Krooninen sairaus

tiivistelmä

stroomakasvaimet-epiteelin vuorovaikutus on osoitettu edistää paikallista kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Olemme pyrkineet luomaan lupaavan geeniterapian lähestymistapa, yhteistyön tavoitteet syövän ja sen tukeminen stroomasolujen torjumiseksi kastraatio kestävä eturauhasen kasvaimia. Tässä osoitimme, että ihmisen osteonektiini yliekspressoituu eturauhasen syöpä epiteelin ja kasvaimen strooman verrattuna normaalin vastine. Suunnittelimme ihmisen uuden osteonektiini promoottori (hon-522E), joka sisältää myönteisiä transkription säätelyelementtejä tunnistettu sekä promoottori ja eksoni 1 alue ihmisen osteonektiini geenin.

In vitro

toimittaja määritykset paljastivat, että HON-522E-promoottori on erittäin aktiivinen androgeenireseptorin negatiivisia ja metastaattisen eturauhassyövän ja luun stroomasolujen verrattuna androgeenireseptorin-positiivisten syöpäsolujen. Lisäksi

in vivo

eturauhasen kasvainten edistävää aktiivisuutta HON-522E-promoottori vahvistettiin laskimoon adenovirusvektori, joka sisältää HON-522E promoottoriajetun lusiferaasi-geeni (Ad-522E-Luc) hiiriin laakeri potilaalle tehdä ihmisen eturauhasen tuumoriksenografteja. Lisäksi adenovirusvektori kanssa HON-522E-promoottori-driven herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasigeeni (Ad-522E-TK) oli erittäin tehokas kasvua vastaan ​​androgeenista riippumaton ihmisen eturauhassyövän PC3M ja luun stroomasolulinja

in vitro

ja ennalta laadittujen PC3M kasvaimet

in vivo

lisättäessä aihiolääkkeen gansikloviiri. Koska heterogeenisuus ihmisen eturauhasen kasvaimia, HON-522E promoottori välittämä geeniterapia on potentiaalia hoitoon hormoniresistentti ja luun metastasoituneen eturauhasen syöpiä.

Citation: Sung SY, Chang JL, Chen KC, Yeh SD, Liu YR, Su YH, et ai. (2016) Co-kohdistaminen Eturauhassyöpä epiteelin ja Bone Stroma Human osteonektiini-promoottori välittämä Suicide Gene Therapy estää tehokkaasti androgeenin Independent Eturauhassyöpä Growth. PLoS ONE 11 (4): e0153350. doi: 10,1371 /journal.pone.0153350

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 03 helmikuu 2016; Hyväksytty: 28 maaliskuu 2016; Julkaistu 7 huhtikuuta 2016

Copyright: © 2016 Sung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain Grant MOST 103-2320-B-038-040-MY3 (CLH) ja 103-2320-B-038 -039-MY3 (SYS) ministeriön Science and Technology, MOHW105-TDU-B-212-134001 (SYS) valtiovarainministeriöstä terveyttä ja hyvinvointia, ja TMUTOP103003-6 (CLH), TMUTOP103003-3 (SYS) ja 104TMU-SHH-01-3 (YHS) Taipei Medical University, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat sekä Euroopassa ja Yhdysvalloissa [1]. Androgeenien puute hoitoa (ADT) pidetään keskeisenä hoitoon monoterapiana tai yhdessä muiden hoito. Useimmat potilaat aluksi vastata ADT; kuitenkin ominaisluonne heterogeenisyys kasvainsolujen aiheuttaa vastustuskykyä hoitoon ja eteneminen erittäin sairaalloinen sairaus kutsutaan kastraatio vastustuskykyisiä eturauhassyöpä (CRPC) kuluessa 18-24 kuukautta [2]. Loppuvaiheen CRPC liittyy yleisesti luinen etäpesäkkeitä, joka aiheuttaa merkittävää kuolleisuutta ja sairastuvuutta kanssa Vaikeiden luustokomplikaatioita sairastavilla potilailla. Viimeaikaiset kliiniset lähestymistapoja käyttäen aineita, jotka kohdistuvat erillisiä toimintamekanismi, myös tubuliinia sitovan kemoterapiaa (kabatsitakseli); immunoterapia (sipuleucel-T); CYP-17 esto (abirateronin); androgeenireseptorin (AR) saarto (enzalutamide); ja radioisotooppi hoito (radium-223), vaikka ovat osoittaneet lupaavia tuloksia viivyttää luustokomplikaatioita ja myös parantaa yleistä eloonjäämistä [3], hallintaa metastasoituneen CRPC edelleen haaste, jolla on keskimääräinen elinaika on alle 19 kuukautta [4] . Siten uusien aineiden tehokkaammilla antituumorivaikutus on ratkaisevan tärkeää hoitoon metastaattisen CRPC. Erityisesti lääkkeitä tarvitaan, että kohde hormoni tulenkestävät syöpäsolujen riippumatta erilaistumisen valtion, jossa eri tasoilla androgeenireseptorin (AR) ja eturauhasen antigeenin (PSA) lauseke.

Past geneettiset ja molekyylitason tutkimukset pidetään että kasvainsolut ovat heterogeenisiä ja niiden myöhempää etäpesäkkeet ovat tulokset ei-satunnainen, juokseva ja monivaiheisia selektiivinen prosessien joukossa preexisting solupopulaatioiden. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat todistaneet monimutkainen solujen välinen viestintä strooman ja syövän epiteelisolujen johtaa pysyvään geneettisiä muutoksia käytöksessä ja ei ainoastaan ​​epiteelisoluissa, mutta myös syöpään liittyvä stroomasolujen, joka ajaa geneettisiä ja geeniekspression muutokset eturauhassyövän soluissa [ ,,,0],5, 6]. Läpi useita monimutkaisia, intiimi kaksisuuntaisen viestinnän välillä eturauhassyöpä ja isäntä strooman, syöpäsolut saada lisää kasvua ja selviytymistä etuja ja lopulta levittää kaukaisiin elimiin tappavilla vaikutus [7-9]. Siten co-kohdistaminen sekä kasvaimen ja sen tukeminen stroomasolujen voi parantaa terapeuttisen vaikutuksen ja eloonjäämisaste potilaiden eturauhassyövän [10-13]. Koska geeniterapia on tunnistettu ensisijaiseksi hoitoon yhdistettynä metastasoituneen syöpien [14], kehittää tehokas strategia toimituksen ja ilmentymistä terapeuttisten geenien kasvain epiteelin ja viereisen strooman on tärkeää tällaisten hoitoa.

osteonektiini (tunnetaan myös tyvikalvon-40 [BM-40] ja erittyvän proteiinin hapan runsaasti kysteiiniä [SPARC]) on laajalti useissa kudoksissa kehityksen aikana ja solujen vahinko [15] ja on tärkeä rooli säätelyssä soluadheesion lisääntymisen, migraation ja kudoksen uudelleen [16]. Luun mikroympäristössä, osteonektiini on yleisin ei-kollaasi matriisin proteiini, joka ilmentyy voimakkaasti aikaisin osteoblastien erilaistumista ja on kriittinen ylläpitämiseksi luumassan [17]. Rooli osteonektiini eturauhasen syöpä on todettu kemoattraktantti luu-invasiivisen eturauhassyövän solut [18-20]. Korkeita osteonektiini ilmentymisen on havaittu eturauhassyövän solulinjoissa, jotka ovat peräisin etäpesäkkeitä ja eturauhassyövän metastaasipesäkkeiden [21]. Lisäksi kohonnut osteonektiini tasoilla ensisijainen eturauhassyövän liittyi myöhemmän kehityksen etäpesäkkeiden [22], mikä osoittaa, että eturauhasen syöpäsolumetastaasi luuhun välittyy osittain osteonektiini välittämä edistäminen syöpäsolun maahanmuuton proteaasiaktiivisuutta, ja invaasio. Koska osteonektiini ilmaus esiintyy sekä kasvaimen epiteelisoluissa ja luun solujen osteonektiini promoottori voitaisiin käyttää ajamaan terapeuttinen geeni yhteistyössä kohdistaminen luun metastaattisen eturauhassyövän ja sen tukeminen microenvironment riippumatta perustason AR ja PSA ilmaisua.

tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet luomaan promoottori välittämä terapeuttinen aine, joka yhteistyössä tavoitteet eturauhassyövän ja sen ympärillä stroomasoluissa. Huomasimme, että osteonektiini oli yläreguloituja eturauhassyövän epiteelisoluissa ja syöpään liittyvän stromasoluja verrattuna normaalin kollegansa. Suunnittelimme uudenlaisen hon promoottori (hon-522E), joka sisältää myönteisiä transkription säätelyelementtejä tunnistettu sekä promoottori ja eksoni 1 alue Hon geenin. Olemme myös rakentaneet replikaatiopuutteel- adenovirusvektori varustettujen herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSV-TK) geenin, jota erittäin aktiivinen 580 emäsparin hon promoottori (hon-522E). Hoito Tässä rakenteessa Ad-522E-TK, yhdessä aihiolääke gansikloviirin (GCV) havaittiin ensimmäisen kerran tappaa molemmat androgeenista riippumaton eturauhassyöpä ja luun stroomasolulinja linjat

in vitro

ja estävän eturauhasen kasvaimen kasvua käytettäessä ksenograftimallissa. Koska heterogeenisuus ihmisen eturauhasen kasvaimia, Ad-522E-TK voidaan soveltaa lisähoitona muiden AR-kohdistaminen menettelytavat hoitoon hormoniresistentti ja luun metastasoituneen eturauhasen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja soluviljelmä

ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP, C4-2, C4-2B, PC3, DU145 ja PC3M, ja ihmisen luusarkoomasolulinja MG63, joita on käytetty edellisessä tutkimuksissa [6, 23, 24], pidettiin T väliaineessa ja jota oli täydennetty 5% vasikan sikiön seerumia (FBS). hFOB 1,19 ihmisen osteoblasti ja HS27A ihmisen luuydinstroomalla solulinjat hankittiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA) ja pidettiin 1: 1-seoksella Ham F12 Medium /Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine tai RPMI 1640-väliaine, vastaavasti, 10% FBS: ää. Adenoviruksen pakkaus 293-solulinja (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada) ylläpidettiin Minimal Eaglen Medium ja täydennetty 10% FBS: ää ja 2 mM glutamiinia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kaikki Soluviljelyväliaineet ja reagenssit hankittiin Invitrogen. Kaikki solut viljeltiin 37 ° C inkubaattorissa 5% CO

2 ja siirrostettiin saavuttaessaan 90% konfluenssiin.

Ihmisen aihe ja Laser capture mikrodissektion (LCM) B

Kokeilut ihmisen näytteet tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional Review board (IRB) Taipei Medical University (TMU-JIRB 20131253). Eturauhasen kudosta mikrosiru (TMA), joka sisältää 49 kudoksen ytimet edustavat näytteet 40 tapausta eturauhassyövän ja 9 vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten saatiin Super Bio Chips (CA4, Seoul, Korea). Jäädytetyt ihmisen eturauhasen kudosnäytteitä saatiin TMU yhteisen Biopankkiverkosto perustuu Taipei Medical University ja sidoksissa sairaaloita aiheista kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. LCM käytettiin eristämään valikoivasti puhtaan populaatiot eturauhassyöpäsolujen ja ei-neoplastisten epiteelisolujen sekä strooman vieressä Gleason asteen 3 ja 4 rauhaset ja strooman vieressä hyvänlaatuisen rauhaset jäädytetystä osien eturauhasen yksilöitä peräisin neljästä potilaiden . Lyhyesti, kahdeksan mikronin paksuisia leikkeitä jäädytetyn kudoksen värjättiin käyttäen Arcturus HistoGene Frozen jakso Värjäys Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alueet valitun solun populaatiot microdissected leikkauksista ja kerättyjen tietojen avulla ArcturusXT järjestelmää ja CapSure HS LCM Caps. Asetukset Laserin olivat seuraavat: spot halkaisija asetetaan 30 pm, teho 70 mW, ja pulssin kesto 25 millisekuntia. Kokonais-RNA kustakin mikropaloitelluista näytteestä uutettiin käyttäen PicoPure RNA: n eristäminen Kit jälkeen, valmistajan ohjeiden mukaisesti. LCM väline ja kaikki reagenssit käytettiin kokeessa saatiin Thermo Fisher Scientific Inc. (Madison, WI, USA).

Reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Ensimmäisen säikeen maksuton DNA syntetisoitiin käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja Moloneyn käänteiskopioijaentsyymin (Invitrogen) ja alistettiin reaaliaikaisen PCR käyttäen LightCycler 480 kanssa Light Cycler TaqMan Master Kit yhdistää Universal ProbeLibrary koetin (Roche) mukaan valmistaja ohjeita. Kohdegeenien monistettiin käyttämällä spesifisiä alukkeita Hon (eteenpäin: 5′-GTGCAGAGGAAACCGAAGAG-3 ’ja reverse: 5′-TGTTTGCAGTGGTGGTTCTG-3’, koetin ei. 77), ja taloudenhoito geeni, HSPCB (eteenpäin: 5’AGCCTACGTTGCTCACTATTACG-3 ’ja reverse: 5’GAAAGGCAAAAGTCTCCACCT-3’, koetin ei. 55). Suhteellinen geeniekspressiota osteonektiini solulinjoissa on edustettuna 2

-ΔCT, jossa ACt määritetään vähentämällä keskimääräinen taloudenhoito geeni HSPCB kynnyssyklistä keskimääräisestä kohdegeenin arvo.

plasmidikonstruktion

Kaikki promoottorikonstrukteja luotiin käyttäen TOPO TA-kloonausvektoriin järjestelmä (Invitrogen) ja sen jälkeen pilkottiin käyttämällä tarkoituksenmukaisia ​​restriktiokohtia polylinkkerissä, jotta insertiota vektoriin pGL3-basic (Promega, Madison, WI, USA), joka sisälsi koodaavan alueen tulikärpäsen lusiferaasi-geeni. Kaikki promoottorikonstrukteja oli sama 5′-pää. Välike välillä GGA-kohtiin 1 ja 2 on poistettu yhdistelmä-PCR: llä käyttäen seuraavia alukesarjat: 522-N: (5’ACTAGTAGCAGCTTGTCTTGTC3 ’), spdel-C: (5’CTTCTCCCCTGTCTCTGTCTT3’), ja spdel-N: (5 ”AAGACAGAGACAGGGGAGAAG3 ’) yhdessä alavirran alukkeita: Intron-C: (5’TACCTCAGTGGCAGGCAGGCAG3’), eksoni-C: (5’CAGGCAGGCAGGCGGCAG ’), ja Hafner-C: (5’GCGCGCTCTCCGGGCAGTCTG3’) rakentaa hon-522I, rehelli- 522E ja HON-522H, vastaavasti. Genominen DNA eristettiin DU145-solujen malliin. Kaikki rakenteet, mukaan lukien PCR: llä tuotettu DNA-fragmentit varmistettiin sekvensoimalla.

DNA-transfektio ja lusiferaasianalyysissä

Solut kotransfektoitiin eri osteonektiini promoottorin lusiferaasireportteri- plasmidit ja pCMV-pGal (galaktosidaasi) on 5 : 1 moolisuhde käyttämällä lipofektamiini 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen). 48 tunnin kuluttua inkubaation solu-uutteet valmistettiin lusiferaasi ja β-gal-aktiivisuuden arviointi käyttäen Luciferase Assay System, ja β-galaktosidaasi-entsyymianalyysi System (Promega), vastaavasti, mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudeksi laskettiin tulikärpäsen lusiferaasi suhteellisen kevyt yksikköä (RLU) jaettuna vastaava arvo β-gal aktiivisuus kunkin näytteen. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena rinnakkaisena.

malli adenovirusvektorien

Ad-522E-TK ja Ad-522E-Luc adenovirusvektoreiden (tyyppi 5) on suunniteltu ja massatuotantona mukaisesti vakiintunutta protokollaa [25]. Lyhyesti, plasmidit p522E-TK ja p522E-Luc, joka sisältää hon-522E-promoottori ja herpes simplex -viruksen TK-geenin ja lusiferaasin geeniä, vastaavasti, rakennettiin insertoimalla ekspressiokasetti E1A poistetaan alueen Ad5 adenoviruksen sukkulavektori pΔ E1sp1B. Replikaatioinkompetentti viallinen rekombinantti Ad522E-TK adenovirus tuotettiin 293-soluissa transfektoimalla nämä solut sekä ilmaisun shuttle-plasmidi ja pyöreä Ad genomiin plasmidi (pJM17) käyttäen standardi kalsium- siumfosfaattisaostusmenetelmällä [26]; Ad-CMV-TK ja Ad-CMV-Luc rakennettiin samalla tavalla.

tymidiinikinaasiaktiivisuus määritys

TK toimintaa Ad-522E-TK- ja Ad-CMV-TK-infektoituneen solulinjojen määritettiin kautta fosforylaation [

3H] GCV [27]. Lyhyesti, supernatantti osa solujen raakauutteista sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden TK määrityspuskuriin, joka sisälsi 0,2 uCi [

3H] GCV (Moravek Biochemicals, CA, USA), 3 mM MgCI

2, 3 mM ATP: tä, 10 ug /ul naudan seerumialbumiinia, ja 50 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 6,5). Reaktioseos inkuboidaan 37 ° C: ssa 90 min, siirrettiin DE-81-levyjä (Whatman, Beaverton, OR, USA), kuivattiin ilmassa, ja pestiin perusteellisesti 50% etanolia. Fosforyloitua [

3H] GCV sitoutunut levyt määritettiin tuikelaskurilla (Beckman Coulter Inc., Schaumburg, IL, USA). Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena rinnakkaisena.

In vitro

-sytotoksisuusmäärityksiä

Solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

4 solut kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua solut infektoitiin Ad-522E-TK alueella 0-100 infektiokertoimella (MOI). Sen jälkeen, kun 2 tunnin adsorption, virus sisältävä väliaine korvattiin tuoreella väliaineella. 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa 10 ug /ml GCV varten 5 päivää ja sen jälkeen kristallivioletilla värjäys; sen jälkeen, solujen suhteellisen määrän arvioitiin optinen tiheys (OD) 590 nm: n värjäyksen jälkeen. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Animal tutkimus

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin ja noudattanut asetusten Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Taipei Medical University (Lac- 2013-0047). Kuusi viikkoa vanhoja koiraspuolisia kateenkorvattomia nude-hiirten BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl hiiret saatiin National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Eläimiä pidettiin normaaleissa patogeenivapaissa olosuhteissa ja hoidetaan mukaan esitetyt kriteerit National Academy of Sciences Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals. Analysointiin HON-522E promoottorin aktiivisuutta

in vivo

, 1 x 10

5 PC3M solut 10 pl PBS: ää injektoitiin ventraalinen prostates hiirillä. 5 vuorokauden kuluttua kasvainsolujen injektion, kasvain tai käsittelemätöntä hiirille annettiin laskimoon 1 x 10

9 pmy Ad-522E-Luc tai Ad-CMV-Luc kautta häntälaskimoon (n = 5). Hiiri elinten ja eturauhasen tuumoriksenografteissa kerättiin lusiferaasiaktiivisuuden määritys 2 päivää sen jälkeen viruksen injektion. Arvioimiseksi Ad-522E-TK yhdistettynä GCV-indusoitua kasvaimen kasvun inhibitiota

in vivo

, 5 x 10

5 PC3M solua 50 ui PBS: ää injektoitiin subkutaanisti kyljissä hiirillä. Kun kasvain tuli kouraantuntuva (3-4 mm halkaisijaltaan), eläimet jaettiin satunnaisesti 4 koeryhmään (n = 8 kullekin ryhmälle): ryhmä 1, PBS hoito; ryhmä 2, GCV vain; ryhmä 3, Ad-522E-TK yhdistettynä PBS; ja ryhmä 4, Ad-522E-TK yhdistettynä GCV. Ad-522E-TK (50 ui, 2 x 10

9 pfu) PBS: ssä ylläpitäjä läpi kasvaimeen injektio joka toinen päivä 3 kertaa. GCV (100 ui) annetaan päivittäin vatsaonteloon annoksena 40 mg /kg kehon paino 2 viikkoa. Kaksiulotteisesta kasvain mittaukset suoritettiin kahdesti viikossa jarrusatulat, ja tuumorin tilavuus laskettiin käyttäen yksinkertaistettu kaava pyörivän ellipsoidiin (L x w

2 x 0,5236). Eläimet tapettiin viisi viikkoa hoidon jälkeen käyttämällä CO

2 eutanasiaa, ja kasvaimet olivat innoissaan histopatologista tutkimusta.

immunohistokemia (IHC) B

IHC värjäys suoritettiin käyttäen Novolink Polymer Detection System (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne, UK) kuten aiemmin on kuvattu [28]. Ki-67-proteiinia ei havaittu tuumoriksenografteja hiiren anti-ihmis-Ki-67 monoklonaalista vasta-ainetta (1: 100, NCL-Ki67-MM1, Leica Biosystems). Apoptoosi arvioitiin käyttämällä Apo-BrdU-IHC in situ DNA Fragmentation Assay Kit (BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA), kuten on kuvattu [28]. IHC värjäys osteonektiini suoritettiin eturauhasen TMA käyttäen anti-ihmisen-osteonektiini monoklonaalinen vasta-aine (1:50, NCL-O-NECTIN, Leica Biosystems). Kukin TMA paikalla tutkittiin patologi (J.L.C.) käyttäen Allred pisteytystä [29]. Lukuarvo yleisen intensiteetti (intensiteetti pisteet) perustuu 4-pisteytysjärjestelmä: 0, 1, 2, ja 3 (ei mitään, kevyt, medium tai tumma värjäys). Numeerinen arvo prosenttia värjättyä (osuus pisteet) määritetään geometrinen jako; ei tahraa = 0; ≤1 /100 solua värjätään = 1; ≤1 /10 solut värjättiin = 2; ≤1 /3-solut värjätään = 3, ≤2 /3-solujen värjätty = 4; kaikki solut värjätään = 5. lisäys kahdesta arvosta saadaan vain Allred maalin [30].

Tilastollinen

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona (keskihajonta [SD]), ellei toisin määritetty. Analyysi suoritettiin käyttäen kahden tailed Studentin t-testiä. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

ilmentäminen osteonektiini eturauhassyövässä ja stroomasolujen

yhdistys osteonektiini ilmaisun ihmisen syövän etenemiseen oli aluksi arvioitiin reaaliaikaisen RT -PCR on androgeeni-reagoiva LNCaP ja androgeenin-epäherkkä PC3 eturauhassyövän solulinjoissa. Sarjassa LNCaP linjaa solulinjojen ilmentyminen osteonektiini korreloi lisääntyneen luun metastaattista potentiaalia, jossa hormoni tulenkestävät ja luun metastaattinen C4-2B ilmaistuna korkeamman tason osteonektiini kuin teki sen lähtöaineena androgeeniriippuvaisissa LNCaP ja androgeenista riippumaton C4 -2-soluja. Vastaavasti, PC3M, erittäin metastaattinen johdannainen ilmaistuna 18 kertaa korkeampi osteonektiini verrattuna niiden vanhempien PC3-soluja, jotka oli alun perin peräisin luun etäpesäkkeitä eturauhassyövän (kuvio 1A). Nämä tulokset paljastivat korrelaation kohonnut osteonektiini ilmaisun ja metastaattisen CRPC etenemistä. Koska eturauhassyövän luumetastaasipotilailla pidetään mikroympäristön perustuva taudin korkeampi osteonektiini ilmaistuna ihmisen luun stroomasolujen kuin eturauhasen syöpäsolujen havaittiin käyttäen hFOB osteoblastien ja HS27A luuytimestä peräisin fibroblastisolulinjat (kuvio 1A). Arvioida ero ilmentymisen osteonektiini välillä noncancerous ja syöpä eturauhasen epiteelisolut sekä normaalin ja syöpään liittyvän strooman solujen samat henkilöt, LCM leikattiin näytteet ensisijainen eturauhasen kasvaimia käytetty. Niistä paria normaalien ja malignien eturauhasen kudosten, 3 4 potilaiden näytteet näytetään merkittävästi lisääntyneen ilmentymisen osteonektiini syöpäsoluissa ja syöpään viereisten stroomasolujen verrattuna tavanomaista vastine; ja toinen oli vähentynyt ekspressiota tuumorikudoksissa (kuvio 1 B).

Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi osteonektiini mRNA: n ekspression (A) sarjanumero ihmisen eturauhassyövän ja luun strooman (hFOB ja HS27A) solulinjoja ja (B) LCM-eristettiin eturauhasen epiteelisolujen ja strooman soluja pareittain ensisijaisen eturauhasen kasvain (T) ja normaalissa eturauhasessa (n) kudoksiin johdettu 4 potilaalla (Pt: n 1 ~ 4). Suhteellinen geeniekspressiota osteonektiini oli edustettuna 2

-ΔCT, jossa ACt määritetään vähentämällä keskimääräinen taloudenhoito geeni HSPCB kynnyssyklistä keskimääräisestä kohdegeenin arvo. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta ja esitetään keskiarvona ± SD. * P 0,05, ** p 0,001 verrattuna normaaleihin soluihin. (C) sirontakuvaajaan IHC värjäytymisen sijoituksen osteonektiini eturauhasessa epiteelin ja strooman kohdissa ihmisen eturauhasessa microarray sisältävät pää- eturauhasen kasvain (n = 40) ja terveessä eturauhasessa (n = 9). Edustavat kuvat IHC värjäytymisen osteonektiini pariksi eturauhasen kasvain ja normaali eturauhaskudoksiin kahdesta yksittäisten potilaiden suurennuksella 40 x ja 100 x näytettiin oikealla. Nuoli ja nuolenkärki osoittavat positiivista värjäytymistä strooman ja epiteelin soluja, tässä järjestyksessä.

edelleen vahvistaa yhdistyksen välillä yli-ilmentyminen osteonektiini ja eturauhasen syövän syntymistä kliinisissä näytteissä, immunohistokemiallisella (IHC) analyysi tehtiin eturauhasen kudosta microarray sisältää 40 ensisijainen eturauhasen kasvaimia ja 9 vastaaviin normaaleihin eturauhasessa. Kussakin ydin, immunoreaktiivisuus osteonektiini mitattiin kohdissa, johon on strooman, normaali epiteelin, kasvain strooman ja kasvain epiteelin. Vaikka nämä erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (P = 0,2654 ja 0,4042), joukkoon koko Allredin pisteet yleisessä näytteitä kasvain epiteelin ja kasvaimen strooman oli korkeampi suhteessa normaaliin epiteelin ja normaali strooman, vastaavasti (kuvio 1 C). Ero oli merkittävämpi, kun vain pareittain eturauhasen tuumorin ja normaalin eturauhasen näytteet analysoitiin (P = 0,085 ja 0,2165 ja epiteelin värjäytymisen ja strooman värjäys, vastaavasti). Puute tilastollisen merkitys voi johtua pienen otoksen koosta. Lisäksi vahva värjäytyminen osteonektiini voidaan havaita näytteessä eturauhassyövän luun etäpesäkkeitä (S1 kuvio). Suunta vaikutuksen ehdottaa autokriininen ja parakriininen toimien osteonektiini kasvaimen ja kasvaimen mikroympäris- aiheuttavat eturauhassyövän maligniteetti ja etäpesäkkeitä.

tunnistaminen ylimääräisiä transkription säätelyelementtejä ihmisen osteonektiini promoottorialueen

GGA-box 1 ihmisen osteonektiini (hon) promoottorialue on elintärkeää maksimaalinen transkriptioaktiviteettia, kun taas pyrimidiini-rikas spacer välillä GGA-laatikot 1 ja 2 kohdistaa heikentävän säätelyn vaikutus [31]. Vertailu naudan, hiiren ja ihmisen osteonektiini eksonin 1 DNA-sekvenssit paljasti huomattavan useita toista sekvenssin CCTG kaikilla lajeilla, jolla johdonmukaisesti klusterin 7-8 emästä ylävirtaan alusta eksonin 1 [32]. Siksi tutkittiin 2 hon-promoottori-reportteri konstruktioita, p522E-Luc ja p522H-Luc, tutkia roolia CCTG sekvenssin Hon promoottoritoiminta. Promoottori fragmentti p522H-Luc on samanlainen kuin pGL2-spdel, jolla on potentiaalia transkriptionaalista aktiivisuutta ihmisen solulinjoissa [31]. p522E-Luc on 5′-alueen hon promoottorin sekvenssejä, samanlainen kuin p522H-Luc, mutta 3 ’pää ulottuu bp + 62, jossa 4 CCTG yksiköt ovat mukana (kuvio 2A). Transfektio Näiden rakenteiden ja pGL-3-TATA (joka toimii vertailukohtana promoottoriaktiivisuuden) ihmisen luun stroomasolulinja linjat, kuten hFOB, HS27A, ja osteosarkooma MG63 osoittivat selvän kasvun lusiferaasiaktiivisuutta p522E-Luc verrattuna p522H- luc (kuvio 2B). Vielä 3 ’laajentaminen promoottorista bp +73 sijaitsee intronin 1 alueella (p522I-Luc) alensivat lusiferaasiaktiivisuuden, mikä osoittaa selvästi, että alue välillä bp +39 ja bp +62 vastaa lisäksi säätelyä hon promoottorin aktiivisuutta ihmisen luun soluissa, kun taas välistä aluetta bp +63 ja emäsparin +73 sisältää negatiivisen säätelyelementin.

(A) Schema erilaisia ​​osteonektiini-promoottori-ajettu lusiferaasi konstruktioita. Kaikki sekvenssit on numeroitu suhteessa +1 (transkription aloituskohtaan). Osittainen sekvenssi osteonektiini promoottori emäkset 40-62, jotka sisältävät 4 CCGT motiiveja (alleviivattu). Modifioitu pGL3-konstrukti (pGL3-TATA) keinotekoisella TATA asetettu ylävirtaan lusiferaasireportterigeenin käytettiin kontrollina perustaso promoottorin aktiivisuutta. (B, C) vertailu lusiferaasireportteri aktiivisuuden Hon-promoottorikonstrukteja ihmisen luun stroomasolulinja linjojen ja ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa

in vitro

transfektion ja (D) hiiri -urut

vuonna vivo

geeni toimitus. (B, C) suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus eri konstruktien jaettiin normalisoitu aktiivisuus tyhjän vektorin (pGL3-TATA) ja ilmaistiin kertamuutosta haltuunsa. * P ≤ 0,05 vs. p522H-Luc. (D) Lusiferaasiaktiivisuudet (suhteellisesti valoyksiköitä [RLU] milligrammaa proteiinia) määritettiin edustavan elimissä 2 päivää sen jälkeen suonensisäinen injektio 1 x 10

9 pfu Ad-522E-TK tai Ad-CMV-TK aikuisten hiiriä (n = 5).

vieressä arvioitiin transkriptionaalista aktiivisuutta HON-522E-promoottori eri eturauhassyövän solulinjoissa heijastaa eri vaiheissa eturauhassyövän etenemisen. Transfektion tiedot osoittivat, että hon-522E promoottorin aktiivisuutta havaittiin kaikissa testatuissa solulinjoissa. Kuitenkin verrattaessa lusiferaasiaktiivisuus näiden transfektoitujen eturauhassyövän solulinjoissa, ja ne, joilla on endogeeninen osteonektiini RNA ilmentymistä (kuvio 1A) osoitti, että hon-522E-promoottorin aktiivisuus on suhteellisesti suurempi AR-negatiivinen, aggressiivisempia ja metastaattinen solulinjoja, mukaan lukien DU145 , PC3 ja PC3M soluja verrattuna AR ilmentävien LNCaP, C4-2 ja C4-2B solulinjoissa (kuvio 2C).

arvioida mahdolliset hyödyllisyyden HON-522E promoottori ilmaista siirtogeenin kudosspesifisellä tavalla

in vivo

, adenovirusvektori, joka sisältää HON-522E promoottori tai kaikkialla läsnä sytomegaloviruksen (CMV) promoottorin, joka ohjaa lusiferaasireportterigeenillä (Ad-522E-Luc tai Ad-CMV-Luc) annettiin suonensisäisesti miespuolisille kateenkorvattomissa hiirissä joko terve tai kuljettaa potilaalle tehdä PC3M kasvaimia. 2 vuorokauden kuluttua viruksen annon, tärkeimpien elinten, kuten maksan, keuhkojen, munuaiset, perna, suoli, sydän, aivot, paksusuoli, kivekset, eturauhanen, ja lihakset, ja PC3M tuumoriksenografteissa kerättiin mitata lusiferaasiekspressio (kuvio 2D) . Havaitsimme, että normaalissa elimissä, Ad-522E-Luc välittämä lusiferaasin ilmentymistä maksassa, pernassa ja keuhkoissa oli merkittävästi alhaisempi kuin Ad-CMV-Luc, jossa vähennyskertoimet 16%, 41%, ja 1%, vastaavasti. Yhdenmukaisesti aikaisemman tutkimuksen paljastava lisääntyneen ilmentymisen osteonektiini mRNA: haimatiehyen epiteelisoluissa [33], lusiferaasiaktiivisuutta transdusoitu Ad-522E-Luc haima oli 34 kertaa suurempi kuin se, minkä indusoivat Ad-CMV-Luc. Vaikka lusiferaasiaktiivisuus tuskin havaittiin normaalin hiiren eturauhasen riippumatta Ad vektorin annon, erittäin korkea lusiferaasiekspressio Ad-522E-Luc havaittiin PC3M eturauhasen ksenografteissa, jossa ilme 5 kertaa suurempi kuin Ad-CMV-Luc. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HON-522E promoottori soveltuu suhteen tehokas ja selektiivinen ilmentymistä transkription kohdentamista AR-negatiivisten ja metastaattinen syöpäsolujen.

arviointi

in vitro

sytotoksisuus yhdistelmä-Ad-522E-TK eturauhassyövässä ja luun stroomasoluja

arvioimaan mahdollisuutta Hon promoottorin ohjaama yhteistyön kohdistaminen geeniterapian eturauhassyöpään, suunnittelimme replikaatiovialliset adenovirusvektori, Ad-522E- TK kantaen HON-522E promoottori perustuva herpes simplex -viruksen TK-geeniä. Tehokkuus TK-geenin toimituksen eturauhasen syöpä ja luun stroomasolulinja linjojen määritettiin käyttämällä TK entsyymiaktiivisuuden määritys jälkeen altistaa nämä solut Ad-522E-TK ja normalisoitiin ulkoisen valvonnan Ad-CMV-TK virusinfektiivisyydelle. Testatuissa solulinjoissa, mukaan lukien eturauhassyöpä ja luun stroomasolulinja linjat, paljasti onnistunut TK-geenin transduktio Ad-522E-TK, jossa on ainakin kaksi kertaa vahvempaa aktiivisuutta AR-negatiivisten eturauhasen syöpäsolujen DU145, PC3 ja PC3M sekä luun stroomasolujen MG63 ja HS27A verrattuna AR-positiivisten LNCaP-sukuperää olevien solujen linjat (kuvio 3A), joka oli samanlainen tulos lusiferaasireportterigeenin aktiivisuuden p522E-Luc (kuvio 2C). Enemmän silmiinpistävän, Ad-522E-TK-tartunnan PC3M solut osoittivat suurempaa kuin pienentäisivät TK aktiivisuus kuin solut infektoitu Ad-CMV-TK; Tämä tulos oli yhdenmukainen että Ad-522E-Luc siirtogeenin aktiivisuuden PC3M ksenograftikasvaimissa (kuvio 2D). Lisäpäätelmien aihiolääke gansikloviirin (GCV) käsittely, Ad-522E-TK selvästi ja annoksesta riippuvaa laskua kasvua PC3M solujen suurempaa tehoa kuin Ad-CMV-Luc; Ad-522E-TK tai GCV yksin kohdistama ole sytotoksisia vaikutuksia PC3M soluissa (kuvio 3B). Lisäksi tartuntaa MG63 ja HS27A Ad-522E-TK myös indusoi merkittävän solukuoleman yhdistettynä GCV (kuvio 3C). Nämä tulokset osoittivat kykyä Ad-522E-TK kohdistaa sekä eturauhassyövän ja luun stroomasolut.

(A). Vertailu TK ilmentymistä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen solujen ja luun stroomasolulinja riviä Ad-522E-TK ja Ad-CMA-TK. * P