Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisääntynyt aineenvaihdunta on edellytys kasvainsoluproliferaation. Ymmärtää riippuvuus kasvainsolujen rasvahappojen metaboliaan, arvioimme erilaisten solmujen rasvahapon synteesin kautta. Käyttäen RNAi olemme osoittaneet, että ehtyminen rasvahappojen synteesireitti entsyymit Scd1, FASN tai ACC1 in HCT116 paksusuolen syövän soluissa johtaa sytotoksisuuden, joka on peruutettavissa eksogeenisen rasvahappoja. Ehdollinen fenotyyppi on erityisen voimakas, kun Scd1 on tyhjentynyt. Käytimme tätä rasvahappojen pelastus strategia luonnehtia useita pienimolekyylisiä estäjiä rasvahappojen synteesi, mukaan lukien tunnistaminen TOFA- kuin voimakas Scd1 estäjä, joka edustaa aiemmin kuvaamattoman toimintaa tätä yhdistettä. Viite FASN ja ACC inhibiittorit osoittavat sytotoksisuus, joka on vähäisempi kuin TOFA-, ja rasvahappojen pelastus profiilit sopusoinnussa niiden ehdotettujen kohde-entsyymi. Kaksi viittaus Scd1 estäjät osoittavat matalan nanomolaarinen sytotoksisuus, joka kompensoi ainakin kaksi suuruusluokkaa eksogeeniset oleaatti. Yksi näistä estäjien hidastaa kasvua HCT116 ksenograftikasvaimissa. Tuloksemme hahmotella tehokas strategia kuulusteluun paikan mekanismin teho ja polku-solmu-spesifisyys rasvahapposynteesissä estäjät, perustaa yksiselitteistä yhteys rasvahapposynteesissä ja syöpäsolujen selviytymisen, ja kohta kohti Scd1 keskeisenä tavoite tämän reitin.

Citation: Mason P, Liang B, Li L, Fremgen T, Murphy E, Quinn A, et al. (2012) Scd1 esto aiheuttaa syöpää solukuoleman Depleting kertatyydyttymättömiä rasvahappoja. PLoS ONE 7 (3): e33823. doi: 10,1371 /journal.pone.0033823

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 lokakuu 2011; Hyväksytty: 17 helmikuu 2012; Julkaistu: 22 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Mason et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat työntekijät Genzyme Corporation. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

rasvahappojen pitoisuus elimistön solujen on johdettu ruokavaliosta ja

de novo

synteesiä. Nopeasti lisääntyvät syöpäsolut usein vankka ohjelma rasvahappojen synteesin liittyy korkean tason ilmentymistä liittyy geenien, kuten rasvahappojen syntaasin [1]. Koska sen suhteellinen runsaus syöpäsoluissa, rasvahappojen syntaasia on harjoitettu kuin syöpätautien tavoite [2]. On kuitenkin epäselvää, rasvahappojen syntaasia edustaa nopeutta rajoittavaa komponenttia rasvahappojen synteesireitti.

pitkäketjuiset rasvahapot ovat kriittisiä nopeasti kalvon synteesin vaatimuksen in voimakkaasti kasvavia soluja ja pelata avain rooleja eri signalointikaavoja [3]. Lisäksi sopiva tasapaino ketjun pituudet ja aste kyllästyminen on kriittinen ylläpito solukalvon liikkuvuus ja kaarevuus [4]. On raportoitu, että esto eri vaiheet rasvahappojen synteesireitti aiheuttaa eston syöpäsolujen kasvua, joko puutteellisuuden vuoksi loppupään rasvahappoja

sinänsä

, tai koska kertyminen myrkyllisten reitin välituotteiden kuten malonyyli-CoA, tai molemmat [5].

Käyttämällä yhdistelmää siRNA ja pienmolekyylisalpaajien, yhdistettynä ”rasvahapon komplementoinnin” strategiaa, olemme tunnistaneet stearoyl-CoA-desaturaasi 1 kuin entsyymi rasva- happo synteesireitti, joka on välttämätön syövän solujen elinkelpoisuus. ”Komplementaatio” strategia sallittu luonnehdinta molempien Scd1 sekä spesifisyyttä erilaisten rasvahappojen synteesi-inhibiittorit, ja selventää mekanismia, jolla Scd1 estäminen rajoittaa syöpäsolujen lisääntymistä. Tuloksemme hahmotella yksiselitteistä yhteys rasvahapposynteesissä ja syöpäsolun selviytymistä.

Tulokset

Syöpäsolut ovat herkkiä menetys Scd1 funktion

vaikutuksen tutkimiseksi keskeytymisestä rasvahappojen synteesi syövän solujen elinkykyä, käytimme siRNA-altaat heikentävistä kolme solmut koulutusjakson synteesiä varten pitkäketjuisten rasvahappojen (kuvio 1A). Kuten kuviossa 1B on esitetty, ehtyminen asetyyli-CoA-karboksylaasi (ACC1), rasvahappojen syntaasia (FASN), tai stearoyyli-CoA-desaturaasi (Scd1) johtaa laski elinkelpoisuuden (tai solun aineenvaihduntaan) (mitattuna solun ATP-tasot käyttäen solu- tiitteri Glo) in HCT116 koolonkarsinoomasoluissa, 30%, 30%, ja 70%, tässä järjestyksessä, verrattuna ei-suunnattu siRNA ohjaus, joka nimettiin 100% elinkelpoisuuden jokaisessa tapauksessa mRNA knockdown määritettiin reaaliaikaisella RT -PCR olevan noin 80% (ei esitetty). Me perusteltu, että jos tämä sytotoksisuus on todella geeni-sidottu ja kohde-, ja jos keskeytys rasvahapposynteesissä polku johtaa vähensi solujen elinkelpoisuuden vuoksi puute loppupään rasvahappoja verrattuna kertyminen myrkyllisten koulutusjakson välituotteiden, sitten sytotoksisuus aiheutti ehtyminen eri koulutusjakson solmujen pitäisi olla rescuable tai estettävissä, lisäämällä eksogeenistä rasvahappojen alavirtaan solmun. Kuten kuviossa 1B on esitetty, ACC1 ehtyminen ja FASN heikentyminen ovat rescuable mukaan palmitaatti, stearaatti ja oleaatti, jotka kaikki ovat alavirtaan sekä ACC1 ja FASN. Scd1 ehtyminen ei rescuable joita palmitaatti tai stearaatti (jotka ovat ylävirtaan Scd1), mutta Scd1 ehtyminen merkittävästi pelastaa oleaattia (joka on alavirtaan Scd1). Alennettu solujen elinkelpoisuus aiheuttamia ehtyminen kaksi olennaista geenien liity mekanismi, PSMD14 ja RNA-polymeraasi II (Pol II) ei pelastaa tahansa rasvahapon hoitoja. Tämä viittaa siihen, että vähentynyt solujen elinkelpoisuuden aiheuttama hoito näillä siRNA: t on todella johtuu ehtyminen kohdegeenin, ja että se on aiheuttanut puute rasvahappojen synteesiä, toisin kuin kertyminen myrkyllisiä reitin välituotteiden normaalissa viljelyolosuhteissa .

de novo

synteesiä mono-tyydyttymättömiä rasvahappoja. B HCT116 paksusuolen syövän soluja (ATCC) viljeltiin RPMI-1640 (Cambrex), joka sisälsi 2% FBS: ää maljattiin tiheydellä 4000 solua kuoppaa kohti 100 ul median 96-kuoppalevyillä transfektoitiin siRNA altaat (Dharmacon, 50 nM) kohdistaminen kolme rasvahappoja synteesireitti solmuja, tai kaksi eivät liity selviytymisen geenejä, käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 16 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 25 uM rasvahappoa (Sigma, 100 x varastot liuotettiin 10% MeOH /0,9% BSA /PBS), kuten on osoitettu, ja elinkelpoisuus määritettiin 72 tuntia transfektion jälkeen (Cell Titer Glo, Promega). Tulokset ilmaistaan ​​prosentuaalisena elinkelpoisuus vastaan, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (nimetty 100% elinkelpoisuus) käsiteltiin samalla rasvahappo. C DU145 eturauhassyövän solut, HCT116 koolonkarsinoomasoluissa, ja MIA PaCa2 haimasyövän soluja (ATCC) viljeltiin RPMI-1640, joka sisälsi 2% FBS hoidettiin yhdellä siRNA kohdistamista Scd1 tai PSMD14 (Dharmacon, 25 nM), jota seurasi 16 tuntia myöhemmin hoidon oleaattia esitetyllä. Elinkyky määritettiin 72 tuntia transfektion jälkeen. Tulokset ilmaistaan ​​prosentuaalisena elinkelpoisuus vastaan, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (nimetty 100% elinkelpoisuus) käsiteltiin samalla rasvahappo. D HCT116 koolonkarsinoomasoluissa maljattiin tiheydellä 1000 solua per kuoppa 25 ul median 384-kuoppalevyille käsiteltiin pienimolekyylisiä estäjiä ACC1 (CP640186, Pfizer), FASN (# 10v, Merck), tai Scd1 (# 7n, Abbott), väliaineessa, joka sisältää rasvahappoja, kuten on osoitettu, 72 tuntia ennen elinkelpoisuuden määrittämiseen. Inibitors syntetisoitiin Genzyme (Waltham, MA).

tutkia yhden Scd1 osallisuudesta syöpäsolun selviytymisen, useat syöpä solulinjoja altistettiin Scd1 tai PSMD14 RNAi hoitoa, molemmissa tapauksissa käyttäen single siRNA. Elinkelpoisuus DU145 eturauhassyöpäsolujen, HCT116 koolonsyöpäsoluja, ja MIA PaCa2 haimasyöpäsoluissa pienenee (verrattuna ei-kohdistuksen ohjaus siRNA) ehtyminen sekä geenien, kuten on esitetty kuviossa 1C. Kaikissa tapauksissa Scd1-ehtyminen sytotoksisuus on rescuable jonka täydentämistä median oleaatti, kun taas kaikissa tapauksissa PSMD14 ehtyminen ei ole. Tämä viittaa siihen, että erilaisia ​​syöpäsoluja riippuvat

synteesi mono-tyydyttymättömien rasvahappojen

solujen elinkelpoisuuden, ja että Scd1 on kriittinen solmun reitti, joka voi olla sopiva terapeuttinen kohde.

rasvahappo synteesireitti on tutkittu yhteydessä molempien aineenvaihduntasairaus [6] ja syöpä [7]. Näin ollen erilaisia ​​rasvahappojen synteesin inhibiittorit ovat käytettävissä. Ryhdyimme käyttämään rasvahappojen pelastus strategia useita sellaisia ​​yhdisteitä, keinona sekä testaamalla oletusta, että rasvahappojen synteesi, ja Scd1 aktiivisuus erityisesti, ovat välttämättömiä syöpäsolun elinkelpoisuuden, ja myös tavoitteena ymmärtää paremmin on- ja off-mekanismi toimintaa rasvahappojen synteesi estäjät itse. Kuten kuviossa 1D, viite estäjiä ACC1 (Pfizer # CP640186 [8]), FASN (Merck # 10v [9]), ja Scd1 (Abbott # 7n [10]) kaikki näyttö sytotoksisuutta ja pelastus profiilit sopusoinnussa polku asemaa tavoitteesta. Myrkyllisyys johtuen ACC1 ja FASN esto pelastaminen palmitaatti, stearaatti ja oleaatti, kun taas myrkyllisyys johtuu Scd1 esto pelastaminen vain oleaatti. On myös huomionarvoista, että teho nämä inhibiittorit kuvastaa havainto siRNA. Huolimatta siitä, että viittaus inhibiittorit ovat verrattavissa teho biokemiallisissa määrityksissä niiden tavoitteensa, ACC1 ja FASN inhibitio saadaan vaatimaton elinkelpoisuuden väheneminen, kun taas fenotyypin Scd1 esto on voimakkaampi, mikä viittaa Scd1 on erityisen arvokas, ehkä korko- rajoittamalla solmun tämän reitin. Nämä havainnot viittaavat myös siihen, että viittaus inhibiittorit ovat vapaita hallitseva (ei rescuable) off-mekanismi myrkyllisyys tässä solussa järjestelmässä. Tyydyttyneet pitkäketjuiset rasvahapot käytetty pelastus skenaariossa itse tuottaa vaatimaton kannattavuus vähentäminen käytetyillä pitoisuuksilla. On huomionarvoista, että nämä tyydyttyneet rasvahapot ovat synergistisiä kanssa Scd1 inhibiittoria (kuvio 1 D). Tämä viittaa siihen, että vaikka suurin osa elinkelpoisuuden vaikutus nähdään, kun Scd1 inhibitio on ehtymisen vuoksi mono-tyydyttymättömien rasvahappojen, Scd1 inhibitio vähentää myös solujen kykyä vaikutusten lieventämiseksi luonnotonta, eksogeenisen tyydyttyneiden rasvahappojen, oletettavasti ”vieroitus” että oleaatti tai palmitoleate.

Inhibitor aktiivisuus selvennystä täydentämisen

Testasimme kolmen kaupallisen laajasti käytetty historiallinen inhibiittorit rasvahappojen synteesireitti käyttäen ”rasvahappo pelastaa” strategiaa. Cerulenin ja C75 ovat FASN estäjiä [11], [12], ja TOFA- on ACC1 estäjä [13]. Kuten kuviossa 2A on esitetty, cerulenin ja C75 sekä estää HCT116 paksusuolen syövän solujen elinkykyä, kuten odotettua. Kuitenkin kumpikaan näistä estäjien reagoi palmitaatti, stearaatti tai oleaatti, mikä viittaa siihen, että nämä molemmat inhibiittoreilla on hallitseva, ei-mekanismiin perustuva sytotoksisuutta tässä solussa, ja että tämä väheneminen solujen elinkelpoisuuden ohjaa näitä yhdisteitä ei liity esto rasvahapon synteesiä.

HCT116 paksusuolen syövän soluja käsiteltiin pienimolekyylisiä FASN inhibiittorit C75 ja Cerulenin (Sigma), tai ACC inhibiittorin TOFA (Sigma), väliaineessa, joka sisältää rasvahappoja, kuten on osoitettu, 72 tuntia ennen elinkelpoisuuden määrittämiseen. B HCT116-soluja käsiteltiin oleaatti eri aikoina suhteessa aikaan TOFA lisäksi. Solujen elinkyky määritettiin 72 tunnin kuluttua TOFA hoidon. C HCT116-soluja käsiteltiin yhdisteiden media puuttuu tai sisältävät oleaatti, jonka jälkeen elinkelpoisuuden määritys 72 tunnin kuluttua. D HCT116 paksusuolen syövän soluja viljeltiin tiheydellä 1 x 10

6 solua per 1 ml media kuoppaa kohti 12-kuoppaisilla levyillä esi-käsiteltiin TOFA yhden tunnin ajan, minkä jälkeen 13 C-palmitaatti tai 13C-stearaatti tai 13C asetaattia (Sigma) käsittely neljä tuntia. Merkityt rasvahapot ja esterit poimittiin, saippuoidaan, ja analysoitiin LC /MS /MS käyttäen joko API 5000 tai API 4000 kolmoiskvadrupolisen massaspektrometriä (AB Sciex, Forster City, CA) hyphenated kanssa Agilent 1100 HPLC järjestelmä (Agilent, Santa Claire, CA). LC erotus suoritettiin käyttäen Xbridge fenyyli 2.1 x 100 mm: n pylväs (Waters, Milford, MA). Mobile faasi A koostui 5 mM ammoniumformiaattia deionisoituun veteen. Liikkuva faasi B koostui 5 mM ammoniumformiaattia metanolissa. Näytteen latauspuskuria koostui 30% puskuria A ja 70% puskuria B. Lineaarinen gradientti käytettiin erottamiseen (70%: sta 100% B 5 min). Näytteet ionisoidaan ESI on negatiivinen ioni tila ja pysähdysaikaa MRM oli 75 ms.

Tässä kokeessa TOFA- myrkyllisyys pelastaminen tehokkaasti oleaatti, mutta ei palmitaatti tai stearaatti (kuva 2A), toisin kuin odotusarvo spesifinen inhibiittori ACC1. Tämä malli rasvahappojen pelastus on sopusoinnussa TOFA- esto Scd1. Vaihtoehtoisesti TOFA- perustuva sytotoksisuus voisi olla kokonaan pois-tavoite (unrescuable by palmitaatti tai stearaatti), ja TOFA- voisi periaatteessa fyysisesti vuorovaikutuksessa oleaatti kasvualustaan ​​siten, että oleaatti yksinkertaisesti estää TOFA- pääsemästä soluista. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, lisäsimme oleaatti eri aikoina suhteessa aikaan TOFA lisäksi, ja mitattu elinkelpoisuus kaikissa tapauksissa 72 tunnin kuluttua TOFA hoidon. Kuten on esitetty kuviossa 2B, oleaatti lisäksi jopa 8 tunnin jälkeen, TOFA lisäksi saadaan jonkin verran ”pelastus”, joka on erotettavissa tapauksessa, jossa oleaatti lisätään ennen TOFA lisäksi. Tällöin TOFA- on tuntia tunkeutua solun ja estävät tavoite, ennen käyttöönottoa oleaatti. Tämä on ristiriidassa oleaatti yksinkertaisesti estää TOFA- pääsemästä soluista. Kun oleaatti lisätään 24 tunnin kuluttua TOFA- Lisäksi fenotyyppi kääntyminen on merkittävästi heikentynyt. Siksi välillä 8 ja 24 tunnin kuluttua TOFA- hoidon solut ohittaa ”kohdan, josta ei ole paluuta” ja tulla reagoimatta oleaatti kun analysoitiin elinkelpoisuuden 72 tuntia.

Lisäksi pidimme oleaatti voi olla siveetön ”sytotoksisuus-pelastus-aine.” tämän mahdollisuuden testaamiseksi, testasimme erilaisia ​​sytotoksisia yhdisteiden oleaatti-pelastus määrityksessä. Kuten kuviossa 2C on esitetty erilaisia ​​inhibiittoreita erilaisten mekanismien testattu (mukaan lukien C75 ja cerulenin), vain TOFA-driven sytotoksisuus on rescuable mukaan oleaatti. Tämä on ristiriidassa oleaattia toimii yleisenä ”pelastus-aine.”

Sen hypoteesin testaamiseksi, että TOFA- ”rasvahappo pelastus profiilin” todenmukainen TOFA- esto Scd1, me seurataan muuntaminen vakaa-isotooppi-leimattua rasvahapot LC /MS /MS: llä rasvahappojen flux puuttuessa tai läsnä TOFA-. Olemme tutkineet Scd1-välitteisen desaturaatio 13C-palmitaatti tai 13C-stearaattia palmitoleate tai oleaatti, vastaavasti, ja venymä 13C-palmitaatti ja stearaatti jälkeen 1 tunnin TOFA altistumista. Lisäksi arvioida ACC1 esto, me seurataan 13C-asetaatti sisällyttäminen palmitaatti. Kuten kuviossa 2D, TOFA- estää sekä Scd1 välittämää desaturation tapahtumia voimakkuudella verrattavissa sen solun elinkelpoisuuden EC50, ja verrattavissa sen teho on ACC1. Toisaalta, huomattavasti korkeampi TOFA tarvitaan vaikuttaa (ei-Scd1 perustuva) venymä palmitaatti ja stearaatti. Sen vuoksi, joka perustuu rasvahappojen pelastus profiilin ja suora mittaus Scd1 inhibition elävissä soluissa, TOFA estää Scd1, joka on aiemmin kuvaamattoman toimintaa TOFA.

Kun on kyse sekä TOFA ja Scd1 estäjä # 7n (kuviot 1D ja 2A), ulkoiset palmitaatti täydentää vaikutusten Scd1 eston. Beyond että tässä määrityksessä ympäristössä palmitaatti esitetään joitakin luontaisia ​​solujen elinkykyä esto, palmitaatti myös vasen-siirtymät EC50 TOFA- ja # 7n, mikä viittaa siihen, että yhdistelmä luonnottoman koholla palmitaatti, ja kyvyttömyys käsitellä sen oleaatti, parantaa kannattavuutta esto syöpäsoluja.

syöpä solujen elävyyden esto kappaleita estäjän tehoa ja Scd1 ovat yksinomainen olennainen desaturation reitti

testaa uskollisuutta ja korrelaatio meidän rasvahappoja pelastus elinkelpoisuutta koskeviin tutkimuksiin ja matkapuhelinverkon Scd1-esto LC /MS /MS-määritys, tutkimme kolme Scd1 inhibiittorimolekyyliehdokkai-: TOFA-, Abbott # 7N, ja Abbott # 28 c [14]. Kuten kuviossa 3A on esitetty, # 7n on useita kertaa voimakkaampi kuin TOFA, ja oleaattia rescuable, että solun elinkelpoisuuden määrityksessä, ja vastaavasti on tehokkaampi kuin TOFA suorassa solu Scd1 inhibition määrityksessä. Vastaavasti, # 28c on olennaisesti tehokkaampi kuin # 7n suorassa solu Scd1 inhibition määrityksessä, ja myös solunelinkykyisyysmääritys, kun taas täysin säilyttäen oleaatti-rescuability.

HCT116-soluja käsiteltiin ja analysoitiin solujen elinkykyisyys tai solu Scd1 inhibition (LC /MS /MS), kuten edellä on kuvattu. B HCT116 käsiteltiin DMSO: ssa tai Scd1 estäjä # 28c, kun läsnä on eri rasvahappojen (25 uM) (Biomol, # 2803) 72 tunnin ajan, ja analysoitiin solujen elinkykyisyys. Tiedot näytetään että karttaa jatkumo vihreästä (elävät solut) punaiseen (kuolleita soluja). C HCT116-soluja käsiteltiin 36 tunnin ajan erilaisilla annoksilla Scd1 estäjien kuten on osoitettu. Solut lyysattiin MAP täyteväriä (Invitrogen) ja analysoitiin Western blot -menetelmällä varten PARP pilkkominen (Cell Signaling). Staurosporiini, laajakirjoinen estäjä, sisällytettiin positiivisena kontrollina PARP pilkkominen. D HCT116-solut käsiteltiin kuten C, läsnä ollessa tai poissa ollessa eksogeenisen oleaatti, jota seuraa analyysi PARP pilkkominen.

katsotaan, että muita tyydyttymättömyys tapahtumat voivat olla saatavilla tukemaan syövän solujen elinkelpoisuuden kautta desaturaaseja muut kuin Scd1, jos solut saavat riittävästi tyydyttyneiden alustan. Tutkia tätä mahdollisuutta, sekä edelleen luonnehtia spesifisyys # 28 c Scd1 -estäjä tutkimme paneelin rasvahappojen vaihtelevan ketjun pituudet ja kylläisyyttä valtiot niiden kyky ”täydentää” (estää vaikutus) Scd1-inhibitor- välittämä elinkelpoisuuden väheneminen. Kuten on esitetty kuviossa 3B, mutta ei kaikki tyydyttymättömien rasvahappojen täydentää, kaikki ”täydentää” rasvahapot eivät sisältävät ainakin yhden tyydyttymättömän sidoksen. Toisaalta, kaikki tyydyttyneitä rasvahappoja ei komplementoinut, mikä viittaa siihen, että tyydyttymättömyys vaaditaan ehdottomasti komplementointitutkimuksiin, ja että vaihtoehtoiset desaturaasi toimintaa ei voida käyttää.

Tutkimme TOFA-, # 7N, ja # 28c induktioon apoptoosi cascade. HCT116-soluja käsiteltiin yhdisteellä annoksilla vastaa, tai kymmenen kertaa edellä, niiden sytotoksisuus IC50. Kuten kuviossa 3C on esitetty, kaikki kolme rasvahappojen synteesin estäjät indusoivat PARP pilkkominen annoksesta riippuvalla tavalla, mikä viittaa siihen, että keskeytys rasvahappojen synteesiä näissä soluissa aiheuttaa apoptoosin. Induktion PARP pilkkominen korreloi solukuoleman että se on korjattavissa eksogeeninen oleaattia (kuvio 3D). PARP pilkkominen on merkki apoptoosin [15].

Scd1 esto hidastaa kasvaimen kasvua ja ei yleisesti myrkyllinen

Vaikutus Scd1 ehtyminen useilla syöpäsolulinjoissa nostaa esiin mahdollisuuden, että Scd1 esto tulee yleismaailmallisesti myrkyllinen. Testasimme munasarjasyövän solulinja SKOV3 herkkyyttä viittaus Scd1 estäjä. Kuten kuviossa 4A on esitetty, Scd1 inhibiittori on rajallinen vaikutus SKOV3 solujen elinkykyä, versus HCT116, huolimatta vertailukelpoisia estävä vaikutus solujen muuntaminen stearaattia oleaatin (Scd1 aktiivisuus). Me katsoi SKOV3 voi olla yleisesti herkkä eri myrkyllisiä aineita. Kuten kuviossa 4B, SKOV3 ja HCT116 ovat verrattain herkkiä erilaisia ​​mekaanisesti-erillisten myrkyllisiä yhdisteitä, kuten dimethylsphingosine ja daunorubisiini, kun taas tapauksessa Scd1 estäjien, SKOV3 on varsin herkkä suhteessa HCT116. Tämä viittaa siihen, että SKOV3 on tiettyjä ali rasvahappojen synteesin inhibition, ja että Scd1 esto ei ole yleisesti myrkyllisiä.

HCT116 tai SKOV3- soluja käsiteltiin ja analysoitiin solujen elinkelpoisuuden tai solujen Scd1 inhibition (LC /MS /MS), kuten edellä on kuvattu. B HCT116 tai SKOV3- soluja käsiteltiin ja analysoitiin solujen elinkelpoisuuden. Taulukko ilmaisee suhde SKOV3 EC50 verrattuna HCT116 EC50. C, D Nude hiiret kätkeminen passage viisi 200 mm3 HCT116 kasvaimet (kuljetettiin kuten troakaarijakeita) (n = 10 ryhmää kohti) annostellaan suun kautta letkulla kahdesti vuorokaudessa ja 160 mg /kg # 28c 20 päivää tai laskimoon CPT11 kolmena peräkkäisenä päivänä joka alkaa, kun kasvaimet saavuttivat 200 mm3. Kasvaimen kasvua (C) ja painon (D) seurattiin ja piirrettiin keskiarvona +/- standardipoikkeama.

Scd1 estäjä # 28c kuvattiin vastikään Abbott [14] on voimakas, orally- käytettävissä Scd1 estäjä suotuisan farmakokineettiset ominaisuudet. Siksi tämä molekyyli on työkalu

in vivo

Scd1 tavoite validointi syöpään. Käsittelimme hiirillä 200 mm3 HCT116 kasvaimia kahdesti päivässä # 28c letkulla suun kautta (vs. IV CPT11 optimoituun annosteluohjelmaa) 20 päivän ajan ja tarkkaillaan kasvaimen kasvua ja kehon painoa. Kuten kuviossa 4C, # 28c kasvoi maltillisesti viiveellä HCT116 kasvaimia. Vaikka Scd1 estäjä ei vähentää oleaatti sisältö leikattiin kasvaimia (ei esitetty), huomattava oleaatti pysyi tuumorikudoksessa, nostaa sitä mahdollisuutta, että ravinnon oleaatti voidaan rajoittaa tehoa ja Scd1 estäjä. Hoito Scd1 estäjän mukana oli laihtuminen lähestyy 20%, tai vähennys 20 g noin 16 g, annostelemalla päivänä 10 (tutkimus päivä 26) (kuvio 4D), joka saatiin talteen, kun annostelu lopetettiin (tutkimus päivä 36). On epäselvää, onko tämä laihtuminen on on-mekanismia estäjä (kuten voitaisiin odottaa estäjä lipidisynteesiin), tai eivät liity Scd1 eston.

Keskustelu

Syöpäsolut ovat erillisiä alkaen pahanlaatuisten solujen perustuu osittain niiden ainutlaatuinen metabolisen tilan jonka yhtenä elementtinä on epätavallinen vaatimus rasvahapposynteesissä [16]. Niinpä rasvahappojen synteesireitti on ollut houkutteleva syövän tavoite jo jonkin aikaa, ja ensisijainen huomio on keskittynyt rasvahappojen nopaliinisyntaasin, joka osoittaa kohdan, tuotannon pitkäketjuisten rasvahappojen [17]. Kokeemme ym [18] viittaavat kuitenkin, että reaktionopeus synteesissä kertatyydyttymättömiä rasvahappoja on paikassa de-kylläisyys (by Scd1), ja että Scd1 edustaa erityisen haavoittuva solmun tämän reitin. Käyttäen sekä siRNA ja viite estäjiä, olemme osoittaneet, että menetys Scd1 aktiivisuuden tuotosten lausutaan elinkelpoisuutta esto erilaisten syöpäsolujen

in vitro

. Se, että tämä kannattavuus esto on palautuva, kun oleaatti lisätään soluviljelyalustaan ​​väittää, että fenotyyppi on on-mekanismi, ja selittyy sillä Scd1-eston välittämä oleaattia puutos, toisin kuin kertyminen solunsisäisten palmitaatti tai muu ylävirran polku komponentteja. Ehdotamme, että tämä rasvahappojen pelastus strategia on yksinkertainen, yleisesti käyttökelpoinen mekanismi luonnehdinta rasvahappojen inhibiittorin spesifisyys, osoituksena meidän luonnehdinta Scd1 estävästä vaikutuksesta TOFA-.

HCT116 kasvaimen kasvu viivästyy upon hoito tehokas, oraalisesti-käytettävissä Scd1 viite estäjä. Kuitenkin kasvaimen kasvun viivästyminen on kohtalainen, falling huomattavasti alle sen nähty CPT11, joka toimi positiivisena kontrollina. On huomionarvoista kuitenkin, että optimoitu annostusohjelmaa ei ole perustettu Scd1 estäjä. Kasvaimen kasvun viivästyminen oli mukana laihtuminen, ja laski kehon painon säilyi koko annostelun aikana. Scd1 alunperin tutkittu kohteena aineenvaihduntahäiriöiden, ja se ei olisi yllättävää, jos jokin osa havaitun laihtuminen johtui laaja eston

monotyydyttämättömäksi

rasvahappojen synteesi. Lisäksi, vaikka Scd1 hiirten ovat elinkelpoisia [19], hiiret on useita SCD isoformeja, joka voi olla tarpeeton. Jos haittavaikutus (laihtuminen) nähdään nykyisessä tutkimuksessa johtuu rasvahappojen synteesi esto, tämä saattaa johtua Scd1 estäjä moniosaisia ​​hiiren SCD isoformeja. Tämä ei testattu. Kuitenkin periaatteessa tämä eriyttää estäjä perustuva toksisuusprofiilin geneettisestä Scd1 tyrmäys. Vaihtoehtoisesti laihtuminen nähnyt voisi olla nettovaikutus Scd1-esto-ajettu vähensi painoindeksin ja lisääntynyt energiankulutus, verrattavissa nähtävä Scd1 tyrmäys [19], [20].

Mono-tyydyttymättömien rasvahappojen happo kypsymisen ja jalostuksen jälkeen tuotanto Scd1, on monimutkainen verkko johtaa monia eri ketjun pituudet, kylläisyys valtiot, ja subsellulaarisessa jakelu kohtaloita. Voi olla, että kun Scd1 edustaa lopullista, nopeutta rajoittava ”point-of-supistumista” on reitti, joka on alavirran entsyymi kohteeseen, pitkin yhtä erilaisia ​​mono-tyydyttymättömien rasvahappojen käsittely sub-väyliä, voivat edustaa solmun joka on erityisesti vaaditaan syöpäsolun elinkelpoisuuden, ja tarpeeton normaalia solujen toimintaa. Voi myös olla, että Scd1 esto voisi olla tuottavia yhteistyössä hoito skenaario, pienillä annoksilla yhdessä perinteisen agentti.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

HCT116, DU145, ja MIA PaCa2 syövän solut saatiin ATCC: stä ja ylläpidettiin RPMI 1640 (Cambrex) täydennettynä penn-strep (ATCC) ja 5% FBS: ää (Hyclone). Määrityksiä varten solut maljattiin RPMI1640 puuttuu Penn-strep ja joka sisälsi 2% FBS: ää tiheydessä 4000 solua /100 ul /kuoppa 96-kuoppalevyille ja siRNA hoitoon ja elinkelpoisuuden määritys, tai tiheydellä 1000 solua /25 ul /kuoppa 384 kuoppalevyillä yhdistehoito ja elinkykyisyyden määrityksistä, tai tiheys 1 x 10

6 solua /1 ml /kuoppa 12-kuoppalevyillä yhdisteen hoitoon ja LC /MS /MS-analyysi leimatun rasvahappojen flux . Kaikki solut kasvatettiin yhtenä kerroksena 95% ilma /5% CO

2, ja yhden paljon kuin lipidit FBS käytettiin kaikissa kokeissa

Fatty Acid valmistus

Fatty hapot (Sigma) liuotettiin metanoliin konsentraatioon 25 mM. 25 mM varastot laimennettiin sitten kymmenkertaisesti PBS (Cambrex), joka sisälsi 0,9% BSA: ta (A9576, Sigma). Näitä 2,5 mM (100X) varastot sekoitettiin perusteellisesti ja seos inkuboitiin 37 asteen vesihauteessa yksi tunti ennen aliquoting ja pakastamalla -20 asteessa. Rasvahappo paneeli Biomol (# 2803) liuotettiin DMSO: hon.

LC /MS /MS-analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin käyttämällä API 5000 tai API 4000 kolmoiskvadrupoli massa- spektrometriä ( AB /MDS Sciex, Concord, Kanada) ja Agilent 1100 HPLC pumppu (Agilent, Andover, MA). Pylväät olivat Xbridge fenyyli 2,1 x 100 mm (Waters, Milford, MA). Puskuri A oli vettä 5 mM ammoniumformiaattia; puskuri B oli metanoli 5 mM ammoniumformiaattia; ja latauspuskuria oli 30% puskuria A plus 70% puskuri B). Vain 5 min gradientti (70%: sta 100% puskuri B, lineaarinen) käytettiin MRM hankinnan ajankohtana 75 ms käyttämällä negatiivista tilassa. Rasvahapposynteesissä määritykset ilmaistiin joko tuote /(tuote + substraatti) (jos kyseessä on stearaattia palmitoleate, ja oleaatti synteesi), tai raaka tuote normalisoitu leimaamattoman linolihappoa (jos kyseessä on palmitaatti synteesi).

siRNA transfektion

oN-Target-PLUS tai siGENOME varastossa siRNA (geenispesifiseen tai ei-kohdistuksenhallintavaihtoehtoja) ostettiin Dharmacon, ja transfektoituja (50 nM (12,5 nM kutakin neljästä siRNA: iden) in tapauksessa siRNA-allas (Smartpools), tai 25 nM, kun on kyse yhden siRNA: iden käyttäen Lipofectamine 2000 Scd1 yhdessä siRNA sekvenssi oli: 5′-GAACAGUGCUGCCCACCUC-3 ’. PSMD14 yhdessä siRNA sekvenssi oli: 5’-GGCAUUAAUUCAUGGACUA-3 ”. Kuusitoista tuntia transfektion jälkeen, 1/100

th tilavuus 100 x BSA-kompleksoidun rasvahappo (palmitaatti, stearaatti tai oleaatti) (100X = 2,5 mM) tai pelkästä lisättiin. Seitsemänkymmentä kaksi tuntia transfektion jälkeen, 25 ul Cell-tiitteri Glo lisättiin ja levyjä analysoitiin solujen elinkelpoisuus mukaan valmistajan (Promega) suositus. Kaikki analyysit suoritettiin kahtena tai kolmena kappaleena, lukuisia kertoja samanlaisia ​​tuloksia, ja piirretään keskiarvona ± SD yhden edustavan kokeen.

pienimolekyylisiä estäjähoidon

C75, cerulenin ja TOFA hankittiin Sigmalta. ACC estäjä CP640186 (Pfizer), FASN estäjä # 10v (Merck), ja Scd1 inhibiittorit # 7n ja # 28 c (Abbott) syntetisoitiin Genzyme (Waltham, MA). Yhdisteet liuotettiin DMSO: hon ja säilytetään -20 asteessa. Kun kyseessä on sekä BSA-kompleksoituna rasvahapon (tai vehikkeli) ja pienimolekyylisiä inhibiittorit (tai DMSO), aineet olivat esilaimennettua määrityksessä elatusaineeseen 7 x lopullinen konsentraatio. 5 ul kappaleelta on 7 × varastojen kahden sopivan aineita lisättiin 25 ul välineellä 35 ul lopputilavuuteen. 72-96 tuntia myöhemmin, 7,3 ul Cell-tiitteri Glo lisättiin, ja levyjä analysoitiin solujen elinkelpoisuus. Kaikki analyysit suoritettiin kahtena tai kolmena kappaleena, lukuisia kertoja samanlaisia ​​tuloksia, ja piirretään keskiarvona ± SEM yhden edustavasta kokeesta.

HCT116 Vieraslajisiirteen

Eläinkokeet (# GENZ100507- 20) suoritettiin hyväksymisen jälkeen Genzyme Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). HCT116 kasvaimet siirrostettiin kuten troakaarijakeita in

nu /nu

hiirillä. Eläimillä käytävä viisi kasvaimia käsiteltiin # 28c (160 mg /kg kaksi kertaa päivässä suun kautta annostelu 20 päivää) tai CPT11 (kerran päivässä laskimoon annostelun kolmena peräkkäisenä päivänä), kun kasvaimet saavuttivat 200 mm3.