Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lokalisoitu hypoksia kiinteissä kasvaimissa aktivoi transkription ohjelmia, jotka edistävät metastaattista muutosta soluja. Kuten hypoksia-indusoituvaa hyper-verisuonten muodostumista, menetys retinoblastoomaproteiiniin (Rb) on piirre yhteinen vaiheissa syövän etenemisen monissa metastaattisen syövissä. Kuitenkaan ole mitään yhteyttä välillä rooli Rb ja hypoksia-odotuksiin metastaattinen prosesseja on perustettu. Olemme osoittaneet, että Rb on keskeinen välittäjäaine hypoksia vasteen välittämä HIF1α /β, päällikön sääntelijä hypoksiavaste, ja sen olennainen koaktivaattoria, kilpirauhashormonin reseptori /retinoblastoomaproteiinin-vuorovaikutuksessa proteiinin (TRIP230). Lisäksi menetys Rb unmasks täydellistä yhteistyötä aktivointi mahdollisuuksia TRIP230. Käyttämällä pieni estävä RNA lähestymistapoja

in vivo

, loimme että Rb vaimentaa normaali fysiologinen vaste hypoksia mukaan HIF1α. Erityisesti menetys Rb johtaa hypoksia riippuvia biokemiallisia muutoksia, jotka edistävät hankinta invasiivisen fenotyypin MCF7 rintasyövän soluja. Lisäksi Rb on läsnä HIF1α-ARNT /HIF1β transkription komplekseja liittyvät TRIP230 määritettynä yhteistyössä immunosaostuksella, GST-pull-down ja siru määritykset. Nämä tulokset osoittavat, että Rb on negatiivinen modulaattori hypoksian säädellään transkription nojalla sen suoria vaikutuksia HIF1 monimutkainen. Tämä työ on ensimmäinen yhteys toiminnallinen ablaatio Rb kasvainsoluissa ja HIF1α riippuvaisen transkription aktivaation ja invaasio.

Citation: Labrecque MP, Takharin MK, Jagdeo JM, Tam KJ, Chiu C, Wang TY, et ai. (2014) TRIP230-retinoblastoomaproteiiniin Complex Säätelee Hypoksia-indusoituva Factor-1α-välitteisen transkriptio ja syöpäsoluinvaasiota. PLoS ONE 9 (6): e99214. doi: 10,1371 /journal.pone.0099214

Editor: Sonia Rocha, University of Dundee, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu 5 maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 12 toukokuu 2014; Julkaistu: 11 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Labrecque et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot sisältyvät käsikirjoituksen.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat toiminta- avustukset Kanadan Breast Cancer Foundation BC /Yukon (https://www.cbcf.org/bc/Pages/default.aspx ) sekä luonnontieteiden ja tekniikan tutkimuksen toimikunta, RGPIN 356355 (https://www.nserc-crsng.gc.ca/index_eng.asp) Kanadan TVB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hypoksian indusoima tekijä-1α (HIF1α), sen ortologin HIF2α, ja niiden dimerisaatio kumppani aryylihiilivetyreseptori ydin- translocator, (ARNT tai HIF1β), jotka muodostavat HIF1 monimutkainen [1], [2] säännellään solun vastaus heikossa happea. Terveillä kudoksiin liittyy HIF1 monimutkainen ohjaa tilattu ja tiukasti säänneltyä geenien ilmentymistä ohjaa

de novo

synteesi uusia verisuonien tukea kudoksen kasvun tai kudoksen uudelleen perfuusio. Hypoksian aikana, HIF1α kertyy, siirtyy tumaan, ja sitoo ARNT. HIF1 monimutkainen rekrytoi co-aktivaattorit, mukaan lukien CBP /p300 [3], ja Brm /Brg-1 [4] ja aktivoi geenien ilmentymistä, kuten verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), erytropoietiini (EPO) ja metastaattinen markkereita, CXCR4 ja prokollageenin lysyyli hydroksylaasin 2 (PLOD2) [1], [5], [6]. On näyttöä siitä, että HIF1 kompleksi voi aktivoida geeniekspressiota itsenäisesti tai yhdessä muiden transkriptiotekijöiden [7], [8]. Osoitus siitä, että HIF1α pystyy olemaan vuorovaikutuksessa C-Myc, Notch ja viime aikoina FOXA2 ohjaamaan tilattu transkription ja parantaa kasvaimen muodostumista [9] – [11] jättää avoimeksi mahdollisuuden, että HIF1 kompleksi on keskeinen transkriptionaalinen yksikkö, joka moduloi useita solunsisäisen signaloinnin verkkoja, joista monet voivat olla mukana metastaattisen muutosta. Niinpä monet molekyyleistä, jotka ohjaavat eri näkökohtia HIF1 toiminto ei ole vielä tunnistettu.

HIF1 monimutkainen toteuttaa tämän toiminnon rekrytoimalla transkription koaktivaattoria proteiinit mukaan lukien kilpirauhashormonin reseptori /retinoblastooma-vuorovaikutuksessa proteiini- 230 (TRIP230) on säätelyalueita hypoksian reagoivan geenien transkription aktivoimiseksi [12]. TRIP230, alun perin tunnistettiin tyroidihormonireseptorin (TR) -interacting proteiini, joka parantaa TR toimintaa [13]. Lisäksi, TRIP230 on eristetty osana P160 koaktivaattori kompleksin [14], joka on bona fide ARNT koaktivaattori kompleksin [15]. Mikä tärkeintä, olemme osoittaneet, että TRIP230 värvää ARNT transkription koaktivaattori, ja on tärkeää, että transkriptionaalista aktiivisuutta HIF1 kompleksin [12]. Lisäksi on osoitettu, että TRIP230 vuorovaikutuksessa Rb ja Rb vaimentaa TRIP230-avusteinen TR-jentymisen [16]. Tämä ja myöhemmin tutkimus osoitti, että vain hyper-fosforyloitua muotoa Rb vuorovaikutuksessa TRIP230 [17] esiin toiminto Rb erillään sen kanoninen E2F-riippuvaisen säätely solusyklin, nimenomaan sen hypo-fosforyloitua muotoa.

menetys

RB1 ​​

, geeni, joka koodaa Rb [18], ja tai keskeytys- toiminto Rb liittyy kehittämiseen ja metastasointiin monien muiden kiinteiden kasvainten kuten syöpiä munasarja-, keuhko-, rinta-, eturauhas- ja aivojen [19] – [23]. Paras ymmärretty tehtävä Rb on, että solusyklin säädin tukahduta E2F transkriptiotekijä funktio siten välittäjinä solujen lisääntymistä ja erilaistumista [24]. Hypo-fosforyloitu Rb estää solusyklin etenemisen sitoutumalla E2F transkriptiotekijät ja vaikuttavat E2F-riippuvaisen transkription tuloksia. Se tekee rekrytoimalla kromatiiniin remontin transkription repressoriproteiinit kuten Sin3a /b, HDAC, SUV39H1 ja DNMT1 [25] – [27]. Hyper-fosforyloitu Rb ei tukahduttaa E2Fs ja mahdollistaa niiden käyttöön tai tukahduttaa eri geenin ilmentymisen ohjelmia [24].

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että Rb voivat olla fysiologisia rooleja lisäksi sen kanoninen E2F toiminto [28]. Aiemmin olemme osoittaneet, välillä on suora vuorovaikutus TRIP230 ja ARNT [12]. Lisäksi osoitimme, että TRIP230 oli välttämätön transkription välittämä kaksi erillistä dimerointi kumppanien ARNT eli aryylihiilivetyreseptori ja HIF1α [12]. Tässä raportissa, tarjoamme ensimmäinen todiste olemassaolosta Rb-TRIP230-ARNT kompleksi, joka välittää HIF1 transkriptio. Lisäksi osoitamme, että Rb vaimentaa aktiivisuutta ARNT transkription komplekseja nojalla sen yhdessä TRIP230 ja riippumaton E2F. Viime kädessä tämä työ paljastaa kyky Rb moduloida HIF1 aktivoituva geeniekspression seurauksia syöpäsolun muutosta.

Tulokset

HIF1-säännelty Gene Expression tehostetaan siRNA Knock-down Rb

TRIP230 tiedetään sitoutuvan suoraan TR ja ARNT [12], [16]. Ottaen huomioon, että hyper-fosforyloitua-Rb tukahduttaa TRIP230 co-aktivoitu TR toimintaa [16], [17] ja että TRIP230 ekspressio tarvitaan transkription aktiivisuuden ARNT kumppaneiden AHR ja HIF1α [12], me arveltu, että Rb voi vaimentaa hypoxia- geenin, transkription. Jotta voidaan tutkia roolia Rb kertyminen hypoksian indusoituvaa kohdegeenin mRNA-me köyhdytettyä Rb ihmisen syöpäsolun riviä siRNA-välitteinen geenin

knock-down

. MCF7 ja LNCaP-solut transfektoitiin joko salattu (SCX) ohjata siRNA tai kaksi Rb-spesifisiä siRNA: t ja mRNA: n kertymistä HIF1 kohdegeenien alttiina normoksia ja hypoksia verrattiin (kuvio 1). Rb RNA ja proteiini tasot vastaavasti tukahduttamaan sekä normoxic ja hypoksinen olosuhteet (kuviot 1A, ja E). Ei havaittu muutosta CXCR4 tai VEGF ilmentymisen Rb siRNA transfektoiduissa soluissa alla happiolosuhteissa kuitenkin lisääntyminen PLOD2 mRNA kertyminen alla happiolosuhteissa havaittiin MCF7-soluissa (kuvio 1 D), mutta ei LNCaP (kuvio 1 E). Lisäksi, MCF7-solut, jotka oli transfektoitu Rb-spesifinen siRNA: t osoittivat merkittävästi lisääntynyt mRNA kertyminen HIF1 kohdegeenien CXCR4, VEGF: n ja PLOD2 hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 1 B-D). Samanlainen hypoksia-riippuvaista vaikutusta CXCR4, VEGF ja PLOD2 induktio havaittiin vastauksena tukahdutti Rb ilmentymisen LNCaP eturauhassyövän solut (kuvio 1 E) viittaa siihen, että tämä havainto ei solutyyppispesifisiä.

MCF7-solut (A , B, C ja D) ja LNCaP-soluja (E) transfektoitiin joko salattu siRNA (SCX) tai Rb siRNA siRb 1, ja siRb 2. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut joko säilytetään happiolosuhteissa tai 1% O

2: ssa vielä 24 h. Geenin ilmentyminen määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä eristyksen jälkeen ja käänteistranskriptio kokonais-RNA. VEGF, CXCR4, PLOD2 ja Rb ilmaisun normalisoitiin konstitutiivisesti aktiivinen 36B4 geeniekspressiota. Avoimet pylväät edustavat normoksia (20% O

2) ja kiinni (harmaa) palkit edustavat hypoksian (1% O

2). Virhe pylväät edustavat ± S.D. * P 0,05.

Rb ja Rb liittyviä repressoriproteiinien rekrytoidaan Regulatory alueiden Hypoksia Inducible Genes aikana transkriptiota

Havaitsimme, että menetys Rb johti liioiteltu ilmaisu of HIF1 kohdegeenien hypoksian riippuvalla tavalla. Niinpä olimme kiinnostuneita onko läsnäolon Rb voidaan kirjata yli säätelyalueita HIF1 geenien kätkeminen hyvin tunnettu hypoksiavaste elementtejä aikana transkriptiota; eli VEGF-promoottorin ja EPO tehostajana. Kaavio näiden alueiden ja sijoittaminen oligonukleotidien PCR-monistus kromatiinin on kuvattu kuviossa 2A. Chromatin immunosaostuksella (chip) analyysi osoitti, että Rb assosioituu säätelyalueita HIF1 geenien, VEGF ja EPO hypoksian riippuvalla tavalla MCF7-soluissa (kuvio 2B). Sen varmistamiseksi, että meidän koeolosuhteissa tuottanut asianmukainen vastaus hypoksia, myös saostaa kromatiinin kanssa vasta HIF1α, ARNT, TRIP230 tai kontrolli kaniinin IgG. Ohjaus IgG oli kykenemätön saostamalla kromatiinin sisältävän VEGF ja EPO säätelyalueita. Kuten olemme osoittaneet aiemmin [12], olimme helpommin pystyy monistamaan chromatin saostetaan hypoksia käsitelty lysaatit kuin niistä johdetut lysaateista ylläpidetään happiolosuhteissa käyttäen HIF1α, ARNT, TRIP230 ja Rb vasta-aineita. Voisimme täydentää alhainen VEGF-promoottorin ja EPO tehostajana alla happiolosuhteissa (kuvio 2B), kun saostamalla kromatiinin kanssa TRIP230 vasta-, siksi emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että TRIP230 assosioituu hRes alhaisella tasolla huolimatta normaali hapen paine. Kuitenkin meidän kyvyttömyys havaita HIF1α tai HIF2α proteiinia näissä olosuhteissa (kuvio 2C) viittaa siihen mahdollisuuteen, että Rb ei ole otettu palvelukseen näihin HRE -alueiden happiolosuhteissa.

(A) Kaavamainen VEGF proksimaalisen promoottorin ja EPO tehostaja ja suhteellinen sijainti oligonukleotidien PCR-monistukseen käytettiin. (B) asema HIF1α, ARNT, TRIP230, ja Rb on VEGF-promoottorin ja EPO edistäjän MCF7-soluissa analysoituna kromatiiniin immunosaostuksella (ChIP) ja polymeraasiketjureaktio (PCR) ja sitä verrataan monistusreaktioissa peräisin lysaateista saostetaan kontrolli IgG. Kaikki pelimerkit suoritettiin vähintään kolme kertaa, ellei toisin mainita. (C) HIF1α ja HIF2α proteiinin tasot ovat dramaattisesti rikastunut aikana hypoksiaa MCF7-soluissa. MCF7-soluja ylläpidettiin viljelmässä joko 20% tai 1% O

2 24 tuntia. Tumauutteet analysoitiin immuno-blot ja kalvot tutkittiin affiniteettipuhdistettuja vasta-aineita HIF1α ja α-tubuliinin. Sequential siru proksimaalisen VEGF-promoottorin ja EPO tehostajana käyttämällä joko anti-HIF1α (D) tai anti-ARNT (E) affiniteettipuhdistettu vasta sen jälkeen immunosaostuksella anti-TRIP230 ja anti-Rb vasta-aineita. (F) pelimerkin VEGF-promoottorin jälkeen MCF7-soluissa transfektion jälkeen joko salattu siRNA tai siRb1 ja immunosaostuksella anti-TRIP230 vasta-aine. Arvot ilmaistaan ​​kertainen rikastus haltuunsa ja määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Kukin kokeellinen arvo korjattiin tulon ja kokeet suoritettiin kahdesti. (G) Immuno-blot-analyysi siRNA-transfektoiduissa MCF7 solulysaateista käytetään piiritekniikan kokeissa. (H) pelimerkin Rb-repressorin kompleksin proteiinien MCF7-soluissa. Soluja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu ja kromatiinin kompleksit eristettiin affinitecttipuhdiste- suunnattuja vasta-aineita Sin3a, Sin3b, ja HDAC: t 1-3.

laajeni tutkimuksia yrityksenä sen määrittämiseksi, TRIP230 ja Rb on kyky olla vuorovaikutuksessa yksittäisten DNA-elementtejä konsertti HIF1α ja ARNT at hypoksinen vastaus elementtejä. Suoritimme peräkkäisen kaksivaiheinen ChIP määritystä, ensin eristetään kromatiinia affinitecttipuhdiste- vasta Arnt tai HIF1α jälkeen saostetaan näiden puhdistettiin kromatiinin fraktioiden vasta-aineiden kanssa TRIP230 ja Rb. Kussakin tapauksessa VEGF promoottori-DNA: ta monistettiin PCR: hypoksia-riippuvaisella tavalla (kuvio 2D ja E) mikä viittaa vahvasti siihen, että HIF1α, ARNT, TRIP230 ja Rb ovat läsnä hRes monen proteiinin kompleksin. Lisäksi knock-down Rb arvioituna immuno-blot (kuvio 2G), ei johtanut edelleen rikastuminen TRIP230 at VEGF-promoottorin (kuvio 2F) viittaa siihen, että Rb ei häiritse TRIP230 värväyksen HIF1 reagoiva elementtejä.

Lopuksi olimme kiinnostuneita näkemään, jos tiedossa Rb liittyvä repressori kompleksit [26], [27] oli läsnä näiden elementtien aikana hypoksia-odotuksiin transkriptio. ChIP analyysi paljasti Sin3a /b, HDAC1 ja HDAC3 oli rikastettu HIF-reagoiva säätelyalueita sekä VEGF ja EPO geenit hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 2 H) tukevat hypoteesia, että Rb on osa transkription Repressorikompleksin vaikuttava HIF1-säännellyillä transkriptio. Sen sijaan HDAC2 käyttäytyi entistä kanoninen muoti ja erotettiin näiden alueiden hypoksian mukaisesti (Kuva 2 H). Nämä tiedot viittaavat siihen, että transkription repressoriproteiinit rekrytoidaan hypoksian geenien aikana transkriptiota. Lisäksi nämä havainnot tukevat olettamusta, että transkriptio on vaimennettu siirtämisen varmistamiseksi transkription vastaus.

ARNT ja TRIP230 ovat Essential Rb-sääntelyn HIF1 Activity

Koska Rb ja TRIP230 ovat vuorovaikutuksessa proteiineja kvantitatiivinen RT-PCR-kokeet toistettiin käyttäen siRNA suunnattu TRIP230. Hypoksinen geeni induktio CXCR4 mRNA kertyminen oli vakavasti heikentynyt upon knock-down of TRIP230 (kuvio 3A ja B). Knock-down Rb näissä olosuhteissa, mistä on osoituksena immuno-blot-analyysillä (kuvio 3B) ei aiheuttanut merkittävää lisäämistä CXCR4 mRNA, joka tarjoaa lisäksi todisteita siitä, että tämä vaikutus on TRIP230 riippuva. Kuvia koko immunologiseen blots löytyy kuvassa S1. Lisäksi menetys Rb ei johtanut kasvuun CXCR4 mRNA kerääntymistä soluihin ablatoitu varten ARNT siRNA-välitteisen knock-down edelleen viittaa siihen, että vaikutus välittämä Rb on hypoksia-riippuvainen (kuvio 3C ja D). Lisäksi siRNA-välitteinen tukahduttaminen DP1 ilmentymisen MCF7-soluissa vastasi hypoksia yhtä helposti kuin kontrolli solut (kuvio 3C ja E), mikä osoittaa, että moduloivia funktio Rb HIF geenien on riippumaton E2F ja irrotetaan Rb kanoninen roolia solusykliä välittäjänä.

(A) MCF7-solut transfektoitiin joko salattu siRNA (SCX) tai Rb siRNA siRb 1, ja siRb 2, tai yhdistelmä TRIP230 siRNA ja siRb1. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut joko säilytetään happiolosuhteissa tai 1% O

2: ssa vielä 24 h. Geenin ilmentyminen määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä eristyksen jälkeen ja käänteistranskriptio kokonais-RNA. CXCR4 ilmentyminen normalisoida konstitutiivisesti aktiivinen 36B4 geenin ilmentymistä. (B) Immuno-blot-analyysi TRIP230 ja Rb jälkeen siRNA transfektion joko salattu siRNA, tai yhdistelmä siTRIP230 ja siRb. Alfa-tubuliinin (α-tubuliinin) käytettiin latauskontrollina. (C) MCF7-solut transfektoitiin joko salattu siRNA (SCX) tai Rb siRNA siRb 1, ja siRb 2, tai ARNT tai DP1 siRNA tai niiden yhdistelmää ARNT /RB1 siRNA ja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu. (D) Immuno-blot of ARNT ja α-TUB transfektion jälkeen joko salattu ohjaus siRNA suunnattu ARNT. (E) Immuno-blot DP1, TRIP230 ja α-tubuliinin (α-tubuliinin). MCF7-solut transfektoitiin joko salattu ohjaus (SCX) tai siRNA suunnattu DP1. Tiedot kuviossa 3A ja 3C analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista-ANOVA. * P 0,01.

Menetys Rb lisäisi vuonna HIF1 Target Gene Protein Expression

Olimme kiinnostuneita määrittämään, onko vaikutus Rb-tappio mRNA kertymistä näkyi at proteiini tasolla HIF1 kohdegeenien ja erityisesti, jos pro-metastasoitunut tekijät vaikuttivat. Siten tutkimme myös roolia Rb ilmaisemisessa loppupään metastasoituneen markkereita, jotka ovat herkkiä hypoksia. Menetys Rb johti samanaikaiseen kasvuun CXCR4-proteiinia tasot 48 tunnin jälkeen ja hypoksia ja PLOD2 jälkeen 96 h hypoksian (kuvio 4A). Lisäksi 24 h altistus hypoksia Rb knock-down myös johti lisääntymiseen ilmaus mesenkymaalisten merkki, vimentiinistä (kuva S2A). Lisäksi menetys Rb ei lisätä endogeenisten tasojen HIF1α (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, että havaittu hypoksinen vaikutus ei johtunut kasvusta HIF1α ilmentymistä tai vakautta. Lopuksi aiemmat raportit osoittivat, että TRIP230 assosioituu hyper-fosforyloidun Rb [16], [17]. Immunoblottaus lysaatit MCF7 ja LNCaP-solut vasta-aineiden kanssa ja Rb, Rb-fosfoseriini-

780 ja Rb-fosfoseriini-

807/811 osoittavat, että on olemassa merkittävä määrä fosforyloidun Rb MCF7 ja LNCaP solut (kuvio 4B).

MCF7-soluja (A) transfektoitiin joko salattu siRNA (SCX) tai Rb siRNA siRb 1, ja siRb 2. Rb CXCR4, HIF1α, PLOD2 ja α-tubuliinin proteiinin tasot olivat arvioidaan immuno-blot altistuksen jälkeen ilmakehän O

2 tai 1% O

2 48 (Rb ja CXCR4) tai 96 h (HIF1α, ja PLOD2). (B) Immuno-blot-kokosolulysaateista päässä MCF7 ja LNCaP-solut joko jätettiin normoksia (N) tai käsiteltiin 1% O

2: ssa 6 tuntia (H). Blotit primaaristen vasta-aineiden yhteensä Rb, Rb-fosfoseriini-

780 (Rb-pS

780), Rb-fosfoseriini-

807/811 (Rb-pS

807/811 ), tai α-tubuliinin latauskontrollina.

menetys Rb Edistää invasiivisen Fenotyyppikuvaus MCF7 Breast Cancer Cells

kyky Rb knock-down parantaa HIF1 monimutkaisia ​​transkription aktiivisuuden ja proteiinin ilmentyminen johti meidät arvioimaan, Rb tukahduttaminen voi myös parantaa hypoksian aiheuttaman soluinvaasiota perinteisesti ei-invasiivisen MCF7 rintasyövän soluja [29]. Solujen täydellisen komplementin Rb (eli solut, jotka on transfektoitu SCX-ohjaus siRNA), hypoksia ei ollut vaikutusta invaasion MCF7-solujen Matrigel (kuvio 5A ja B). Kuitenkin siRNA knock-down Rb lisäsi invaasio MCF7 solujen hypoksisissa olosuhteissa, mutta ei vaikuttanut hyökkäystä mukaisesti happiolosuhteissa (kuvio 5A ja B). Nämä tulokset tukevat rooli Rb tuumorisuppressorina hypoksia-säännelty metastaattinen ohjelmia.

Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun siRNA transfektion jälkeen solut altistettiin Matrigel invaasiomääritys. Levyjä inkuboitiin normoxic (20% O

2) tai hypoksinen olosuhteet (1% O

2) 37 ° C: ssa 24 tuntia ja tunkeutuvat solut kiinnitettiin ja visualisoitiin toluidiinisinisellä. (A) mikrovalokuvia matrigeelin upotettu MCF7-soluissa. (B) numeerinen edustus suhteellinen hyökkäyksen matrigeelin-sulautettujen MCF7-solujen hoidon jälkeen SCX tai siRb ja altistuminen normoxic tai hypoksinen olosuhteet (n = 6), (C) Knock-down Rb MCF7-soluissa ei muuta solujen lisääntymistä in vastauksena CoCl

2. Solut transfektoitiin siRNA: n, kuten edellä on kuvattu. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin ajoneuvon tai 100 uM CoCl

2 aktivoida HIF1α ja solut laskettiin 0, 6, 12, 24, 36 48, ja 72 tuntia myöhemmin. Virhe pylväät edustavat ± S.E.M. * P 0,01.

olivat huolissaan siitä, että lisääntynyt invasiivisuus saattaa johtua dramaattinen kasvu solujen lisääntymisen takia menetyksen Rb hallinnan solusyklin. Välttää aikoja pidennetään, vaikea hypoksia, olemme osoittaneet, että HIF1α stabilointiainetta CoCl

2 matkisi vaikutuksia hypoksian Matrigel määrityksessä (kuvio S2C). Nämä tiedot tukevat edelleen hypoteesia, että havaitut vaikutukset välittyvät HIF1 monimutkainen. Jossa CoCl

2 vahvistettu tehokkaana matkivat hypoksian jälkeen knock-alas Rb Matrigel määrityksessä, pystyimme onko havaittu lisäys soluinvaasiota johtui kasvusta soluproliferaatioon (kuva 5C). MCF7 solujen kasvua dynamiikka seurattiin säännöllisin väliajoin laskemalla elävät solut yli 72 tuntia ajan. Transfektoiduissa soluissa joko SCX ohjaus siRNA tai Rb siRNA ja erillisellä näytettä kustakin yllä joko läsnä tai poissa CoCI

2, havaitsimme, että menetys Rb vähentynyt proliferaatio sekä YK-käsitelty ja CoCl

2 käsiteltyä soluja (kuvio 5C), joilla ei ole merkittävää eroa muita hoitoja. Samoin Matrigel invaasion SCX kontrollisolujen ollut erotettavissa joko kunnossa. Solulajittelussa jälkeen propidiumjodidivärjäys paljasti suurempi osa Rb knock-down solujen osa-G1 vaiheeseen solusyklin (kuvio 5D ja E). Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että menetys Rb edistää solujen invaasiota in hypoksian riippuvalla tavalla ja että nämä vaikutukset eivät ole lisääntyneen solujen määrä tai lisääntymistä.

Rb Associates kanssa PAS-B /TRIP230- vuorovaikutus Domain on ARNT Protein

mahdollisuus, että ARNT, TRIP230 ja Rb voivat olla osa multimeerisen kompleksin tutkittiin immuno-saostus TRIP230 liittyvien kompleksien ydin- uutteet MCF7-soluja inkuboitiin 6 tuntia hypoksisissa olosuhteissa (kuvio 6A). Immuno-blot-analyysi osoitti ARNT ja Rb on läsnä anti-TRIP230 immuno-sakka, kun taas yksikään kolme tekijää havaittiin sakka lysaatit suoritetaan ei-immuuni-lgG: llä. Nämä tulokset osoittavat vahvaa todistetta sille, että natiivi TRIP230 proteiini kykenee proteiini-proteiini-vuorovaikutusten ARNT ja Rb.

(A) Immuno-blot-kompleksien saostetaan käyttäen joko hiiren monoklonaalista vasta-ainetta on suunnattu TRIP230 tai hiiren kontrolli-IgG ydin- otteet MCF7-solujen. Blotit läsnäolo TRIP30, ARNT ja Rb. Vasemmalla kaistalla kunkin blot sisältää tumauutteesta edustavat 10% panos. (B) GST-ARNT-PAS-B pystyy hajottamaan TRIP230 ja Rb. Immuno-blot-analyysi GST-ARNT-PAS-B avattavan ja GST avattavan of TRIP230 ja Rb välillä MCF7 tumaekstraktien. GST osat kiinnitettiin glutationiagaroosihelmiin, ja inkuboitiin 90 min 4 ° C: ssa 500 ug MCF7 solun tumaekstraktin. Input kaistat kuormitettiin 250 ug tumauutetta. Täydellinen blots paneelien A ja B löytyy Supplemental Kuva S1. GST-ARNT-PAS-B pystyy vetämällä alas fosforyloidun Rb. (C) Immuno-blot-analyysi GST-ARNT-PAS-B avattavan ja GST avattavan Rb-fosfoseriini-

780 (Rb-pS

780) välillä MCF7 tumauutteista kerättiin solut vasemmalle at normoksia (N) tai käsiteltiin 1% O

2 6 h (H). (D) Kromatiini immunosaostuksella määritys EPO tehostajana ja VEGF promoottori alueiden MCF7-soluissa käyttäen ohjaus- tai Rb-fosfoseriini-

780 vasta-aineita. Soluja käsiteltiin kuten edellä on kuvattu. Rb vaimentaa TRIP230 välittämää co-aktivoitumisen ARNT riippuvaisen transkription aktiivisuutta. Rb- ja ARNT-vuorovaikutus verkkotunnuksia on merkitty. Hepa-1c1c7 solut (E) ja MCF7-solujen (F) transfektoitiin hypoksian reagoiva 4xHRE perustuva lusiferaarikonstrukti reportterina, ekspressioplasmideja TRIP230, TRIP230ΔRB ja Rb kuten ja altistettiin 1% O

2 tai ilmakehän (20%) O

2 24 tuntia. Kokosolulysaateille lusiferaasiaktiivisuus. (G) kaavamaisen TRIP230ΔRB mutantti. (H) TRIP230 proteiinin tasot eivät vaikuta transfektoimalla Rb ekspressioplasmidin Hepa1c1c7 soluihin. Kokosolulysaateille analysoitiin immuno-blot ja kalvot tutkittiin affiniteettipuhdistettuja vasta-aineita TRIP230, Rb ja α-tubuliinin. * P 0,05.

Koska edellinen

in vitro

interaktiotutkimuksia päättäneet, että Rb ei suoraan vuorovaikutuksessa ARNT [30], me siis olivat kiinnostuneita selvittää, onko TRIP230 vuorovaikutus verkkotunnuksen sisällä ARNT voitaisiin käyttää eristämään Rb välillä MCF7 solujen tuman uutteita. Partch ja kollegat ovat todenneet, että TRIP230 vuorovaikutus verkkotunnuksen sisällä ARNT sijaitsee sen PAS-B-alue [31]. Olemme sulatettu aminohapot 344-479 kätkeminen laajennettua PAS-B domain hiiren ARNT GST. Käyttämällä tätä minimaalinen vuorovaikutus verkkotunnuksen tehtiin osittain vähentää mahdollista ARNT vuorovaikutuksessa muiden tumaproteiineja. Pull-down of TRIP230 ja Rb tumauutteista hypoksian ilmastoiduissa MCF7-soluissa dramaattisesti rikastunut käyttäen GST-ARNT-PAS-B domain verrattuna GST yksin (kuvio 6B). Siten on mahdollista, että ARNT monimutkainen lukien TRIP230 ja Rb on muodostettu läpi ARNT PAS-B domain. Tämä domain välittää vuorovaikutusta ARNT ja monia samanaikaisia ​​aktivaattoreita, jotka ovat välttämättömiä ARNT-välitteisen transkription: nimittäin, TRIP230 [12] P160 /NCoA /SRC-perheen transkription co-aktivaattorit [15], ja kaakao [32] .

Lopuksi halusimme selvittää erityisesti, jos hyper-fosforyloidun Rb oli mukana HIF1 sääntelemättömien geenin transkription. Me testattiin immuno-blotteja anti-fosfoseriini-

780 Rb-spesifistä vasta-ainetta sen jälkeen avattavasta käyttäen GST-PAS-B. Tällä tavalla havaitsimme hyper-fosforyloitu Rb blotteja syntyvät normoxic ja hypoksinen MCF7 solujen tuman otteet (kuvio 6C). Lisäksi kyselyä varten transkription säätelyalueita HRE sisältävän VEGF-promoottorin ja EPO tehostaja paljasti Rb-pSER

780 hypoksian mukaisesti (kuvio 6D).

TRIP230 välittävä sortava vaikutukset Rb HIF-säädellä transkriptio

Olemme luoneet että Rb yhdessä puhdistaa kanssa TRIP230 ja että Rb vaimentaa kertyminen hypoksian indusoituvaa kohdegeenin mRNA ja proteiini tasoilla. Jotta voidaan määrittää, jos kyky Rb moduloida HIF1-säädeltyjä transkription aktiivisuus välittyy TRIP230, tutkimme vaikutuksia Rb ilmentymisen hypoksian reagoiva reportteri-konstrukti käyttäen deleetiomutantteja TRIP230 Rb-negatiivisten ja positiivisten solulinjojen . Rb-negatiivinen Hepa1c1c7 solut transfektoitiin ekspressioplasmidilla koodausta TRIP230 tai kopiointia toimivaltaisen poistetaan-mutantti TRIP230 (TRIP230ΔRb; kaavamainen kuviossa 6G), josta puuttuu rb-vuorovaikutuksen domeeni [17], joka on Rb-cDNA-ekspressioplasmidin, ja synteettinen lusiferaasireportterista rakenteen, joka sisältää multimerisoituja hypoksia-reagoivan elementin (HRE) promoottori (kuva 6e). Rb kumottu hypoksinen induktio reportteri toimintaa soluissa, jotka on transfektoitu villin tyypin TRIP230, mutta oli tehoton soluissa, jotka oli transfektoitu mutantti-TRIP230. Transfektio Rb osaksi Hepa1c1c7 solulinja ei ollut vaikutusta tasot endogeenisen TRIP230-proteiinin (kuvio 6H). Itse asiassa, titraus kasvavia määriä Rb-ekspressioplasmidin tukahdutettu hypoksia-indusoituvaa toimittaja aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio S2B). Transfektio mutantti TRIP230 osaksi Rb-positiivisia ihmisen maitorauhasen MCF7-syöpäsoluja entisestään ilmentymisen reportterigeenin (kuvio 6F), toimii siten dominantti negatiivinen todennäköisesti kilpailemalla hRes endogeenisen villityypin TRIP230. Nämä tiedot viittaavat yhdessä siihen, että Rb: n lieventäviä vaikutuksia HIF1 transkriptionaalista aktiivisuutta näyttävät välittyvän TRIP230.

Keskustelu

Olemme määrittäneet, että Rb vaimentaa fysiologisen vasteen hypoksialle jonka HIF1α, ja että se on erottamaton ja välttämätön osa HIF1 transkription monimutkainen nojalla suoraa vuorovaikutusta TRIP230. Tämä vaikutus on riippumaton muista proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tukahduttava vaikutus Rb hävisi soluissa yli-ilmentävät kopiointia toimivaltaisen mutantti TRIP230 josta puuttuu Rb-vuorovaikutuksen domeeni (kuvio 6E ja F), ja soluissa köyhdytetty TRIP230 (kuvio 3A ). Lisäksi, siRNA-välitteinen knock-down Rb johti samanaikainen kasvu tunnettuja HIF1 kohdegeenien hypoksian riippuvalla tavalla ihmisen rinta- MCF7 ja ihmisen eturauhasen LNCaP syöpäsolulinjoissa (kuvio 1). Lisäksi pystyimme tallentamaan Rb yli hyvin tunnettu hRes EPO ja VEGF säätelyalueita (kuva 2) viittaa siihen, että Rb voi säädellä näiden geenien ilmentymistä transkriptiotasolla.

TRIP230 koaktivaattori oli kloonattu ja karakterisoitu perustuu sen kykyyn olla vuorovaikutuksessa tyroidihormonireseptorin (TR) ja parantaa sen transaktivaatiofunktiota [13], [16], ja sen vuoksi sen kyky olla vuorovaikutuksessa Rb [16]. Tässä jälkimmäisessä raportissa esitetty todisteita, että kannatti rooli Rb transkription vaimennin kilpirauhashormonin reseptorin toiminnan, todennäköisesti välittämien TRIP230 transkription koaktivaattori. TRIP230 todettiin myöhemmin toimii tärkeänä co-aktivaattori ARNT riippuvaisen transkription toimintaa, mukaan lukien hypoksia-indusoituva geeniekspression [12]. Tärkeää on, huomasimme, että TRIP230 ei vuorovaikutuksessa HIF1α hiivan kahden hybridin määrityksessä (T. Beischlag, julkaisematon data). Meidän immunosaostuksella tutkimuksissa käytettiin vasta-aineita suunnattu TRIP230 osoittaa, että endogeeninen ARNT ja Rb vuorovaikutuksessa TRIP230 MCF7-soluissa (kuvio 6A), jotka edelleen tukevat hypoteesia, että Rb on osa HIF1 transkription monimutkainen.

määritellä tarkemmin luonne otaksutun monimutkainen ja onko ARNT, TRIP230 ja Rb ovat olemassa yhdessä monimutkainen, me poistaa muita tunnettuja proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen rajapintojen ARNT ja käytetään GST avattavasta strategia Affiniteettisieppausreaktiot TRIP230 ja Rb. Kattava analyysi GST avattavasta suorittamien Elferink ja työtovereiden pystynyt osoittamaan suoraa vuorovaikutusta ARNT ja Rb

in vitro

[30]. Lisäksi perustuu aiempiin tutkimuksiin kuvaavat vuorovaikutusta ARNT ja TRIP230 [12], Partch ja työtovereiden tunnistettu aminohappojen sisällä ARNT PAS-B domain jotka välittävät ARNT-TRIP230 vuorovaikutus [31]. Suunnittelimme GST-ARNT-PAS-B fuusio poistaen muun proteiinin vuorovaikutus verkkotunnuksia sisällä ARNT. Kykyä ARNT-PAS-B-alue vetää alaspäin Rb tukee olemassa monen proan- kompleksi, joka sisältää ARNT, TRIP230 ja Rb (kuvio 6B). Todellakin, PAS-B verkkotunnus on noussut bona fide alustan rekrytointi monimuotoisen transkription yhteistyön sääntelyyn kompleksit [12], [15], [31], [33].

HIF1 * P 0,05.