Krooninen sairaus

tiivistelmä

ennustetta munasarjasyöpäpotilaalle pysyi huonona lähinnä aggressiivinen syövän etenemisessä. Koska epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on tärkeä mekanismi välittävien ja metastaasit syöpäsolujen, kohdistaminen EMT prosessia tehokkaampi ja vähemmän myrkyllisiä yhdisteitä estämään etäpesäkkeiden on suuri terapeuttinen arvo munasarjasyövän hoitoon. Olemme löytäneet ensimmäistä kertaa, että ginsenoside 20 (S) -Rg3, farmakologisesti aktiivisen komponentin perinteisen kiinalaisen yrtti

Panax ginseng

, voimakkaasti estää hypoksian indusoiman EMT munasarjasyövän solujen

in vitro

ja

in vivo

. Mekanistinen tutkimukset vahvistavat vaikutustapa 20 (S) -Rg3, joka vähentää ilmentymistä hypoksian indusoituva tekijä 1α (HIF-1α) aktivoimalla Ubikitiini-proteasomireitillä edistämiseksi HIF-1α hajoamista. Väheneminen HIF-1α puolestaan ​​johtaa ylössäätöä kautta transkription tukahduttaminen Etana, että epiteelisolujen markkeri E-kadheriinin ja alas-sääntely mesenkyymisolun markkeri vimentiinista hypoksisissa olosuhteissa. Tärkeää on, 20 (S) -Rg3 estää tehokkaasti EMT nude mouse ksenograftimalleja munasarjasyöpä, lupaava uusi terapeuttinen aine syövän hoitoon.

Citation: Liu T, Zhao L, Zhang Y, Chen W, Liu D, Hou H, et al. (2014) Ginsenoside 20 (S) -Rg3 tavoitteet HIF-1α Block Hypoksia-aiheuttama epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon in munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 9 (9): e103887. doi: 10,1371 /journal.pone.0103887

Editor: Joseph Najbauer, Pécsin yliopisto Medical School, Unkari

vastaanotettu: 31 lokakuu 2013; Hyväksytty: 04 heinäkuu 2014; Julkaistu: 08 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30973429). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä, nykyiset pääasiassa muodossa epiteelin munasarjasyöpä (EOC), on kaikkein vaarallisin gynecologic maligniteetti [1], [2]. Alhainen eloonjäämisaste munasarjasyöpäpotilaalle liittyy sen ilkeä luonne ja metastaasit. Niistä kriittinen avustajat invasiivisen ja metastaattisen kyvyn munasarjasyöpäsoluja on hypoksian kasvaimen microenvironment [3], [4], joka välittää kasvainsolujen invaasion ja etäpesäkkeiden kautta stabilointi hypoksian indusoituva tekijä-1 alfa (HIF-1α) [5], [6].

normoxic soluissa, HIF-1α hydroksyloituu perheen proliini hydroksylaaseja (PHD1-3) at Pro402 ja Pro564, mikä konformaatiomuutos joka edistää HIF-1α sitova von Hippel Lindaun proteiini (VHL) – komponentti suurten E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen, joka välittää proteasomaalisten hajoaminen HIF-1α [7], [8]. Hypoksisissa olosuhteissa, alhainen happipitoisuus estä proliini hydroksylaatio, joka johtaa HIF-1α vakautus- ja muodostamalla sen heterodimeerin kanssa konstitutiivisesti HIF-1β. Bioaktiivinen HIF-1-dimeerin säätelee, kuten transkriptiotekijän, ilmentymistä laajan geenien ei vain solusyklin, apoptoosin [9], angiogeneesin [10], [11] ja aineenvaihduntaa [12] vastauksena hapenpuuteympäristössä, mutta myös soluprosessin kutsutaan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [13] – [15].

Tunnistetut ensimmäisen alkion kehitykseen, EMT on havaittu myöhemmin saada olla tiiviisti mukana prosessissa syövän eteneminen ja metastaasit [16], [17]. Aikana EMT prosessin solut muuntuvat polarisoitunut epiteelisolujen fenotyyppi on mesenkymaaliset fenotyyppiin [18], biologinen tapahtuma ominaista solujen morfologia vaihtamisesta uuteen mukulakiven muodon dispergoidun fibroblastit muoto, menetys epiteelisolujen-erityisiä proteiinimarkkereita ja hankinta mesenkyymisolun-erityisiä ominaisuuksia, ja tehostetun solun liikkuvuus ja invaasiota. Vaikka useita tekijöitä, mukaan lukien kasvutekijät ja hypoksinen mikroympäristön osoitetaan indusoijina EMT, monia transkription tekijöitä, kuten Snail vahvistetaan tärkeitä välittäjiä EMT [19]. EMT estää epiteelisolujen-spesifinen E-kadheriinin toiminnan kautta eri välittäjäaineiden, mikä johtaa menetykseen apikaalisella-perus napaisuus ja solu-solu-adheesion risteyksessä, ja ajan säätelee mesenkyymisolun erityisiä vimentiinista [20] jolloin solun tukirangan uudelleenjärjestelyn ja soluliikkuvuus lisälaite. Nämä tapahtumat muodostavat peruspiirteitä EMT molekyylitasolla. Huomattavaa on, että EMT on myös osallisena syövän huumeiden vastarintaa ja korit tehokkaan terapeuttisen intervention syövistä vaiheissa [21]. On selvää, kohdistaminen EMT prosessi tarjoaa uuden idean syöpähoitoa varten, erityisesti munasarjasyöpä-kasvain, joka näyttää olevan hyvät mahdollisuudet saada etäpesäkkeitä.

Ginsenosides ovat farmakologisesti aktiiviset komponentit

Panax ginseng

[22], joka on jo pitkään hyödynnetty perinteisen kiinalaisen lääketieteen officinalis tai toipumis- tarkoituksiin [23], [24]. Tähän mennessä yli 40 ginsenoside yhdisteiden on havaittu [25]. Jotkut niistä, Rg1, Rg3, RH1 ja Rh2 esimerkiksi osoittaa voimakas syövän vastaista aktiivisuutta [24], [26] – [28]. Ginsenoside Rg3, bioaktiivinen otteita

Panax ginseng

, on erilaisia ​​lääketieteellisiä vaikutuksia, kuten anti-kasvain [29] – [32], antioksidantti, anti-tulehdus ominaisuuksia [33], [34], estämällä arpi liikakasvu ihon [35] ja angiogeneesissä [36]. Lisäksi, stereoisomeerit 20 (R) -Rg3 ja 20 (S) -Rg3 on kaksi optisesti aktiivista kiraalista molekyylejä, jotka eroavat suunta hydroksyyli (OH) -ryhmä on hiili-20 [24]. Vaikka molemmat on raportoitu estävän kasvainten etäpesäkkeitä [30], stereospesifisyys Rg3 näyttää liittyvän niiden bioaktiivi-. Tässä tutkimuksessa olemme havainneet ensimmäistä kertaa, että 20 (S) -Rg3 estää tehokkaasti hypoksian aiheuttaman EMT ihmisen munasarjasyöpäsoluja paitsi

in vitro

mutta myös nude mouse ksenograftimalleissa, lupaava uusi luonnollinen aine anti-munasarjasyövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Lääkkeet ja vasta-aineet

20 (S) -Rg3 ja 20 (R) -Rg3 saatiin Tasly Pharmaceutical Company (Tianjin, Kiina), ja puhtaus oli ≥99% määritettynä korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC). Rg3 stereoisomeerien liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jossa on 4 mg /ml kantaliuosta ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Alikvootteja kantaliuosta lisättiin suoraan elatusaineeseen.

Seuraavia vasta-aineita käytettiin: kanin vasta-aine vimentiinin, VHL, hiiren vasta-aine p-aktiini (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), kanin vasta-aineen E-kadheriinin (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), hiiren vasta-aineen HIF-1α (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA), lampaan vasta-aineen PHD1 (R HIF-1α-käänteisfaasi, 5′-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3 ’; PHD1 eteenpäin, 5’-AGGCTGTCGAAGCATTGGTG-3 ’; PHD1- taaksepäin, 5’-GGGATTGTCAACGTGCCTTAC-3 ’; PHD2 eteenpäin, 5’-AAGCCCAGTTTGCTGACATT-3 ’; PHD2-käänteinen, 5’-TTACCGACCGAATCTGAAGG-3 ’; PHD3 eteenpäin, 5’-AGCCCATTTTTGCCAGACTCC-3 ’; PHD3-käänteinen, 5’-GATTTCAGAGCACGGTCAGTC-3 ’; VHL-eteenpäin, 5’-GCAGGCGTCGAAGAGTACG-3 ’; VHL- taaksepäin, 5’-CGGACTGCGATTGCAGAAGA-3 ’; Snail-eteenpäin, 5’-TCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3 ’; Snail- taaksepäin, 5’-CTTTCCCACTGTCCTCATCTG-3 ’; β-aktiini-forward, 5’TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3 ’; β-actin- käänteinen, 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3 ’.

Western Blot

Yhteensä solu-proteiini-uutteet valmistettiin lysoimalla solut RIPA-puskurissa jäissä. Solut kerättiin raaputtamalla ja siirrettiin mikrosentrifugiputkiin. Näytteet sonikoitiin ja sentrifugoitiin 12000 rpm 30 minuutin ajan poistamaan liukenematon roskia. Supernatantti kerättiin ja mittaamaan Quick Start Bradfordin Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteiinit keitettiin ennen erotettiin elektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatti -polyacrylamide geelielektroforeesilla (SDS-PAGE) geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Pall Life Science, NY, USA) käyttäen märkää transmembraanisen laite (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ , USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, testattiin yön yli primaarisen vasta-aineen (E-kadheriinin 1:500, vimentiinin 1:2000, β-aktiini 1:1000, HIF-1α 1:500, PHD1 1:2000, VHL 1:1000) TBST: ssä, jota seuraa inkubointi sopivilla piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vuohen anti-hiiri /kani IgG 1:2000, kanin anti-lammas-IgG 1:1000) kuten on osoitettu. ECL reagenssi (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) käytettiin kehittää blotteja. Kaikki arvot normalisoitiin P-aktiini.

Haavan paranemista määrityksessä

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen käsittelyä. Yksisolukerrokset raaputettiin 200 ul pipetin kärki ja pestään media ilman seerumia poistamiseksi irrotettuja soluja. Soluja ylläpidettiin media ilman seerumia normoksia, hypoksia tai hypoksia läsnäollessa 20 (S) -Rg3 24 tuntia. Haavoittuneet alueet, sitten kuvataan inkuboinnin jälkeen indikoidun ajaksi.

Cell migraatiokokeessa

Solut (1 x 10

5 /kuoppa) 100 ui elatusainetta ilman seerumia lisättiin osaksi millicells 8 um huokoskoko (Millipore Co., Bedford, MA, USA), lisätään kaivoihin, jotka sisälsivät RPMI 1640 20% naudan sikiön seerumia kemotaktinen tekijä. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut jäljellä yläpinnalla suodattimen poistettiin vanupuikolla, ja vaeltavat solut kiinnitettiin 5% glutardialdehydin minkä jälkeen Giemsa-värjäyksellä kvantitoimiseksi solujen määrä. Numerot vaeltavia solujen kolmen HPF alemman kalvojen pinnoille laskettiin. Vähintään kolme kuopat laskettiin koetta kohti.

Sirna (siRNA) pudotus

knockdovvn PHD1 ja VHL suoritettiin käyttäen tiettyjä siRNA hankittiin GenePharma Company (Shanghai, Kiina). Sekvenssit siRNA: t ovat seuraavat: siPHD1-A, 5′-GCAUCACCUGUAUCUAUUATT-3 ’; siPHD1-B, 5’-CCAACAUCGAGCCACUCUUTT-3 ’; siPHD1-C, 5’-GCUAGCAUCAGGACAGAAATT-3 ’; siVHL-A, 5’-CCACCCAAAUGUGCAGAAATT-3 ’; siVHL-B, 5’-GUCUCAUUCUCAGAGUAAATT-3 ’; siVHL-C, 5’-AACUGAAUUAUUUGUGCCAUCTT-3 ’. Salatun siRNA (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’) käytettiin rinnakkain kokeissa negatiivisena kontrollina. siRNA: t transfektoitiin SKOV3- ja 3AO solujen 40-50% konfluenssiin siRNA transfektioreagenssin (Roche, Indianapolis, IN, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tehokas siRNA: t seulottiin ulos tulosten mukaan reaaliaikaisten RT-PCR jälkeen 48 tunnin inkuboinnin ja Western blot jälkeen 72 h. Sitten tehokas siRNA: t transfektoitiin soluihin ja inkuboitiin 24 tuntia, minkä jälkeen hypoksian induktion kanssa tai ilman 20 (S) -Rg3 hoitoa vielä 24 tuntia. Vaikutus PHD1 ja VHL hiljaisuus tukahduttamisesta HIF-1α 20 (S) -Rg3 arvioitiin proteiinin tasolla.

lusiferaasireporttiterilla määritys

Alkukiteiden päälle 24-kuoppaisille levyille 24 h, solut transfektoitiin ohimenevästi E-kadheriinipromoottorin lusiferaasireportteriplasmidi pGL2Basic-E-cadK1 (Addgene, Cambridge, MA, USA) ja phRL-TK-vektoria (Promega, Madison, WI, USA). 24 tuntia myöhemmin solut käsiteltiin kanssa tai ilman 20 (S) -Rg3 in hypoksinen asetukset 24 h normoxically viljeltiin transfektoitu solu kontrollina. Solulysaatti kerättiin 24 tuntia myöhemmin, ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin luminometrillä (Promega, Madison, WI, USA) käyttämällä Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). E-kadheriinin lusiferaasiaktiivisuus normalisoida Renillan lusiferaasin. Tulokset saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta ja kukin määritys sisältäviä rinnakkaisesta kuopasta.

Eläinkokeet

hoitoon ja käyttöön koe-eläinten hyväksyi eettinen komitea ensimmäisen Affiliated sairaala, ja oli kiinnittynyt institutionaalisten ohjeiden ja eettisiä standardeja. Kaikki kuusiviikkoisilla naaraspuolisten BALB /c nude-hiiriä sijoitettu SPF este tilat alle 12 tunnin valo /pimeä sykli. Eläimen kehon painoja ja ihonalainen kasvain kohtisuorassa halkaisijat kirjattiin joka toinen päivä. Kasvaintilavuudet laskettiin kaavalla V = 0,5236 × (L x W

2) (V: kasvaimen tilavuus, L: pituus, W: leveys).

Ihon alle ksenografti koetta, SKOV3- solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään lopulliseen konsentraatioon 2 x 10

7 solua /ml. 2 x 10

6 solua injektoitiin ihon alle kylkeen hiiret. 10 päivää myöhemmin, nude-hiiret jaettiin satunnaisesti hoitoa (n = 4) ja kontrolliryhmä (n = 4). Hiiret näissä kahdessa ryhmässä käsiteltiin suonensisäisiä injektioita joko 5 mg /kg 20 (S) -Rg3 tai yhtä suuri tilavuus PBS: ää häntälaskimoon joka toinen päivä sen jälkeen. Kun 30 päivää kokeellisten hoitojen hiiret tapettiin CO

2 asphyxia. Kasvain kerättiin ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 24 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, parafiiniin upotettuja, ja leikattiin immunohistokemiallista analyysia varten.

vatsaonteloon ksenograftimallissa, SKOV3- solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään pitoisuutena 1 x 10

8 /ml. Hiiriä inokuloitiin 1 x 10

7-soluja vatsaonteloon päivänä 0. Päivästä 1, 5 mg /kg 20 (S) -Rg3 (käsittely ryhmä, n = 7), tai sama tilavuus PBS: ää (kontrolli ryhmä, n = 7) injektoitiin hännän laskimoon joka toinen päivä. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin, ja tapettiin 30 päivää. Ruumiinavaus tehtiin, levitetty kasvaimet resektoitiin hiiriltä, ​​ja vesivatsanestesupernatan- kerättiin. Yhteensä kasvaimen paino ja tilavuus vesivatsanestesupernatan- kussakin hiiren mitattiin. Kaikki sisältö eläinkoeluvan olemme raportoineet täällä ovat mukaisia ​​ARRIVE ohjeita.

immunohistokemia

histologisen Levyt valmistettiin parafinoidut munasarjasyöpään kudosblokeista. Näytteet poistettiin vaha ksyleenillä, vedettömät laskevassa alkoholin sarja seuraa lämmitetty 0,01 M sitraattipuskurissa (pH 6,0) in höyrystimen 1,5 minuuttia noutaa antigeenisten sitoutumiskohtia. Antigeenien detektio suoritettiin käyttäen inkubointia primaaristen vasta-aineiden (E-kadheriinin 1:200, vimentiinin 1:400, HIF-1α 1:200), 2 tuntia huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen inkuboitiin HRP-leimattua sekundaarista vasta-ainetta ( MaxVision HRP-Polymer anti-hiiri /kani IHC Kit, 1:200) huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, ja värin kehittymisen kanssa DAB. Negatiivinen kontrolli näytteet inkuboitiin PBS: ssä ilman primaarista vasta-ainetta samoissa olosuhteissa. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu nousevassa alkoholin sarja, ja asennettu analysointia. Digitaaliset kuvat hankittiin Olympus BH-2 mikroskooppi (Tokio, Japani) asennetaan niin, että DeltaPix kamera ja ohjelmisto (Maalov, Tanska).

Tilastollinen

Tilastoeroja määritettiin kaksi- tailed

t

-testi tai Wilcoxonin-sum test (vain volyymi askites). Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistoa (Chicago, IL, USA). Eroja pidettiin merkittävinä (*) osoitteessa

P

0,05 ja erittäin merkitsevä (**) osoitteessa

P

0,01 kaikkiin vertailun.

Tulokset

20 (S) -Rg3, mutta ei 20 (R) -Rg3, estää hypoksian aiheuttaman EMT in SKOV3 ja 3AO munasarjasyöpäsoluja

ensin tutkittiin, mikä vaikutus 20 (S) -Rg3 ja 20 (R) -Rg3 solujen elinkelpoisuuteen kahden ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3 ja 3AO sarjassa MTT määrityksiä. Rakenteiden 20 (S) -Rg3 ja 20 (R) -Rg3 oli kuviossa S1-A. 20 (S) -Rg3 inhiboi solujen kasvun annoksesta riippuvalla tavalla, mikä aiheuttaa IC

50 (inhiboiva pitoisuus, jossa 50% solujen elinkelpoisuuden estyy) arvot 146,8 ja 242,6 ug /ml, vastaavasti, SKOV3- ja 3AO soluja 24 h (tai 48 h) jälkeen (kuva S1-B.). Sitä vastoin 20 (R) -Rg3 ei havaittu ilmeisiä inhibitiota leviämisen sekä solutyyppien pitoisuuksina 640 ug /ml (kuvio S1 AC).

vieressä tutkittiin kyky 20 (S) -Rg3 ja 20 (R) -Rg3 vaikuttaa hypoksian aiheuttamaa EMT. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, kun se altistetaan 1% O

2: ssa 24 tuntia sekä SKOV3- ja 3AO solut läpikävivät EMT tunnusomaista solun morfologian muutos tiukka-junctioned cobblestone ulkonäkö on dissosioitunut karan kaltainen muoto. Tämä muutos liittyy merkittävä alas-säätely epiteelin merkki E-kadheriinin ja merkitään-sääntely mesenkymaalisten merkki vimentiinista joka käy ilmi Western blot-analyysi (Fig. 1 B). Hoito SKOV3- ja 3AO soluja 20 (S) -Rg3 80 ug /ml, 160 ug /ml, vastaavasti, esti tehokkaasti elimellisen muutoksen liittyy hypoksian indusoiman EMT (Fig. 1A), mikä on yhdenmukaista kohonnut E -cadherin ja alentuneen vimentiinista hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 1 B). Sitä vastoin hoito SKOV3 20 (R) -Rg3 80 ug /ml ja 160 ug /ml, vastaavasti, ei ole pelastaa solut, joille EMT (Fig. 1A), mistä on osoituksena muuttumattomana tasoa E-kadheriinin ja vimentiinista hypoksisissa kulttuuri tilassa (kuvio. 1 C). Edelleen varmistamiseksi, että 20 (S) -Rg3 tukkima hypoksian aiheuttaman EMT, solun liikkuvuus arvioitiin haavan paranemista ja

in vitro

muuttoliike määrityksiä. Kuten on esitetty kuviossa. 2A ja B, kun taas hypoksia selvästi edistänyt solun liikkuvuuden ja haavan, vaikutukset olivat pääosin torjuttiin hoitoon SKOV3- ja 3AO soluja 20 (S) -Rg3.

(A) Soluja viljeltiin ensin yhteistä edellytys 24 h. Sillä hypoksia induktio in vitro, SKOV3- ja 3AO soluja inkuboidaan hypoksian kammiossa 1% O

2, 5% CO

2 ja 94% N

2 vielä 24 tuntia ilman (hypoksia) tai Rg3 (hypoksia + Rg3) ilmoitetuilla pitoisuus 24 tuntia. Kontrollit viljeltiin normoxic ehto (normoksia) 24 tuntia. Cell kuvat otettiin kiinni käyttäen faasikontrastimikroskopiaa (100 x). (B) proteiinit soluja altistetaan normoksia, hypoksia ja hypoksia plus 20 (S) -Rg3 kerättiin, ja ilmentyminen E-kadheriinin ja vimentiinista tutkittiin western blot käyttäen β-aktiini latauskontrollina. Hypoksia lasku E-kadheriinin proteiini ja lisätä vimentiinista proteiinia, joka purettiin 20 (S) -Rg3 co-hoitoa. (C) vaikutus 20 (R) -Rg3 ekspressioon EMT merkkiaineiden SKOV3- soluissa. Ei vaikutusta 20 (R) -Rg3 ekspressioon hypoksian aiheuttaman EMT markkereita havaittiin. Kaikki hoidot tässä kuviossa tehtiin kolmena kappaleena.

(A) Cell liikkuvuuden havaittu haavan paranemista määrityksessä. Soluja inkuboitiin alla normoxic edellytys 24 tuntia, minkä jälkeen raaputtamalla yhtenäinen so- kerroksen ja altistaa sen normoksia, hypoksia tai hypoksia plus 20 (S) -Rg3 vielä 24 h. Sulkeminen tyhjästä seurattiin aikana 24 h ja valokuvat näytettiin 0 h ja 24 h jälkeen naarmuuntumista. (B) Cell liikkuvuus tutkinut

in vitro

migraatiokokeessa. Normoxically viljellyt solut ympättiin millicells, minkä jälkeen inkuboitiin 24 tunnin ajan normoksia, hypoksia tai hypoksia ja 20 (S) -Rg3, vastaavasti. Solujen lukumäärä, jotka mennyt kalvon läpi kohti 20 x suurennettuna linssin laskettiin ja käytetään edustamaan siirtymisen kapasiteetin soluja. Kaikki hoidot tämä luku tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset näkyvät keinona ± SD. *

P

0,05, **

P

0,01,

t

-testissä.

Yhteenvetona havaintomme voimakkaasti osoittavat, että 20 (S) -Rg3, mutta ei 20 (R) -Rg3, pystyy kääntämään hypoksian indusoiman EMT solujen morfologian muutoksiin, solujen markkereita, ja solujen liikkuvuutta, mikä korostaa sen mahdollisuudet toiminnon estäjä hypoksian indusoiman EMT ja EMT välittämän syövän etäpesäkkeiden.

20 (S) -Rg3 alentaa HIF-1α ilmaisun edistämällä HIF-1α proteiinien hajoaminen on PHD1 /VHL /proteasomin riippuvaisesti

Ymmärtääksemme paremmin molekyylitason mekanismit, joilla 20 (S) -Rg3 estää hypoksian indusoiman EMT on munasarjasyöpäsoluja, olemme analysoineet ilmentymisen HIF-1α, keskeinen säätelijä EMT, sekä transkription ja translaation tasolla. Kun viljeltiin 1% O

2 24 tuntia HIF-1α-proteiinin taso kohosi SKOV3- ja 3AO soluja, kun taas HIF-1α mRNA-tasolla tuskin vaikutti. Hoito Solujen 20 (S) -Rg3 muutoin identtisessä hypoksinen asetukset selvästi tukahdutettu HIF-1α ilmentymisen proteiinin tasolla mRNA tasolla muuttumattomana, mikä osoittaa, että HIF-1α oli transkription jälkeen säätelee 20 (S) -Rg3 ( Fig. 3A ja B).

(A) Kokonais-RNA soluista alttiiksi normoksia, hypoksia tai hypoksia ja 20 (S) -Rg3, vastaavasti, 24 h uutettiin. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysit suoritettiin analysoimiseksi vaikutus 20 (S) -Rg3 on HIF-1α mRNA-tasolla, ja mitään muutoksia ei havaittu. (B) Soluja viljeltiin 24 tunnin ajan normoksia, hypoksia tai hypoksia plus 20 (S) -Rg3 vastaavasti seurattiin Western blot niiden ilmentyminen HIF-1α. 20 (S) -Rg3 häiritsi hypoksian aiheuttamaa HIF-1α vahvistukseksi. (C) MG132 esti esto vaikutus 20 (S) -Rg3 on HIF-1α-proteiinin tason. HIF-1α-proteiinin tasot verrattiin joukossa hypoksisia soluja, hypoksisia soluja co-käsiteltiin 20 (S) -Rg3, ja soluja esikäsiteltiin 20 uM MG132 30 minuuttia, jota seuraa altistus hypoksia ja 20 (S) -Rg3 24 tuntia. (D) Solut altistettiin normoksia, hypoksia ja hypoksia, kun läsnä on 20 (S) -Rg3, vastaavasti, arvioitiin reaaliaikainen PCR-transkription PHD1, PHD2, PHD3 ja VHL. Sen jälkeen kun 20 (S) -Rg3 hoitoa, transkription PHD1 ja VHL-geenit, jotka on laskenut alle hypoksia, lisättiin sekä SKOV3- ja 3AO soluja. (E) Proteiiniekstraktit käsitellyistä soluista tutkittiin western blot ilmentämiseen PHD1 ja VHL, jossa proteiinia normoxically viljellyistä soluista kontrollina ja β-aktiini kuin latauskontrollina. PHD1 ja VHL laskivat hypoksinen soluissa. 20 (S) -Rg3 talteen niiden ilmaisu hypoksiaolosuhteissa kunnossa. Kaikki hoidot tämä luku tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset näkyvät keinona ± SD. *

P

0,05, **

P

0,01,

t

-testissä.

Koska HIF-1α proteiinin vähentämiseen oli läheisessä suhteessa proteiinien hajoaminen kautta ubikitiini-proteasomireitillä, 26S-proteasomin-spesifisen proteaasinestäjän MG132 käytettiin tutkimaan, 20 (S) -Rg3 edisti proteasomaalisten hajoamista HIF-1α. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, esikäsittely 20 uM MG132 30 min hypoksisissa olosuhteissa palauttaa HIF-1α proteiinin SKOV3- ja 3AO soluja käsiteltiin 20 (S) -Rg3, jotka osoittavat, että 20 (S) -Rg3 alassäädetty HIF-1α että proteasomin -riippuvaisella tavalla. Jäseninä PHD perheen ja VHL proteiinin tiedetään tekijöitä välittävä ubikitiini /proteasomin riippuvia HIF-1α hajoamista, vaikutus 20 (S) -Rg3 mRNA- tasoja PHD1, PHD2, PHD3 ja VHL tutkittiin tarkemmin. Reaaliaikainen PCR tiedot osoittivat, että hypoksia johdonmukaisesti alassäädetty PHD1, PHD3 ja VHL (Fig. 3d). Tämä vaikutus hypoksian, erityisesti PHD1 ja VHL kuitenkin purettiin 20 (S) -Rg3 sekä SKOV3- ja 3AO soluja. Kuten odotettua, PHD1 ja VHL proteiinin tasot olivat suurelta osin palautettu, kuten oli laita mRNA jälkeen hoito SKOV3- ja 3AO soluja 20 (S) -Rg3 vastapainoksi hypoksia välittämää alas-säätely PHD1 ja VHL proteiineja (Fig. 3E).

selventämään lisäksi roolit PHD1 ja VHL välittämisessä aktiivisuus 20 (S) -Rg3 suhteen HIF-1α hajoamista, SKOV3- ja 3AO solut transdusoitiin siRNA-PHD1 (siPHD1) tai siRNA-VHL (siVHL). Vedoten reaaliaikainen PCR ja western blot, valitsimme kaksi tehokkainta siRNA hiljentää PHD1 (siPHD1-A ja siPHD1-B) ja VHL (siVHL-B ja siVHL-C) (kuvio S2), jonka jälkeen hypoksia stimulaatio ja 20 (S) -Rg3 hoitoon. Määritettynä western blot, knock-alas PHD1 tai VHL esti pro-hajoamisen vaikutus 20 (S) -Rg3 on HIF-1α (Fig. 4A ja B), jossa vaikutus siPHD1 merkittävämpi kuin siVHL on HIF -1α proteiinin talteenotto. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että 20 (S) -Rg3 estetty hypoksian indusoiman EMT ja munasarjasyövän solujen aktivoimalla PHD1- VHL- ubikitiini /proteasomin reitin helpottamiseksi HIF-1α hajoamista.

Effect of PHD1 ( A) ja VHL (B) hiljaisuus 20. (S) -Rg3 tukahdutti HIF-1α. SKOV3- ja 3AO soluja transfektoitiin ohimenevästi 24 h siPHD1 tai siVHL, mitä seurasi inkubointi hypoksisissa olosuhteissa vielä 24 tuntia. Proteiini taso PHD1, VHL ja HIF-1α sitten havaittiin käyttämällä western blot. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

20 (S) -Rg3 kumoaa hypoksian indusoiman transkription tukahduttaminen E-kadheriinin kautta tukahduttamalla Snail

aikana EMT prosessi, E-kadheriinin yleisesti tukahdutti sen transkriptiorepresso- lukien Snail joka puolestaan ​​transkriptionaalisesti aktivoidaan HIF-1. Jotta ymmärtää paremmin, miten 20 (S) -Rg3 esti hypoksian aiheuttaman down-regulation of E-kadheriinin, tutkimme vaikutus 20 (S) -Rg3 on Etana. Käännetyn-PCR Tulokset osoittivat, että hypoksia sai aikaan jyrkkä kasvu Snail mRNA, joka ilmeisesti estyi 20 (S) -Rg3 (Fig. 5A). Näin ollen ylös-säätely Snail-proteiinin stimuloidaan hypoksia oli vakavasti vaimennettu 20 (S) -Rg3 hoitoa (kuvio. 5B).

(A) SKOV3- soluja viljeltiin normaaleissa olosuhteissa 24 tuntia, ja viljeltiin sitten 21% O

2 (normoksia) tai 1% O

2 (hypoksiaa) tai 1% O

2 ja 80 ug /ml 20 (S) -Rg3 (hypoksia + 20 (S) -Rg3) vielä 24 tunnin ajan. Snail mRNA määritettiin RT-PCR: llä, jossa β-aktiini kuin sisempi ohjaus, ja standardoitu taso läsnä normoxically viljellyissä soluissa. Ilmaisu Snailin kasvanut mRNA tasolla SKOV3- soluissa hypoksian jälkeen stimulaation 24 tuntia. 20 (S) -Rg3 hoito kumosi Snail ylösajon aiheuttamien hypoksia. (B) Solu-uutteet tehtiin immunoblot-analyysi havaitsemiseksi Snail-proteiinin taso, ja β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Alhainen Snail-proteiinin havaittiin normoxically viljellyissä soluissa, kun taas Snail-proteiini lisääntyi hypoksinen soluissa. 20 (S) -Rg3 vähentää hypoksian indusoiman Snail ilmentymistä. (C) lusiferaasianalyysissä in SKOV3- ja 3AO soluja. E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus väheni merkittävästi hypoksinen soluissa. Pienenee E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus palautettiin 20 (S) -Rg3 co-hoitoa. Aktiivisuus E-kadheriinipromoottorin tulikärpäsen lusiferaasi konstruktioita oli normalisoitu on kotransfektoitiin

Renilla

lusiferaarikonstrukti. Kaikki hoidot tässä kuviossa tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja arvot on esitetty keskiarvoina ± SD kolmesta kokeesta. *

P

0,05, **

P

0,01, sillä

t

-testissä.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia, tukahduttaminen of Snail 20 (S) -Rg3 vastasi elvyttämiseksi E-kadheriinin hypoksisissa olosuhteissa, dual-lusiferaasireport- määritys suoritettiin. E-kadheriinin promoottori-lusiferaasireportteri- konstrukti ja sisäisenä kontrollina, joka kykenee ilmentämään Renillan lusiferaasia transfektoida soluihin. Hypoksia todettiin tekemään lähes 50% menetys lusiferaasin signaalin voimakkuus sekä SKOV3- ja 3AO soluja, kun taas 20 (S) -Rg3 tukahdutetaan hypoksinen vaikutuksia ja aiheutti merkittävän kasvun lusiferaasin intensiteetti (Fig. 5C). Nämä tulokset osoittivat, että 20 (S) -Rg3 tukossa hypoksinen esto E-kadheriinipromoottorin aktiivisuutta.

20 (S) -Rg3 estää munasarjasyöpä kasvua ja EMT

in vivo

< Kuten on esitetty kuviossa.