Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Mahasyöpä on yksi yleisin pahanlaatuinen sairauksia maailmanlaajuisesti. Kehittyvät näyttö on osoittanut, että MikroRNA (miRNA) liittyvät kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että

H. pylori

infektio kykeni indusoimaan muuttunut ilmentyminen miR-30b mahalaukun epiteelisolujen. Kuitenkin tiedetään vähän mahdollisesta roolista miR-30b mahasyövän.

Methods

Analysoimme ilmentymisen miR-30b mahasyövän solulinjoissa ja ihmisen mahasyövän kudoksiin. Olemme tutkineet vaikutus miR-30b jäljittelee on apoptoosin mahasyövän solujen in vitro virtaussytometrialla (FCM) ja kaspaasi-3/7-aktiivisuus määrityksissä. Nude mouse ksenograftimallissa käytettiin määrittämään onko miR-30b on osallisena kasvainten synnyssä mahasyövän. Tavoitteena on miR-30b tunnistettiin bioinformatiikan analyysi, lusiferaasianalyysissä ja Western blot. Lopuksi suoritetaan korrelaatio analyysi välinen miR-30b ja sen kohde-ilmaisun mahasyövässä.

Tulokset

miR-30b oli merkitsevästi alassäädetty mahasyövän soluissa ja ihmisen mahasyövän kudoksiin. Pakotettu ilmentymä miR-30b edisti apoptoosin mahalaukun syövän solujen in vitro, ja miR-30b voidaan merkittävästi inhiboida kasvainten muodostumiseen mahasyövän lisäämällä apoptoosin osuutta syövän soluihin in vivo. Lisäksi, plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-1 (PAI-1) tunnistettiin mahdollisen kohteena miR-30b, ja miR-30b taso korreloi käänteisesti PAI-1 ilmentymisen mahasyövässä. Lisäksi, hiljentäminen PAI-1 pystyi phenocopy vaikutus miR-30b ilmentymisen vaikutus apoptoosiin sääntelyä syöpäsolujen, ja yli-ilmentyminen PAI-1 voi tukahdutti edistävä vaikutus solu- apoptoosin miR-30b, mikä osoittaa, PAI-1 on mahdollisesti mukana miR-30b-indusoidun apoptoosin syöpäsoluissa.

Johtopäätös

miR-30b voi toimia uutena tuumorisuppressorigeenin mahasyövän kohdistamalla PAI-1 ja säätelemällä apoptoosin syöpäsoluja. miR-30b voisi toimia mahdollisena biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde vastaan ​​mahasyövässä.

Citation: Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, alassäädetty mahasyövän, Edistää Apoptoosi ja vaimentaa tuumorikasvun Targeting plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10,1371 /journal.pone.0106049

Editor: Gerolama Condorelli, Federico II yliopisto Napoli, Italia, Italia

vastaanotettu: 7. 2014; Hyväksytty: 28 heinäkuu 2014; Julkaistu: 29 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81202310), Scientific Innovation Research Foundation kolmannen Military Medical University (No. 2009XQN20). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää aiheuttaa noin 738000 kuolemantapausta maailmanlaajuisesti vuodessa, ja se on tunnustettu kolmanneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat miehillä [1]. Varhainen diagnoosi ja hoito ovat johtaneet erinomaisen odotukset pysyvyyttä ja hyvää ennustetta, kun taas näkymät potilaille, joilla on edennyt mahasyöpä edelleen heikko. Kuten muutkin syövät, kehittäminen mahalaukun syövän uskotaan olevan monitekijäinen.

Helicobacter pylori (H. Pylori) B-infektio on todettu olevan tärkeä laukaista mahasyövän [2]. Vaikka monia geneettisiä ja epigeneettisiä muutoksia on raportoitu mahasyövän, molekyylimekanismi taustalla mahasyövän jää epäselväksi.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka posttranscriptionally säädellä geeniekspressiota. Aikuinen miRNA voivat sitoutua spesifisesti 3 ’UTR kohde- solun mRNA puolestaan ​​laukaista mRNA: n hajoamisen tai esto käännös [3], [4]. miRNA toimivat keskeisinä sääntelyviranomaisten monenlaisia ​​biologisia prosesseja, kuten kehitys, solujen erilaistuminen, apoptoosi, aineenvaihduntaa, ja signaalitransduktion [5], [6]. On osoitettu, että 50% miRNA sijaitsevat usein syöpään liittyvän genomisen alueen tai hauras sivustoja [7]. Kasvava näyttö on osoittanut, että poikkeava miRNA ilmaisu korreloi erilaisten ihmisen syöpien ja osoittaa, että miRNA voivat toimia oncogenes tai kasvaimeen synnyssä [8] – [10]. Äskettäin huomattava määrä vapautettiin miRNA lukien miR-106b-25 klusteri, miR-21, miR-218, miR-7, ja miR-335 on tunnistettu modulaattoreina solujen kasvun, apoptoosin, muuttoliike tai invaasio mahasyövän kehittäminen [11] – [15]. Nämä havainnot viittaavat siihen, miRNA voi olla ratkaiseva merkitys patogeneesissä mahasyövän.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että

H. pylori

infektio kykeni indusoimaan muuttuneen ilmentymisen miRNA mahalaukun epiteelisolujen lukien miR-155, miR-146A ja miR-30b, miRNA voivat toimia uusina alipaineensäätöventtiileillä hienosäätää

H. pylori

indusoimaan tulehdus [16], [17]. Lisäksi olemme osoittaneet, että miR-146a voi olla mahdollisen roolin kehittämisessä mahasyövän moduloimalla leviämisen ja apoptoosin mahalaukun syöpäsolujen [18]. Erityisesti olemme myös löytäneet miR-30b voi säädellä autophagy prosessin aikana

H. pylori

jatkuvat infektio, mikä edistää pysyvyys

H. pylori

infektiot [19]. Kuitenkin rooli miR-30b mahasyövän on edelleen suurelta osin tuntematon.

plasminogeeniaktivaattori-inhibiittori 1 (PAI-1) on tärkein seriiniproteaasi-inhibiittori kudostyypin (t-PA) ja urokinaasi-tyypin ( u-PA), plasminogeenin aktivaattori, ja siksi sillä on tärkeä rooli plasminogeeni-plasmiini-järjestelmän [20]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, PAI-1 on huono ennustetekijä useita yhteisiä kasvaimia, ja liittyy syövän eteneminen ja metastaasit [21]. Viime aikoina monet ryhmät myös havainneet, että PAI-1 voi edistää kasvaimen kasvua estämällä solun apoptoosin. Esimerkiksi lisääminen vakaan villityypin PAI-1 ihmisen eturauhassyövän solulinja PC-3, ihmisen promyelosyyttinen leukemiasolulinja HL-60 ja jopa ei-kasvaimia solujen, johti merkittävään apoptoosin inhibitio [22] . Kun ihon alle nude-hiiriin, joissa PAI-1 yliekspressoivia hiiren fibrosarkoomasoluissa, kasvaimet nopeasti perustettiin, kun PAI-1 vajaiden solujen oli tukahdutettu kasvainten muodostumiseen [23]. Toinen raportti osoitti, että geneettinen ja farmakologinen esto PAI-1 ihmisen kasvainten solulinjoissa (HT-1080, A549, HCT-116, ja MDA-MB-231) lisääntynyt spontaani apoptoosin, ja mielenkiintoisesti, istutettiin PAI-1 knockdown HT 1080 solut PAI-1 hiirten alensivat kasvainten synnyssä ja pidentynyt eloonjääminen verrattuna verrokkihiirten [24]. Nämä tutkimukset tarjoavat tärkeitä todisteita, että PAI-1 kykenee suojaava rooli vastaan ​​tuumorisolujen apoptoosin.

Nykyisessä tutkimuksessa, huomasimme, että miR-30b oli merkitsevästi alassäädetty mahalaukun syöpäsoluissa ja tuumorikudoksia. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-30b voisi edistää apoptoosia mahasyövän soluun in vitro, ja miR-30b voisi merkittävästi estää kasvainten muodostumiseen mahasyövistä nude hiiren ksenograftimallissa. Lisäksi, PAI-1 on tunnistettu mahdollisia kohteita miR-30b, ja miR-30b voivat aiheuttaa apoptoosia ja estää kasvaimen kasvua tukahduttaa ilmentymistä PAI-1. Tulosten perusteella näyttää, että miR-30b voi toimia uutena tuumorisuppressorigeeniä mahasyövän ja voi olla potentiaalinen hoidon kohde mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki eläinkokeiden hyväksyttiin eläinten eettisen ja kokeellinen komitean kolmannen Military Medical University. Kaikki eläin Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Tutkimuksessa mukana kudosnäytteiden hyväksyi eettinen Review Board Third Military Medical University, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen osallistumista.

Tissue yksilöitä

Kaikkiaan mahasyöpä kudoksiin ja viereisen ei-kasvain kudokset saatiin primaarisessa mahalaukun syövän voimakkaassa gastrectomy Southwest Hospital, kolmas Military Medical University, Kiina, ja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia mahasyöpäpotilaista on koottu taulukkoon 1. Sen jälkeen kirurginen poisto, kudokset jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Tutkimuksen hyväksyi eettinen tarkastelu aluksella Third Military Medical University, ja suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen osallistumista.

Solulinjat ja soluviljelmä

Kaikki käytetyt solulinjat tässä tutkimuksessa saatiin Shanghai Type Culture Collection of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), ihmisen mahasyövän solulinjoja AGS viljeltiin Hamin F12 (Hyclone) väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), muut mahasyöpä solulinjat MKN45, HGC-27, BGC-823, SGC-7901 ja ihmisen alkion munuaisen (HEK) 293-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Hyclone), 10% FBS, ne kaikki pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa, kuten aiemmin on kuvattu.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin Trizol-reagenssia (Invitrogen), jota seurasi käänteistranskriptio käyttäen TaqMan miRNA määritykset (Ambion), U6 pieni ydin- RNA sisäisenä normalisoitu viite. qRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen seuraavia parametrejä: 95 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 30 s. qRT-PCR-analyysit mRNA PAI-1 suoritettiin käyttäen PrimeScript RT-PCR-sarjat (Takara), kun seuraavat parametrit: 95 ° C 30 s ja sen jälkeen 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s, 60 ° C 5 s ja 72 ° C 30 s. MRNA taso β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Sekvenssit käytettyjen alukkeiden on esitetty taulukossa 2.

Northern blot

Pienet RNA: t eristettiin käyttäen Mirvana RNA: n eristäminen kit (Ambion). Kolme paria kliinisistä näytteistä valittiin satunnaisesti päässä 21 potilaasta myöhempää Northern blot-analyysi. Northern blot suoritettiin standardin menettelyä kuin descried aiemmin [17]. DNA-oligonukleotidi antisense- koettimia käytetään havaitsemaan miR-30b ja U6 snRNA olivat seuraavat: miR-30b (5’AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ’) ja U6 (5′-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3’).

Cell transfektio

miR-30b jäljittelee, munakokkelia miR-ohjaus, kemiallisesti muunnetut miR-30b duplex (AGOMIR), kemiallisesti muunnetut salattu miR-ohjaus, PAI-1 siRNA, tai siRNA negatiivinen kontrolli ostettiin GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., Kiina). PAI-1 (Serpine1) Ihmisen cDNA ORF Klooni ostettiin Origene (Origene Technologies, Peking, Kiina). Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollan.

Cell apoptoosimäärityksessä FCM

SGC-7901 tai HGC-27-soluja ympättiin 12-kuoppaiseen levyyn sopivassa tiheys ja kasvatettiin 30% konfluenssiin 24 tunnin kuluttua. Sitten solut transfektoitiin miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus, ja elatusaine korvattiin seerumittomalla DMEM: ssa 48 tuntia. Yhteistyön transfektion koe miR-30b ja PAI-1 ilmentävällä vektorilla, SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-ohjaus- tai miR-30b jäljittelee, ja sitten PAI-1 Human cDNA ORF Clone vektori (merkitty PAI-1) tai tyhjän vektorin 24 tuntia myöhemmin. 24 h jälkeen vektori transfektion väliaine korvattiin seerumittomalla DMEM vielä 24 tuntia. Lopuksi solut levitettiin apoptoosin analyysillä. FCM-analyysi, anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen) käytettiin, sitten analysoitiin virtaussytometrialla (BD FACSCantoTM II).

kaspaasi-Glo 3/7 määritys

aktiivisuus kaspaasi 3/7 havaittiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 Assay (Promega). Lisää 100 ui kaspaasi-Glo 3/7 reagenssin valkoiseksi muurien 96-kuoppalevylle, sekoita varovasti sisältö kaivojen, ja sitten inkuboidaan kuoppiin huoneenlämmössä 30 min. Luminesenssi havaittiin käyttäen GloMax-96 Microplate Luminometer (Promega).

tuumorigeenisyyden määrityksissä nude-hiirissä

hiiret käytettiin tässä kokeessa ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa. Elinkelpoisten miR-30b mimics- ja miR-ohjaus-transfektoidut SGC-7901-soluja (1 x 10

6) suspendoitiin 100 ul: aan PBS: ää ja injektoitiin sitten ihonalaisesti kummallakin puolella posterior kylkeen saman naaraspuolisia BALB /c, joilta puuttuu kateenkorva nude mouse 4 6 viikon iässä kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kasvaimen kasvu ja kunnon mukaan lukien yleistä terveyttä ja käyttäytymistä hiiret tutkittiin kolmen päivän välein 4 viikkoa. Kasvain tulevatko tästä hiiret eivät osoittaneet merkkejä kivusta tai kärsimystä, kuten laihtuminen tai käyttäytymisen muutoksia, joten kaikki hiiret tapettiin CO

2 tukehtumisen päivänä 28 injektion jälkeen. Kasvaimen tilavuus (V) seurattiin mittaamalla pituus (L) ja leveys (W) kanssa jarrusatulat ja lasketaan kaavalla (L x W

2) x 0,5.

TUNEL värjäys

kasvaimet kerättiin 26 päivää, ja kiinnitettiin 10%: ista formaldehydiliuosta, sitten upotettiin parafiiniin. Osiot (5 pm paksu), joka oli parafiini ja nesteytyksestä värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. Apoptoottiset kasvainsoluja värjättiin in situ terminaali deoxynucleotidyltransferase välittämää dUTP nick end merkinnät (TUNEL) menetelmällä, jossa käytetään in situ solukuoleman havaitseminen pakki (POD; Roche Diagnostics Co.). Negatiivinen kontrolli suoritettiin samaan värjäytymisen TUNEL ilman TdT. Kuvat kerättiin käyttämällä mikroskooppia × 200 suurennus.

Plasmidien

rakentamisen eri lusiferaasin raportin levittäjinä miR-30b tavoite suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16], [26] , ja konstrukti, joka sisälsi mutantin siemenet alueella luotiin kontrolliksi. Sekvenssit käytetyt oligonukleotidit on esitetty taulukossa 2.

lusiferaasianalyysissä ja GFP tukahduttamisen kokeissa

HEK-293-solut ympättiin 96-kuoppalevylle 5000 solua kuoppaa kohti päivänä ennen transfektiota. Solut transfektoitiin kunkin tulikärpäsen lusiferaasi reportteri vektori, Renilla lusiferaasi kontrollivektori, PRL-TK (Promega), ja miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus (GenePharma). Lusiferaasimääritys suoritettiin käyttäen dual lusiferaasireportterigeenin määritys (Promega).

GFP tukahduttaminen kokeissa, HEK-293-soluja siirrostettiin 12-kuoppaiseen levyyn 1 x 10

5 kohti hyvin päivää ennen transfektiota ja sitten kotransfektoitiin miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus eri GFP reportterivektoreita. Solut altistettiin virtaussytometria-analyysi, ja tiedot analysoitiin käyttäen CellQuest Pro -ohjelmisto.

Western blot

Käsitellyt solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja sitten hajotettiin soluhajotuspuskurin (Puhkaista). Kun oli sentrifugoitu 12000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, proteiinipitoisuus mitattiin BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Solujen proteiini lysaatit erotettiin 12% SDS denaturoidaan polyakryyliamidigeelillä ja sitten siirrettiin polyvinylideenidifluoridimembraanille kalvo. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa Tris-puskuroitu suolaliuos, pH 7,4, joka sisälsi 0,05% Tween 20, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla ja PAI-1 (1:1000, Abcam) ja β-aktiini (1:1000 , Santa Cruz), 4 ° C: ssa yön yli vastaavasti. Membraanit pestiin ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:5000, Santa Cruz), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Mielenkiinnon kohteena oleva proteiini visualisoitiin käyttäen ECL Western blotting substraatti (Pierce) ja Chemidoc XRS Gel Documentation System (BioRad).

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD) vähintään kolmen erillisen kokeen. Studentin t-testiä sovellettiin analysoida eroja ryhmien välillä. Suhde miR-30b tason ja PAI-1expression analysoitiin Pearsonin korrelaatiota. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS (versio 17). Tilastolliset erot ilmoitettu merkitsevä

P

0,05 tasolla. Tilastollisesti merkittävää tietoa, on merkitty tähdellä (

P

0,05 (*),

P

0,01 (**).

Tulokset

vähentynyt miR-30b ilmentymistä ihmisen mahasyövän solulinjoissa ja GC kudosnäytteiden

määrittämiseksi roolin miR-30b patogeneesissä mahasyövän, olemme analysoineet miR-30b tasot eri mahasyövässä soluja, mukaan lukien HGC-27, AGS, BGC-823 ja SGC-7901. Kuten kuviossa 1A, ilmentymisen miR-30b oli merkitsevästi alassäädetty neljässä solulinjoissa verrattuna pooli viisi ei-kasvain mahalaukun kudoksissa (

P

0,01).

(A) vertailu ilmentymistaso miR-30b välinen normaali mahan limakalvoa kudosnäytteitä ja mahasyövän solulinjoissa HGC-27, SGC-7901, BGC-823 ja AGS . **

P

0,01, verrattuna normaalissa kudoksessa. (B) Suhteellinen ilmentyminen miR-30b 21 mahasyövän kudoksiin verrattuna sovitetun viereisen ei-kasvain mahalaukun kudoksissa. (C) vertailu keskimääräisestä ilmentyminen miR-30b kahdessa ryhmässä B. Data edustaa keskiarvoja ± SD **

P

0,01, verrattuna normaaliin mahalaukun limakalvon. (D) analyysi miR-30b ilmentymistä käyttämällä Northern blotting. Kokonais-RNA uutettiin kolmesta pariksi mahasyöpä (T) ja viereisen ei-syöpä mahalaukun kudosten (N), jotka valittiin satunnaisesti kaikista potilaista. RNA: t hybridisoitiin peräkkäin miR-30b ja U6 koetin, ja U6 käytettiin kontrollina RNA lastaus.

ilmentyminen miR-30b tutkittiin edelleen 21 pariksi GC ja viereisen ei-kasvain mahalaukun kudosten läpi TaqMan kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR). Kuten esitetään kuviossa 1B, lasku miR-30b löydettiin 18 21 potilasta (85,7%) verrattuna vastaaviin ei-kasvainkudoksia. Lisäksi pistekaavioon osoitti, että miR-30b oli merkitsevästi alassäädetty mahasyövän näytteissä vs. normaali mahan limakalvoa, joiden keskimääräinen 6,28-kertainen pieneneminen (

P

= 0,002) (kuvio 1 C). Validoida ilmentymisen kautta saatuja tietoja qRT-PCR, 3 kaikista 21 paria näytteet olivat sattumanvaraisesti valitsi tason määrittämiseksi miR-30b käyttämällä Northern pulttia. Olemme myös löytäneet johdonmukaisesti vähentynyt ilmentyminen miR-30b mahasyövän verrattuna ei-kasvain mahalaukun kudoksissa (kuvio 1 D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-30b ilme on usein alassäädetty mahasyövän ja ehkä mukana kehittämässä mahasyövän.

yli-ilmentyminen miR-30b nostaa apoptoosin mahasyövän solujen

Yksi tunnusmerkki syöpä on sen kyky kiertää apoptoosin [27], joten tutkimme vaikutus miR-30b mahalaukun syöpäsolujen apoptoosin. SGC-7901 tai HGC-27-solut transfektoitiin miR-30b jäljittelee tai sekoitetun miR-ohjaus, ja pätevyyttä miR-30b ektooppinen ilmentyminen varmistettiin qRT-PCR: llä (kuvio 2A). Sitten vaikutus miR-30b on apoptoosiin SGC-7901 tai HGC-27-soluissa arvioitiin virtaussytometrialla (FCM) analysointi ja kaspaasi-3/7-aktiivisuus määrityksissä. Kuten kuviossa 2B ja 2C, löysimme osuutta apoptoottisten solujen määrä oli lisääntynyt SGC-7901 tai HGC-27 transfektoitujen solujen miR-30b matkii verrattuna miR-ohjaus-transfektoiduissa soluissa (16,08%

versus

8,25% ja SGC-7901-soluissa, ja 17,83%

verrattuna

10,87% ja HGC-27-solut). Lisäksi merkittävä kasvu kaspaasi-3/7-aktiivisuus havaittiin SGC-7901 tai HGC-27 transfektoitujen solujen miR-30b verrattuna miR-verrokkitransfektantteja (

P

0,01, kuvio 2D). Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen miR-30b voivat edistää apoptoosia mahasyövän in vitro.

(A) Suhteellinen ilmentyminen miR-30b AGS, HGC-27, ja SGC-7901-soluissa, jotka oli transfektoitu asennuspalveli- 30b jäljittelee tai miR-ohjaus 48 tuntia. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta, ***

P

0,001. (B) vaikutus miR-30b apoptoosiin tutkittiin FCM analyysi. SGC-7901 tai HGC-27-solut transfektoitiin miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus, ja sitten elatusaine korvattiin seerumittomalla DMEM: ssa 48 tuntia, solut analysoitiin apoptoottisten hinnan värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC: llä ja PI . Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. neljästä itsenäisestä kokeesta, **

P

0,01. (C) yksi edustaja FCM analyysi B näytetään. (D) SGC-7901 tai HGC-27-solut transfektoitiin miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus 48 tuntia. Toiminta kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 havaittiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 Assay. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. 6 päällekkäisyyksien neljästä itsenäisestä kokeesta, **

P

0,01.

miR-30b vaimentaa tuumorigeenisyyteen ja edistää solujen apoptoosia in vivo

Edelleen määrittämiseksi onko miR-30b on osallisena kasvainten synnyssä mahalaukun syövän, nude mouse ksenograftimallissa käytettiin. Koska huomasimme, että miR-30b ollut merkittävämpi rooli SGC-7901-solujen apoptoosin kuin HGC-27-solujen in vitro, tutkimme rooli miR-30b kasvainten synnyssä mahasyövän käyttäen SGC-7901-soluissa. miR-ohjaus- ja miR-30b-transfektoiduissa SGC-7901-soluja injektoitiin subkutaanisesti joko taka kylkeen saman nude-hiirissä. Hiiriä seurattiin havainnoimalla ksenograftin kasvun 4 viikkoa. Todettiin, että käyttöönotto miR-30b SGC-7901-soluissa johti huomattavaan vähenemiseen koko kasvaimen tilavuus (kuvio 3A ja 3B), ja kasvainten, jotka ovat peräisin miR-30b käsitellään SGC-7901-solut kasvoivat hitaammin verrattuna kontrolliin ryhmä koko kasvaimen kasvun aikana (kuvio 3C, vasen paneeli). Kun kasvaimet kerättiin, keskimääräisen kasvainten johdettu miR-30b jäljittelee ryhmä oli vain 27,87% siitä mitä se on miR-kontrolliryhmän (kuvio 3C, oikea paneeli,

P

0,01). Kasvaimet otettiin talteen 26 päivää kaksi puolta posterior kylkeen saman hiiren, apoptoosin in situ mitattiin TUNEL. Kuten on esitetty kuviossa 3D, kasvaimen osastoja miR-30b jäljittelee käsiteltiin ksenografteja esillä merkittävästi kasvaa TUNEL-positiivisia soluja. Nämä tulokset viittasivat vahvasti siihen, että käyttöönotto miR-30b voi estää mahalaukun syövän kasvua edistämällä apoptoosin syöpäsoluissa.

(A) Vaikutus ofmiR-30b kasvaimen muodostumiseen in vivo ksenograftin tilassa. miR-ohjaus- ja miR-30b-transfektoiduissa SGC-7901 (1 x 10

6) suspendoitiin 100 ul: aan PBS: ää ja injektoitiin sitten ihonalaisesti kummallakin puolella posterior kylkeen saman naaraspuolisia BALB /c, joilta puuttuu kateenkorva nude mouse. Kaksi edustavaa tuumoreita kantavaa hiirtä jälkeen 4 viikkoa siirrostuksen näytettiin. (B) merkittävät erot kasvaimen tilavuuden välillä miR-kontrolliryhmän ja miR-30b ryhmä 6 hiirillä. (C) Kasvaimen tilavuus mitattiin joka kolmas päivä injektion jälkeen SGC-7901-solujen käsittely, kuten on kuvattu kohdassa A, ja kasvaimen kasvu käyrä on esitetty. Ero kasvaimen koon välillä miR-kontrolliryhmän ja miR-30b ryhmässä oli tilastollisesti merkitsevä, ** P 0,01. (D) Kasvaimet kerättiin 26 päivää kaksi puolta posterior kylkeen saman hiiren, apoptoosin in situ mitattiin TUNEL. Kaikki edellä mainitut tiedot ovat edustavia vähintään kolmen erillisen kokeen.

PAI-1 on ehdokkaana kohdegeeni miR-30b

lisäarvioimiseksi toimintaa miR-30b, se on tärkeää määrittää, mitkä isännän mRNA: t ovat säädellään miR-30b. Aiemmissa tutkimuksessa selvitimme mRNA ilmaisun profiili viisi paria primaarituumorin kudosten mahasyöpäpotilaista ja sovitettu ei-tuumorikudoksissa käyttäen mikrosirulla. Täysin löysimme 303 voimistunut geenejä (fold muutos 2,

P

0,05) mahasyövän kudoksissa verrattuna ei-tuumorikudoksista (tuloksia ei ole esitetty). Ottaen huomioon vaimentua ilmaus miR-30b mahasyövän keskityimme luetteloon geenien osoittaa lisääntynyt ilmaisuja ja valittu 30 parhaan kasvoi geenien mahasyövän, määritetään sitten jos nämä geenit olivat mahdollisia kohteita miR-30b käyttämällä ennustusalgoritmi , TargetScan. Mielenkiintoista on, olemme havainneet, että PAI-1-geenin, joka on yliaktiivista microarray (3,83-kertainen,

P

= 0,04), voisi olla todennäköinen kohde geenin miR-30b (kuvio 4A). Mahdollisuus ratkaista, onko miR-30b sitoutuu 3′-UTR kohde mRNA: iden, rakensimme lusiferaasi raportissa vektorit, jotka sisältävät oletetun miR-30b sitoutumiskohtien 3′-UTR. Kuten kuviossa 4B, havaitsimme selvä vähentäminen lusiferaasiaktiivisuudessa (

P

0,01) jälkeen contransfection lusiferaasin raportin vektoreiden ja miR-30b matkii. Sitä vastoin mitään muutosta lusiferaasin havaittiin transfektoiduissa soluissa mutantti 3′-UTR-konstrukteja. Tämä tulos vahvistettiin myöhemmin GFP tukahduttaminen kokeita. Kuten kuviossa 4C ja 4D, GFP fluoresenssi väheni merkittävästi transfektoiduissa soluissa GFP raportti vektoreilla, jotka sisältävät sitoutumiskohtia ja miR-30b jäljittelee, vaikkei ollut mitään muutosta GFP-fluoresenssin transfektoiduissa soluissa mutantti vektorin ja miR-30b matkii. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-30b AGS ja HGC-27 soluihin johti alassäätöä proteiinin tasot PAI-1 (kuvio 4E). Yhdessä edellä tiedot osoittavat, että PAI-1 on potentiaalinen kohde miR-30b, ja miR-30b voi alas-säädellä kohdeproteiiniin.

(A) sekvenssin rinnastus miR-30b ja sen kohdesivustot 3′-UTR PAI-1. (B) HEK293-solut lyhytaikaisesti kotransfektoitiin lusiferaasin raportti vektoreilla, ja joko miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus. Lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitiin aktiivisuus Renillan lusiferaasin. (C ja D) HEK-293-solut transfektoitiin GFP raportin vektori tai mutantin vektori, ja joko miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus. GFP fluoresenssia seurattiin fluoresenssimikroskooppiin ja FCM analyysi. (E) Western-blotit analyysi PAI-1 AGS ja HGC-27 transfektoitujen solujen miR-30b jäljittelee tai miR-ohjaus. Kaikki tiedot edellä edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen, **

P

0,01.

käänteinen korrelaatio mir-30b ja PAI-1 ilmentymisen mahasyövän kudoksiin ja syöpäsolulinjoissa

Ottaen huomioon, että miR-30b säätyy alas mahasyövän, ja se on raportoitu, että PAI-1-proteiinin mahasyövän kudoksissa on merkittävästi suurempi kuin ei-tuumorikudoksissa [28], suoritimme korrelaatio analyysi välinen miR-30b ja PAI-1 ilmentymisen mahasyövässä solulinjoissa ja mahasyövän kudoksiin. Kuten kuviossa 5A top, PAI-1-proteiinin taso oli alhaisin AGS solussa yksi viidestä mahalaukun solulinjat. Sen sijaan miR-30b taso oli korkein AGS, verrattuna muihin solulinjoihin (kuva 5A alhaalla). Myöhemmin, tutkimme PAI-1 ja miR-30b ilmentymistä 21 sarjaa mahasyövän ja viereisen ei-kasvainkudoksia. Olemme havainneet, että 81% (17/21) mahasyövistä näkyy korkeampi PAI-1 mRNA verrattuna normaaleihin kudoksiin. Sen sijaan miR-30b oli yleisesti alassäädetty 18 21 kasvaimia. Pearsonin korrelaatio analyysi, havaitsimme merkittävää käänteinen korrelaatio miR-30b ja PAI-1 mRNA (kuvio 5B,

R

= -0,6475,

P

= 0,0123). Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että miR-30b ilmentyminen korreloi käänteisesti PAI-1 ilmentymisen mahasyövän ja parannettu PAI-1 ilmentymisen mahasyövässä voisi olla seurausta alennettu miR-30b ilme.

(EN) ilmentyminen mir-30b ja PAI-1 mahasyövän solulinjoissa MKN45, MGC-823, SGC-7901, AGS ja HGC-27. Top, western blot-analyysi PAI-1-proteiinin tasot; bottom, qRT-PCR-analyysi miR-30b tasolle. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) miR-30b ja PAI-1 mRNA-tasot mahasyövän kudoksissa analysoitiin qRT-PCR. Insertti kuvaaja osoitti tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio (

R

= -0,6475,

P

= 0,0123). U6 ja β-aktiini toimi sisäinen normalisoitu viittaukset miR-30b ja PAI-1 mRNA, vastaavasti.

PAI-1 on mahdollisesti mukana miR-30b: n indusoiman apoptoosin

tutkia tarkemmin, ovatko PAI-1 on osallisena miR-30b-edistänyt apoptoosin, ensin testata, jos hiljentäminen PAI-1 ilmentyminen voi olla samanlainen apoptoosia edistävä vaikutus kuin miR-30b yli-ilmentymisen. SGC-7901-soluja transfektoitiin PAI-1 siRNA tai negatiivinen kontrolli-RNA (NC) 48 h, kuten on esitetty kuviossa 6A, mRNA tasoja PAI-1 voidaan vähentää merkittävästi sen siRNA. Myöhemmin PAI-1 siRNA ilmeiseen korotukset apoptoottisen korko SGC-7901-soluissa (kuvio 6B, 6C), verrattuna miR-ohjaus. Varsinkin PAI-1 siRNA pystyi phenocopy vaikutuksen miR-30b ilmentymisen vaikutus apoptoosiin säätelyyn syöpäsolun (kuvio 6B, 6C). Eräs edustava esimerkki pistekuvaajan oli kuvassa 6D. Seuraavaksi tutkimme myös, onko PAI-1 voisi kumota edistävä vaikutus apoptoosin miR-30b. SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-ohjaus- tai miR-30b jäljittelee 24 tuntia, ja sen jälkeen transfektoimalla PAI-1 Human cDNA ORF Clone vektori (merkitty PAI-1) tai tyhjän vektorin. Kuten kuviossa 6E-G, yliekspressoivassa PAI-1 aiheutti ilmeisiä tukahduttaminen vaikutuksesta miR-30b: n indusoiman apoptoosin. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että PAI-1 on mahdollisesti mukana miR-30b-edistää apoptoosia.

(A) PAI-1 siRNA estää ilmentymisen PAI-1 tehokkaasti mRNA-tasoja. RT-PCR: ää käytettiin seurata ilmentymisen PAI-1 48 tuntia transfektion jälkeen siRNA PAI-1 tai negatiivinen kontrolli-RNA, β-aktiini toimi sisäisenä kontrollina. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta, **

P

0,01. (B) SGC-7901-soluja transfektoitiin miR-ohjaus, miR-30b tai PAI-1 siRNA, ja elatusaine korvattiin seerumittomalla DMEM: 48 tuntia, kaspaasi-3, ja kaspaasi-7 havaittiin käyttäen kaspaasin Glo 3/7 määritys. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. 6 päällekkäisyyksien kolmesta itsenäisestä kokeesta, **

P

0,01. (C) SGC-7901-soluja käsiteltiin (B), ja sen jälkeen solut analysoitiin apoptoottisten hinnan värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC: llä ja PI. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta, **

P

0,01. (D) yksi edustaja FCM analyysi (C) näytettiin. (E) SGC-7901-soluja transfektoitiin ensin miR-ohjaus- tai miR-30b jäljittelee, ja sitten PAI-1 Human cDNA ORF Clone vektori (merkitty PAI-1) tai tyhjän vektorin 24 tuntia myöhemmin. 24 h jälkeen vektori transfektion väliaine korvattiin seerumittomalla DMEM vielä 24 tuntia, lopuksi kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 havaittiin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 Assay. Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. 6 päällekkäisyyksien kolmesta itsenäisestä kokeesta, **

P

0,01. (F) SGC-7901-soluja käsiteltiin (E), lopuksi solut analysoitiin apoptoottisten hinnan värjäyksen jälkeen anneksiini V-FITC: llä ja PI. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta, **

P

0,01.