Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, että voi olla häiriöstä endokannabinoidijärjestelmä aineenvaihdunnan syöpä. Tässä olemme tutkineet ilmaus endokannabinoidijärjestelmä-entsyymi rasvahappoamidi hydrolaasi (FAAH) on hyvin tunnettu kudos microarray potilaiden diagnosoitu eturauhasen syöpä höyläysleikkaus hylkäämiseen ongelmia.

Menetelmät /Principal Havainnot

FAAH immunoreaktiivisuus (FAAH-IR) arvioitiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu ei-pahanlaatuisten ja kasvaimen ytimien 412 potilailla, joilla on eturauhasen syöpä. CB

1 -reseptorin immunoreaktiivisuus (CB

1IR) tulokset olivat saatavilla tämän aineisto. FAAH-IR havaittiin epiteelisoluissa ja verisuonten seinämien, mutta ei strooman. Kasvaimen epiteelin FAAH-IR korreloi positiivisesti taudin vakavuus diagnoosi (Gleason, kasvain vaiheessa% näytteen, joka sisälsi kasvain) tapauksista, joissa keskitason CB

1IR tulokset, mutta ei niille, joilla on korkea CB

1IR tulokset. Sillä 281 tapausta, jotka saivat vain lievittävä hoito lopussa vaiheissa taudin, korkean kasvain epiteelin FAAH-IR liittyi huono tautikohtaisia ​​selviytymistä. Monimuuttuja Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyyseissä osoittivat, että FAAH-IR toivat lisää ennustetekijöiden tietoja toimittamat CB

1IR kun keskialuetta, mutta ei korkea CB

1IR kynnysarvon käytettiin. Interleukiini-4 (IL-4) -reseptori IR havaittiin kasvaimen epiteelisolujen ja inkubointia eturauhassyövän PC-3 ja R3327 AT1-solujen IL-4 lisäsivät FAAH toimintaa.

Johtopäätökset /merkitys

Kasvaimen epiteelin FAAH-IR liittyy eturauhassyöpään vakavuus ja lopputulos alueen keskivaiheille, mutta ei korkea, CB

1IR tulokset. Korrelaatio CB

1IR tuumorikudokseen voi liittyä yhteiseen paikallisen säätelyhäiriötä komponentilla kasvaimen microenvironment.

Citation: Thors L, Bergh A, Persson E, Hammarsten P, Stattin P , Egevad L, et ai. (2010) Rasvahappoamidi Hydrolase in Eturauhassyöpä: Assosiaatio sairauden vakavuuden ja tulos, CB

1 -reseptorin Expression ja asetuksen IL-4. PLoS ONE 5 (8): e12275. doi: 10,1371 /journal.pone.0012275

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 27 heinäkuu 2010; Julkaistu: 19 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Thors et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos Ruotsin tiedeneuvoston (Grant no. 12158, lääketiede, CJ Fowler); Ruotsin Cancer Society (Grant no. CAN 2007/712, Anders Bergh); Lions Cancer Research Fund Uumajan yliopistossa /Cancer Research Fund Norlannin ja tutkimuksen rahastojen lääketieteellisen tiedekunnan, Umeå University (C. J. Fowler) taloudellista tukea. Rahoituslähde vasta (Dr. Mackie) oli myöntää NIH DA11322. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä muodossa miehillä. Mukaan Yhdysvaltain National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/prostate), määrä uusia tapauksia eturauhassyövän Yhdysvalloissa vuonna 2009 oli 192280, ja kuolleiden määrä johtuu tauti oli 27360. Hoitovaihtoehdot vaihtelevat odotteen ja eturauhasen, hormonihoidon ja säteilyn luonteesta riippuen syöpä.

Viime vuosina on saatu lisää näyttöä siitä, että endokannabinoidijärjestelmä, joka käsittää kannabinoidin CB

1 ja CB

2-reseptorien, niiden endogeenisten ligandien anandamidia ja 2-arakidonyyliglyseroli, ja niiden synteettiset ja hajottavia entsyymejä, on rooli patogeneesissä ja mahdollisia syövän tyypit, mukaan lukien eturauhassyöpä (viimeaikaisten selostuksia, katso [1] – [3 ]). Näin ollen, esimerkiksi, kannabinoidit tuottaa CB-reseptorivälitteisen apoptoosia glioomasolut seurauksena jatkuvan tuotannon keramidin [4], ja useita asiakirjoja ovat raportoineet sekä CB-reseptorin riippuvia ja riippumattaman vaikutukset kannabinoidien kun elinkelpoisuutta, liikkuvuuden ja invasivity sekä androgeenin-herkkä ja epäherkkä eturauhassyövän solulinjoissa [5] – [11].

In vitro

, paikallinen endokannabinoidijärjestelmä sävy on tärkeä tekijä, joka säätelee pahanlaatuisuuden eturauhassyöpäsolujen . Näin ollen, modulaatio tasot endokannabinoidit, käyttämällä inhibiittorit endokannabinoidijärjestelmä synteesiä tai metaboliaa, johtaa muutokseen invasiivisessa ominaisuuksien eturauhasen syöpäsolujen tavalla, joka on suojaava vaikutus endokannabinoidit [8], [12]. Endokannabinoidijärjestelmä anandamidia metaboloituu entsyymi rasvahappoamidi hydrolaasi (FAAH) ja yli-ilmentymisen entsyymin PC-3-solujen tuloksia ilmiasuun lisääntynyt invasiivisen käyttäytymisen

in vitro

[12]. Nämä tekijät päättelivät, että ”inhibitio FAAH-aktiivisuuden spesifisiä inhibiittoreita voi olla yksi terapeuttinen kohde eturauhas- syöpä” [12]. FAAH estäjiä, jotka eivät tuota sellaista Keski käyttäytymiseen liittyviä vaikutuksia kannabinoidien kuten Δ

9-tetrahydrokannabinoli [13], tällä hetkellä lääkekehityksessä, pääasiassa kipua terapeuttisena kohteena, ja johtava yhdiste on vaiheessa II sen kehityksen.

Vähemmän tiedetään endokannabinoidijärjestelmä eturauhasen kasvainkudoksessa, mutta tutkimuksessa käytetään suuri määrä potilaita, joilla on pitkä seurannan, me raportoi äskettäin, että ilmaus CB

1 reseptoreihin kasvainkudoksessa saatu diagnoosi liittyi sairauden vakavuuden ja tuloksista [14]. Siten yksilöiden CB

1 -reseptorin immunoreaktiivisuus (CB

1IR) vähintään yhtä suuri kuin mediaani pisteet tietojoukon ilmaantuvuus oli suurempi etäpesäkkeitä diagnoosin, ja suurempi osuus tapauksista on korkea Gleason (indikaattori sairauden vaikeusasteen perusteella morfologia kaksi yleisintä kasvaintyypeille näytteessä [15]) kuin yksilöiden CB

1IR alapuolella mediaani tietojen käyttöä. Lisäksi henkilöille, jotka olivat sen jälkeen odote kunnes ulkonäkö etäpesäkkeitä, korkea CB

1IR tilanne oli liittyä pienempi taudin aiheuttaman selviytyminen [14]. Suhteen FAAH, on raportoitu, että kaupallisesti saatavilla kudosten microarray, ytimien eturauhassyöpäkudoksille oli korkeampi ilmentyminen entsyymin kuin nähdään normaalin kudoksen [12]. Kuitenkaan mitään tietoja välisestä suhteesta FAAH immunoreaktiivisuus (FAAH-IR) ja sairauksien lopputulos esiteltiin. Lisäksi, mahdollisia syitä korkea FAAH-IR tuumorikudokseen ei tutkittu näissä kirjoittajat. Näin ollen tässä tutkimuksessa olemme tutkineet FAAH-IR kudoksessa microarray aiemmin edellisen voimme luonnehtia CB

1IR tuumorikudokseen [14], ja toteutetaan tutkimuksia käyttäen viljeltyjä soluja, onko tunnettu komponentti kasvaimen microenvironment voi vaikuttaa FAAH toimintaan. Lisäksi olemme tutkineet onko FAAH-IR korreloi muiden patogeeniset ja ennustetekijöiden muuttujia, kuten paikallinen kasvain vaiheessa numero ja immunoreaktiiviset pisteet fosforyloidun epidermaalisen kasvutekijän reseptori (pEGFR).

Methods

etiikka lausunto

tutkimus eettinen komitea Uumajan yliopistollisessa sairaalassa (Regional Ethical Review Board Uumajassa) hyväksyi tutkimuksen ja luopua tarvetta tietoisen suostumuksen.

Potilaat

formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut näytteet, joita käytetään tässä tutkimuksessa kerättiin keskussairaalassa, Västerås, Ruotsi, vuodesta 1975 vuoteen 1991 ja yhteensä 412 potilasta diagnosoitu eturauhasen syöpä höyläysleikkaus varten micturation vaikeuksia [16 ]. Läsnäolo metastaasien määritettiin käyttäen luukuvaus pian höyläysleikkaus. Potilaita seurattiin kunnes 2003. 388 tapauksia, joissa kasvain FAAH-IR voitaisiin sai (katso jäljempänä), 281 seurasivat valpas odottaa kunnes ulkonäkö etäpesäkkeitä (tavallinen hoito lähestymistapa tuolloin). Toinen potilasta sai hormonihoitoa, sädehoitoa tai eturauhasen. Gleason pisteet ja prosenttiosuus näytteen, joka sisälsi kasvain arvioitiin kunkin näytteen. Kuolinsyy arvioitiin arvioinnissa potilastietoja. Kudossiruina (ytimet, joiden halkaisija on 0,6 mm) rakennettiin käyttäen Beecher Instrument (Sun Prairie, WI, USA). Kukin kudos microarray dia (56 yhteensä, yleensä porausnäytteistä 8 tapausta dia) sisälsi enintään kahdeksan (yleensä viisi) näytteet kasvainkudoksen (sekä ensimmäisen että toisen Gleason arvosana sisältyivät) ja enintään neljä (yleensä neljä) näytettä ei-pahanlaatuista kudosta kunkin potilaan [16].

immunohistokemia

pääluokat poistettiin parafiini, vedettömät ja sijoitetaan sitraattipuskurissa pH 6,0. Keittämisen jälkeen painekattilassa 60 min, näytteet sijoitettiin veteen ja sitten Ventana puskurissa, minkä jälkeen ne pantiin Ventana -automaattianalysaattoria (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ), johon FAAH-vasta-ainetta (laimennus 1 /2000) ja toissijainen järjestelmä (iView DAB Detection Kit, Ventana Medical Systems Inc.) lisättiin. Käytetty vasta-aine, kanin anti-FAAH nostatettu viimeisen 102 aminohappoa rotan FAAH, on tunnettu siitä, yksityiskohtaisesti [17] ja sen havaittiin tuottavan sopivan värjäyskuvio (stomatodentrinen värjäys pääasiallisen solut) formaliinilla kiinnitetyt kudosta ihmisen hippokampus (tuloksia ei ole esitetty), mikä on yhdenmukaista rotan hippokampuksessa [18], [19]. CB

1 -reseptorin immunoreaktiivisuus (CB

1IR) tulokset olivat saatavilla tietokannassa, ja on raportoitu muualla [14].

Yksittäiset ytimet pisteytettiin mikroskoopilla FAAH-IR toimesta tutkija (LT), joka oli sokea kliiniset tiedot potilaille. Pisteytysjärjestelmään oli oleellisesti sama kuin aikaisemmin käytetty CB

1IR [14]. Lyhyesti, että epiteelikudoksen, ytimet pisteytettiin immunoreaktiivisia intensiteetin (0-3, jossa 0 on poissa ja 3 on korkea) ja jakauma epiteelikudosta (0, 10, 25, 33, 50, 67 tai 100% of koko jakauma kunkin intensiteetti). Jakelu yleisimpiä intensiteetti asetettiin 100 miinus summa muita intensiteettejä. Murto jakelu jokaisena intensiteetti kerrottuna intensiteetti pisteet ja arvot summataan, jolloin saatiin lopullinen pisteet ydin. Siten esimerkiksi ydin voimakkuudet 1 (10%), 2 (10%) ja 3 (loppuosa) (jakelu suluissa) saisivat komposiitti pisteet 1 × 0,1 + 2 x 0,1 + 3 × 0,8 = 2,7 . Kun tunnistettavissa ydin, pohjapinta ja luminaalinen epiteelikudoksen pisteytettiin erikseen. Verisuonten seinämien pisteytettiin samalla tavalla, mutta yksinkertaisempi jakelu (0, 50 ja 100%). Koko pisteytys esimerkkejä hylsyjen pisteytetään 1, 2 ja 3 olivat käsillä vertailun ”sisäinen standardi”. Ytimet, jossa rakenne tai laatu kudoksen ei ollut riittävän hyvä tai jos värjäytyminen oli epäselvää, jätettiin pois tutkimuksesta. Kunkin toimenpiteen, mediaani arvot komposiitti pisteet kunkin potilaan laskettiin ja syötetty tietokantaan toisella tutkija (CF). Mittana luotettavuuden kasvain epiteelin tulokset, 67 ydintä (16 potilasta) pisteytettiin kahdessa eri otteeseen saman tutkija. Spearman korrelaatiokerroin yksittäisen ytimen tulokset välillä pilotin ja varsinainen tutkimus oli 0,76 (n = 67, p 0,0001, 95%: n luottamusväli 0,63-0,85). Intraclass korrelaatiokerroin yhden toimenpiteisiin (ICC (2,1), mitta toistettavuutta pisteytyksen menetelmä) oli 0,67 (95%: n luottamusväli 0,51-0,78, p 0,001).

interleukiini-4 (IL-4) -reseptori immunoreaktiivisuus arvioitiin formaliinilla, parafiiniin kudosleikkeitä käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta solunulkoisen domeenin ihmisen rekombinantti IL-4-reseptorin (MAB230, R seuraavilla jaksoilla denaturointia suoritettiin 94 ° C: ssa 40 s. Sillä FAAH ja CB

1, analyysit mukana 35 jaksoa, kun taas 25 sykliä käytettiin GAPDH.

Quantitative real-time PCR

Lisäksi semikvantitatiivinen PCR yhdistetyistä näytteistä analyysi yksittäisten näytteiden suoritettiin käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Molemmat SYBR Green (FAAH, CB

1, GAPDH) ja TaqMan (ß-aktiini) kinetiikka käytettiin. Sillä FAAH, CB

1 ja GAPDH, edellä kuvattuja alukkeita käytettiin yhdessä Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), kun taas ihmisen ß-aktiini havaittiin käyttäen valmiista pohjamaali -probe mix (Hs00357333_g1, Applied Biosystems) yhdessä TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Monistamiset suoritettiin ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System ja ohjelmistot (Applied Biosystems), ja näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena. Sekä GAPDH ja ß-aktiini käytettiin taloudenhoito geenejä, joilla on samanlaiset tulokset (tiedot ß-aktiini ei esitetty). Suhteellinen ilmentyminen FAAH ja CB

1was lasketaan

Ct

arvoja standardikäyrän menetelmää.

Western Blot

Western blotting, proteiini näytteet elektroforeesissa 10% SDS – polyakryyliamidigeeleillä pelkistävissä olosuhteissa ja fraktioitu proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti Immobilon-P-membraanille (Millipore, Bedford, MA, USA). Membraanit blokattiin yön yli 4 ° C: ssa pyörivässä ravistelijassa 5% rasvatonta maitojauhetta, 0,05% Tween-20 PBS: ssä (PBS: llä T) ennen inkubointia primääristen kanin polyklonaalinen vasta-aine FAAH (1:1000-1 :5000, sama vasta-aine, jota käytetään immunohistokemiallinen osa tutkimuksesta) tai ensisijainen kanin polyklonaalinen vasta-aine aktiini (1:8000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin PBS-T: 3% (FAAH) tai PBS-T 5% (aktiini) rasvatonta maitojauhetta. Inkuboinnin jälkeen peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (Amersham Biosciences), proteiinit havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Biosciences). Molecular koot Proteiinivyöhykkeet määritettiin rinnakkain elektroforeesi molekyylipainomerkkiaineet (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Ruotsi). Proteiinikonsentraatiot määritettiin BSA proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL, USA).

yhdisteet

anandamidia (etanoliamiini-1-

3H, spesifinen aktiivisuus: 2,2 TBqmmol

-1) saatiin American Radiolabeled Chemicals Inc. (St. Louis, MO, USA). Merkitsemätöntä anandamidia ja URB597 saatiin Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA). Interleukiini-4 saatiin Sigma-Aldrich.

Tilastot

lukuun ottamatta Coxin suhteellisen vaarat regressio ja intraclass korrelaatiokerroin analyysit, jotka suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistoa (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), kaikki tilastolliset laskelmat tehtiin käyttämällä tilastollista pakettia rakennettu GraphPad Prism 5 tietokoneohjelma Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Hengissä analyysit, tapahtuma määriteltiin kuolema johtuu eturauhasen syöpä ja syötetty tietokantaan ”event = 1”. Muista syistä johtuvat kuolemat sensuroitiin, kuten myös silloin, kun potilas oli elossa viimeisimmän seurannan. Nämä ryhmiteltiin ”event = 0”. Tapaukset (n = 3) sairaaksi tulos oli tuntematon jätettiin selviytymisen analyysit. Kesto tapahtuma-elinaika määritellään diagnoosista asti eturauhassyövän kuolema, kuolema muista syistä, tai jos kuolema tapahtui, saakka Viimeisimmässä seurannassa.

Receiver operating (ROC) käyriä käytetään määrittämään raja-arvot on FAAH-IR, joka käytettiin sitten rakentaa eloonjäämiskäyristä käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmää. Erot tulos ryhmien välillä testattiin log-rank-testi. Coxin suhteellisen vaarat Regressioanalyysistä tehtiin arvioimaan vaikutuksen FAAH pisteet kun lopputulos eri CB

1IR cutoffs. Erot jakelu muuttujien välillä potilasryhmille analysoitiin käyttäen chi-neliö testi.

lukijoille tuttuja tilastollisia menetelmiä käytetään arvioitaessa vaikutuksen FAAH-IR upon tauti tulos, lyhyt selitys niiden käyttökelpoisuus on perusteltua, erityisesti suhteessa valintaan raja-arvojen FAAH-IR. ROC Testi on alunperin kehitetty helpottamaan tulkintaan tutkasignaalia, ja piirtää määrä tosi negatiivit (1- väärien positiivisten fraktio, jota kutsutaan 1 – spesifisyys)

vs.

Utaretulehdusmallia (herkkyys) tietyllä sulku arvo (eli tapaukset, joiden pistemäärä on yhtä suuri tai suurempi kuin valittu arvo). Alue ROC-käyrän alla voidaan laskea. Jotta testi mitään diagnostista arvoa, käyrä on suora viiva, jossa ala on 0,5. Täydellinen testi antaisi arvoa 1,0, joten kauempana 0,5 arvo, sitä parempi testi. Jotta testi, jonka AUC merkittävästi suurempi kuin 0,5, tärkeä kysymys on valinta raja, arvo valitaan signaalin siitä, että potilas voi olla kyseisen taudin. Jos raja-arvo on asetettu pieni, niin herkkyys on korkea, mutta siellä on suuri määrä vääriä positiivisia. Jos raja-arvo on asetettu korkealle, niin määrä vääriä positiivisia on pienempi, mutta suuri joukko utaretulehdusmallia jää saavuttamatta. Valinta katkaisu on siis kompromissi maksimoimalla oikeilla positiivisilla löydetty ja pienin mahdollinen määrä vääriä positiivisia. Valinta sulku riippuu suhteellinen merkitys puuttuu utaretulehdusmallia

vs.

Misdiagnosing totta negatiivit kyseistä tautia, mutta hyödyllinen tapa tunnistaa optimaalinen sulku on määrittää cutoff pisteen maksimivaikutus pystysuora etäisyys välillä havaittu arvo ja vastaava arvo testi ilman diagnostista arvoa, laskettuna maksimi herkkyys + spesifisyys -1. Tämä arvo nimitetään Youdenin indeksi, J, ja olemme käyttäneet tätä arvoa täällä FAAH-IR (kutsutaan J

FAAH). Hyödyllisiä katsauksia ROC käyrät ja valinta optimaaliset raja-arvot, katso [22] – [24].

Mitä tilastolliseen analyysiin eloonjäämiskäyristä, Kaplan-Meier menetelmä, jossa erot tulos välillä ryhmiä testataan log-rank testi, on hyödyllinen (ja visuaalinen) arviointimenetelmän eroja eloonjäämiskäyrien. Coxin suhteellinen vaaratekijät regressioanalyysisarjoissa vaara ”funktiona selittävät muuttujat ja tuntemattomia regressiokertoimia kerrottuna mielivaltainen ja tuntemattoman ajan funktiona” (lainaus alkuperäisestä paperi Cox [25]), eli arvioi osuus eri mahdollisten riskitekijöiden päähän pisteen mitattuna (tässä tapauksessa johtuvan kuoleman eturauhassyöpä) tekemättä oletuksia perus selviytymisen käyrä itse.

tulokset

jakelu FAAH immuunivaste ei- pahanlaatuinen ja kasvainkudoksen

FAAH-IR pisteytettiin vuonna porausnäytteistä kaikkiaan 412 potilasta. Näistä kirjaa kuusi potilasta ei löydy tietokannasta, ja niin tietoja näitä potilaita ei sisällytetty analyyseissä.

Esimerkki FAAH-IR ei-pahanlaatuinen kudos on esitetty Kuva. 1A. FAAH-IR nähtiin epiteelisoluissa, ja verisuonissa sekä soluissa (mahdollisesti lymfosyyttejä, jotka ilmentävät FAAH [26]) tunkeutuu strooman joissakin ydintä. Kaikkiaan 1247 porausnäytteistä 377 potilasta pisteytettiin hyvänlaatuisen epiteelin FAAH. Näistä 733 porausnäytteistä 307 tapausta oli määriteltävissä pohjapinta: luminaaliseen morfologia ja FAAH-IR näissä tapauksissa pisteytettiin erikseen ja analyyseissa. Lisäksi, 993 ytimien 369 tapausta pisteytettiin FAAH-IR verisuonten seinämiin. Kumulatiivinen pisteiden Perusinsuliinin ja luminaalinen epiteelisolujen esitetään kuviossa. 1B, jossa on selvää, että mediaani FAAH-IR on suurempi pohjapinta epiteelisolujen kuin onteloerityssolut. Itse asiassa on 733 ytimien teki, pohjapinta FAAH-IR tilanne oli korkeampi kuin vastaava luminaali pisteet 724 ydintä ja molemmat tulokset olivat yhtä 9 sydämiä. Luminaaliselle tilanne oli koskaan korkeampi kuin pohjapinta pisteet. Verisuoneen FAAH-IR teki hieman eri tavalla, joten suora vertailu arvoja ei ole merkitystä. Oli kuitenkin merkittävä korrelaatio perustason FAAH-IR ja verisuonten FAAH-IR, mutta ei välillä luminaaliselle ja verisuonen FAAH-IR (taulukko 1).

Paneeli A. Esimerkki FAAH-IR ydin ei-pahanlaatuinen eturauhasessa saatu höyläysleikkaus peräisin 75-vuotiaan potilaan. Tähdet osoittavat verisuonia, ja # symboli ilmaisee FAAH positiivisissa soluissa, oletettavasti tunkeutuvia lymfosyyttejä. Paneelissa C FAAH-IR ydin tuumorikudosta 64 vuotta vanha potilaan on esitetty. Viivat oikeassa yläkulmassa edellä ytimet osoittavat 100 pm. Paneeli B esittää kumulatiivisen taajuudet FAAH-IR pisteet pohjapinta ja luminaalinen ei-pahanlaatuinen (N) epiteelikudoksen (n = 307 kummassakin tapauksessa), ja kasvaimen (T) epiteelikudoksen (n = 388). Mediaaniarvot (jossa kvartiiliväli suluissa) olivat: pohjapinta (N), 2,625 (2,125-2,9); luminaali- (N), 1,25 (1-1,75); epiteelin (T), 2,05 (1,8-2,3). Mediaaniarvot olivat merkittävästi erilaisia ​​toisiinsa nähden (p 0,001, Dunn monivertailutesti merkittävien Kruskal-Wallisin testi). Paneelissa D esitetään suhteessa epiteelin kasvain FAAH-IR on Gleason (GS) diagnoosi. FAAH-IR pisteet jaettiin neljänneslohkoihin jossa olen viittaa tulokset välillä 1,8 (n = 96), II välillä 1,8 ja 2 (n = 94), III välillä 2,05 ja 2,25 (n = 99) ja IV välillä 2,3 ja 3 (n = 99). Jakauma GS ryhmistä oli merkitsevästi erilainen neljännesten (χ

2 = 27,03, df = 9, p 0,0005).

Yhteensä 1851 ytimien 388 tapausta pisteytettiin FAAH-IR kasvaimen epiteelisolujen. Sillä verisuonia, 1201 porausnäytteistä 360 potilasta sai. Eräs esimerkki värjäytymisen kasvaimen ydin on esitetty kuviossa. 1C ja kumulatiivinen epiteelin tulokset on esitetty kuviossa. 1B, jossa se voidaan nähdä, että mediaani pistemäärä oli merkittävästi suurempi kuin ei-pahanlaatuinen luminaaliselle pisteet, mutta pienempi kuin pohjapinta pisteet.

Käytetyt näytteet tässä on aikaisemmin tutkittu meille suhteen ilmaus epiteelin CB

1-reseptoreihin [14]. Ei-pahanlaatuinen näytteitä, ei ollut merkitsevää korrelaatiota CB

1IR tulokset ja joko pohjapinta, luminal tai verisuonen FAAH-IR. Sitä vastoin merkittävä korrelaatio kasvaimen CB

1IR ja kasvaimen epiteeli- ja verisuonten FAAH-IR havaittiin (taulukko 1).

FAAH aktiivisuutta eturauhassyövän solulinjoissa vaikuttaa interleukiini-4

Yksi selitys havainto, että kasvain epiteelin FAAH-IR on suurempi kuin FAAH-IR normaalissa eturauhasessa epiteelikudoksessa [12] on, että ainesosana kasvaimen microenvironment vaikuttaa sen toimintaan. T

H2 sytokiini-interleukiini-4 (IL-4), joka on raportoitu säädellä FAAH ja CB

1 reseptoreita lymfosyyttien ja Jurkat-soluissa [26] – [28], on mukana patogeneesiin useiden syövän tyypit, mukaan lukien eturauhassyöpä (katso [29] – [35]). IL-4-reseptorit on raportoitu sekä kasvaimen epiteelisoluissa ja viljellyissä eturauhassyövän solulinjoissa [29], [36]. Olemme vahvisti IL-4 IR eturauhassyövässä epiteelikudoksessa (Fig. 2A), ja todettiin, että inkubointi sekä ihmisen androgeenireseptorin-herkkä PC-3-soluissa ja rotan Dunning R3327 AT-1 syöpäsolujen kanssa IL-4: ssa 24 h tuotti merkittävän kasvun FAAH solujen aktiivisuus (kuvio. 2B ja C). Samanlainen tulos havaittiin ihmisen eturauhassyövän LNCaP-soluja (tietoja ei esitetty). Tämä vaikutus IL-4 ei ole ainutlaatuinen eturauhasen syöpäsolujen, koska se havaittiin myös hiiren P19 teratokarsinoomasolua (Fig. 2D).

paneeli A, IL-4-reseptorin immunoreaktiivisuus eturauhaskasvainnäytteen kudosnäyte ( Gleason pisteet 8). Rivi vasemmassa alareunassa kuvan edustaa 100 um. Paneelit B-D, vaikutus IL-4 kun FAAH aktiivisuus ihmisen PC-3-eturauhassyöpäsoluilla (B); rotan R3327 AT-1 syöpäsolujen (C) ja hiiren P19 teratokarsinoomasolua (D). Solulinjoista inkuboitiin 24 h 5 ng /ml IL-4 ja FAAH aktiivisuus soluhomogenaattien määritettiin käyttäen 2 uM [

3H] anandamidia substraattina. Entsyymiaktiivisuus kaikissa tapauksissa oli täysin estänyt selektiivinen FAAH estäjä URB597. Tiedot ovat keskiarvoja ja s.e.m., n = 4-5; * P 0,05, ** p 0,01, pariksi t-testiä. In Paneelit (E) ja (F) PC-3 ja LNCaP-soluja inkuboitiin IL-4 (5 ng /ml) 24 tuntia. RNA: n, cDNA-synteesi ja PCR-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu ”Menetelmät” osiossa. Paneeli E. Semi-kvantitatiivinen PCR-analyysi FAAH mRNA: n ekspression PC-3 ja LNCaP. MRNA ilmentyminen FAAH normalisoitui vastaan ​​GAPDH. Semi-kvantitatiivinen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen yhdistettyä näytettä (n = 6). Paneeli F. Quantitative reaaliaikainen PCR-analyysi FAAH mRNA ilmaisun, normalisoitu vastaan ​​GAPDH. Kvantitatiivinen PCR tiedot visualisoitiin välineet (n = 6) ja sem, jossa käsittelemättömän kontrolliryhmän keskiarvo on määritelty 100%.

Seuraavissa kokeissa, vaikutukset IL-4 hoidon yhteydessä FAAH-proteiinia ja mRNA arvioitiin. Hoito PC-3 ja LNCaP-solujen IL-4 24 tunnin ei säädellä mRNA ilmentymistä FAAH arvioituna sekä semikvantitatiivinen PCR ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (kuvio 2E, 2F). Lisäkokeessa, PC-3-soluja käsiteltiin IL-4 (5 ng /ml) 3 tuntia, tutkia alussa säätely FAAH ilmentymisen. Samanlainen 24 h kokeen, mutta hoito PC-3-solujen IL-4: ssa 3 h ei säädellä mRNA: n ilmentymistä FAAH (tuloksia ei ole esitetty). Toisin kuin tilanne Jurkat-solujen ja T-lymfosyyttien, ilmaus CB

1 LNCaP-soluissa ei säädellä IL-4: suhteellinen ekspressio CB

1 /GAPDH (% käsittelemättömien kontrollien, välineet ± sem, n = 6) sen jälkeen, 24 h hoidon joko vehikkeliä tai IL-4 oli 100 ± 33 ja 109 ± 20, vastaavasti. PC-3-solujen käytetty meidän lab ei ilmaissut havaittavia määriä CB

1 mRNA (tuloksia ei ole esitetty).

Alustava Western blotit analyysit tehtiin myös käyttämällä lysaatit PC3 soluista käsiteltiin 24 h joko vehikkeliä tai 5 ng /ml IL-4.