BLIMP1

mRNA ilmaisu laski keskimäärin 48%, kun ektooppinen ilmentyminen Ras S186 (Fig. 3B). Vaikutukset vallitsevan negatiivisen Ras on

Blimp1

promoottorin aktiivisuutta testattiin myös. A549-solut kotransfektoitiin joko EV tai Ras S186 vektori-DNA, sekä 7-kB

Blimp1

promoottori reportteri-konstrukti

Blimp1

-luc ja β-gal-ilmentymisen vektoriin, normalisointi of transfektiotehokkuudet. Yliekspressio Ras S186 johdosta keskimääräinen lasku 69% vuonna normalisoitu

Blimp1

promoottorin aktiivisuutta (Fig. 3C). Lopuksi, joka on Si-

KRAS

strategiaa käytettiin (Fig. 3d). Knockdown K-Ras johti laskua 93% K-Ras-proteiinin ilmentymisen ja merkittävä lasku ERK aktiivisuuden arvioituna väheneminen fosfori-ERK tasolle. Lisäksi keskimääräinen lasku 44% vuonna Blimp1 tasot havaittiin kahdessa riippumattomassa kokeessa (Fig. 3d). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että onkogeenisiä Ras signaling A549 keuhkosyövän soluja asemat

BLIMP1

geenin ilmentymistä.

(A) A549-solut transfektoitiin 5 ug: lla plasmidia, jotka ekspressoivat vallitsevaa negatiivista Ras S186 tai EV DNA. 48 tunnin kuluttua, WCE ja RNA valmistettiin. *, P 0,01.