Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tetra-pohjamaali vahvistusta tulenkestävä mutaatio järjestelmä PCR (T-ARMS-PCR) on nopea ja taloudellinen keino määrittämällä SNP: n, vaatii vain PCR-monistus ja sen jälkeen elektroforeesi määrittämiseksi genotyyppien. Parantaa läpäisyä ja tehokkuutta T-ARMS-PCR: ää yhdistettynä T-ARMS-PCR, jossa on kimeerinen aluke-, lämpötilan kytkin PCR (TSP) strategiaa, ja käytetään kapillaarielektroforeesilla (CE) ja amplikonin erottamisen ja tunnistamisen. Arvioimme tämän prosessin samanaikaisesti genotyypitys neljä rintasyövän ja kahden kohdunkaulan syövän riskiä liittyviä SNP.

Methods

Yhteensä 24 T-ARMS-PCR-alukkeita, kukin 5′- koodattu universaali sekvenssi ja pari universaali alukkeiden, yhdistettiin yhteen monistamaan 12 tavoitteen alleelin 6 SNP 186 ohjaus naisten verinäytteitä. Suora sekvensointi kaikista näytteistä suoritettiin myös arvioida tarkkuutta tällä menetelmällä.

Tulokset

Näistä 186 näytteistä, jopa 11 amplikoneihin voidaan tuottaa yhdellä PCR ja erottaa CE . Genotyypitys tulokset multiplex T-ARMS-PCR olivat täysin samaa mieltä suora sekvensointi kaikista näytteistä.

Johtopäätökset

Tämä uusi multiplex T-ARMS-PCR-menetelmällä on ensimmäinen raportoitu menetelmä mahdollistaa yhden genotyypin kuusi SNP yhdessä reaktiossa ilman jälkeistä PCR käsittelyä kuin elektroforeesi. Tämä menetelmä on luotettava, nopea ja helppo suorittaa.

Citation: Zhang C, Liu Y, Ring BZ, Nie K, Yang M, Wang M, et al. (2013) romaani Multiplex Tetra-Primer ARMS-PCR varten samanaikainen genotyypin Kuusi yhden emäksen monimuotoisuus Associated kanssa Nainen Syövät. PLoS ONE 8 (4): e62126. doi: 10,1371 /journal.pone.0062126

Editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2013; Julkaistu: 17 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kiinan Mega-projekti Infectious Disease (2011ZX10004-001, 2012ZX10004-215 ja 2013ZX10004-202). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

rooli yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) myötävaikuttaa vaihtelua yksilöiden välillä syöpäalttiuteen [1], kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden rate [2] – [4], sekä hoidon tehokkuuden ja haittavaikutukset vastauksia, on hyvin tunnustettu [5], [6]. Niistä monia menetelmiä, jotka on kehitetty genotyyppi SNP: iden, tetra-aluke vahvistus tulenkestävien mutaatio järjestelmän PCR (T-ARMS-PCR) on osoittautunut nopea, yksinkertainen ja edullinen [7] – [11]. Kautta kahden ulomman alukkeita ja kaksi alleelispesifisen sisempi alukkeita, genotyyppaus vaatii vain yhden PCR seurasi elektroforeesi erottaminen [8]. Multiplex PCR sisällytettiin T-ARMS-PCR käyttäen kahdeksan alukkeita yhdessä PCR, ja pystyy samanaikaisesti tunnistaa kaksi mutaatiota [9]. Erikseen, kimeerinen-aluke-pohjainen multiplex-PCR, joka lisää yleistä 5 ’tag sekvenssin spesifisiä alukkeita useita tavoitteita, on raportoitu parantaa läpäisyä ja tehokkuutta polymeraasiketjureaktion [12]. Sen korkea hyötysuhde paljastamisessa kymmeniä eri PCR tuotteita yhteen reaktiossa, käyttö kimeerisen pohjamaali PCR on usein raportoitu käytettäväksi mRNA määrällisesti [13] – [15] ja taudinaiheuttajan tunnistaminen [16], [17].

Rintasyöpä ja kohdunkaulan syöpä ovat nykyään yleisimmin diagnosoitu syöpien ja johtavia syitä syövän kuolemaan naisten keskuudessa [18]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että somaattisia variantteja herkkyys alueilla liittyvät esiintymisen todennäköisyys rinta- ja gynecologic syövistä [19] – [23]. SNP valittiin tätä tutkimusta pohjalta raportoitu yhdistysten kanssa näiden syöpien ja jolla on kohtuullisen korkea esiintyvyys aasialaisilla. Neljä alhaisen penetraation variantteja ennustamiseksi rintasyöpäriskin valittiin. SNP: t rs4784227 [24] ja rs3803662 [25] on sijoitettu transkriptiotekijä TOX3; rs1219648 sijoittuu FGFR2, joka edistää solukasvua, invasiivisuus, liikkuvuuteen, ja angiogeneesi [26]; rs889312 [27] on sisällä MAP3K1, joka liittyy soluvastetta mitogeeneille. Kaksi liittyvät muunnelmat riski kohdunkaulan tai munasarjasyövän valittiin. SNP rs750749 [21] on polymorfismien CD83, joka on mukana immuunitunnistusta ja antigeenin esittelyn; rs749292 in CYP19A1, jolla on keskeinen rooli estrogeenin biosynteesin [22], [23].

Tässä artikkelissa kuvaamme uusi multiplex T-ARMS-PCR mahdollistaa samanaikaisen genotyypin 6 SNP (rs4784227 , rs3803662, rs1219648, rs889312, rs750749 ja rs749292), joka liittyy rinta- ja gynekologiset syövät yhdessä putkessa käyttäen 24 kimeerisiä alukkeita ja pari yleisen alukkeiden käyttö kimeeristen alukkeita ja lämpötila kytkin PCR (TSP) strategia yhdistettiin T- ARMS-PCR optimoida Monistusparamctrit ja parantaa välityskykyä SNP genotyypitys. Näiden eri genotyypin tekniikoita osoittaa ensimmäistä kertaa kyky tetra-alukkeen ARMS-PCR luotettavasti ja tehokkaasti havaita kuuden SNP yhdessä reaktiossa. Koska yli 10 PCR-tuotteita, joilla on erilaiset pituudet on tunnistettava, kapillaarielektroforeesilla (CE) sijasta käytetään agaroosigeelielektroforeesilla.

Materiaalit ja menetelmät

yhteensä 186 verinäytteitä terveistä Kiinan vapaaehtoisilla naisilla, jotka olivat seurataan mahdollisen verenpainetauti kerättiin terveyskeskuksen Wuhan, Kiinassa vuoden 2011 aikana tähän tutkimukseen. Kaikessa tutkimuksessa tehtiin mukaisesti kansallisten eettisten säännösten ja hyväksynyt Institutional Review Boards keskuksen for Disease Control and Prevention 70 Kiinassa, sekä eettisen komitean Huazhong tiede ja teknologia. Osallistujat sai ”kirjallinen lupa” tutkimuksen tarkoitusta ja että heillä on oikeus pitää tiedot luottamuksellisina. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki osanottajat tai heidän huoltajiensa.

Perimän DNA uutettiin 0,2 ml tuoretta aäreisverinäytteiden käyttämällä Wizard

® Genominen DNA Purification Kit (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Uutettu DNA-näytteet oli lopullinen pitoisuus vaihtelee 55-365 ng /ul.

korjata puutteet standardin multiplex T ARMS-PCR-menetelmillä, ehdotettu menetelmä optimoitiin kannalta alukesuunnittelu, PCR-syklien olosuhteet ja hyödyntämisessä kimeerisen alukkeiden ja TSP strategia, kuten kuvattu aiemmissa raporteissa havaitsemisessa influenssavirusten ja ihmisen käsi jalka ja suun liittyvien patogeenien [16], [28]. Yhteensä 24 kimeerisen alukkeita, joista kukin koostuu geenin-spesifinen sekvenssi, jolla on yleinen tag-sekvenssi 5′-päähän käytettiin. Geeni-spesifisten osien alukkeet suunniteltiin vaatimusten mukaisesti T-ARMS-PCR: llä. Spesifisyys alleelin alukkeet on myönnetty identiteetti terminaalin 3 ’nukleotidin joko villityypin tai mutantti alleeli, spesifisyys kasvaa ottamalla käyttöön tarkoituksellinen yhteensopimattomuus asemassa -1 3’-päässä. Pari yleisen alukkeita ja kuusi sarjaa T-ARMS-PCR kimeerisiä alukkeita käytettiin monistamiseen. Yksityiskohtaiset alukesekvenssit ja työskentely pitoisuudet kullekin SNP on lueteltu taulukossa 1.

genotyypitys määritettiin polymorfismien suoritettiin multiplex PCR-monistuksella ja fragmentti analyysi. Kuusi sarjaa T-ARMS-PCR-alukkeita monistamiseen kahdentoista fragmentteja erikokoisia yhdistettiin yhdessä 20 pl: n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi myös 10 ui master sekoitus QIAgen Multiplex PCR kit, 50-100 ng genomista DNA: ta, ja optimoitu pitoisuudet kutakin aluketta (katso taulukko 1). Multiplex-PCR suoritettiin käyttäen Bioer LifePro Thermal Cycler. Optimoitu lämpötila kytkin PCR (TSP) protokolla, joka käyttää neljää eri hehkutus lämpötilassa suoritettiin seuraavasti: aluksi denaturointivaihetta 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 3 sykliä 95 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 45 s, 10 sykliä 95 ° C 30 s, 58 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 45 s, 20 sykliä 95 ° C 30 s, 68 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 45 s, 15 sykliä 95 ° C 30 s, 55 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 45 s, minkä jälkeen lopullinen laajennus sykli 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja sitten se jäähdytettiin 4 ° C.

multiplex PCR-tuotteet erotettiin QIAxcel

® DNA korkean resoluution geeli patruuna (Qiagen) on QIAxcel järjestelmä (Qiagen). DNA koko Marker on 25-450 bp (Qiagen) ja kohdistus Marker 15 bp /500 bp (Qiagen) käytettiin kussakin QIAxcel kulkee ja koko tuotteiden määritettiin käyttäen ScreenGel ohjelmiston (Qiagen). Koska kukin amplikonien oli pituudeltaan erilainen, alleelit havaittiin perusteella kuvioiden piikin koossa.

yhteensä 186 näytettä myös sekvensoitiin rinnakkain ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems , USA) mukaan BigDye Termination versio 3.1 protokollan Invitrogen Corporation (Shanghai, Kiina) vahvistaa multiplex T-ARMS-PCR tuloksia käyttämällä ulompaa alukkeita luetellaan taulukossa 1 kullekin SNP.

tulokset

yhteensä 186 näytettä tyypattiin multiplex T-ARMS-PCR-määritys ja myös kirjoitetaan rinnalla suoraan sekvensoinnilla arvioida tarkkuutta ja tehokkuutta määritystä. Kaikki PCR-tuotteet hyvin ratkaistu ja mitoitettiin CE ja ScreenGel, mahdollistaa helpon tunnistamisen eri genotyyppiä. Kaksi 186 näytteillä oli yksitoista ainutlaatuinen amplikoneja, eli ne potilaat ovat vain yksi homogeeninen SNP kuudesta testattu loci. Elektroferogrammi ja geeli kuva näiden kahden näytteen (Fig. 1) osoittavat, että CE on QIAXEL voi selvästi erottaa jopa 11 fragmentteja yhdessä näytteessä. Tarkkuus useiden PCR-analyysi yhden näytteen varmistettiin suoralla sekvensoinnilla (Fig. 2). Fragmenttikokoja määräytyy QIAXEL perustuu CE on lueteltu taulukossa 2. Lue pituudet olivat 2-10 emäsparin suurempi kuin odotettua joukkoon, mutta tämä ei häiritse alleeli määrätietoisesti. Heterotsygooteilla ja homozygoottien oli yksiselitteisesti siirtämän CE profiileja. Ei rajat havaittu reaktiota. Genotyyppien teki kanavointiosalta määrityksessä olivat 100% mukaisesti suoralla sekvensoinnilla.

V: geeli kuva 4 näytettä. B. Geelin kuva ja elektroferogrammi näytteen lane1. 11 bändejä vaihtelevat 202-356 emäsparin havaittiin, mikä osoittaa 5 heterogeenisia ja 1 homogeeninen SNP tunnistettiin C: Gel kuva ja elektroferogrammi näytteen lane2. Toinen yhdistelmä 5 heterogeenisen ja 1 homogeeninen SNP havaittiin.

genotyyppi jakelu ja alleelifrekvenssit kunkin SNP luetellaan taulukossa 3. alleeli raportoitu liittyvän riskin syövän esiintymisen korostuu. Havaittu taajuus genotyyppien tässä tutkimuksessa oli yleisesti ottaen samankaltainen kuin mitattuna HapMap varten Han-kiinalaiset populaatio (HCB). Jos HapMap taajuuksia käytettiin ennustamaan odotettavissa genotyypin laskee tässä tutkimuksessa, niin vertailun tämän väestö käyttää HapMap HCB väestö osoitti merkittäviä poikkeamia varten rs4784227 vuonna Tox3 ja rs749292 in CYP19A1, jossa riski ja ei-riskin alleelien vastaavasti ovat läsnä merkittävästi suurempi osuus kuin aikaisemmin raportoitu Kiinan väestöstä. On todennäköistä on monimuotoisuudesta Han väestöstä, joka ei ole vielä vangiksi HapMap tutkimuksissa. Täydentävä taulukko (taulukko S1) on järjestetty näyttämään täsmälleen sarjaa alleelien kaikille 6 SNP löytyy yksittäisistä näytteistä myöhempää käyttöä varten.

Keskustelu

Menetelmät mahdollistavat edullisen , nopea ja luotettava SNP määritys houkuttelevat kasvavaa kiinnostusta ikä henkilökohtaisen lääketieteen. On yleisesti tunnustettu, että käyttämällä tietoja useista SNP genotyyppiä tarjoaa tarkemman riskinarvioinnin kuin on ennakoitu yksittäinen riski alleelin [29], siis menetelmät pystyy tunnistamaan useita genotyyppejä, kuten MALDI-TOF-massaspektrometrialla [30], [31 ] ja hybridisaatio-pohjainen [32] – [34], tai entsyymi-[35] menetelmiä on käytetty. Kuitenkin nämä menetelmät vaativat joko kalliita erikoislaitteita, kuten massaspektrometriin tai aikaa vievää post-PCR toimintaa.

Tetra-pohjamaali ARMS-PCR-menetelmällä on tullut yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä SNP genotyypitykseen. Se vaatii vain säännöllistä molekyylibiologian laitteet ja poistaa tarpeen hybridisaation tai muita entsymaattisia reaktioita. Vaikka triplex ja Nelivaiheinen PCR menetelmiä on raportoitu, on rajoitettu käyttö multiplex T-ARMS-PCR genotyypitys koska kaksi keskeistä rajoituksia. Ensinnäkin todennäköisyys löytää alukkeiden Hyväksytty sulamislämpötilat putoaa jyrkästi, kun yritetään yhdistää havaita useita SNP yhdessä reaktiossa. Toiseksi tuloksena poolin amplikonien edellyttää riittävän pitkä välit Naapuritaajuusalueiden elektroforeesipuskurissa irtoamisen helpottamiseksi. Yhdistämällä T-ARMS-PCR kimeerisen pohjamaali perustuva lämpötilakytkin PCR strategia me pitkälti kiertää nämä rajoitukset. Meidän menetelmä osoittaa ensimmäistä kertaa kyky tetra-pohjamaali ARMS-PCR helposti havaita kuusi SNP yhdessä reaktiossa.

menetelmän luotettavuuden havainnollistettiin kirjoittamalla 186 kliinistä verinäytteet rinnalle suoralla sekvensoinnilla ja 100% johdonmukaisuus kahden menetelmän saatiin. Tämä proof-of-concept tutkimuksessa siis käyttöön nopea, toistettavissa, ja kustannustehokas tapa havaitsemiseksi multiplex SNP, koska CE mukaan QIAXCEL pysty ratkaisemaan amplikonien niin vähän kuin 5 bp kokoero, pienimmän koon ero tässä testissä oli 10 bp. Koska luetut pituudet tässä kokeessa on keskihajonta 0,8-1,3 (taulukko 2), määritys alleelin siis ei puututa.

käyttö kimeeristen alukkeita ja kaksivaiheinen lämpötila kytkin hehkutusmenetelmissä laskee eron in monistustehokkuudessa keskuudessa amplikoneja. Parin ensimmäisen PCR syklin monistaminen suoritetaan alleelispesifisillä kimeerisen alukkeita. Myöhemmissä vaiheissa PCR-monistus kantavat pääasiassa universaali alukkeita, jotta kaikki tavoitteet tällä multiplex PCR -järjestelmää monistetaan puolueettomasti yhden parin universaali alukkeita. Tämä vähentää esiintyminen puolueellinen ja osittainen vahvistus, minimoi ei-spesifisiä reaktioita, ja vähentää tarvetta optimoida kunkin yksittäisen PCR-määrityksen.

arvioimiseksi virheet johtuvat käyttöä multi-band electrophoregrams erottaa amplikonit , luetut pituus kunkin kaistan verrattiin teoreettiseen pituudet lasketaan pohjamaali-linjaus (taulukko 2). Ei päällekkäisiä luku- pituus alue tahansa kahden amplikoneista havaittiin lisäksi, ei ole päällekkäisyyttä, että 99%: n luottamusvälit havaitun keskimääräisen luku- pituus. On huomattava, että kaistaintensiteettejä voidaan soveltaa useita tekijöitä kuten genomista DNA laatu ja PCR reagenssit laatua; olemme havainneet, että 50-100 ng /ul DNA: ta on optimaalinen tarjota riittävän selkeä ja kirkas nauhat minimaalisella taustalla (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi, toisin kuin useimmat muut raportoitu T-ARMS-PCR menetelmissä pohdittiin epäsuhta asemassa -1 päässä 3’sisällytettiin sisä- alukkeilla ja oli riittävän spesifinen ero havaitsemiseksi kahden alleelin kullekin SNP. Johtuen rajoittamisesta koosta syrjiä PCR-tuotteet, PCR suunnittelu voidaan rajoittaa jossain määrin tehdään useita T-ARMS-PCR vaikea kirjoittaa ne SNP, jotka sijaitsevat lähempänä kuin 20 emäsparin toisiinsa.

kaksi erillistä edut useita aseita-PCR-menetelmällä ovat lyhyitä määrityksen ajan ja alhaiset kustannukset, jopa analysoimiseksi paljon yksilöitä. Ehdotettu menetelmä, vain liittyy tavanomaisia ​​PCR CE, voidaan suorittaa 3,5 tunnin minimaalisella käytännön työtä. Louhinnan jälkeen perimän DNA myöhemmät vaiheet voidaan suorittaa yhden reaktioputken mahdollistaa valmiille analyysiä useiden näytteiden yhdellä ajolla korkean seulontaan. Tämä määritys kuluttaa vain standardin PCR reagenssit ja elektroforeesi patruunat; kustannukset tässä tutkimuksessa oli vain 2 US $ samanaikaiseen havaitsemiseen kuusi SNP näytettä kohti.

Tietääksemme ehdotettu menetelmä on ensimmäinen havaita kuusi SNP yhdessä reaktiossa käyttäen tetra-aluketta ARMS- PCR. Romaani multiplex tetra-pohjamaali ARMS-PCR-menetelmällä kehitetty tässä tutkimuksessa on potentiaalia myös laajasti sovellettavissa sekä kaupalliset ja kliiniset asetukset seulontaa useita SNP.

tukeminen Information

Taulukko S1.

alleelit 6 SNP kunkin yksittäisen näytteen tässä tutkimuksessa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0062126.s001

(DOCX)