Krooninen sairaus

tiivistelmä

piirityksen kasvutekijän reseptorin (EGFR) toiminta on ollut ensisijainen terapeuttinen kohde ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä (NSCLC). Koska potilaita, joilla villityypin EGFR ovat osoittaneet vain vähäistä hyötyä EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), tarvitaan ylimääräisiä hoitomenetelmät potilailla, joilla on villin tyypin EGFR. Keskeisenä osana loppupään integriinin signalointia ja tunnetut reseptori ylikuuluminen EGFR, me arveltu, että kohdistaminen polttoväli adheesiokinaasi (FAK) aktiivisuus, joka on myös osoitettu korreloivan aggressiivinen vaihe NSCLC, johtaisi parannettu aktiivisuus EGFR TKI . Sellaisenaan, EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC-soluja (A549, H1299, H1975), hoidettiin EGFR-TKI erlotinibin ja FAK-inhibiittorit (PF-573228 tai PF-562271) sekä yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä. Määritimme solujen elinkykyä, apoptoosin ja 3-ulotteinen kasvu

in vitro

ja arvioidaan kasvaimen kasvua

in vivo

. Hoito EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC-solujen FAK-estäjä yksin tehokkaasti esti solujen elävyys kaikissa testatuissa solulinjoissa; kuitenkin, sen käyttö yhdistelmänä EGFR-TKI erlotinibin tehokkaammin vähentämään solujen elinkelpoisuus kuin jompikumpi hoito yksinään testattaessa sekä 2- ja 3-ulotteinen määritykset

in vitro

, tiiviimmän hyöty nähdään A549-soluja. Tämä lisääntynyt teho voi johtua osittain havaittu esto Akt fosforylaation, kun lääkkeet käytettiin yhdistelmänä, jossa jälleen A549-soluja osoitettiin kaikkein estävää Lääkehoito yhdistelmä. Yhdistämällä erlotinibi kanssa FAK-estäjä oli myös voimakas

in vivo

osoituksena alentunut kasvaimen kasvu A549 hiiren ksenograftimallissa. Olemme lisäksi todennut, että herkempiä oli riippumatta LKB1 mutaatiostatuksesta riippumatta. Yhteenvetona tehokkuuden osoittamiseksi yhdistää erlotinibin ja FAK-inhibiittoreita käytettäväksi tunnettujen EGFR villityypin EGFR-TKI resistentit solut, joilla on potentiaalia, että osajoukko solutyyppejä, joka sisältää A549, voi olla erityisen herkkä tämän yhdistelmähoidon. Sinänsä tutkitaan tarkemmin tätä yhdistelmähoitoa on perusteltua ja voisi osoittautua tehokas terapeuttinen lähestymistapa potilaille, joilla on luontainen EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC.

Citation: Howe GA, Xiao B, Zhao H, Al-Zahrani KN, Hasim MS, Villeneuve J, et al. (2016) Focal adheesiokinaasi estäjät yhdistelmähoidossa Erlotinibi osoittaa Enhanced antituumorivaikutuksen in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 11 (3): e0150567. doi: 10,1371 /journal.pone.0150567

Editor: Jeremy J.W. Chen, Institute of Biomedical Sciences, Taiwan

vastaanotettu: 28 syyskuu 2015; Hyväksytty: 14 helmikuu 2016; Julkaistu: 10 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Howe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksen CLA päässä Lung Cancer Research Foundation (https://www.lungcancerresearchfoundation.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu tai analysointi päätös julkaista tai valmistelua tämän käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

lyhenteet: DMSO, dimetyylisulfoksidi; ECM, soluväliaineen; EGFR, epidermaalisen kasvutekijän reseptori; FAK, focal tarttuvuus kinaasi; LKB1, maksan kinaasi B1; NSCLC, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä; PBS, fosfaattipuskuroitu suolaliuos; PF-228, PF-573228; PF-271, PF-562271; TKI, tyrosiinikinaasiestäjä

Johdanto

keuhkosyövässä osuus enemmän kuolemia maailmanlaajuisesti kuin mikään muu syöpätyyppi [1] ~ 80% keuhkosyövässä on luokiteltu ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLC) [2]. Epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) proteiini yli-ilmentyy jopa 80% NSCLCs, joten EGFR on ensisijainen terapeuttinen kohde NSCLC [3,4]. Tätä varten, aineet on suunniteltu vaikuttamaan sekä solunulkoisen domeenin ja solunsisäisen kinaasidomeeni EGFR. Inhibiittorit kohdistaminen kinaasidomeenia EGFR, kuten erlotinibi ja gefitinibi, ovat osoittautuneet lupaaviksi potilailla on aktivoivia mutaatioita (eli eksonit 18, 19 tai 21) EGFR [5-8], vaikka nämä inhibiittorit ovat osoittaneet vain vaatimattomia etuja potilaille kätkeminen villityypin EGFR [9,10]. Lisäksi toissijainen mutaatioita EGFR tai c-MET vahvistus voi kehittyä, resistenssin aiemmin herkillä potilailla [11]. Koska esiintyvyys EGFR aktivoivia mutaatioita on suhteellisen alhainen useimmissa Pohjois-Amerikan ja Euroopan populaatiot [12-15], on tarpeen parantaa herkkyyttä EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) potilailla, joilla villityypin EGFR.

Focal tarttuvuus kinaasi (FAK) on ei-reseptori-tyrosiinikinaasin, joka paikantuu paikoissa soluadheesion solunulkoisen matriisin (ECM) ja välittää signaloinnin tapahtumista myötävirtaan integriinin sitoutumista ECM. FAK tiedetään säännellä solujen selviytymistä, proliferaatiota ja muuttoliike [16]. FAK ilme on myös osoitettu olevan säädelty monissa syöpätyyppejä mukaan lukien keuhkosyövässä [17], mikä paikannus FAK tärkeänä kohteena sääntelyä syövän hoidossa. Tätä varten, FAK-inhibiittoreita on kehitetty, mukaan lukien farmakologiset inhibiittorit FAK tyrosiinikinaasiaktiivisuuden [18,19]. Esto FAK on osoitettu vaikuttavan useita soluprosesseja tärkeää kasvaimen kasvua ja sairauden etenemistä, mukaan lukien angiogeneesi ja metastaasi [20-22]. Lisäksi FAK estäjien on osoitettu tehokkaasti estää kasvaimen kasvua useissa ihonalainen ksenograftimalleja [23,24] osoittaa lupauksen yksittäisinä aineina sekä yhdessä muiden estäjien [24-26].

NSCLC, lisääntynyt ekspressiotasot FAK havaitaan kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin keuhkokudokseen, ja tämä lisääntynyt ekspressio korreloi korkeamman taudin vaiheissa [27]. Nämä havainnot viittaavat siihen merkittävä rooli FAK etenemisessä NSCLC. Viimeaikaiset todisteet on myös sekaantunut β1-integriinin ilmentyminen vastustuskykyä EGFR TKI gefitinibi, lisääntynyt gefitinibi herkkyys nähdään seuraavat β1-integriini ehtyminen NSCLC soluissa [28]. Koska FAK on yksi tärkeimmistä kinaasien aktivoitu alavirtaan β1-integriinin merkitys ECM-fokaalisen adheesion monimutkainen signalointi vastustuskykyä EGFR-TKI on aiheellinen. Koska se on vakiintunut käytäntö hoitoon pienisoluista keuhkosyöpää EGFR TKI ja siellä yhä enemmän todisteita siitä FAK on merkittävä rooli keuhkojen syövän kasvua ja etenemiseen, ryhdyimme testata hyödyllisyyttä yhdistämällä EGFR estäjä erlotinibi kanssa FAK esto in NSCLC. Olemme tutkineet vaikutuksia kahdessa FAK estäjiä, PF-573228 (PF-228) ja PF-562271 (PF-271) on NSCLC solukasvua kulttuuriin ja kasvaimen kasvua hiiren ksenograftimalleissa koska sekä yksittäisinä aineina ja yhdessä erlotinibin. Tulokset Tutkimuksemme osoittavat, että yhdistämällä FAK esto erlotinibin tehokkaammin vähentää EGFR villityypin NSCLC solujen elävyyden

in vitro

ja ksenograftin kasvaimen kasvua

in vivo

kuin kumpikaan lääke hoito yksinään, erityisesti tehoa A549 solutyypissä. Siten tuloksemme ovat tunnistaneet lupaava lääke yhdistelmä strategiaa kohdistaminen EGFR ja FAK in NSCLC, ja osoittavat, että hoito-ohjelma, joka sisältää FAK-estäjä voi olla hyödyllisempää kuin hoito erlotinibin yksinään potilailla kätkeminen luontainen EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC.

Methods

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen solulinjat A549 (EGFR villityypin) ja H1299 (EGFR villityypin) ostettiin ATCC, kun taas H1975 (EGFR L858R ja T790M mutaatiot), HCC827 (EGFR ΔE746-E750) ja HCC4006 (EGFR ΔL747-E749) solulinjat olivat lahja tri Ming Tsao (prinsessa Margaret Hospital, Toronto, oN). A549-soluja ylläpidettiin DMEM (Mediatech, Manassas, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Medicorp, Montreal, QC), kun taas H1299, H1975, HCC827 ja HCC4006 soluja ylläpidettiin RPMI-1640 (HyClone Laboratories, Logan , UT) ja 10% FBS: ää. Kaikkia solulinjoja kasvatettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. FAK-estäjä PF-573228 (PF-228) ostettiin Tocris Bioscience (Bristol, UK) ja liuotetaan DMSO. Erlotinibi ja FAK-estäjä PF-562271 (PF-271) ostettiin Shanghai Biochempartner Co. Ltd (Shanghai, Kiina) ja liuotetaan DMSO

in vitro

soluviljelmässä työtä.

Generation erlotinibin resistenttien solujen

HCC4006 soluja, jotka olivat alun perin herkkä erlotinibille, tehtiin resistenttejä erlotinibille läpi 5 kierrosta annoksen suurentaminen alkaen 0,005 uM erlotinibin ja kasvava keskittyminen tekijällä 5, kunnes solujen resistenttejä 3 uM erlotinibin eristettiin. Vanhempien soluja käsiteltiin yhtä suuria määriä DMSO läpikäyvien solujen valinnan resistenssin ajaksi annoksen suurentaminen kokeilu, ja näitä käytettiin kontrolleina kaikissa myöhemmissä kokeissa.

plasmidi transfek- LKB1 A549-solujen

A549-solut transfektoitiin pcDNA3-FLAG-LKB1 (plasmidi 8590 [29], Addgene, Cambridge MA), yli-ilmentää LKB1 tai pcDNA3.1 kuten vektori hallinnan käyttämällä GeneJuice transfektioreagenssia (Novagen, Etobicoke, oN). Transfektoidut solut ympättiin useita kudosviljelymaljoihin ja 48 tunnin kuluttua, aktiivisesti jakautuvat solut käsiteltiin 500 ug /ml Geneticiniä (Invitrogen, Burlington, ON) helpottaa valintaa plasmidi-ilmentävien solujen. Solut kussakin kudosviljelymaljaa jäljellä valinnan jälkeen yhdistettiin luoda useita yhdistettyjen klooneja sekä LKB1 ilmentävien että ei-ilmentävien A549-solut. Vahvistus LKB1 ilmentymisen FLAG-LKB1 transfektoiduissa soluissa ja jatkoi puute LKB1 ilmentymisen kontrolli soluissa varmistettiin western blottauksella varten LKB1.

siRNA transfektion

H1299-soluja joko valetransfektoidut (PBS) tai transfektoitu siGENOME ei-kohdistuksen ohjaus siRNA # 2 tai siGENOME SMARTpool LKB1 siRNA (cat # M-005035-02, Dharmacon, Lafayette, CO), jossa Oligofectamine reagenssilla (Invitrogen, Burlington, ON). Tehokkuutta LKB1 Knockdown varmistettiin western blottauksella. MTT hyödyntäviä määrityksiä siRNA-transfektoiduissa soluissa, lääkehoitoa aloitetaan 48 tuntia transfektion. Kokeissa, joissa stimulaatio solujen EGR Western blotting, siRNA-transfektoidut solut seerumia yli yön alussa 48 tuntia transfektion ennen kasvutekijä stimulaatiota.

MTT solunelinkykyisyysmääritys

Soluja ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 4000 solua /kuoppa ja inkuboitiin yön yli. Annoksen nostaminen ja lääkeyhdistelmää kokeissa soluja käsiteltiin joko erlotinibi tai PF-228 yksinään tai yhdessä eri lääkepitoisuuksia DMEM tai RPMI-1640 täydennetty 5% FBS 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin sitten MTT-reagenssia (tiatsolyyli blue liumbromidi, Sigma, Oakville, ON), kuten aiemmin on kuvattu [30], jossa absorbanssi määritetään aallonpituudella 570 nm, jossa on Multiskan Ascent levylukijalla (Thermo Scientific, Rockford, IL). Hoidot tehtiin rinnakkaisnäytteet kuusi keskiarvot ilmaistuna prosenttia elinkelpoisuus suhteessa DMSO hoidettuun kontrolliryhmään (100% elinkelpoisia). Luonne vaikutuksesta erlotinibin yhdessä FAK-estäjä PF-228 määritettiin Chou-Talalay menetelmä [31] avulla CalcuSyn- ohjelmistoa (Biosoft, Cambridge, UK). Tiedot solujen elinkelpoisuuden mitattuna MTT kullekin lääkkeelle yksinään ja yhdistelmänä käytettiin CalcuSyn ohjelma tuottaa murto-vaikutti CI (Fa-CI) tontteja osoittaa yhdistelmän indeksi (CI) arvot kullekin lääkeyhdistelmä. Cl-arvot 1 osoittavat synergistisiä vuorovaikutuksia, CI-arvot 1 osoittavat antagonistista vuorovaikutusta ja Cl-arvot = 1 osoittavat lisäaineen vuorovaikutuksia.

FAK immunosaostuksella ja in vitro kinaasimääritys

immunosaostus ja kinaasi-reaktiot suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Lyhyesti, yhtä suuret määrät kokosolulysaattia (600 ug) immunosaostettiin ja FAK anti-FAK-vasta-ainetta (BD Bioscience, Mississauga, ON) ja 20 ui Protein A /G Sepharose-helmiä (GE Healthcare, Uppala, Ruotsi), kun taas pyörii 2 tuntia 4 ° C: ssa. Helmet pestiin sitten 3 kertaa 200 mM NETN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0, 200 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630), jota seuraa yksi pesu kinaasipuskurissa (0,25 mM NAvó

3, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM NaF, 10 mM β-glyserofosfaatti, 1 mM ditiotreitoli, 15 mM MgCl

2). DMSO: ta (vehikkelikontrolli) tai FAK-estäjä PF-228 1 tai 5 uM pitoisuuksina lisättiin sitten reaktio 20 ul: ssa kinaasipuskuria ja inkuboitiin 20 minuutin ajan 30 ° C: ssa. Kinaasimääritys aloitettiin sitten 1 ui [

32P] γATP (5 uCi /ul) ja inkuboitiin 30 minuuttia 30 ° C: ssa sekoittaen 10 minuutin välein. Reaktio lopetettiin lisäyksen jälkeen 4X SDS-näytepuskuria. Näytteet erotettiin 7,5% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Kalvo altistettiin autoradiografialle kehittämiseen FAK fosforylaation tapahtumia ja koestettiin yhteensä FAK tasot Western blot -menetelmällä, kuten on kuvattu alla.

Virtaussytometria

Soluja käsiteltiin liuottimella ohjaus (DMSO), erlotinibi PF-228, tai molemmat erlotinibi ja PF-228 väliaineessa, joka sisälsi 5% FBS: ää 48 tunnin ajan. Sekä tarttumattomat ja tarttuneet solut kerättiin ja yhdistettiin, pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 70% etanolissa läpäiseväksi. Solususpensiot käsiteltiin sitten propidiumjodidiliuoksella (48 ug /ml propidiumjodidilla, 40 ug /ml RNaasi A: ta) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Yhteensä 1 x 10

4 solut arvioitiin käyttämällä Beckman Coulter Epics XL virtaussytometrillä (Beckman-Coulter, Mississauga, ON) ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin solujen alle 2 N DNA sisältöä käyttämällä FCS Express virtausta cytometry analyysin ohjelmisto (De Novo Software, Los Angeles, CA).

Western blot-analyysi

jälkeen yhteensä proteiiniuutto, western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [30]. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: kanin anti-Akt (Cat. # 9272), Pakt (S473, Cat. # 9271), LKB1 (Cat. # D60C5) ja PARP (Cat. # 9542) vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology (Danvers, MA), hiiren anti-FAK (klooni 77 /FAK) oli BD Transduction Laboratories (Mississauga, oN), ja hiiren anti-β-aktiini vasta-aineella (klooni AC-74) oli Sigmalta (St. Louis , MO). Inkuboinnin jälkeen primaarisessa vasta-aineella yön yli, kalvot pestiin 3 x 5 minuuttia ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua vuohen anti-hiiri tai vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta (Calbiochem, San Diego, CA) 1 tunnin ajan. Sitten membraanit pestiin 6 x 5 minuuttia ja inkuboitiin Immobilon Länsi Kemiluminesenssiin HRP Substrate (EMD Millipore, Billerica, MA) ennen kuvan kehittämiseen käyttämällä GeneGnome Bio Imaging System ja GeneSnap ohjelmisto (Syngene-, Frederick, MD).

Colony kasvun määrityksessä

Lab-Tek II 4-kuoppaisen kammion kalvot (Nalge Nunc International, Naperville, IL) päällystettiin 100 ul: lla vähentää kasvutekijän tyvikalvon uute (BME; Trevigen, Gaithersburg, MD), joka kiinteytyi 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Sitten solut ympättiin jähmettynyt BME kerroksen tiheydellä 5000 solua /kuoppa väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 2,5% BME. Väliaine päivittyy joka kolmas päivä. Cell pesäkkeen koot määritettiin ImageJ ohjelmiston yhteensä 4 kuvaa kunkin kahden rinnakkaisen kuopan kutakin koetta.

In vivo kasvaimen kasvua

A549 keuhkosyövän soluja (1 x 10

6 solua) injektoitiin subkutaanisesti sekä vasemman ja oikean takajalan kyljet 6 viikon ikäisiä CD-1 nude-hiirissä (Charles River, Wilmington, MA). Hiiriä pidettiin erityisiä taudinaiheuttajista vapaa olosuhteissa, 12 tunnin valo /pimeä sykli alfalaktalbumiini ja vettä kokeen ajan. Kolme päivää injektion jälkeen hiiret (4 hiirtä /käsittely) käsiteltiin ensin suun kautta letkuruokinnalla ajoneuvon hallintaan tai aiemmin osoitettu tehokkaasti pitoisuuksia erlotinibin (50 ug /g) [33], PF-271 (50 ug /g), [ ,,,0],23], tai molempia lääkkeitä PBS: ssä 5% Gelucirea (ajoneuvon kontrolli). Drugs Sitten tapahtui suun kautta päivittäin viiden peräkkäisen päivän ajan ja sen jälkeen kaksi päivää ilman hoitoa, ja prosessi toistetaan sitten kokeen keston ajan. Mittaukset kasvaimen koon otettiin kerran viikossa mittaamalla tulkilla ja tuumorin tilavuus laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tuumorin tilavuus = (leveys)

2 x (pituus) /2. Kaikki eläinkokeet suoritettiin ja hyväksynyt Ottawan yliopisto Animal Care komitean ja sopeutui suuntaviivojen mukaisesti

Eläimet tutkimuslaki

ja Kanadan neuvoston Animal Care n

Opas hoito ja käyttö kokeellinen Eläimet

(Vol. 1, 2. painos., 1993), ja standardien käytännön tieteenalojen laboratorioeläinten tieteen ja koe eläinlääketieteessä. Kuten kohti hyväksytty protokolla, eläimet lopetettiin hiilidioksidilla tukehduttamalla seurasi niskanmurrolla ennalta määrätty kokeellinen päätepisteet lukien) kasvain massa siihen pisteeseen, jossa se merkittävästi häiritsee kehon normaalin toiminnan tai aiheuttaa kipua, b) johdonmukainen tai nopea laihtuminen yli 20% kehon painosta c) haavaumia /infektio tuumoripaikkaan (rikkoutuminen ihon este), e) Tuumorirasitusta 10% hiiren ruumiinpaino g) Vaikea hengitysvaikeudet tai h) avohoidossa hätä jostain syystä.

Ex vivo keuhkojen kasvain analyysi

Kirurgisesti toistoleikattiin NSCLC kasvaimia ja normaalin viereisen keuhkokudoksessa kerättiin sen jälkeen kun patologinen arvioinnin viideltä potilaalta, jotka toimitti kirjallisen tietoisen suostumuksen kohti protokollan hyväksynyt Ottawa Hospital Research Ethics Board ( Protocol # 20120559-01H). Potilaiden ominaisuudet on kuvattu taulukossa 1. Kudos prosessoitiin samana päivänä käytettäväksi

ex vivo

kokeiluja. Biopsian (Miltex GmbH, Rietheim-Weilheim, Saksa) käytettiin, jolloin saatiin 2 mm: n ytimet sekä keuhkojen kasvainkudoksen ja normaalin keuhkokudoksen ja edelleen leikattiin 1 mm: n paksuisiksi viipaleiksi, jossa on kolme viipaletta sitten satunnaisesti jaettu kolmeen rinnakkaiseen kuoppaan 24 kuoppaiset kudosviljelymalja. Kudosleikkeitä pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 100 U /ml antibioottia /antimykoottiliuoksella (Gibco, Waltham, MA) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Koska jokainen kudos siivu ei välttämättä ole identtisiä sen solutiheyden tai elinkelpoisuutta aikaan eristyksen, seuraavana päivänä eristäminen, elinkelpoisuus kudos viipaleet arvioitiin kohti hyvin pohjalta ennen lääkkeen lisäksi inkuboinnin jälkeen 4 tuntia 10 % alamarBlue liuosta (ABD Serotec, Raleigh, NC). Post lääkehoito lukemat olivat sitten normalisoidaan näiden perustason lukemat elinkelpoisuuden jokaiselle hyvin. Tissue viipaleita käsiteltiin seuraavana päivänä eristäminen joko ajoneuvon ohjaus (DMSO), erlotinibi (10 uM), PF-271 (5 uM), tai molempia lääkkeitä 48 tuntia ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin sitten 10% alamarBlue ratkaisu . Fluoresenssi mitattiin (eksitaatio 530 nm /emissio 590 nm) Fluoroskan Ascent fluoresenssilevylukijaa (Thermo Scientific, Rockford, IL) 4 tuntia lisäämisen alamarBlue.

Tilastolliset analyysit

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Prism 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA). Useat vertailut suoritettiin ANOVA taas yhdellä vertailuja suoritettiin parittomia Studentin

t

testejä. Tilastollisesti merkittäviä eroja määritettiin

P

0.05 alkaen vähintään kaksi itsenäisesti suorittaa kokeita.

Tulokset

esto FAK vähentää solujen elinkelpoisuutta EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC-solujen

Jotta voidaan arvioida tehokkuutta hoidettaessa EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solulinjoissa FAK TKI, käytimme kahta EGFR villityypin solulinjoilla (A549, H1299), joilla on tunnettu sieto EGFR TKI [34], samoin kuin EGFR mutantti solulinja H1975, jossa hankittu EGFR TKI vastus koska T790M mutaation EGFR-geenin [35]. Nämä kolme solulinjat täten antanut meille kohtuullisen esimerkkejä testata tehokkuutta lisäämällä FAK tyrosiinikinaasiestäjä erlotinibille käsittelyn avulla voimakkaammin estää kasvun EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC soluissa.

testattiin ensin FAK-estäjä PF-228 [36] ja arvioi sen kyky annoksesta riippuen (0,001-25 uM) estää kasvun NSCLC solulinjojen

in vitro

. Solujen käsittely nousevia annoksia PF-228 osoitti, että kaikki kolme EGFR-TKI-resistenttejä solulinjoja (A549, H1299, H1975) olivat herkkiä tämän lääkkeen pitoisuus on yli 1 uM (kuvio 1A). IC 50-arvot PF-228 määritetään kuvaajan olivat: 5,6 uM (R

2 = 0,92) A549, 6,6 uM (R

2 = 0,95) in H1299 ja 10,4 uM (R

2 = 0.80 ) in H1975. Mielenkiintoista, elinkelpoisuus kaksi EGFR-TKI-herkkiä solulinjoissa (HCC827, HCC4006) [34] oli huomattavasti suurempi (~ 75% soluista Elinkykyisyyden kontrolliin verrattuna käsitelty) kuin EGFR-TKI-resistenttejä solulinjoja (~ 10% soluista jäljellä elinkelpoinen kontrolliin verrattuna käsitelty) korkeimmalla annoksella PF-228 testattu (25 uM) (kuvio 1A), vaikka syynä tähän eron elinkelpoisuutta ei ole vielä ymmärretty. Koska kaksi solulinjaa joka oli luontainen vastustuskyky erlotinibille ja olivat molemmat EGFR villityypin näyttivät olevan herkempiä FAK-estäjä kuin H1975-solut, jotka oli EGFR mutaatioita saavutettuihin herkkyyden, tutkimme onko solut perin herkkä erlotinibille tuli myös herkempiä Fak kun saamassa hankitun lääkeresistenssin. HCC4006 solut jotka oli sulatettu resistenttejä erlotinibille seuraava järjestysnumero johtamisella kasvavien pitoisuuksien erlotinibin jopa 3 uM, johti solukloonien huomattavasti vähemmän herkkyyttä erlotinibille kanssa IC50 1,3 uM (R

2 = 0,87) ja 16,8 uM (R

2 = 0,73) ja resistentit kloonit 1 ja 2 verrattuna kontrollisoluihin, jotka on sarjaan siirrostettiin yhtä suuret määrät DMSO-kontrollin, jonka IC50 on 0,21 uM (R

2 = 0,91) (kuvio 1B). On huomattava, että molemmat näistä klooneista osoitti erlotinibin resistanssi samanlaisia ​​tai korkeampia kuin resistenttien vanhempien valittujen linjojen (jossa IC50-arvot vaihtelevat 1.2μM, 5.3μM ja 5.9μM A549, H1299 ja H1975 vastaavasti). Erlotinibin resistenttejä HCC4006 solut osoittivat lisääntynyt herkkyys Fak estäjien kanssa IC50-arvot 8,0 pM (R

2 = 0,96) ja 8,7 uM (R

2 = 0,95) ja kloonien 1 ja 2 verrattuna kontrolliin HCC4006 klooni IC50 12,3 uM (R

2 = 0,90) (kuvio 1 C). Vaikka erlotinibin resistenttien solun klooneja saatiin näyttöä lisääntynyt herkkyys Fak estäjiä, ne pysyivät vähemmän herkkiä PF-228 verrattuna EGFR villityypin luonnostaan ​​erlotinibi kestävät A549 tai H1299 soluja. Näin ollen on epätodennäköistä, että tärkein mekanismi hankittu resistenssi erlotinibille EGFR mutantti NSCLC riippuu merkittävästi FAK toimintaa.

(A) Solujen elinkelpoisuus arvioitiin hoidon jälkeen PF-228 vaihtelevilla annoksilla 48 tuntia täydellisessä mediaa 5% FBS. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä, jossa elinkelpoisuutta DMSO-käsiteltyjä soluja asetetaan 100%. Tiedot osoittavat, keskiarvo ± SEM log [estäjä] vs. normalisoitu vastausta kahden itsenäisesti suorittaa kokeita. (B) HCC4006 soluja sarjaan kasvatetaan kasvavien pitoisuuksien erlotinibin jopa 3 uM vahvistettiin resistenttejä verrattuna emo-soluissa MTT-määritystä soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla erlotinibin. Data esitetään graafisesti keskimääräinen log [inhibiittori] vs. normalisoitu vaste ± SEM (N = 2). (C) erlotinibi resistenttejä HCC4006 solut ovat herkempiä FAK-estäjä PF-228 kuin vanhempien HCC4006 soluja. Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla PF-228 ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Tiedot esitetään keskiarvona log [inhibiittori] vs. normalisoitu vaste ± SEM (N = 2). (D) Suhteellinen proteiinin ilmentymisen välillä erlotinibi resistenttejä (A549, H1299, H1975) ja herkkä (HCC827, HCC4006) vanhempien solulinjat. (E) A549 solulysaatit immunosaostettiin endogeenisen FAK ja altistettiin

in vitro

kinaasimäärityk- läsnä joko DMSO (ajoneuvon kontrolli) tai PF-228 (1 uM tai 5 uM). Autoradiografia paljasti FAK fosforylaatiota (FAK AUTORAD) ja Western blotting osoitti yhteensä tasoja FAK (IB: FAK).

arvioidaan myös, onko herkkyys Fak estäjien havaittiin vanhempien NSCLC solulinjoissa liittyi perusekspression merkittävistä proteiineista näissä huumeiden tavoite reittejä. Herkkyys FAK lääke ei näytä korreloivan yleiseen tasoon FAK, EGFR tai β1-integriinin proteiineja, koska nämä tasot ilmestyi muuttuja sekä herkkä ja tunteettomia solulinjoissa (kuvio 1 D). Ottaen huomioon, että kolme EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solulinjoissa oli IC50-arvot PF-228 vaihtelee 5-10 uM, ja että lab aiemmin havaittu inhibitio autofosforylaation sekä kinaasiaktiivisuuden FAK 5 uM PF-228 [20] varmistimme toimintaa tämän inhibiittorin A549-soluissa

in vitro

kinaasi määrityksissä FAK autofosforylaatio. Lisäämällä PF-228 kinaasireaktion inhiboi merkittävästi FAK autofosforyloituvan A549-soluja (kuvio 1 E), joilla on samanlaiset tulokset on havaittu H1299 ja H1975 solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Siten myöhemmät kokeet suoritettiin käyttäen pitoisuuksia PF-228 välillä 1-10 uM.

FAK-estäjä PF-228 synergiassa erlotinibin tehokkaammin vähentää solujen elävyys EGFR villityypin NSCLC-solujen

Koska hoidon FAK TKI yksin näytti estävän elinkelpoisuutta EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC-solut testattiin kuvassa 1, halusimme seuraavaksi onko lisäämällä PF-228 voi herkistää soluja erlotinibille, tai ainakin , aiheuttaa additiivisen väheneminen solujen elinkelpoisuuden edellä ja pidemmälle hoidon erlotinibin yksin. Soluja näin käsitelty erlotinibin (1-25 uM) tai PF-228 (1-10 uM) yksin ja yhdistelmänä ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT aktiivisuutta. Kaikki kolme testatuista solulinjoista esillä vastustuskyky erlotinibille hoito yksinään edes suurilla pitoisuuksilla (25 uM, kuvio 2A) tulosten vahvistamiseksi aiempien tutkimusten suhteen EGFR-TKI vastus sekä EGFR villityypin ja T790M mutaation sisältäviä solulinjoja [34, 35,37-39]. Kun erlotinibin ja PF-228 käytettiin yhdistelmänä havaitsimme lisääntynyt sytotoksinen vaikutus A549, H1299 ja H1975 soluja kuin olimme arveltu (kuvio 2A). Chou-Talalay menetelmää käytettiin luonteen määrittämiseksi lääkeyhdistelmän vaikutus [31]. Yhdistelmä-indeksi (CI) määritettiin läpi piirtämällä osa vaikuta se, CI-arvot olivat alle 1 pidetään synergistisiä, CI-arvot ovat yli 1 pidetään vastakkaisia, ja CI-arvot yhtä 1 pidetään lisäainetta. Yhdistelmä erlotinibin ja PF-228 mikä vähentää solujen elinkykyisyys havaittiin olevan synergistinen kaikissa kolmessa testatuissa solulinjoissa (kuvio 2B). Toissijaisesti järjestelmä käytimme käyttää ihmisen keuhkosyövän potilaalle kasvain eksplanttien edelleen testata tehokkuutta FAK TKI keuhkojen syöpäsoluja. Kasvain eksplanttien alkaen valitsematta potilailla, joille thoracotomy alkuvaiheen keuhkosyövässä hoidettiin

in vitro

erlotinibin tai FAK TKI yksin tai yhdistelmänä. Hoito kudosviljellyn keuhkojen kasvain erlotinibin yksinään osoitti vaatimaton mutta ei tilastollisesti merkittävä lasku solujen elinkelpoisuuden (kuvio 2C, vasen paneeli). Samanlaisia ​​vaatimaton vähennyksiä solujen elävyyden havaittiin myös viereisten normaaleissa keuhkojen kudoksiin seuraavat erlotinibi hoito yksinään (kuvio 2C, oikea paneeli). Havaitsimme, että potilas keuhkosyövässä olivat myös herkkiä FAK TKI esto kehityssuuntauksena tehokkaampi estäminen, kun sitä käytetään yhdessä erlotinibin (kuvio 2C). Huolimatta pienen otoksen koosta ja vaihtelu liittyy testaus heterogeenisissä kudoksissa (eli eri suhde kasvaimen strooman saattaa esiintyä kunkin potilaan näytteessä), olimme rohkaisi ilmeinen etu lääkeyhdistelmän yli erlotinibin hoito yksinään, samanlainen kuin mitä havaitsimme meidän solulinjakokeissa. Ylimääräisten tärkeää, vieressä normaali keuhkojen kudosta näytti olevan vaikuta FAK TKI hoitoja yksin tai yhdessä erlotinibin (kuvio 2C), mikä viittaa mahdollisen selektiivinen esto NSCLC kasvaimia.

(A) Soluja käsiteltiin PF -228 ja erlotinibin 48 tuntia ja määritettiin solujen elinkelpoisuus käyttäen MTT-määritystä. Data osoittaa, että keskiarvo ± SEM solujen elinkelpoisuuden esitetty prosentteina kontrollista DMSO-käsiteltyjen solujen (100% elinkelpoisia) kahden itsenäisesti suorittaa kokeita. (B) jae vaikuttaa /Combination (CI) tontteja osoittaa synergistisen sytotoksisuutta erlotinibin ja PF-228. CI 1 pidetään synergistisiä, CI 1 pidetään vastakkaisia, ja CI = 1 pidetään lisäainetta. (C) FAK esto vähentää solujen elinkelpoisuutta ihmisen keuhkojen kasvainkudoksessa mutta ei normaalissa keuhkokudoksessa

ex vivo

. Kudokset viideltä valitsematta potilasta hoidettiin 48 tuntia ajoneuvon ohjaus (DMSO), erlotinibi (10 uM), PF-271 (5 uM), tai yhdistelmä erlotinibin ja PF-271. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin sekä kasvainkudoksen ja normaalin kudoksen alamarBlue kolme syvennystä per ehto kukin kuoppa sisältää kolme 2 mm x 1 mm kudosta kappaletta. Fluoresenssi oli normalisoitu perustasolle Fluoresenssilukemia kullekin hyvin otettu ennen lääkehoitoa. Kokeilut suoritettiin itsenäisesti kullekin potilaalle näytteestä fluoresenssikeskiarvo on kullekin kunnossa kuin vaakasuora viiva ja tilastollisesti merkitseviä eroja määritettiin ANOVA ja merkitään

P

arvojen yläpuolella vertailussa.

sen määrittämiseksi, jos havaitun vähentää solujen elinkelpoisuuden korreloi tehostettuun apoptoosin käsitellyissä soluissa, olemme analysoineet SubG1 solujen populaation hoidon jälkeen joko erlotinibi tai PF-228 yksinään tai yhdessä käyttämällä propidiumjodidivärjäys DNA-pitoisuus ja virtaussytometria analyysi. A549-soluja, yhdistelmähoitoa erlotinibin ja PF-228 (5 uM hoito) tilastollisesti merkittävää kasvua SubG1 solujen populaation kontrolliin verrattuna (~ 6-kertainen), lisäksi on merkittävässä kasvu prosenttiosuus SubG1 solujen verrattuna sekä erlotinibi hoito yksinään (

P

0,001) ja PF-228 hoito yksinään (

P

0,001) (kuvio 3A).