Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Useimmat kemoterapeuttisten syöpäsolujen tappamiseksi ovat erittäin sytotoksisia normaaleissa soluissa, mikä rajoittaa niiden kliinisiä sovelluksia. Siksi jatkuva haaste on tunnistaa lääke, joka on yliherkkä syöpäsoluihin mutta on minimaalinen vahingollisia vaikutuksia terveitä soluja. Tavoitteet Tämän tutkimuksen oli arvioida mahdollisuuksia 4β-hydroxywithanolide (4βHWE) selektiivisesti tappaa syöpäsoluja ja valottaa siihen liittyvät mekanismit.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Muutokset selviytymistä, oksidatiivisen stressi, DNA-vaurioita, ja apoptoosin signalointi verrattiin toisiinsa 4βHWE käsiteltyjen suusyövän (Ca9-22) ja normaali fibroblasti (HGF-1) solua. 24 h ja 48 h, numerot Ca9-22 soluja oli huomattavasti vähentynyt, mutta määrä HGF-1-solut vain hieman vähentynyt. Lisäksi IC

50-arvot 4βHWE että Ca9-22 solut olivat 3,6 ja 1,9 ug /ml 24 ja 48 h. Aikariippuvainen epänormaalin ROS ja annoksesta reagoiva mitokondrioiden Depolarisaatio voidaan hyödyntää käyttämällä 4βHWE vuonna chemotherapies valikoivasti tappaa syöpäsoluja. Annoksesta riippuvaa DNA-vaurioita mitattuna komeetta-tumauutteesta määritys ja virtaussytometria-pohjainen γ-H2AX /propidiumjodidia (PI) analyysi osoitti suhteellisen kovempia vahinkoja Ca9-22 soluissa. Sekä matala ja korkea pitoisuuksina, 4βHWE mieluiten levoton solusyklin Ca9-22 soluissa lisäämällä subG1 väestö ja pidätykseen G1 tai G2 /M. Valikoiva apoptoosin induktiosta Ca9-22 soluissa varmistettiin lisäksi anneksiini V /PI-määrityksellä, suosituimmuusjärjestelmistä ilmentyminen fosforyloitua ataksia-telangiectasia- ja Rad3 liittyvä proteiini (p-ATR), ja lohkaisemalla kaspaasi 9, kaspaasi 3, ja poly ADP-riboosi-polymeraasi (PARP).

Johtopäätökset /merkitys

Yhdessä tämän tutkimuksen tulokset, erityisesti parempi ymmärtäminen selektiivisen tappamisen mekanismeja 4βHWE, voidaan käyttää parantamaan tehokkuutta tappamisessa suun syöpäsoluissa aikana kemopreventiossa ja hoidon.

Citation: Chiu CC, Haung JW, Chang FR, Huang KJ, Huang HM, Huang HW, et al. (2013) Golden Berry-Derived 4β-hydroxywithanolide E valikoivaksi Killing Oral syöpäsolujen Generating ROS, DNA-vaurio, ja Apoptotic Pathways. PLoS ONE 8 (5): e64739. doi: 10,1371 /journal.pone.0064739

Editor: Siyaram Pandey, University of Windsor, Kanada

vastaanotettu: 22 tammikuu 2013; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 21, 2013

Copyright: © 2013 Chiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Science neuvosto (NSC101-2320-B-037-049), Department of Health, Executive Yuan, Kiina (DOH102-TD-C-111-002), ja National Sun Yat- Sen University-KMU Joint Research Project (# NSYSU-KMU 102-034). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun syöpä on kuudenneksi yleisin syöpä maailmassa [1]. Sen korkea sairastuvuus ja kuolleisuus johtuvat osittain sen huonosta kemoterapiaa tuloksiin [2]. Koska niiden korkea sytotoksisuus normaaleissa soluissa, eri anti-suun syöpälääkkeet kehitetty tähän mennessä on rajoitettu terapeuttisissa sovelluksissa. Siksi jatkuva haaste on kehittää anti-suusyövän hoito, joka on turvallisempi ja tehokkaampi, etenkin valikoiva tappotehoon.

Ote

karviaiskoiso

(kultainen marja), joka on syötävä kasvi perheen Solanaceae kuulemma antaa anti-hepatooma vaikutus apoptoosin kautta [3]. Aikaisemmat työ [4] todettiin, että

P. peruviana

-johdannainen 4β-hydroxywithanolide E (4βHWE) on apoptoottisia ja antiproliferatiivisia vaikutuksia ihmisen keuhkosyövän soluista [4]. 4βHWE withanolides ovat kasviperäisiä C (28) steroideihin laktonit [5], jolla on voimakas syövän ominaisuuksia [6]. Muut withanolides, kuten withaferin A, kuulemma apoptoosin monissa syövän tyypit, mukaan lukien rintasyövän [7], melanooma [8], ja leukemia [9].

Kertyvät todisteena viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että valikoiva aktivointi apoptoosin parantaa tehokkuutta syövän kemoterapiaan [10] – [15]. Paremman modulaatio apoptoottisen potentiaalia syöpäsolujen, yksi lupaava tutkimuslinja on käyttää withanolides joka selektiivisesti tappaa kasvainsoluja, mutta on alhainen myrkyllisyys terveissä soluissa [13]. Kuitenkin mahdollista käyttöä apoptoosin indusoiva withanolides kuten 4βHWE [4] ja withaferin [7] – [9] valikoivaan tappaminen, erityisesti suun kautta syöpäsoluissa, on harvoin käsitelty.

Siksi tässä tutkimuksessa tutki mahdollista tehokkuutta ja siihen liittyvät mekanismit

P. peruviana

-johdannainen 4βHWE käyttää valikoivasti tappaa suun syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja huumeiden tiedot

Kaksi solulinjojen, Ca9-22 (ihmisen ienten karsinooma) [16] – [18] ja HGF-1 (ihmisen normaalia ienten fibroblasti) [19], viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) -F12 keskipitkän ja DMEM-elatusainetta (Gibco, Grand Island, NY), vastaavasti , jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 0,03% glutamiinia ja 1 mM natriumpyruvaattia. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. 4βHWE (C

28H

38O

8; MW: 502,6) valmistettiin kultainen marja uutetta kuvatulla [4] ja liuotetaan dimetyylisulfoksidiin (DMSO) testaukseen.

arviointi kasvun inhibitio

Solun kasvua mitattiin (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium ( MTS) määrityksellä, kuten on kuvattu [18]. Lyhyesti, solut altistettiin vehikkelikontrolliin (DMSO) tai 4βHWE pitoisuuksina 1, 2, 5 ja 10 ug /ml 24 h. sitten solut altistettiin MTS-liuosta ( CellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega, Madison, WI, USA) ja annettiin inkuboitua 1-2 tunnin ajan 37 ° C: ssa. tuote mitattiin 490 nm: ssä absorbanssista käyttäen Dynex MRX Malli 96 Well Plate Reader (MTX Lab Systems, Inc., Vienna, VA, USA).

arvio solunsisäisten reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) B

solunsisäinen ROS mitattiin 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA) peräisin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Sen jälkeen 4βHWE hoidon, solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin sitten 10 uM H2DCF-DA PBS: ssä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Sitten solut otettiin talteen ja pestiin PBS: llä. Sentrifugoinnin jälkeen solut suspendoitiin uudelleen PBS: ään ja analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson, Mansfield, MA, USA) kanssa Win-MDI-ohjelmiston (https://facs.scripps.edu/software.html) viritys- ja emissio asetukset 480 ja 525 nm, vastaavasti.

arviointi mitokondrion kalvon potentiaalia

mitokondrio kalvon potentiaali (ΔΨ

m; MitoMP) mitattiin käyttäen MitoProbe ™ DiOC

2 ( 3) määritys (Invitrogen, San Diego, CA, USA), kuten on kuvattu [16]. 4βHWE-käsitellyt solut suspendoitiin 1 ml: aan lämmintä PBS: ää noin 1 x 10

6 solua /ml, täynnä 5 ui 10 uM DiOC

2 (3), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5 % CO

2 20-30 minuutin ajan. Sadonkorjuun jälkeen solut pestiin, suspendoitiin uudelleen PBS: llä ja analysoitiin välittömästi käyttämällä virtaussytometrillä Win-MDI-ohjelmiston virityksellä ja emissio asetukset 488 ja 525 nm, vastaavasti.

arviointi DNA vaurioita komeetta-NE määritys

tumauutteesta (NE) HGF-1-soluissa käytetään suorittamaan komeetta-NE mukainen määritys aikaisemmin kuvatun protokollan [4], [20] kanssa pienin muutoksin. Lyhyesti, solususpensiot sekoitettiin yhtä suuret tilavuudet 1,2% alhaisen sulamispisteen agaroosia, ladattiin välittömästi 1,2% säännölliseen agaroosilla esipäällystetty dioja, ja sitten jäähdytettiin jäällä, kunnes jähmettyminen. Kolmas kerros, jossa on yhtä suuri tilavuus 1,2% matalan sulamispisteen agaroosigeelillä ladattiin sitten jähmettynyt toisen geelin ja jäähdytettiin jälleen jäällä. Solujen hajoamisen jälkeen käsittely 4 ° C: ssa 2 tuntia, levyt käsiteltiin NE pilkkomalla peitelasi ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan kostutetussa tilassa. Denaturointi diat 0,3 N NaOH ja 1 mM EDTA 20 minuutin seurasi elektroforeesi. Pesun jälkeen objektilasit siirrettiin 0,4 M Tris-HCl (pH 7,5), ja 40 ui propidiumjodidia (PI, 50 ug /ml; Sigma, St Louis, MO, USA) lisättiin fluoresenssimikroskopialla havainnon (TE2000-U ; Nikon, Tokio, Japani). Vuonna komeetta määrityksessä, ilmainen ohjelma (https://tritekcorp.com) käytettiin DNA-vaurioiden mittaamiseen mitattuna prosenttiosuutena hännän DNA [21].

arviointi DNA vaurioita γ-H2AX /PI cytometry

jälkeen 4βHWE hoidon, solut kiinnitettiin 70% etanolilla, pestiin kahdesti BSA-T-PBS-liuosta (1% naudan seerumin albumiinia ja 0,2% Triton X-100 PBS: ssä, Sigma), ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa 100 ul: ssa BSA-T-PBS-liuosta, joka sisälsi 0,2 ug p-Histone H2A.X (Ser 139) monoklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Pesun jälkeen solut suspendoitiin 1 tunnin ajan 1:100 laimennus Alexa Fluor 488-leimatun sekundaarisen vasta-aineen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Kun toinen pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 5 ug /ml PI analysoitavaksi FACSCalibur virtaussytometria Win-MDI-ohjelmiston.

Arvio solukierron jakelun ja sub-G1 väestön

PI-värjäys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin ajoneuvon (DMSO vain) tai 0,5, 1, 2, 5, ja 10 ug /ml 4βHWE 24 ja 48 tuntia. Sadonkorjuun jälkeen solut kiinnitettiin yön yli 70% etanolilla. Sentrifugoinnin jälkeen solujen pelletit inkuboitiin 10 ug /ml PI: n ja 10 ug /ml RNaasi A: PBS: ssä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Sitten näytteet analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä ja Win-MDI-ohjelmiston.

Arvio apoptoosin

Apoptoosi mitattiin anneksiini /PI kaksinkertainen värjäys (Pharmingen, San Diego, CA, USA) kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, soluja käsiteltiin ajoneuvon tai 4βHWE annoksilla 1, 2, ja 5 ug /ml 24 h. Sitten soluja inkuboitiin 10 ug /ml anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti ja 5 ug /ml PI: n ja analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton-Dickinson) ja Win-MDI-ohjelmiston.

Western blotting

Western blot-määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, solut ensin kerätään ja rikotaan. Lysaatit sentrifugoitiin, ja proteiinin pitoisuudet määritettiin. 40 ug proteiinia lysaatit erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja sitten sähköllä. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa. Membraanit inkuboitiin sitten ensisijaisen vasta-aineita fosforyloidun ataksia-telangiectasia- ja Rad3 liittyvä proteiini (p-ATR) (# sc-109912, Ser 428, Santa Cruz Biotech., CA, USA), pilkottiin kaspaasi-9 (# 9501 , Cell signalointi Technology, Beverly, MA, USA), pilkottiin kaspaasi-3 (# IMG-144A, IMGENEX, San. Diego, CA, USA), lohkaistaan ​​poly ADP-riboosi-polymeraasi (PARP) (# 9541, Cell signaling Technology) ja β-aktiini (# sc-8432, Santa Cruz Biotech.), ja niiden johdetun vasta-aineita. ECL ™ (Amersham Piscataway, NJ, USA) kemiluminesenssidetektiolla kit käytettiin sitten signaalin havaitsemiseen.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvoina ± SD. Ryhmä eroja solujen elinkelpoisuutta ja solukierron arvioitiin käyttämällä JMP® 9 ohjelmisto suorittaa yksisuuntainen ANOVA Tukey HSD Post Hoc Test. Tasot ole yhdistetty saman pikkukirjaimesta osoitti merkittäviä eroja. Muut tiedot analysoitiin Student

t

-testissä.

Tulokset

Arvio kasvun hidastumisen

MTS soluvil- elinkelpoisuuden jälkeen 24 tunnin ja 48 h hoito 4βHWE (0, 1, 2, 5 ja 10 ug /ml) osoitti, että kunkin kokeellisen pitoisuus 4βHWE, leviämisen Ca9-22 suun syöpäsolujen oli merkittävästi pienempi kuin HGF-1 normaaleja soluja (yhden tavalla ANOVA) (kuvio 1). HGF-1-soluja, käsittely 10 ug /ml 4βHWE väheni hieman solujen elinkelpoisuuden 89,02 ± 1,17% ja 65,42 ± 2,26% sen jälkeen, kun 24 tunnin ja 48 tunnin, vastaavasti. Sen sijaan elinkelpoisuutta käsiteltiin samalla tavalla 4βHWE käsiteltyjen Ca9-22 solujen dramaattisesti laski 26,56 ± 2,22 ja 16.01 ± 2.38 kuluttua 24 h ja 48 h. Antiproliferatiivinen vaikutus 4βHWE on Ca9-22 soluissa oli sekä annoksesta reagoiva ja ajasta riippuvaa. Lisäksi IC

50-arvot olivat 3,6 ja 1,9 ug /ml 24 tunnin ja 48 tunnin, vastaavasti, 4βHWE saaneilla Ca9-22 soluissa, kun taas IC

50 oli havaittaisi käsiteltiin samalla tavalla HGF-1-soluissa.

Soluja käsiteltiin 0, 1, 2, 5, ja 10 ug /ml 4βHWE 24 ja 48 tuntia. Data, keskiarvo ± SD (n = 3). Samasta lääkeaineen pitoisuudet neljä erilaista ryhmää (Ca9-22 24 tuntia, Ca9-22 48 tuntia, HGF-1 24 tuntia, HGF-1 48 h), tietoja ei ole yhdistetty samaan pieni kirjain ( oikeassa yläkulmassa SD) merkittävästi erilainen (yksisuuntainen ANOVA Tukey HSD Post Hoc Test).

arvio ROS

Jotkut withanolides kuten withaferin kuulemma aiheuttaa solukuoleman melanoomasoluissa muodostamalla ROS [8]. Näin ollen tämä tutkimus vieressä verrattiin säätelevä vaikutus ROS proliferaatioon Ca9-22 ja HGF-1-soluissa. Kuviot 2A ja 2B esittävät ROS fluoresenssivoimakkuudet suhteen prosentteina Ca9-22 ja HGF-1: lle positiivisten solujen DCFD-A, joka laskettiin käsittelyn jälkeen 3,6 ug /ml 4βHWE ja vaihtelevin aikavälein. Kuvio 2C esittää lievän ROS havaittiin HGF-1-soluissa verrattuna suhteellisen dramaattinen ajasta riippuva induktio ROS Ca9-22 soluissa. Kutakin kokeellista pitoisuutta 4βHWE prosenttiosuus DCFD-A-positiivisia soluja oli huomattavasti korkeampi Ca9-22 suun syöpäsoluja kuin normaalissa HGF-1-solut (

P

0,0001).

Solut annettiin ajoneuvon ja 3,6 ug /ml 4βHWE varten vaihtelevin aikavälein (0-5 h). Mitata ROS muutos, 200 uM H

2O

2 käytettiin positiivisena kontrollina. (A, B) edustaja virtaussytometrialla-pohjainen ROS profiileja varten 4βHWE käsiteltyjä soluja. (C) kvantifiointi analyysi ROS intensiteetin suhteen DCFD-A positiivisuus (%). Tähdet osoittavat merkittävät erot kahden solulinjoista hoidon jälkeen samanlainen 4βHWE pitoisuuksilla (

t

-testi,

P

0,0001 **).

Assessment mitokondrioiden kalvon potentiaali (mitoMP) B

Seuraavaksi DiOC

2 (3) määritys suoritettiin vaikutusten tutkimiseksi 4βHWE-indusoidun ROS induktio mitoMP. Kuviot 3A ja 3B esittävät mitoMP fluoresenssivoimakkuudet kannalta prosenttiosuuksien DiOC

2 (3) -positiivinen Ca9-22 ja HGF-1-soluissa 24 tunnin kuluttua hoidon 0, 1, 2, ja 5 ug /ml 4βHWE. Kuvio 3C osoittaa, että mitoMP kohtalaisesti vähentynyt HGF-1-soluissa, mutta oleellisesti vähentynyt Ca9-22 soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Kunkin kokeellisen pitoisuus 4βHWE prosenttiosuus positiivisten solujen DiOC

2 (3) oli merkitsevästi pienempi Ca9-22 soluissa kuin HGF-1-solut (

P

0,0005).

(A, B) edustaja virtaussytometrialla-pohjainen MitoMP profiilit 4βHWE-käsitellyn Ca9-22 ja HGF-1-soluissa. Soluja käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla (0-5 ug /ml) 4βHWE 24 tuntia. (C) kvantifiointi analyysi MitoMP intensiteettiä. Data esitetään keskiarvoina ± SDS% (n = 3). Tähdet osoittavat tilastollisesti merkittäviä eroja Ca9-22 ja HGF-1 solulinjoissa hoidon jälkeen samanlainen pitoisuuksia 4βHWE (

t

-testi,

P

0,0005 **).

arviointi DNA vaurioita comet-NE määritys

komeetta-NE määritys (kuvio 4A) niin kutsuttua ”pyrstön” havaitut vaikutukset Ca9-22 soluja suurimmat korkeilla 4βHWE pitoisuuksia. Sitä vastoin yksikään koe-4βHWE pitoisuudet indusoi havaittavan pyrstön vaikutus HGF-1-soluissa. Kuvio 4B osoittaa, että HGF-1-soluissa ei havaittu näkyvää kasvua% hännän DNA taas Ca9-22 solut osoittivat kasvanut dramaattisesti% hännän DNA: n annos-vaste tavalla. Kutakin kokeellista pitoisuutta 4βHWE, DNA-vaurio kannalta% DNA hännät käsiteltyjen solujen 4βHWE oli merkittävästi vaikeampia HGF-1-soluissa kuin Ca9-22 soluissa (

P

0,0001) .

(A) edustaja komeetta PI-värjäys tulokset solujen valvonnan (DMSO) ja solut käsiteltiin 0,5, 1, 2, ja 5 ug /ml 4βHWE 2 tuntia. Ytimet näkyvät punaisina täplinä, ja hännät täplien mukaan, millaiset DNA-vaurion jälkeen 4βHWE hoitoja. (B) keskiarvo on% hännän DNA 4βHWE saaneilla Ca9-22 ja HGF-1-soluissa. Data, keskiarvo ± SD (ytimet = 50). Tähdet osoittavat merkittäviä eroja Ca9-22 ja HGF-1 solulinjoissa hoidon jälkeen samanlainen 4βHWE pitoisuuksilla (

t

-testi,

P

0,0001 **).

arviointi DNA vaurioita γ-H2AX /PI cytometry

Lisätietoja vahvistuksen osallistumisesta DNA-vaurioita 4βHWE aiheuttama kasvun esto Ca9-22 suun syöpäsolujen DNA kaksijuosteisen tauko (DSB) mitattiin suhteessa γ-H2AX ilme. Kuvio 5A näyttää γ-H2AX /PI-värjäys, jotka saatiin 24 tunnin kuluttua hoitojen kanssa positiivisen kontrollin tai 0, 0,1, 0,25, 0,5 ja 1 ug /ml 4βHWE. Kuvio 5B esittää, että käsittelyn jälkeen 4βHWE pitoisuudet pienempi kuin 2 ug /ml, HGF-1-soluja pidettiin alhainen γ-H2AX ilmentymisen taas Ca9-22 solut osoittivat dramaattisia annoksesta riippuvaista nousua γ-H2AX ilmentymistä. Suuremmilla pitoisuuksilla 4βHWE kuitenkin kertainen muutos% ja γ-H2AX-positiivisia soluja oli selvästi suurempi Ca9-22 soluissa kuin HGF-1-soluissa (

P

0,0005).

Soluja käsiteltiin 0, 1, 2, ja 5 ug /ml 4βHWE 24 tuntia. (A) edustaja virtaussytometrialla perustuvia DSB profiilin 4βHWE saaneilla Ca9-22 ja HGF-1-soluissa. Solut, joita käsiteltiin 5 uM kamptotesiinin (CPT) ja 24 h pidettiin γ-H2AX positiivisena kontrollina. (B) kvantifiointi analyysi kertainen muutosten γ-H2AX-pohjainen DNA-vaurioita 4βHWE saaneilla Ca9-22 ja HGF-1-soluissa. Data, keskiarvo ± SD. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja Ca9-22 ja HGF-1-solut käsiteltiin samankaltaisia ​​4βHWE pitoisuuksilla (

t

-testi,

P

0,0005 **; n = 2 ja 3, vastaavasti).

arvio solukierron jakelu

Kuva 6 osoittaa, että 24 tunnin jälkeen hoidon 4βHWE, prosentuaalinen muutos Saharan G1 väestön HGF-1-soluissa ei ollut tilastollisesti merkittävä konsentraatioissa alle 2 ug /ml. Prosentuaalinen muutos osa-G1 hieman nousi 2,75%, kun pitoisuus saavutti 5 ug /ml. Sen sijaan, prosentuaalinen muutos osa-G1 Ca9-22 käsitellyissä soluissa 4βHWE 24 tuntia alkoi osoittaa merkittäviä muutoksia niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 2 ug /ml, ja lopulta saavutti 30,59%. 48 tunnin kuluttua hoidon, prosenttiosuus sub-G1 väestön HGF-1-soluissa kohtalaisesti kasvoi 25,03% ja 29,42%, kun käsittelyjen 2 ja 5 ug /ml 4βHWE, vastaavasti. Sen sijaan, prosenttiosuus sub-G1 Ca9-22 käsitellyissä soluissa 4βHWE 48 tuntia osoitti tilastollisesti merkittävää muutosta (42,76%) käsittelyn jälkeen 1 ug /ml, ja paljon suurempi muutos (78,89%) käsittelyn jälkeen 5 ug /ml.

Soluja käsiteltiin 0, 1, 2, ja 5 ug /ml 4βHWE 24 h ja 48 h. (A) edustaja solusyklin jakautumisen 4βHWE saaneilla Ca9-22 ja HGF-1-soluissa. (B) Cell vaihe prosenttiosuudet saatu (A) kolmena kappaleena kokeissa. Samasta vaihetta erisuuruisia pitoisuuksia, tietoja ei yhdistetty samaan pikkukirjaimesta (oikeassa yläkulmassa SD) merkittävästi erilainen (yksisuuntainen ANOVA Tukey HSD Post Hoc Test).

24 h, analyysit G1 ja G2 /M väestön HGF-1-solut osoittivat ei-merkittävää muutosta G1 väestön ja perustason muutoksen G2 /M pilaantumista. Sen sijaan, kun 24 h 4βHWE käsittelyn Ca9-22 solut osoittivat merkittäviä muutoksia G1 pidätys (57,49% ja 40,75% 0,5 ja 1 ug /ml, vastaavasti) ja G2 /M-pidätys (50,44% ja 62,08% 1 ja 2 ug /ml, vastaavasti). 48 tunnin kuluttua hoidon 5 ug /ml βHWE, G1 väestö HGF-1-soluissa laski hieman 56,27%, kun taas G2 /M väestöstä lisääntyi hieman. Sen sijaan Ca9-22 solut osoittivat merkittävää (79,23%) G1 pidätyksen jälkeen 48 h käsittelemällä 4βHWE pitoisuus on vain 0,5 ug /ml. G2 /M väestö, käsittely 1 ug /ml 4βHWE johti kohtalainen (27,34%) G1 pidätys yhdistettynä dramaattiseen subG1 kertymät edellä kuvatulla tavalla.

Arvio apoptoosin

Tutkia osallistuminen apoptoosin 4βHWE aiheuttama sub-G1 kertymistä, virtaussytometria-pohjainen anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäys suoritettiin. Kuvio 7A esittää γ-H2AX /PI-värjäys profiilit HGF-1 ja Ca9-22 soluja käsiteltiin vaihtelevilla 4βHWE pitoisuuksia. Kaksinkertainen positiivinen alueet γ-H2AX ja PI-intensiteetit määritellään yleisesti myöhään apoptoosin. Analyysit myöhään apoptoosin (kuvio 7B) oli lievä annoksesta riippuva nousu HGF-1-soluissa, mutta dramaattisen annoksesta riippuva nousu Ca9-22 soluissa. Kutakin kokeellista pitoisuutta 4βHWE, solujen prosenttiosuus, jotka tehtiin myöhään apoptoosia 4βHWE hoito oli merkittävästi korkeampi Ca9-22 soluissa kuin HGF-1-soluissa (

P

0,0001).

Soluja käsiteltiin 0, 1, 2, ja 5 ug /ml 4βHWE 24 tuntia. (A) edustaja apoptoottinen profiilit saadaan anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäytymistä 4βHWE saaneilla Ca9-22 ja HGF-1-soluissa. (B) kvantifiointi analyysitulosten myöhään apoptoosin väestöstä (%). Vain anneksiini V: (+) /PI (+) alueet analysoitiin. Data, keskiarvo ± SD (n = 3). Asteriskit osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja kahden solulinjan (Ca9-22 ja HGF-1) käsiteltiin samankaltaisia ​​4βHWE pitoisuuksilla (

t

-testi,

P

0,0001 **).

arviointi apoptoottisten signaloinnin

apoptoottinen signalointi tutkittiin Western-blottauksella määrityksiä Ca9-22 ja HGF-1-soluja käsiteltiin vaihtelevilla 4βHWE (0, 1, 2, ja 5 ug /ml). Kuvio 8 osoittaa, että kasvavien pitoisuuksien 4βHWE aiheuttama vaiheittainen nousu ATR fosforylaatio liittyy solujen DNA-vaurioita on Ca9-22 soluissa. Pilkkominen kaspaasi 9, kaspaasi 3 ja PARP myös indusoitiin Ca9-22 soluissa, erityisesti 4βHWE pitoisuuksina 2 ug /ml ja 5 ug /ml. Sen sijaan, 4βHWE ei laukaista joko ATR fosforylaation tai kaspaasi kaskadin HGF-1-soluissa.

Soluja käsiteltiin 0, 1, 2, ja 5 ug /ml 4βHWE 24 tuntia. Apoptosis signalointia proteiinien, kuten p-ATR, ja lohkaisu pro-kaspaasi 9, pro-kaspaasi 3 ja PARP havaittiin. Β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Kukin blotti edustaa erillisellä kokeella suoritettiin kolmena kappaleena.

Keskustelu

Withanolides ovat kasviperäinen C (28) steroideihin laktonit voimakkaiden syövän vastaista aktiivisuutta [24], [25] . Kuitenkin käyttö withanolides valikoivasti tappaa syöpäsoluja ei tutkittu intensiivisesti. Withaferin A tiedetään indusoivan apoptoosia monia syöpätyyppejä, mukaan lukien leukemia [9], melanooma [8], ja rinta- [7], maksan [26], haiman [27], paksusuolen [28], keuhko [29 ], ja eturauhasen [30]. Aiemmissa tutkimuksissa, XTT, jotka suoritettiin 24 h kuluttua hoidon withaferin osoittivat IC

50-arvot 2 uM leukemiasolujen (HL-60) [31], 4 uM eturauhassyöpäsoluissa (PC3) [30], ja 6 uM hepatooma (SK-HEP1), paksusuolen syöpä (HT29), ja munuaissyövän (Caki) soluihin [26]. Raportoitu IC

50-arvot saadaan MTT: n määrityksissä rintasyövän soluja (MDA-MB-231) sisältävät 13 uM anomanolide A, 15 uM tubocapsanolide E, ja 20 uM tubocapsenolide B, tubocapsanolide C, ja peruvianolide H [ ,,,0],6].

Äskettäin withanolide johdettu ashwagandha lehtiä uutetaan [32] on osoittanut mahdollisen roolin selektiivisesti tappaa rintasyövän MCF7-soluja pitoisuutena 24 ug /ml [33]. Nykyisessä tutkimuksessa samoin osoittaneet, että IC

50-arvot Ca9-22 suun syöpäsolujen olivat 3,6 ug /ml (7,16 uM) ja 1,9 ug /ml (3,78 uM) 24 tunnin ja 48 tunnin hoidon 4βHWE, vastaavasti. Oletamme, että selektiivinen tappaminen vaikutus 4βHWE voi olla sama tai jopa voimakkaampi muiden suun syöpäsolun linjat. HGF-1-soluja, kuitenkin, IC

50-arvot olivat havaittavissa MTS-analyysissä pitoisuuksilla, pienempi kuin 10 ug /ml. Muissa tutkimuksissa 4βHWE hoitoja 24 h, IC

50-arvo 6 uM raportoitu MTT-määritys rintasyövän MDA-MB-231-soluissa [6] ja IC

50-arvo 1,41 uM oli raportoitu trypaanisinistä määritys keuhkosyövän H1299-soluissa [4]. Nämä tiedot osoittavat, että lääke herkkyys 4βHWE vaihtelee syöpäsolun tyyppi. Lisäksi nykyinen tutkimus on ensimmäinen, joka vahvistaa, että 4βHWE tappaa suun syöpäsoluja valikoivasti normaaliin suun soluihin.

Lisäksi suojaavia vaikutuksia withanolides löytyy normaaleissa fibroblastisoluissa. Esimerkiksi withanone johdettu Ashwagandha lehtiä suojaa ihmisen normaaleja fibroblasteja vastaan ​​metoksietikkahappoa aiheuttamaa vanhenemista-like kasvun pysähtymisen kannalta vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi-värjäys [34]. Vastaavasti nykyinen tutkimuksessa todettiin, että morfologiaa HGF-1-soluja käsiteltiin 1, 2, ja 5 ug /ml 4βHWE oli samanlainen kuin käsittelemättömien fibroblasti HGF-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Lisätutkimukset kasvun pidätys fenotyypit ovat tarpeen selvittää 4βHWE turvallinen normaaleille soluille.

Vaikka kertyvät näyttöä myöntää, että withanolides aiheuttaa ROS-välitteisen apoptoosin, niiden mahdollista käyttöä valikoivasti tappaa syöpäsoluja on suhteellisen epäselvä. Esimerkiksi, withaferin A tiedetään indusoivan ROS-välitteistä apoptoosia in rintasyövän [7], melanooma [8], ja leukemia [9], [31]. Vaikka syöpäsolut odotetaan olevan suurempi oksidatiivista stressiä verrattuna normaaleihin soluihin [35], normaalit solut voivat sietää eksogeenisen oksidatiivisen stressin riittävä estämään ylikuormituksen seurauksena solukuolema. Sitä vastoin syöpäsoluja altistetaan korkealle oksidatiivista stressiä voi sietää eksogeenista ROS-moduloivat aineet, ja solukuolemaa kasvaa kynnysarvon ylittyessä [36]. Tämä käsite saattaa osittain selittää valikoivaa tappaminen vaikutukset 4βHWE suun syöpäsoluissa havaittiin täällä ja niille withanone rintasyöpäsoluissa raportoitu [33], eli molemmat ROS induktion ja vähentäminen mitokondrion kalvon potentiaalia ovat suurempia syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hoitojen valikoivasti tappaa syöpäsoluja pitäisi suunnata moduloimaan redox tilan sekä syöpäsolujen ja normaalien solujen [36]. Kuitenkin roolit kaspaasien ja kaspaasi-inhibiittorit [37] ja 4βHWE aiheuttaman selektiivisen apoptoosin on vielä tutkittava.

ROS-välittämiä vaikutuksia withanolides voidaan moduloida antioksidantteja. Esimerkiksi, N-asetyylikysteiini voi kuulemma pelastaa ihmis-melanooma-solut withaferin A-indusoidun ROS-välitteisen apoptoosin [8]. Niinpä rooli ROS valikoivaan tappamiseen 4βHWE voidaan edelleen selventää tutkimalla ROS modulaattorit.

ROS tiedetään aiheuttavan DNA-vaurioita ja Checkpoint vastauksia [38]. Esimerkiksi komeetta-NE ja γ-H2AX määrityksissä tässä tutkimuksessa kävi ilmi, että 4βHWE aiheuttama DNA-vaurioita ja G1 tai G2 /M solusyklin pysähtymiseen, jotka molemmat on havaittu aikaisemmin muissa withanolides. Esimerkiksi tubocapsanolide kuulemma estää leviämisen keuhkosyöpään A549-solut kautta G1 pidätys [39]. Kuitenkin 4βHWE [4] ja withanone [33] tiedetään indusoivan DNA-vaurioita ja pidätyksen G2 /M keuhkosyövän H1299-soluissa ja rintasyövän MCF-7-soluissa, vastaavasti.

valikoiva DNA-vaurioita ( eli DSB) voidaan seurata H2AX, joka on fosforyloitu in ATR-riippuvaisella tavalla [40]. H2AX myös auttaa vakauttamaan genomiin [41] ja on välttämätöntä kaspaasi-aktivoitua DNA: n fragmentoituminen [42]. Kuten odotettua, 4βHWE indusoi korkeampia ilmauksia ATR ja kaspaasin signalointi proteiineja Ca9-22 soluissa verrattuna HGF-1-soluissa.

24 tunnin kuluttua hoidon 2 ug /ml 4βHWE, Ca9-22 ja HGF-1 solut osoittivat elinvoimaisten solujen (%) ja 56,09 ± 1,78 ja 92,81 ± 2,20 (kuvio 1); mitoMP (%) ja 61,18 ± 3,21 ja 99,81 ± 0,74 (kuvio 3); γ-H2AX (kertainen) on 8,47 ± 0,54 ja 0,73 ± 0,19 (kuva 5); subG1 populaatiot (%) ja 14,74 ± 0,30 ja 1,32 ± 0,15; G2 /M pidätetty 62,08 ± 1,03 ja 15,89 ± 0,19 (kuva 6) myöhään apoptoosin (%) ja 13,80 ± 1,05 ja 7,97 ± 0,06 (kuva 7); ja yli- ja ilmentyminen apoptoosin signalointia proteiinien (kuvio 8), vastaavasti. Nämä tulokset osoittivat johdonmukaisesti vaikutukset 4βHWE kannalta selektiivisen tappamisen, valikoiva mitokondrioiden, valikoiva DNA-vaurioita (eli DSB), selektiivinen G2 /M pidätys, ja selektiivinen apoptoosin Ca9-22 solujen suosivasti HGF-1-soluissa. Sen jälkeen kun vastaava kohtelu 3,6 ug /ml 4βHWE 2 tunnin Ca9-22 ja HGF-1-solut osoittivat ROS induktio (%) on 158,83 ± 0,34 ja 108.63 ± 1,04 (kuva 2) ja komeetta-NE-pohjainen DNA vahinkoja 29.21 ± 5,93 ja 0,27 ± 0,52 (kuvio 4), vastaavasti. Nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että 4βHWE hoito indusoi ROS ja DNA-vaurioita Ca9-22 soluissa mieluummin kuin HGF-1-soluissa.

Yhteenvetona tämän tutkimuksen tulokset vahvistavat, että 4βHWE hoito indusoi ROS, mitokondrio Depolarisaatio ja DNA-vaurioita, mikä puolestaan ​​indusoi valikoiva apoptoosin signalointia, mikä johtaa lopulta selektiivisen tappamisen suun syöpäsolujen (kuva 9). Näin ollen tämä tutkimus osoitti, ensimmäistä kertaa, että 4βHWE käsittely valikoivasti tappaa suun syöpäsoluja mieluummin normaalin suun soluihin. Edelleen tutkimus kohde ehdokkaiden ja viestinvälitystekniikoita raportoitu tässä voi myös tarjota riittävän lisätä ymmärtämystä selektiivisen tappamisen mekanismeja 4βHWE jotta sen tehokasta käyttöä hoidettaessa suusyövän minimaalisella haittavaikutuksia.

Muutokset Ca9-22 solut on merkitty sinisillä nuolilla. Normaali suun soluja (ei esitetty) osoittivat, suhteellisen pieni muutokset verrattuna Ca9-22 soluihin. Vuonna Ca9-22 käsitelty 4βHWE, parannettu ROS sukupolvi lisännyt oksidatiivista stressiä. Induktion ROS nousi sitten mitokondrioiden ja helpottanut vähentäminen mitokondrion kalvon potentiaalia Ca9-22 soluissa. Induktio ROS myös lisännyt DNA-vaurioita Ca9-22 soluissa, esim γ-H2AX DSB, joka sitten aiheuttama ATR fosforylaatio. Yhdessä mitokondriovaurioita signalointi ja DNA-vaurioita signalointi lisännyt apoptoosin signalointia, joka sitten johti valikoiva apoptoosin ja tappamisen Ca9-22 soluja.