Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

KIAA0101 on lisääntyvän solun tuma-antigeenin liittyvä tekijä, joka yli-ilmentyy joissakin ihmisen syöpäsairauksia. Lisämunuaiskuoren kasvain on yksi yleisimmistä ihmisen kasvaimet, joiden molekyyli- syyt tunnetaan huonosti. Lisäksi on vaikea erottaa paikallinen hyvän- ja pahanlaatuiset lisämunuaiskuoren kasvaimet. Näistä syistä olemme tutkineet ilmaisua, funktio ja mahdollinen mekanismi häiriöstä KIAA0101 ihmisen lisämunuaisen kuorikerroksen kasvain.

Menetelmät /Principal Havainnot

KIAA0101 mRNA ja proteiinin ilmentyminen tasot määritettiin 112 lisämunuaiskuoren kudoksen näytteet (21 normaali lisämunuaisen kuorikerroksen, 80 hyvänlaatuiset lisämunuaiskuoren kasvaimet, ja 11 lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC). siRNA knockdown käytettiin määrittämään toiminnallista roolia KIAA0101 soluproliferaatioon, solusyklin, apoptoosin, pehmeä agar ankkurointi riippumatonta kasvua ja invaasiota ACC solulinjaa, NCI-H295R. lisäksi selvitimme mekanismi KIAA0101 dysregulation tutkimalla mutaatiostatuksesta riippumatta. KIAA0101 mRNA (9,7-kertainen) ja proteiinin ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi ACC (p 0,0001). KIAA0101 oli harvaa proteiinin ilmentymistä vain harvoja lisämunuaiskuoren näytteitä, joka rajoittui lisämunuaiskuoren esisolujen. KIAA0101 ekspressiotasot olivat 84% tarkka erottamiseksi ACC ja normaalin ja hyvänlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvain näytteissä. Knockdovvn KIAA0101 geenin ilmentymisen merkittävästi vähentynyt ankkurointi riippumaton kasvua 80% ja hyökkäystä 60% (p = 0,001; p = 0,006). Emme löytäneet mutaatiot KIAA0101 ACC.

Johtopäätökset /merkitys

KIAA0101 yliekspressoituu ACC. Meidän tiedot tukevat että KIAA0101 on merkkiaine soluproliferaation, edistää kasvua ja hyökkäyksen, ja on hyvä diagnostinen merkkiaine erottaa hyvänlaatuista pahanlaatuisia lisämunuaiskuoren kasvain.

Citation: Jain M, Zhang L, Patterson EE, Kebebew E (2011) KIAA0101 yli-ilmennetään, ja edistää kasvua ja Invasion lisämunuaisen syöpä. PLoS ONE 6 (11): e26866. doi: 10,1371 /journal.pone.0026866

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 05 lokakuu 2011; Julkaistu: 11 marraskuu 2011

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lisämunuaisen kasvaimet ovat yksi yleisimmistä ihmisen kasvaimet, havaitaan usein muuten [1]. Useimmat lisämunuaisen kasvaimet ovat hyvänlaatuisia, mutta se on usein vaikea sulkea pois pahanlaatuinen kasvain, kuten lisämunuaiskuoren syöpä. Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC) on harvinainen maligniteetti lisämunuaisen kuoren kanssa huonosti mekanismi kehitystä, ja synkkä potilaiden hoitotuloksiin puutteen takia tehokkaan hoidon [2]. Vuosittainen ilmaantuvuus ACC on noin 1-2 tapausta miljoonaa [3], [4], [5]. Täydellinen kirurginen resektio on ainoa mahdollinen parantavaa hoitoa, mutta yli kaksi kolmasosaa potilailla esiintyy etäpesäkkeitä ja jopa ne potilaat, joilla on täydellinen resektio kehitettävä uusiutuva sairaus yli 50%: ssa tapauksista [2], [6]. Metastasoivaa tautia sairastavaa potilasta on viiden vuoden eloonjäämisaste on alle 10% ja joilla on uusiutuva sairaus on viiden vuoden eloonjääminen vain 50% [2], [6].

ACC voi liittyä perinnöllinen syöpä oireyhtymät kuten Beckwith-Wiedemann oireyhtymä (liittyy ituradan 11p15 kromosomaalisia muutoksia johtaen

IGF2

yliekspressio, OMIM # 130650), Li-Fraumeni oireyhtymä (

TP53

mutaatio, OMIM # 151623) , useita hormonitoimintaa neoplasia tyyppi 1 (mutaatiot Menin tuumorisuppressorigeeniä, OMIM # 131100), ja Gardnerin oireyhtymä (

APC

mutaatio, OMIM # 175100). Geneettinen muutokset liittyvät perinnöllinen syöpien hoitamiseksi ovat antaneet tärkeää tietoa mahdollisista molekyylitason mekanismeja ACC. Kuitenkin useimmiten ACC ovat satunnaisia, ja molekyyli tapahtumia, jotka johtavat taudin alkamisen ja etenemisen lisämunuaiskuoren kasvaimet ovat edelleen epäselviä.

Genominlaajuiset geeniekspressioprofilointi on tärkeitä käsityksen molekyyli polkuja, jotka ovat väärin säädellystä syövässä ja voi olla mukana kasvain taudin alkamisen ja etenemisen. Koska molekyylimekanismi lisämunuaiskuoren syövän synnyn on huonosti ymmärretty, cDNA microarray-analyysi lisämunuaiskuoren kasvaimet on käytetty paljastaa geenit, joiden misexpression liittyy ACC [7], [8], [9], [10], [11]. Niistä geenit, joiden havaittiin olevan yliaktiivista ACC, KIAA0101 (tunnetaan myös nimellä L5, PAF, OEATC1, NS5ATP9, OEATC-1, p15) on uusi potentiaali ja ennustavia markkeri, ja kohde ACC terapiassa. KIAA0101 koodaa lisääntyvien solun tuma-antigeenin (PCNA) -associated tekijä tuntemattoman funktion. KIAA0101 yliekspressoituu ihmisen maligniteettien kuten hepatosellulaarinen ja haimakarsinooma- [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21 ], [22]. Kuitenkin rooli KIAA0101 syövän ja mekanismi johtaa säädeltyyn ilmaus KIAA0101 on epäselvä.

Tässä tutkimuksessa olemme käsitelleet näitä kysymyksiä ja osoitti, että KIAA0101 yliekspressoituu ACC ja merkkiaine solujen lisääntymisen. Lisäksi vähentää KIAA0101 ilmentyminen ACC johtivat kasvun hidastuminen ja hyökkäys viittaa siihen, että KIAA0101 näyttelee onkogeenisessä rooli ACC.

Methods

Tissue yksilöitä

The National Cancer Institute Review Board hyväksyi tutkimuspöytäkirja jälkeen ilmoitti kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Lisämunuaisen kudokset jäädytettiin aikaan leikkauksen ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Tässä tutkimuksessa 112 ihmisen lisämunuaiskuoren kudosnäytteiden analysoitiin myös 21 normaalia lisämunuaisen kuoren kudoksissa, 80 hyvänlaatuiset lisämunuaiskuoren kasvaimet, ja 11 ensisijainen lisämunuaiskuoren karsinoomien (78 hyvänlaatuisia lisämunuaiskuoren kasvaimia ja 11 ensisijaisen lisämunuaiskuoren karsinoomien aiemmin analysoitu) [11]. Riippumaton joukko ACC etäpesäkkeitä (n = 29) ja uusiutumisen (n = 2) käytettiin myös vahvistettavaksi. Diagnoosi yksiselitteinen ACC ja hyvänlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvain varmistui kaikissa tapauksissa histologista tutkimusta ja kliinistä seurantaa. Keskimääräinen seuranta-aika oli 26,3 kuukautta potilailla, joilla on hyvänlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvaimia ja 44,4 kuukautta potilailla, joilla on ACC.

Soluviljely

NCI-H295R ACC solulinja (ATCC, Rockville, MD ) kasvatettiin ja ylläpidettiin DMEM täydennetty 1% ITS + Esiseos (BD Biosciences, San Jose, CA), 2,5% Nu-Serum I (BD Biosciences), ja 10000 U /ml penisilliiniä /streptomysiiniä tavanomaisessa kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun soluja siirrostettiin 24 ja 6-kuoppaisille levyille (4 x 10

^ 4 solua 0,5 ml: ssa ja 1,6 x 10

^ 5 solua 2 ml), solut transfektoitiin epäspesifinen negatiivisen kontrollin siRNA ja jonka KIAA0101 tietyn siRNA lopullisessa pitoisuudessa 40 ja 80 nM (AM4636 ja AM46235, vastaavasti, Applied Biosystems, Foster City, CA). Kauttakulku siQuest reagenssia (Mirus Bio, LLC) käytettiin tuottamaan siRNA soluihin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Knockdown tehokkuus oli samanlainen 40 ja 80 nM. Kaikki in vitro määritykset tehtiin sekä 40 ja 80 nM konsentraatio KIAA0101 erityisiä siRNA: iden ja ei-spesifinen negatiivisena kontrollina.

RNA ja proteiini valmistus

-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia noudattamalla valmistajan ohjeita ( Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). RNA määrän ja laadun arvioitiin käyttämällä NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer) ja Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), vastaavasti.

RIPA puskuria käytettiin valmistettaessa kudosta lysaatit ja kokosolulysaatissa valmistettiin 1% SDS plus 10 mM Tris [pH 7,5] puskuria. Proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen BioRad RC DC-proteiinin määritys (Hercules, CA).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen Käänteiskopiointia polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA (125 ng) käänteistranskriboitiin käyttäen RT kirjoitus cDNA synteesi kit (USB Corporation, Cleveland, OH). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR: ää käytettiin mittaamaan mRNA: n ekspression tasojen suhteen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) mRNA: n ilmentymisen. Normalisoitu geenien ilmentyminen taso = 2

– (Ct

on kiinnostavan geenin – Ct

GAPDH) x 100%, jossa C

t on PCR-sykliä kynnys. PCR-alukkeiden ja koettimien KIAA0101 (Hs00207134_m1) ja GAPDH (Hs99999905_m1) saatiin yhtiöstä Applied Biosystems (määritys-on-Demand Kit®, Foster City, CA). Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin lopputilavuudessa 20 ui, 1 ui cDNA-templaattia ABI PRISM®7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). PCR lämpösyklilaite ehto oli 95 ° C: ssa 12 minuuttia, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

Western blot-analyysi

Proteiininäytteet (40 ug) erotettiin 4%: sta 20% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western blottaus suoritettiin tavanomaisten menettelyjen mukaan käyttäen ensisijaista hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, anti-KIAA0101 (Abcam; ab56773) klo 1:100 laimennus ja anti-β-aktiini (sc-81178, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) klo 1: 2000 laimennus. Signaalin havaitseminen suoritettiin käyttäen HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja parannetun kemiluminesenssi-kittiä (Amersham Pharmacia Biotech).

immunohistokemiallinen (IHC) ja Immuunofluoroscence värjäys

Kasvaimen kudokset formaliinilla, upotettiin parafiiniin, ja 5 mikronin paksuisia leikkeitä leikattiin immunovärjäämistä. Leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen anti-KIAA0101 hiiren monoklonaalinen vasta-aine on 1:300 laimennus yön yli 4 ° C: ssa (Abcam; ab56773), jota seurasi biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (1:150; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Osiot kehitettiin käyttäen 3,3′-diaminobentsidiiniä DAB kromogeenille (ABC eliitin kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ja hematoksyliinillä kuin vastavärinä. Leikkeet rehydroitiin ja asentaa vectamount kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Objektilasit skannattiin alla Olympus valomikroskoopilla (Nikon, Tokio, Japani) ja kuvat otettiin 20X ja 40X suurennoksia. Puolikvantitatiivinen pisteytystä käytettiin analysoimaan KIAA0101 ilmaisu; ilmentymistaso oli luokiteltu mitään värjäytymistä (0), 30% soluista värjäämällä (1), 30-50% soluista (2) ja 50% soluista. Kaksi tarkkailijaa, jotka olivat sokaissut kasvaintyyppi itsenäisesti sijoitettiin kunkin näytteen. Tulokset laskettiin keskiarvo saamiseksi lopulliseen KIAA0101 ilmaisua pisteet.

Immuunofluoroscence värjäys suoritettiin käyttäen ensisijaisena anti-KIAA0101mouse monoklonaalinen vasta-aine on 1:300 laimennus yön yli (Abcam; ab 56773) ja kanin anti-SF-1 (Millipore , 07-618, 2 ug /ml) 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aineet havaittiin fluorofori on konjugoitu RedTX anti-kani-IgG: llä (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja FITC-anti-hiiri-IgG-vasta-aineita (Vector Laboratories). Sitten lasit huuhdottiin ja kiinnitettiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) asennus ratkaisu. Kuvat analysoitiin Zeiss Axioskop-2 mikroskoopilla 20X ja 40X suurennoksia.

DNA Purification

Genominen DNA eristettiin 1 mg kasvaimen ja normaali näytteitä käyttäen QIAamp DNA veren Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Saksa), eluoitiin kokonaistilavuudessa 200 ui, ja niitä säilytettiin -20 ° C: ssa. DNA-konsentraatiot mitattiin UV-absorbanssilla käyttäen NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer).

Sequencing KIAA0101 koodaavan alueen

KIAA0101 eksonit 1, 2, 3 ja 4 sekvensoitiin. PCR-alukkeet on suunniteltu koodaavan alueen käyttäen UCSC genomin selaimen, Primer 3 integroitu ohjelmisto. Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 1. Alukkeet tehtiin IDT, Inc. (Coralville, IA). Eksonit 1, 2, 3 ja 4 monistettiin kolme erillistä reaktiota, 50 ui käyttäen PCR master mix (Fermentas Inc. USA). Standardi PCR-olosuhteet olivat alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 5 min, pariutuminen 50 ° C: ssa 1 min, pidentäminen 72 ° C 1 min ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 min. PCR-tuotteet tehtiin näkyviksi 2% agaroosigeelillä. Tuotteet puhdistettiin käyttäen standardia Exo-nukleaasi I ja FastAP (Fermentas Inc.). Puhdistetut PCR-tuotteet sekvensoitiin käyttämällä ABI sekvensseri 3730xl iso väriaine menetelmällä (DNA Sequencing Kit, iso väriterminaattorireaktioita syklisekvensointireagenssipakkausta; Applied Biosystems). Mutaatiot analysoitiin Mutaatio Surveyor V 3.3 Programme (Soft Genetics, www.softgenetics.com). Kaikki sekvensointi tiedot on talletettu GenBank-tietokantaan.

Solujen lisääntyminen

Solut ympättiin 96-kuoppaiselle levylle konsentraatiossa 5 x 10

^ 3-soluja 100 ui elatusaineeseen kuudessa rinnakkaista. Kussakin aikapisteessä, alusta imettiin pois kuopasta ja solut pakastettiin välittömästi -80 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Levyjä sulatettiin huoneen lämpötilassa, ja valmistettiin solujen määrä kvantifiointi käyttäen CyQuant ™ määritys (Invitrogen, Carlsbad, CA). CyQuant määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden ja analysoitiin fluorometrisellä mikrolevylukijalla (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 480 nm /520 nm.

Virtaussytometria ja apoptoosin analyysit

KIAA0101 ja negatiivinen kontrolli siRNA käsiteltyjä soluja kerättiin, etanoli-kiinteä yön yli 4 ° C: ssa, ja suspendoitiin uudelleen 1 x PBS: ään konsentraatiossa 1 x 10

^ 6 solua /ml. Soluja käsiteltiin DNaasi-vapaata RNaasi (100 ug /ml) 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut värjättiin propidiumjodidilla pitoisuudella 50 ug /ml ja näytteitä säilytettiin 4 ° C: ssa. Virtaussytometria-analyysi suoritettiin Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Datatiedostot kertyi 20000 tapahtumien (solut) käyttäen CellQuest ohjelmistoa. Osa koko solupopulaation, joka on läsnä G1, S ja G2 /M-solusyklivaiheista saatiin ModFit LT-ohjelmisto (Verity Software House, Inc.). Apoptoosi analyysi tehtiin käyttämällä anneksiini V värjäystä (ApoAlert® anneksiini V apoptoosin Kit) mukaan valmistajan ohjeiden (Clontech, Mountain View, CA).

Soft agar ankkurointi riippumattoman kasvun määrityksessä

Kaksi- layered pehmeä agar määritykset suoritettiin kuuden kuoppalevyillä. Pohjakerroksen agar (2 ml /kuoppa) sisälsivät 0,5% agaria (Difco Noble-agar, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) yllä-. Viisi päivää siRNA transfektion jälkeen solut trypsinoitiin, laskettiin ja 50000 solut sekoitettiin 1,3 ml: aan top agaria liuosta, jota oli täydennetty 10% Nu-seerumia (0,3% agar elatusaineissa). Jähmettynyt agar peitettiin 1 ml viljelyalustaa, joka sisälsi 10% Nu-seerumia. Levyjä viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO

2, ja media vaihdettiin kahdesti viikossa. Kun 16 päivän viljelyn solun pesäkkeet värjättiin 0,2% kristalliviolettiliuoksella ja tutkittiin mikroskoopilla. Pesäkkeet laskettiin 5 eri aloilla kohti ja vahvisti TotalLab Quant v11 ohjelmisto (https://www.totallab.com/).

Cell invaasiomääritys

laajuus soluinvaasiota oli arvioitiin käyttämällä BD BioCoat ™ matrigeelin ™ Invasion jaosto (BD Biosciences, Bedford, MA), mukaan valmistajan protokollaa. Yhteensä 1 x 10

^ 5-solut ympättiin insertit (8-uM pore size polykarbonaattikalvosuodattimia), joka on päällystetty ohuella kerroksella Matrigel tyvikalvon Matrix (BD Biosciences). Insertit pantiin 24-kuoppalevylle, jossa oli 10% seerumia sisältävää viljelyalustaa tai media ilman seerumia. Levyjä inkuboitiin 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut, jotka hyökkäsivät matrigeelin matriisi alapintaan kalvon kiinnitettiin ja värjättiin Diff Quik Stain (Dade Behring, Newark, DE, USA) ja laskettiin valomikroskoopilla. Neljä kentät neljässä eri neljännesten Kunkin kalvon laskettiin ja keskiarvo.

TILASTOANALYYSI

Jatkuva Aineisto esitetty keskiarvona ± keskihajonta (S.D.). Kaksisuuntainen ANOVA monen vertailun

t

-testi käytettiin arvioitaessa eroa keskimääräisen ilmaisu keskuudessa normaali, hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset näytteitä. Pearsonin korrelaatio testiä käytettiin jatkuvan datan.

p

-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Analyysi tehtiin Stat View 5,0 (Cary, NC) ja SPSS v 16,0 (Chicago, IL) tilastolliset ohjelmistot.

Tulokset

KIAA0101 mRNA ja proteiini ovat erittäin ilmaistaan ​​lisämunuaiskuoren kasvain

ilmentyminen KIAA0101 mRNA oli merkittävästi korkeampi ACC verrattuna normaaliin lisämunuaiskuoren kudoksen ja hyvänlaatuisia lisämunuaisen kuorikerroksen kasvaimet (12 kertaa suurempi kuin normaali ja 9 kertaa suurempi kuin hyvänlaatuisia, p 0,0001) (kuvio 1A). Lisäksi, KIAA0101 mRNA-ilmentymisen määrä oli pienempi metastaattisen ja toistuvien kasvainten verrattuna ensisijaisen ACC (p 0,001) B

A) KIAA0101 mRNA: n ilmentymisen normaalissa lisämunuaisen kuoren (n = 21), hyvänlaatuiset lisämunuaiskuoren kasvaimet (N = 80), ACC (N = 10), metastasoitunut ja toistuvia ACC (n = 30) ja NCI-H295R solulinjassa. KIAA0101 mRNA: n ekspression taso määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä ja normalisoitiin GAPDH mRNA: n ilmentymisen. Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskihajonta rinnakkaisten määritysten. Tilastollinen merkittävää eroa on merkitty tähdellä (*) (p 0,05, Kruskal Wallis testi). Ensisijainen ACC vs. normaali (p 0,0001), ensisijainen ACC vs. hyvänlaatuisia lisämunuaisen kuorikerroksen kasvaimet (p 0,0001) ja ensisijaisen ACC vs. etäpesäkkeitä (p 0,0001). B) ROC-käyrä analyysi KIAA0101 mRNA ilmaisun. Vastaanotin toimii ominaiskäyrä (ROC) on kuvattu kuvaajan käyttäen RT-PCR-ilmentymisen tiedot KIAA0101 normalisoitiin GAPDH normaalissa lisämunuaisen kuoren (n = 21), hyvänlaatuiset lisämunuaiskuoren kasvaimet (n = 80), ACC (n = 10). Alue käyrän alla (AUC) oli 0,78. Täydellinen diagnostinen markkeri ilman vääriä negatiivisia tai vääriä positiivisia olisi AUC 1. C) KIAA0101 proteiinin ilmentymistä ACC. KIAA0101-proteiinin ekspressiotasot normaalissa lisämunuaisen kuoren (n = 5), hyvänlaatuinen (n = 13), ja pahanlaatuiset lisämunuaiskuoren kasvaimet (n = 3), kuten on esitetty tyypillinen Western blot KIAA0101 erityisiä ja β-Actin kontrollivasta-aineilla. p-Actin signaalia käytettiin kontrollina proteiinimäärän. C = ACC, B = hyvänlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvain, ja N = normaali lisämunuaisen kuoren. D) hajontakuvio KIAA0101 mRNA ja ekspressiotaso normaaleissa, hyvän- ja pahanlaatuisten lisämunuaiskuoren kudosnäytteistä. Y-akseli esittää normalisoitua mRNA: n ilmentymisen kvantitatiivisen RT-PCR ja X-akseli esittää ekspressiotaso samasta näytteestä perustuu bändi densitometrisesti mittaus normalisoida p aktiinin ekspressiotason. Spearmen korrelaatiokerroin (r) = 0,61, p 0,001. E) immunohistokemiaallisesti KIAA0101 proteiinin ilmentymistä normaalissa lisämunuaisen kuoren kudoksessa, hyvänlaatuiset kasvaimet ja ACC. Kuvat ovat näkyvät kunkin kategorian 20X suurennus. Nuoli osoittaa positiivisen tumavärjäystä varten KIAA0101. Normaalissa kudosnäytteitä, vain subcupsular alue oli positiivinen. F) KIAA0101 solusijaintipaikan analysoitiin immunoflouroscence. Tumat värjättiin DAPI (sininen), punainen väri osoittaa KIAA0101 ilme. Kuvat ovat peräisin pahanlaatuista ACC ja normaalit näytteet näkyvät 20X suurennus.

Koska merkittävä ilmaisu eroa mRNA välillä hyvän- ja pahanlaatuisia kasvaimia, olimme kiinnostuneita arvioitaessa jos KIAA0101 oli tarkka diagnostinen ennustaja kasvain tyyppi. KIAA0101 ilme oli 84% tarkka erottamiseksi ACC ja normaalin ja hyvänlaatuinen lisämunuaisen kuorikerroksen kasvain näytteet (lukumäärä oikeita positiivisia ja negatiivisia tuloksia jaettuna näytteen numeron käyttämällä sulku taso 1,5). Pinta-ala saa operaattori (ROC) (AUC) oli 0,78 KIAA0101 mRNA: n ekspression (kuvio 1 B), 0,79 kasvaimen koon, ja 0,85 yhdistelmä KIAA0101 ilmentymisen ja kasvaimen kokoa.

Lisäksi korkea mRNA ilmaisu, KIAA0101 -proteiiniekspressio myös koholla ACC verrattuna normaaliin lisämunuaisen kuoren ja hyvänlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvain näytteissä. Western blot, löydettiin suurempi ekspressio ACC (n = 3) kuin hyvänlaatuiset adrenokortikaalisen kasvain (n = 13), ja normaalissa lisämunuaisen kuoressa näytteitä (n = 5) (kuvio 1 C). Siellä oli hyvä korrelaatio KIAA0101 mRNA ja proteiini ekspressiotasot (kuvio 1D, r = 0,61, p 0,001). Arvioidaan tarkemmin KIAA0101 ilme, suoritimme semikvantitatiivinen analyysi kudoksen array, joka sisältää pieniä osia hyvänlaatuisia ja pahanlaatuisia kasvaimia immunohistokemiallisesti varten KIAA0101 proteiinia. Tämä analyysi ei havaittu huomattavia eroja KIAA0101 proteiinin ilmentymisen välillä hyvän- ja pahanlaatuiset kasvaimet (p = 0,31). Tämä ei ole yllättävää, koska proteiinien ilmentyminen semikvantitatiivinen menetelmä ja ei välttämättä tunnista pienempiä eroja proteiiniekspressiossa. Kuitenkin, kun KIAA0101 proteiinin ilmentyminen arvioitiin yksittäisten hyvän- että pahanlaatuisia näytteitä array, merkittävä yli-ilmentyminen havaittiin verrattuna normaaliin näytteitä (kuvio 1 E). KIAA0101 proteiinia oli läsnä solulimassa ja tumassa, mikä vahvisti myös immunofluoresenssilla (kuvio 1 F).

Havaitsimme vain harva KIAA0101 värjäytymistä harvoja lisämunuaiskuoren näytteitä, joka rajoittui subkapsulaarista cortex alueella ( kuvio 2A). Voit selvittää tämän painopistealueeksi positiivinen KIAA0101 edustaa lisämunuaisen esisolujen, teemme yhteistyötä värjätään samalla normaalin lisämunuaisen kuoren näytteiden steroidien kertoimella 1 (SF-1) vasta-aine, markkeri lisämunuaisen progenitorisolujen [23]. Mielenkiintoista, normaali lisämunuaiskuoren näytteet osoittivat co-värjäys KIAA0101 ja SF-1 yhdessä kapselinalaisessa tai kantaisä alueella lisämunuaisen kuoren (kuvio 2B).

A) immunohistokemia värjäys normaalista Lisämunuaiskuoren SF-1 ja KIAA0101. Ensimmäisen paneelin, alueet ja lisämunuaisen kuoren on merkitty 10X, 1: Zona glomerulosa sisältävät progenitorisolujen, 2: Zona fasciculata, 3: zona reticularis. Toinen ja kolmas paneeli osoittaa SF-1 (20X kanssa 40X upotus) ja KIAA0101 positiivinen immuunivärjäyty- Zona glomerulosa klo 20X suurennus. Punaiset nuolet osoittavat positiivista alueet SF-1 ja KIAA0101 värjäystä. B) Immunofluoroscence SF-1 ja KIAA0101 normaalissa lisämunuaisen kuoren. Tumat värjättiin DAPI (sininen), punainen väri osoittaa KIAA0101 ilmaisun ja vihreä väri osoittaa SF-1 ilme. Sulautunut Images (keltainen väri) 40X osoittavat rinnakkaispaikantumisen kahden proteiinin, SF-1 ja KIAA0101 in progenitorisolujen normaalin lisämunuaisen kuoren.

Mekanismi KIAA0101 yli-ilmentymisen ACC

onko KIAA0101 yli-ilmentyminen oli seurausta geenin sekvenssin muunnelmia, teimme mutaation analyysi KIAA0101. Löysimme yhden de

novo

G Siirtyminen mutaatio asemassa 186, joka kuuluu ei-koodaavan alueen KIAA0101 on hyvänlaatuinen näytteessä. Havaitsimme myös yksi polymorfismi 5’UTR eksonissa 1-2 (88T C). Noin 6,6% hyvänlaatuinen oli heterotsygoottinen ja 12,5% normaaliin mutta mikään pahanlaatuiset näytteistä (taulukko 2). Näiden tulosten perusteella on epätodennäköistä, että KIAA0101 yli-ilmentyminen on seurausta mutaatiosta.

toiminnallinen vaikutus knockdovvn KIAA0101-geenin ACC solulinjassa

Koska merkittävä yliekspressio KIAA0101 ACC (kuvio 1), ja havainto, että KIAA0101 ilmentyminen rajoittuu lisääntyviä lisämunuaisen progentitor soluja (kuvio 2B), me arveltu, että KIAA0101 on rooli lisämunuaiskuoren solujen kasvua. Tilanteen korjaamiseksi, käytimme siRNA on pudotus KIAA0101 ilmentymistä ACC solulinjassa, NCI-H295R. Ohimenevä transfektointi KIAA0101 erityisiä siRNA johti 10-kertaiseen Knockdown 24 tunnin kuluessa ja tämä vaikutus säilyi jopa 6 päivää mRNA ja 80% pienentää proteiinin tasot verrattuna ei kohdistettu siRNA (negatiivinen kontrolli siRNA) ( kuvio 3). KIAA0101 Knockdown johti vähäinen nousu soluproliferaatiokokeessa kanssa lisäys solujen määrän jopa 25% (p = 0,005) (kuvio 4A). Myös solulinja kaksinkertaistaa ajan ja kasvu olivat erilaisia ​​siRNA Knockdown verrattuna negatiiviseen kontrolliin (keskimäärin kaksinkertaistaa aikaa 4,7 ja kasvuvauhti 0,14 verrattuna keskimäärin kaksinkertaistamista aikaa 3,5 ja kasvuvauhti 0,19 päivästä 1-5 , vastaavasti). Solusyklin analyysi paljasti jonkin verran suurempi määrä soluja G1 vaiheeseen (p = 0,013) (kuvio 4B). Ottaen huomioon nämä ristiriitaisia ​​tuloksia, me arvioitiin myös mRNA ilmaus G1 solusykliä sääteleviä proteiineja G1-vaiheessa jälkeen KIAA0101 knockdown. KIAA0101 Knockdown ei merkittävästi muuttanut mRNA ilmentymistä p21 ja sykliini D1, solusykliä sääteleviä proteiineja, vuonna ACC solulinjassa. Lisäksi, KIAA0101-geenin pudotus ei ollut merkittävää vaikutusta solujen määrä apoptoosin (tuloksia ei ole esitetty).

A) H295R solut transfektoitiin KIAA0101 siRNA ja negatiivinen kontrolli ja analysoitiin KIAA0101 mRNA: n ekspression sen jälkeen, kun 48 tunnin hoidon. Pylväät edustavat KIAA0101 mRNA ilmaisun prosenttiosuus suhteessa negatiiviseen kontrolliin ± keskihajonta neljä kokeiluja. B) edustaja Western blot osoittavat proteiinin ilmentymistä KIAA0101 6 vuorokaudessa siRNA ja negatiivisen kontrollin. C) Suhteellinen intensiteetti western blot Image J ohjelmisto. Pylväät osoittavat suhde KIAA0101 ja GAPDH voimakkuuden mittauksia. NC40 = Negatiivinen kontrolli 40 nM; SI40 = siRNA 40 nM; NC80 = Negatiivinen kontrolli 80 nM; SI80 = siRNA 80 nM.

A) solujen lukumäärä että KIAA0101 siRNA käsitelty ja negatiivinen kontrolli käsitellyissä ryhmissä näkyvät ilmoitettuina ajankohtina (merkittävät arvot on merkitty tähdellä (*) (p = 0,005, verrattuna negatiiviseen kontrolliin). Virhepylväät edustavat ± keskivirhettä ja edustaa neljä kokeiluja. NC80 = negatiivinen kontrolli 80 nM; SI80 = siRNA 80 nM. B) KIAA0101 geenin knockdown ja solusyklin analyysi osoitti eri ajankohtina. Edustavia kuva solukierron profiilin siRNA ja negatiivisen kontrollin hoitoryhmien. C) Kukin sarake osoittaa jakelun G0 /G1 solujen populaation kunkin ryhmän eri ajankohtina. Virhe pylväät edustavat ± keskivirhettä ja edustaa neljä kokeiluja. * Päivä 3 ja 5, p 0,05; verrattuna negatiiviseen kontrolliin.

Koska ristiriitaisia ​​vaikutuksia, vaatimaton kasvu solujen lisääntymistä ja G1 pidätys, käytimme lisäaineryhmiin määrityksissä paremmin ymmärtää fenotyyppisiä muutoksia, jotka liittyvät KIAA0101 knockdown. Erityisesti tumorogenicity ja metastaattinen potentiaali arvioitiin. KIAA0101 Knockdown NCI-H295R solujen vähensi pesäkkeet, jotka pystyivät kasvamaan pehmeässä agarissa lähes 80% (p = 0,001) 16 päivän viljelyn (kuviot 5A ja 5B), jossa on 60% vähennys soluinvaasiota vuonna NCI-H295R solulinja (p = 0,006) (kuviot 5C ja 5D).

A) Soluja viljeltiin 15 päivää, kun läsnä oli konsentraatiot siRNA ja negatiivisen kontrollin. Kuvat ovat näkyvät 12X ja 40X suurennoksia. B) jakauma ja pesäkkeiden lukumäärä ryhmässä hoidettiin KIAA0101 siRNA ja negatiivinen kontrolliryhmä 80 nM (p = 0,001, verrattuna negatiiviseen kontrolliin, NC80 = Negatiivinen kontrolli 80 nM; SI80 = siRNA 80 nM). Virhe pylväät edustavat ± keskivirhettä ja edustaa neljä kokeiluja. C) Tunkeutuvat solut värjättiin 0,2% kristallivioletilla ja visualisoitiin mikroskopialla. Edustavia kuvia 20X seuraavat invaasiomääritys. D) jakautuminen solujen määrä KIAA0101 siRNA ja negatiivinen kontrolliryhmä. Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskihajonta (SD) on kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. * P 0,05 KIAA0101 siRNA vs. negatiivinen kontrolli. H295R solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai KIAA0101 siRNA 80 nM 120 tuntia, jonka jälkeen invaasiomääritys 48 tuntia.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tutkimme KIAA0101 ilme ja toimivat ACC. Tuloksemme osoittavat, että KIAA0101 yliekspressoituu ACC, on hyvä diagnostinen merkkiaine ACC, ja on merkkiaine solujen lisääntymisen. Tukahduttaa KIAA0101 ilmentyminen lisämunuaiskuoren karsinoomasoluja johti tukahduttaminen kasvun ja invaasion, mikä viittaa siihen, että sillä on kasvua edistävä merkitys ACC.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet muuttunut ilmentyminen KIAA0101 ihmisen maligniteettien ja poissa tai heikkoa ilmentymistä normaalissa kudos [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tuloksia on saatu KIAA0101 ilmaisun maksasolukarsinoomassa (HCC). Eräässä tutkimuksessa, KIAA0101 ilmentyminen havaittiin vaimentua HCC [13]. Kääntäen, erillisessä tutkimuksessa, suuri kohortin potilaista, joilla HCC, KIAA0101 säädeltiin voimakkaammaksi [18]. Tutkimuksemme osoitti myös KIAA0101 yli-ilmentymisen ensisijainen ACC mutta kiinnostavaa, KIAA0101 mRNA: n ekspressio oli pienempi kasvaimia kohortin metastasoituneen ja toistuvia aluelennonjohtokeskusten jotka vastasivat systeemistä kemoterapiaa ja jalostustoiminto resektio. Nämä tulokset viittaavat siihen, että KIAA0101 ekspressio voi vaihdella hoidon tuloksena, ja se voisi mahdollisesti käyttää biomarkkerina hoitovaste ACC ja muita syöpiä.

Vaikka olemme huomanneet, että KIAA0101-proteiinin ekspressio oli suurempi kasvain verrattuna normaaliin näytteitä, teimme havaita KIAA0101 ilmentymisen osajoukko normaalin näytteitä. Sen ilmentyminen rajoittui subcapular alueelle lisämunuaisen kuoren ja päällekkäin SF-1 positiivista värjäytymistä soluissa. Tällä alueella, SF-1-positiivisten solujen oletettu olevan lisämunuaisen esisolujen [24]. Progenitorisolujen omaavat suuren proliferatiivisen kapasiteetin. KIAA0101 ja SF-1 co-ilmentymisen kantaisä alueella normaalin lisämunuaisen kuorikerroksen viittaa siihen, että KIAA0101 voi olla merkkiaine leviämisen lisämunuaisen kuorikerroksen soluissa. Tämän mukaisesti tekemän tutkimuksen Simpson et al., On osoittanut lokalisoinnin KIAA0101 vuonna tyvisolusyöpä kerros ihoa ja proliferatiivinen alue kryptissa paksusuolen [15].

pikku tiedetään funktio KIAA0101-geenin tuumorisolun biologiassa. Aikaisemmin tutkimukset ovat viitanneet siihen, että KIAA0101 on mukana sääntelyn DNA-replikaation, solusyklin, apoptoosin ja soluproliferaatiota [13], [14], [15], [18], [25], [26].