Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

selventäminen ohjelmistoon erittyvä ja solupintaproteiinien kasvainsolujen on merkitystä molekyylidiagnostiikassa, kasvaimen kuvantamiseen ja kohdennettuja hoitoja. Olemme tunnettu solun pinnan proteomiin ja proteiinit vapautuu solunulkoisesta miljöö kolmen munasarjasyövän solulinjoissa, CaOV3, OVCAR3 ja ES2 ja munasarjojen kasvainsolujen rikastettu askitesnesteestä.

Menetelmät ja havainnot

erilaistua proteiinit vapautuvat median proteiinirakenneosissa median käytetään kulttuurin, soluja kasvatettiin läsnäollessa [

13C] -leimattuna lysiiniä. Biotinyloinnilla perustuvaa lähestymistapaa käytettiin kaapata solun pintaan liittyviä proteiineja. Yleisenä kokeellista strategiaa koostui jakotislaamalla proteiinien yksittäisiä osastoja seurasi proteolyyttinen digestio ja LC-MS /MS-analyysi. Yhteensä noin 6400 proteiinit tunnistettiin suuri luottamus kaikkien yksilöiden ja jakeet.

Päätelmät ja merkitys

Proteiini profiilien solulinjojen oli huomattavaa samankaltaisuutta profiilit ihmisen munasarjan syöpäsolujen vatsaonteloneste ja mukana proteiinimarkkereita tiedetään liittyvän kanssa munasarjasyöpä. Proteomiikka-analyysi osoitti laajaa leviämistä extra-domeenit proteiinien ilmentyvät solun pinnalla, ja huomattavan korkea eritystä hinnat joillekin proteiineille (nanogrammaa miljoonaa solua kohden tunnissa). Solun pinnan ja erittyvien proteiinien tunnistetaan perusteellinen proteomic profilointi munasarjasyöpäsoluja voi tarjota uusia tavoitteita diagnosoinnissa ja hoidossa.

Citation: Faça VM, Ventura AP, Fitzgibbon MP, Pereira-Faça SR, Pitteri SJ, Green AE, et al. (2008) proteomiikan analyysi munasarjasyöpäsoluja paljastaa Dynamic prosessit proteiinieritykselle ja vuodattamalla Extra-Cellular Domains. PLoS ONE 3 (6): e2425. doi: 10,1371 /journal.pone.0002425

Editor: Axel Imhof, University of Munich ja keskus Integrated Protein Science, Saksa

vastaanotettu: 24 maaliskuu 2008; Hyväksytty: 08 toukokuu 2008; Julkaistu: 18 kesäkuu 2008

Copyright: © 2008 Faça et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Kanarian Foundation. Rahoitus organisaatio ei ollut roolia tietojen kerääminen tai analysointi päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yksi aggressiivinen ja tappava epiteelisyövissä naisilla [1]. On olemassa neljä suurta histologisia tyyppejä epiteelin munasarjasyöpä: vakavien, endomet-, kirkas solu, ja mucinous, jotka poikkeavat sekä kliinisessä käyttäytyminen ja molekyylitason ominaisuudet. Vakavien alatyyppi on yleisimmin diagnosoitu, ja on vastuussa suurimmasta munasarjasyöpä kuolemia [1]. Tällä hetkellä ei ole tarkkaa ei-invasiivisia diagnostinen testi munasarjasyöpä; useimmat potilaat diagnosoidaan edennyt pitkälle [2], joilla esiintyy metastaaseja ja hyökkäys vatsaonteloon ja askites [3]. Siksi tunnistaminen proteiineja, joita runsaasti ja pääasiassa ilmaistu munasarjasyövän esittelee arvokas yrityksen ja voivat tarjota varhainen vihjeitä läsnäolon munasarjasyöpä, ja /tai merkkejä molekyyli alatyypin, joka voisi auttaa ohjaamaan hoitoon.

tunnistaminen ohjelmistoon proteiineja, jotka pilkotaan solun pinnalla ja proteiineja, joita muuten vapautuu solun osastoon voi edistää ymmärrystämme kasvaimen käyttäytymisen, että potentiaalisten diagnostisten merkkiaineiden havaittavissa liikkeessä ja mahdollisten kuvantamisen ja hoitotavoitteet, jotka jäävät näkyviin solun pinnalla. Aikana etäpesäke munasarjasyöpä, tuotannon matriisi hajottavien proteinaaseille kasvainsolujen edistää häiriöitä solun vuorovaikutusten kautta mekanismin irtoaminen adheesiomolekyylien. Nämä mekanismit on osoitettu munasarjasyövän kontekstin ALCAM [4] ja epiteelin kadheriinin (CDH1) [5].

Perusteellinen, kvantitatiivinen proteomiikka sallii tämän määrittely proteiinien ilmaistu kasvainsoluissa ja osa- soluosastoihin [6]. Useat proteomic tutkimuksissa on analysoitu munasarjojen kasvainkudoksen [7], [8], solulinjat [9] – [11], askitesneste [12] ja veren munasarjasyöpäpotilaalle [13], [14]. On kuitenkin edelleen tarvetta järjestelmällisesti kuvata ja verrata sarjaa proteiineja, joiden sijainnit tekevät niistä erityisen merkityksellisiä diagnosointiin ja hoitoon, etenkin proteiineja solun pinnalla tai ne päästetään solunulkoisesta miljöö, ja määrittää mekanismin ja dynamiikka proteiini levittämisestä solunulkoiseen tilaan.

ominaista kolme munasarjan adenokarsinooma solulinjoissa, OVCAR3, CaOV3 ja ES2 sekä munasarjasyöpäsoluja rikastettu vatsaontelonesteestä kanssa perusteellisen proteomiikka analyysi kokosolulysaateista, The solun pinnan Proteome ja proteiinit vapautuvat solunulkoiseen tilaan. Tarkemmat etsintä paljastivat useita mielenkiintoisia biologisia ilmiöitä, myös laaja irtoaminen ylimääräistä domeenit proteiineille ilmentyy solun pinnalla ja korkea eritysmäärät osajoukon proteiineja. Data sisältää myös useita proteiinimarkkereita tiedetään liittyvän munasarjasyöpä. Tuloksena julkinen aineisto on resurssi löytämisen diagnostisia ja terapeuttisia tavoitteita ja rikas tietolähde jakelussa proteiinien välisen solun sisustus, solun pinnan ja solunulkoiseen tilaan.

Methods

Culture ja isotooppileimaamiseksi munasarjasyöpäsoluja

OVCAR3, CaOV3 ja ES2 soluja kasvatettiin DMEM (Invitrogen), joka sisälsi 0,1% dialysoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen) ja

13C-lysiini sijaan säännöllisen lysiiniä, 7 kohdat (01:02) mukaan standardin SILAC protokolla [15]. Sisällyttäminen

13C Lys isotooppi ylitti 90% koko proteiinin lysiinin pitoisuus. Sama erä soluja käytettiin talteen solun pinnan proteiineja ja analysoida väliaine ja kokosolulysaatissa proteiineja. Eritettyjen proteiinien saatiin suoraan soluravintoliuoksista 48 tunnin jälkeen viljelyn. Solut ja jäänteet poistettiin sentrifugoimalla 5000 x g ja suodattamalla 0,22 um: n suodattimen. Yhteensä uutteet solut saatiin sonikoimalla ~ 2 x 10

7 solua 1 ml: ssa PBS: ää, joka sisälsi pesuainetta oktyyli-glukosidi (OG) (1% w /v) ja proteaasi-inhibiittorit (täydellinen proteaasiestäjäseostabletit, Roche Diagnostics , Saksa), jota seurasi sentrifugointi 20000 x g.

Tuumorisolut saatiin 2,2 l askitesnesteen yhdestä potilaasta munasarjojen vakavien adenokarsinooma. Askites kerättiin alle IRB hyväksytty protokolla. Kun oli sentrifugoitu 2000 rpm: ssä 5 minuutin ajan, pelletti soluja pestiin 3 kertaa PBS: llä, mitä seurasi sentrifugointi nopeudella 2000 rpm 10 minuutin ajan. Gradientti Percoll (30-60%) käytettiin rikastamaan valmisteen soluissa, jotka ovat peräisin kasvainten ja poistaa vieraiden aineiden mononukleaaristen verisoluja. Kasvainsolut käsitti -80% elävien solujen tuloksena näytteessä arvioitiin mikroskooppisen tarkastuksen. Askites soluravintoliuoksista jälkeen saatiin 24 tunnin viljelyn 0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA), johon ei ole lisätty naudan sikiön seerumia (FBS). Solut ja jäänteet poistettiin sentrifugoimalla 5000 x g ja suodattamalla 0,22 um: n suodattimen.

Capture solun pinnan proteiinien

eristämiseksi solun pinnan proteiinien kolmen kiinnittynyt munasarjasyövän solulinjoissa, ~ 2 x 10

8 solua biotinyloitua vuonna viljelylevyssä laajojen PBS huuhtelun, 10 ml 0,25 mg /ml sulfo-NHS-SS-BIOTIN PBS huoneenlämmössä (23-24 ° C) 10 min. Jäljelle jäänyt biotinylaatio reagenssi tukahdutettiin 10 mM lysiiniä. Rikastettu kasvainsolujen askites pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja biotinyloitua suspensiona (2,5 x 10

8cells /ml) 0.48mg /ml Sulfo-NHS-SS-biotiinia PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (23- 24 ° C). Jäljelle jäänyt bio- tinylointireagenssia pysäytettiin 10 mM lysiiniä sekä solulinjassa ja askites valmistelu. Proteiini uutto suoritetaan liuoksessa, joka sisältää NP-40 detergenttiä 2% (v /v) solujen häiriöitä sonikoimalla mitä seurasi sentrifugointi 20,000 x g. Biotinyloitu proteiinit kromatografisesti eristettiin affiniteettikromatografialla käyttämällä 1 ml UltraLink immobilisoidun NeutrAvidin (Pierce) valmistajan ohjeen. Proteiineja sitoutuu pylvääseen otettiin talteen pelkistämällä bio- tinylointireagenssia 5 ml: lla liuosta, joka sisälsi 65 umol DTT: tä ja 1% oktyyli-glukosidi (OG) pesuaineen 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Eluoitu proteiinit olivat sitten alkyloidaan 200 umol jodiasetamidia huoneenlämmössä.

fraktiointi solu-uutteiden

solun pinnalla, väliaine ja yhteensä uutetta fraktioitiin käänteisfaasikromatografialla käyttäen vastaavasti 500 ug , 1 mg ja 1 mg kokonaisproteiinia. Kaikki solu-uutteet vähentää ja alkyloidaan jodoasetamidilla ennen kromatografiaa. Erottaminen suoritettiin POROS R1 /10-pylväässä (Applied Biosystems-4,6 x 50 mm) 2,7 ml /min käyttäen lineaarista gradienttia 10-80% orgaanista liuotinta, yli 30 minuutin aikavälillä. Käytetty liuotinsysteemi on: vesipitoinen liuotin-5% acentonitrile /95% vesi /0,1% trifluorietikkahappoa; orgaaninen liuotin-75% asetonitriiliä /15% isopropanoli /10% vettä /0,095% trifluorietikkahappoa. Fraktiot kerättiin nopeudella 3 jaetta /minuutti.

Proteiinin tunnistaminen LC-MS /MS

Proteiinidigestio ja tunnistamiseen LC-MS /MS suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16] . Lyhyesti, kunkin yksi käänteisfaasi- jakeet erikseen hajotettiin-ratkaisu trypsiinillä hajotusta (400 ng /fraktio), ja ryhmitelty 15-21-altaat kullekin solulinjan ja jokainen osasto (eli solun pinnalla, väliaine ja liukoista koko solulysaatti), joka perustuu kromatografiseen ominaisuuksia. Altaat yksilöllisesti analysoitiin LC-MS /MS on LTQ-ORBITRAP massaspektrometri (Thermo-Finnigan) kytkettynä nanoflow kromatografiajärjestelmään (Eksigent) käyttäen 25 cm: n pylväs (Picofrit 75 pm ID, New tavoitteet, pakattu-talon MagicC18 hartsia) yli 90 minuutin lineaarisella gradientilla. Hankitut Aineisto käsitteli automaattisesti laskennallisen proteomiikka Analysis System-CPAS [17]. Tandem Massaspektrit vastaavuushaku versio 3.13 ihmisen IPI tietokantaan. Kiinteä muuttaminen 6.020129 massayksikköä lisättiin lysiinijäännöksissä tietokannan etsivät tilille sisällyttämistä raskaan lysiiniä isotooppia. Arvioida merkitys peptidin ja proteiinin tulitikut, haimme työkalut PeptideProphet [18] ja ProteinProphet [19]. Tunnistusasiakirjan kanssa PeptideProphet todennäköisyys on suurempi kuin 0,75 valittiin ja toimitettiin ProteinProphet. Jälkimmäinen päättelee vähimmäismäärää proteiineja, jotka selittävät peptidi todisteita, määrittämällä todennäköisyys kullekin proteiinia perustuu yhdistettyyn peptidi todennäköisyydet. Johdetun proteiinin tunnuksilla oli suodatettuna 1% virheprosentti todennäköisyyden perusteella, että paras ottelu saatu kuuluisi jakelussa satunnainen tietokannan tulitikut [20]. Spektrin laskentamenetelmän [21] käytettiin arvioimaan proteiinin rikastamisen kunkin osaston. Kokonaismäärä spektrin laskee kunkin proteiinin ryhmän tuotos ProteinProphet käytettiin semi-kvantitatiivisen analyysin. Kukin aineisto normalisoitiin kokonaismäärä laskee koko kokeen. Rikastamista kerroin laskettiin seuraavalla lausekkeella: [(C

xp /Nf) + 1] /(C

te p + 1), jossa C

x on laskee kunkin proteiinin (p) sub-proteomiin (erityksen tai solun pinnalla); Nf on normalisointi tekijä (esitetty ylä- taulukon S1); C

te on laskee samaa proteiinia (p) havaittiin yhteensä ote kunkin solun. Lisäys 1 lukemat tarkoituksena oli ottaa huomioon ne proteiinit, joille ei Havainto tehtiin yksi osa-proteomeja ja edustaa vähintään rikastamiseen tekijä kyseisen proteiinin.

Tulokset

proteomiikan Analyysi munasarjasyöpäsoluja

kattava proteomic profiilin OVCAR3, CaOV3 ja ES2 solulinjoissa, ja munasarjasyöpäsoluja vesivatsanesteestä potilaan kanssa vakavien munasarjasyöpä suoritettiin. Yleinen kokeellinen työnkulku koostui ehjän proteiinin fraktioinnin seurasi massaspektrometrisia tietojen hankinnan LC-MS /MS ja data-analyysi, kuten on kuvattu kuviossa 1. Kaiken kaikkiaan suoritimme 215 LC-MS /MS kulkee, jotka vastaavat yli kaksi miljoonaa MS skannaa.

Yhteensä solulysaateista.

käänteisfaasikromatogrammia edustavat fraktiointi proteiineille on kokosolulysaatissa ES2 solujen on esitetty kuviossa 2. Kaiken analyysi tuotti noin 3000 korkea luottamus proteiinia tunnistusten kullekin solupopulaatio analysoitiin (kuvio 3). Määrä proteiini tunnisteiden total solu-uutteissa yhteistä että kolmen solulinjojen oli 1179, ja vaihteli 2011-2267 kahden solulinjoista (kuvio 3A). Keskimäärin 655 proteiinit yksilöidä yhdessä solulinjassa. Lisäksi biologisen heterogeenisuus, osa vaihtelua tunnistettu proteiinien välillä solulinjoja voitiin katsoa massaspektrometrinen Alinäytteistys alhainen runsautta proteiineja.

kromatogrammissa esiintyy profiilia jakotislaamalla 1 mg kokosolulysaatissa. Keräsimme 18 jakeet Tämän näytteen edelleen proteiinin tunnistamiseen LC-MS /MS. Purkavaa Näytteiden ennen LC-MS /MS-analyysi ehjä proteiini fraktioimalla parantaa merkittävästi tunnistaminen vähäisessä määrin proteiineihin [16]. Laatikot alla kromatografiaprofiili osoitti jakeet analysoitiin. Kiinteä tumma viiva osoittaa kaltevuus käytetty erottamiseen.

Venn kaaviot osoittavat päällekkäisyyksiä proteiinien tunnistettu eri solupopulaatioiden analysoitu. A. tunnistukset kokonaisista solulysaateista kolme solulinjojen analysoitiin. B. proteiinit tunnistettu kolme osa-proteomeja (kokosolulysaatissa, väliaine ja solun pinnalla). C. Proteiinit tunnistettiin kasvainsoluissa rikastettu Vesivatsanesteestä näytteille 80% yhteensopivuutta proteiinien tunnistettu kolme munasarjasyövän solulinjoissa. D. lukumäärä proteiinien tunnistettiin kussakin aineisto. Taulukko S1 listaa proteiinien tunnistettu tässä tutkimuksessa.

solupintaproteiinien.

tukeutunut merkintöjä strategiasta lipidien läpäisemätön biotiinin merkitä ja kaapata proteiinit paljaana solun pinnalla OVACAR3, CaOV3, ES2 solulinjojen ja askites johdettu kasvaimen solut (kuvio 1). Noin 2 x 10

8-soluista, saimme noin 500 ug biotinyloitua proteiineja, jotka edustavat ~1-2% koko solun proteiinin massasta. Lista proteiinin tunnisteita on esitetty taulukossa S1.

proteiinit vapautuvat väliaineeseen.

solulinjoja kasvatettiin elatusaineissa, jotka sisältävät raskaita isotooppeja lysiiniä. Isotooppileimaamiseksi proteiinien tarkoituksena oli syrjiä proteiinien vapautuu kasvavista soluista ja proteiinien luontainen täydennetty median. 48 tunnin kuluttua viljelyn pitoisuus proteiinien nousi 100 ug /ml 225 ug /ml väliainetta ja OVCAR3 soluja. Koska -15% ennustetusta ihmisen trypsiinipeptidit yli 6 aminohappoa ovat identtisiä välillä ihmisen proteiineja ja niiden naudan kollegansa, isotooppileimaukseen solun proteiinien tarjotaan keino erottaa ihmisen proteiineja erittyy viljellyistä soluista naudan proteiineja läsnä väliaineessa. Askiteksen peräisin olevia soluja, media kerättiin 24 tunnin kuluttua viljelyn, kun läsnä on 0,1% naudan seerumin albumiinia (BSA). Noin 1 mg proteiineja elatusaineesta solulinjoista ja syöpäsolujen askites fraktioitiin käyttäen samaa käänteisfaasikromatografialla menetelmällä, kuin käytettiin kokosolulysaateista, ja yksittäiset fraktiot analysoitiin LC-MS /MS: llä. Viljeltyjä solulinjoja, proteiineja, jotka havaittiin yksinomaan peptidien merkitty lysiinitähteet ja jotka olivat sekvenssiltään identtinen ihmisen ja naudan, johtuivat elatusaineeseen ja ne eivät sisälly luetteloon proteiineille, joita vapautuu soluista.

Euroopan proteomic profiilia munasarjasyöpäsoluja johtaa tunnistamiseen 6462 proteiineista (kuvio 3D). Käytimme tiukat kriteerit proteiinia tunnisteiden, ottaen huomioon voimassa vain proteiinit pienellä ProteinProphet todennäköisyydellä kynnys 0,9. Tämän kynnyksen arvioitu väärän tunnistaminen on pienempi kuin 1%. Tämä aineisto edustaa tarkat ja täydelliset proteomic tutkimuksen solupopulaatioiden munasarjasyövän hoitoon. Syvyys analyysi ja kattavuus saavutetaan proteiinin tasolla tässä tutkimuksessa vastaa syvällistä analyysia paljastaa ilmaisi geenien RNA-tasolla.

proteiini jakautuminen solunsisäisen, solun pinnan ja solunulkoisen osastoissa

vertaileva analyysi proteiinien eri osastoissa voidaan arvioida, missä määrin rikastuminen proteiineja solun pinnalla ja solunulkoisessa osastoon. Olemme luottaneet spektrin laskentamenetelmän [21] arvioida proteiinin rikastamisen kunkin osaston. Normalisoinnin jälkeen kokonaismäärään spektrin laskee, proteiineja, joilla on suurempi määrä laskee osastoon (solun pinnan tai väliainetta) verrattuna kokosoluliuotteista pidettiin rikastettu, että osastossa (kuvio 3). Vastaava rikastumiskertoimet havainnoitu kaikkien tunnistettujen proteiinien on esitetty taulukossa S1.

Proteiinit johtuvan kolmen solun osiin analysoitiin Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), ja algoritmit ennustamiseksi transmembraanisen alfa-helix domeenit (TMHMM) [22], ja läsnäolon signaalipeptidien (SignalP) [23] (kuvio 4A). Tämä analyysi osoitti huomattavaa vastaavuutta välillä osoitti sijainti perustuvat proteomic profiilin ja ennusteita tietokannasta analyysiin. Tämä vastaavuutta oli erityisen selvää, että top 10% rikastettua proteiineja kun verrattava 10% vähiten rikastettua proteiineista (kuvio 4B ja 4C), joka tukee käytetystä strategiasta analysoida tiettyjä osastoja. Merkittävä määrä proteiineja selityksin kuten ydin- tai soluliman ja läsnä keskuudessa tunnukset sekä elatusaine ja solun pinnan ala-proteomeja on huomionarvoista. Jossain määrin, esiintyminen näiden pääasiallisesti solunsisäisiä proteiineja voi johtua solujen hajoamisen jälkeen noin 1% viljeltyjen solujen arvioitiin olevan kuollut perustuu trypaanisinisellä värjäystä. On kuitenkin olemassa näyttöä esiintymisen sytoplasmisen sitoutuneiden proteiinien solunulkoisen kalvon, erityisesti syövän [24], [25].

. Solu lokalisointi luokittelun yhdistelmää merkintöjä alkaen Ingenuity Pathway Analyysiohjelmisto ja laskennallinen ennustaminen transmembraanisen alfa-helix (TMHMM) ja signaali peptidit (SignalP). B. ja C. vertailu top 10% rikastettua proteiineja elatusaineessa tai solun pinnalla (B ja C, vastaavasti), jolla on vähiten rikastettu 10% osoitetaan vahva välistä yhdenmukaisuutta ennustetun solujen sijainti ja rajattuun proteomiin analysoitu.

proteiinit solut erittävät odotetaan diffusioitumaan kudoksiin ja anna liikkeeseen. Näin ollen, toisin kuin solunsisäisiä proteiineja, eritetyt proteiinit voivat olla todennäköisempää havaita plasmassa. Vertasimme munasarjojen solujen proteiiniprofiileja jonka lokero proteiinien lueteltu Human Plasma peptidi Atlas [26]. Koko 6462 proteiinit tunnistettu tässä tutkimuksessa, 2341 (36%) esiintyi Human Plasma Peptide Atlas (taulukko S1). Top 100 proteiineja, jotka olivat rikastuneet elatusaineessa kunkin solupopulaatioiden analysoitu olivat korkeammin edustettuina Peptide Atlas (65-78%) verrattuna koko 36% edustus. Nämä tulokset viittaavat siihen, että eritettyjä proteiineja on runsaammin plasmassa, että ei-erittyvien proteiinien.

samankaltaisuudet solulinjojen ja askitesta kasvainsolujen

Kolme solulinjat tässä tutkimuksessa edustavat hyvin tunnettu

in vitro

malleja munasarjasyöpä. OVCAR3 ja CaOV3 ovat peräisin ihmisen serous munasarjan adenokarsinooma [27], [28] ja ES2 on peräisin selkeä cell carcinoma [29]. Erot histologia rinnastuvat erot proteiiniprofiilit, mikä näkyy klusterointi analysoinnin spektrin lasketaan toimenpiteitä proteiinin runsauden (kuva S1). Tämä on ilmeistä havainnoista, että eritetyn ja pinta-ala-proteomeja ES2 ovat merkittävästi erilaiset kuin kahden muun solulinjat analysoitiin.

kasvainsolut rikastettu askites analysoitiin olivat peräisin potilaalta, jolla vakavien munasarjojen adenokarsinooma. Kahdeksankymmentä prosenttia tunnistettujen proteiinien ascites kasvainsolut havaittiin myös yksi tai useampi solulinjoista (kuvio 3C). Kuten kuviosta S1, kaavoja potilaan kasvainsolut eristettiin askites on suurempi samankaltaisuus CaOV3 ja OVCAR3 kuin ES2.

Toinen tapa selittää yhtäläisyyksiä voivat luottaa havainto proteiinien jo tiedetään liittyvän kanssa tauti. Useita kallikreiinien on aikaisemmin liittynyt vakavien munasarjan adenokarsinooma [30]. KLK6, KLK7 ja KLK 9 esiintyi runsaasti väliaine askites peräisin kasvainsoluja, OVCAR3 ja CaOV3, mutta ei ES2 soluravintoliuoksista (taulukko S2). Nämä havainnot viittaavat jälleen suurempi yhtäläisyyksiä serous adeonocarcinoma solulinjat OVCAR3 ja CaOV3 ja kasvaimen peräisin olevia soluja sekä eroja suhteessa selkeä soluista saatu ES2 solulinjassa.

Jotkut eroa ei ollut havaittavissa askites peräisin olevien solujen ja solulinjat. Jotkin proteiinit yksinomaan havaita ja rikastettua pinnalla tai elatusaineissa vatsaontelones- johdettujen syöpäsoluja. Näitä ovat proteiinit, kuten ABP1 (amiloridi herkän amiinioksidaasi) ja MMP7 (ja matriisi mettaloprotease 7), transkriptien jolle ovat etenkin runsaasti erilaisia ​​alatyyppejä munasarjasyövän, ja toiset koodaama mRNA: t, joilla on korkea ekspressiotasot tietyissä histologista tyyppisiä munasarjasyöpä (taulukko S3). Huomionarvoista on se, että useat proteiinien rikastettu yksinomaan kasvainsoluissa Vesivatsanesteestä on erittäin alhainen kudoksen ilmentymistä normaalissa munasarjassa [31] (taulukko S3). Nämä proteiinit ovat mahdollisesti peräisin valkosoluista ja mesoteelisolujen jotka olisi yhteistyössä puhdistettu vatsaontelonesteestä.

vuodattamalla pintakalvoproteiinit osaksi extra-soluosastoon

tueksi meidän kokeellisen ja analyyttinen lähestymistapa, huomasimme, että merkittävä osa proteiinien selityksin kuin kalvon proteiinit tunnistettiin viljelyalustaan, jotka edustavat yli 25% kaikista tunnistettu proteiineja kuten esimerkiksi OVCAR3 ja askitesta johdettujen kasvainsoluja (kuvio 4a). Useat näistä proteiineista oli huomattavasti rikastettu sekä solun pinnalla ja viljelyalustassa (taulukko S4). Analyysi peptidien tunnistettu osoitti, että suurin osa, nämä peptidit olivat peräisin solunulkoisten domeenien solun pinnan proteiinien, kuten on esitetty kuviossa 5A, mikä viittaa siihen, ektodomeeni leviämistä.

. Tunnistaminen kattavia peptidejä solunulkoisten domeenien transmembraaniproteiineja havaittu elatusaine, sopusoinnussa irtoaminen prosessi. CDH1 (epiteelin kadheriini) kuvaa hyvin tässä prosessissa, koska peptidit, jotka kattavat vain solunulkoisen domeenin havaitaan elatusaineessa, kun taas peptidit, jotka kattavat sekä solun sisäinen ja ulkoinen alueiden havaittiin pinnalla Ovcar3 ja askites-soluja. Punainen jälkiä osoittavat solunulkoisia domeeneja ja sininen jäljet ​​osoittavat solunsisäisiin. Transmembraanialueita on merkitty keltaisella laatikoihin. Tumma laatikot osoittavat peptidejä tunnistettu. B. Western blottaus CDH1 käyttäen spesifistä vasta-ainetta vastaan, solunsisäinen domeeni (hiiren anti-E-kadheriinin klooni 36, # 610181, BD Biosciences), mikä osoittaa pilkkoutumisen täyspitkän CDH1. Ei ollut johdettujen peptidien solunsisäinen verkkotunnus elatusaineessa.

epiteelikasvaimet kadheriinin (CDH1) osoittaa selvästi irtoaminen prosessi, koska sekvenssi kattavuus ekstrasellulaarisen domeenin on vallitsevana erittyvä murto, kun taas peptidi kattavuus ulottuen sekä sisäisiä ja domeenit havaittiin proteiini on eristetty solun pinnalla osa. Vertasimme massaspektrometrian perustuu havaintojen kanssa Western blot analyysi munasarjasolulinja ja askitesta johdettuja syöpäsoluja. Ehjä muotoja CDH1 havaittiin kokosolulysaateista yhdessä pienemmän molekyylipainon fragmentteja, jotka sisältävät solunsisäiseen domeeniin. Kuitenkin Askites-soluissa on vallitsevana alhaisen molekyylipainon fragmentteja, jotka sisältävät vain solunsisäisen domeenin sekä yhteensä solu-uutteessa ja solun pinnan, joka osoittaa, että irtoaminen prosessi on laajempi tuumorisoluissa kuin solulinjoissa. Muodot CDH1 sisältävät solunsisäisen domeenin ei havaittu vakioitu väliaine näiden solujen (kuvio 5b). Prosessi irtoaminen CDH1 on hiljattain kuvattu munasarjasyöpäsoluja [5], jotka tukevat meidän massaspektrometriaa perustuvat tutkimuksiin. Huomattavaa on havainto tutkimuksessamme ylimääräisiä proteiinien kadheriinin adheesiomolekyylien perheeseen vuonna elatusaineessa, kuten hermo kadheriinin (CDH2), calsyntenin-1 (CLSTN1), alcadein beeta (CLSTN3), desmogleiini-1 (DSG1) ja desmogleiini-2 (DSG2). Perustuu kekseliäisyyttä Pathway Analysis merkinnästä, useimmat näistä kalvon tunnistettujen proteiinien rikastettu elatusaine liittyvät prosessit soluadheesion ja solun liikkumisen (taulukko S4). Prosessi lohkominen ja irtoaminen ei ole yhdenmukainen kaikille proteiineille, kuten olemme havainneet merkittävän määrän proteiineja rikastunut solun pinnan osa, joita ei ole havaittu solun viljelyalustaan ​​(taulukko S4).

Protein eritysnopeuksissa

analysoiminen proteiineista vapautuu väliaineen soluviljelmässä on houkutteleva strategia tunnistaa mahdolliset kiertävän markkereita. Mahdollisuudet havaita kohonnut proteiinin liikkeessä on riippuvainen osittain nopeudesta, jolla proteiini vapautuu solun tilaan ja lopulta veren osaston kasvaimen suhteessa muihin kudoksiin. Luetteloon proteiinien eniten rikastettu elatusaineissa suhteessa kokosolulysaateista kaksi kudosta metalloproteaasien estäjät (TIMP 1 ja TIMP2) (taulukko S2). Nämä proteiinit on suora diagnostiikka potentiaalia munasarjasyöpä [32].

arvioinut rikastamiseen tekijä TIMP1 Western blot-analyysi (kuva 6a). TIMP1 tapahtui pääasiassa erittyvä osastoon kaikissa solulinjoissa, sopusoinnussa perustuvia ennusteita spektrin laskentaa. Olemme myös suorittaa aika-kurssin mittaamiseen TIMP1 ja TIMP2 pitoisuus elatusaine arvioida eritys näiden proteiinien kaikkien kolmen solulinjoissa (kuvio 6b). TIMP1 osoitettiin vähäinen eritys in OVCAR3 soluissa suhteessa muihin solulinjoihin, joka on johdonmukainen Western blot-analyysi. Laskimme eritystä hinnat TIMP1 ja TIMP2 olla suuruusluokkaa nanogrammaa proteiinia miljoonaa solua kohden, tunnissa. Perustuu eritystä nopeudella 3 ng TIMP1 miljoonaa solua kohden tunnissa ja ottamatta huomioon hajoaminen ja puhdistuma seerumissa, se veisi noin 10

8-10

9 kasvainsoluja ja useita päiviä lähtö muuttaa tasoa TIMP1, joita esiintyy normaalissa ihmisen seerumissa, joka on 87-524 ng /ml.

. Western blot osoittaa, että läsnä TIMP1 vain väliaine kaikkien 4 munasarjasyöpä soluja. OVCAR3 ilmaistaan ​​huomattavasti vähemmän TIMP1 verrattuna muihin soluihin. Sama massa proteiinia (5 gg) ladattiin kuhunkin kaistaan, että geeli tämän analyysin. std vastaa rekombinantti TIMP1 käytetään standardina valvonta; TE vastaa kokosolulysaatissa; SE kunnostetun alustan; ja SU solun pinnan proteiineihin. B. eritystä nopeuden mittaamiseen TIMP1 ja TIMP2 käytetty kaupallinen ELISA (R & D systems). Esikäsitelty väliaine laimennettiin 1:15 ja 1:60 analysointiin TIMP1 ja TIMP2, vastaavasti. Eritys määrä arvioitiin perustuen kulmakerroin käyrän lineaarisen ajankohtina.

Keskustelu

Esitämme tässä perusteellisen proteomiikka analyysi munasarjasyövän solulinjoissa ja munasarjasyöpä tuumorisoluissa, mukaan lukien erilliset analyysit solun pinnan ja erittävät proteiineja. Tutkimus perustui kokonaisen proteiinin fraktiointi seuraa trypsiinillä ja LC-MS /MS [16], [33], joten herkkä havaitsemisen vähäisessä määrin proteiineihin. Kaikkiaan olemme tuotti laajan profiilia proteiinit, jotka koostuvat yli 6500 ainutlaatuista tunnuksilla, joilla virhetaso alle 1%. Tuoreessa tutkimuksessa askitesnesteen koostuu valkuaista sekapopulaatioissa soluista [12] tunnistettiin 2737 proteiineja. 2307 (84%) proteiineista raportoitu, että tutkimuksessa oli käsitti keskuudessa proteiinit tunnistettu tutkimuksessamme.

käyttö spektrin laskee mittana runsaasti yhdistettynä vertailuja proteiinien löydetty solun pinnalla tai solunulkoiseen osastoissa ja kokosolulysaatissa profiilien sallittu tunnistaminen proteiinien rikastettu erityisesti osastoissa. Peptidi laskenta tarjoaa runsaasti arvioita, jotka korreloivat kohtuullisen hyvin määrittämät muilla menetelmillä [34]. Tutkimuksessamme olemme myös havaittu hyvä korrelaatio arvioita runsaasti kudosta estäjä metalloproteinaasi 1 (TIMP1) ja epiteelin kadheriinin (CDH1), joka perustuu spektrin laskenta ja arviointi perustuu Western blot-analyysi. Isotooppileimaus kanssa SILAC [15] myös tehokas keino erottaa proteiineja elatusaineessa, joita vapautuu viljellyistä soluista peräisin proteiineista myötävaikuttanut naudan seerumin viljelyväliaineeseen.

analyysit ovat antaneet käsityksen panos pintaproteiini irtoaminen ja vapauttaa proteiini koostumus extra-soluosastoon. Proteiinit korkeasti rikastetun elatusaineissa edustavat potentiaalinen kiertävän merkkiaineita munasarjasyöpä. Transkriptit, jotka vastaavat joitakin näistä proteiineista (esim KLK6, 7 ja 9) ovat suhteellisen runsaasti ovarioiden verrattuna useimpiin normaaleissa kudoksissa [35]. On jo näyttöä esiintyminen suurin osa näiden proteiinien normaalia ihmisen plasmaa. 60 proteiinit taulukossa S2, 48 (80%) oli läsnä Human Plasma peptidi Atlas [26].