Krooninen sairaus

tiivistelmä

Late diagnoosi keuhkosyöpään on edelleen tärkein syy korkea kuolleisuus keuhkosyöpään. Keuhkosyöpä on heterogeeninen sairaus, joka aiheuttaa immuunivasteen eri kasvaimen antigeenejä. Useita menetelmiä etsitään autovasta-aineiden on kuvattu, jotka perustuvat tunnettuihin puhdistettu antigeeni paneelit. Tutkimuksen tarkoituksena on löytää todisteita siitä, että osat antigeenin sitovan domeenin vasta-aineet jaetaan keuhkosyöpäpotilaita. Tämä tutkittiin uusi lähestymistapa, joka perustuu sekvensointi antigeeniä sitovia-fragmentit (Fab) immunoglobuliineja käyttäen proteomic tekniikoita ilman aiemmin tunnettujen antigeenin paneelit. Seerumista 93 osallistujien NELSON oikeudenkäynti IgG eristettiin ja sen jälkeen hajotettiin osaksi Fab ja Fc. Fab puhdistettiin pilkottu seoksesta SDS-PAGE. Fab sisältävä geeli-nauhat leikattiin irti, tryptisiin sulavuuden ja mitattiin nano-LC-Orbitrap-massa-spektrometria järjestelmä. Monimuuttuja-analyysi ja massaspektrometria tiedot lineaarisen kanoninen erotteluanalyysi yhdistettynä asteittainen logistinen regressio johti 12-vasta-aine-peptidi malli, joka pystyi erottamaan keuhkosyöpäpotilaita verrokkiryhmästä suuri riski väestön herkkyydellä 84% ja spesifisyys 90%. Meidän Fab-puhdistus yhdistettynä Orbitrap-massaspektrometrialla lähestymistapa, löysimme peptidejä muuttuja-osat vasta joita jaetaan keuhkosyöpäpotilaiden.

Citation: de Costa D, Broodman I Calame W, Stingl C, Dekker LJM, Vernhout RM, et ai. (2014) peptidit päässä Vaihteleva alue spesifisten vasta-aineiden jaetaan keskuudessa Keuhkosyöpä Potilaat. PLoS ONE 9 (5): e96029. doi: 10,1371 /journal.pone.0096029

Editor: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 03 huhtikuu 2014; Julkaistu: 01 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 de Costa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos Roche Diagnostics tehtävän rajoittamattoman tutkimuksen apurahan ja NWO (Alankomaat Organization for Scientific Research) niiden taloudellinen tuki (Zenith avustus 93511034). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus tukee osittain Roche Diagnostics rajoittamattomalla tutkimus avustusta. Roche Diagnostics ei ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tukeen Roche Diagnostics ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on tällä hetkellä yleisin syöpä, jolla on korkein kuolleisuus ( 28%) maailmassa johtuu diagnoosi on edennyt pitkälle. [1], [2] kuitenkin osoittaminen 20% keuhkosyöpäkuolleisuus kasvihuonekaasupäästövähennyksiä NLST tutkimus (National Cancer screening Trial) pieni annos TT seulonta keuhko syöpä kiinnitetään yhä enemmän kiinnostusta. [3] NELSON tutkimuksessa (Dutch-belgialainen keuhkosyövän seulonta tutkimus) osoitti, että kolmen seulonnan pyöristää 3,6% kaikista osallistujista tämän tutkimuksen oli väärän positiivisen näytön tuloksen. [4] Vaikka vielä noin 27% osallistujista tehtiin invasiivisia joka paljasti hyvänlaatuisia keuhkosairaudet lähtötilanteessa seulonta (ensimmäinen kierros NELSON tutkimus). [5] hyvä biomarkkereiden (paneeli) vähentää tätä määrää turhia invasiivisia toimenpiteitä. Tällä hetkellä valinta korkean riskin yksilöiden seulontaan tapahtuu iän ja tupakoinnin historiaa. Biomarkkereiden eli biomarkkereiden paneeli olisi avuksi valittaessa korkean riskin henkilöitä CT seulontaan, koska tämä voi havaita keuhkosyöpään varhaisemmassa vaiheessa kuin TT.

Vasta-aineet voivat olla mielenkiintoista markkereina erottamaan keuhkosyöpäpotilaita keuhkosta syöpää vapaiden yksilöiden. Näitä vasta-aineita tuotetaan immuunivaste, joka kohdistaa tiettyihin kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA: t) aikana syövän kehitystä, luultavasti varhaisessa vaiheessa. [6] – [12] Äskettäin Liu et

al.

Osoitti, että pitoisuus verenkierrossa IgG vastaisten autovasta-aineiden ABCC3 transporter oli merkitsevästi korkeampi naisilla adenokarsinooma-potilailla kuin naisten valvonnan [13].

Ihmisen vasta-aineita muodostuu neljä ketjua, kaksi identtistä raskasta ketjua, ja kaksi identtistä kevyttä ketjua. Jokainen kevyt ketju on vaihteleva (V

L) ja vakio (C

L) verkkotunnus. Raskas ketjut on kolme eri vakiodomeeneja (C

H1, C

H2 ja C

H3) ja vaihteleva domeeni (V

H). Ensimmäinen vakio ja vaihteleva osat muodostavat antigeenia sitovan fragmentin (Fab). Loput kaksi jatkuvaa osaa raskaan ketjun muodostavat Fc-alueen. Sisällä Fab kuuden komplementaarisuuden määräävät alueet (CDR1, CDR2 ja CDR3), välissä sijaitsevat puitteissa. Nämä CDR-alueet määrittävät antigeenispesifisyys ja muodostavat pinnan, joka on komplementaarinen muoto, joka on osa antigeenin. CDR: t ovat hypervariaabeleita alueita vasta-aineen. [14] Vasta-aineet tai immunoglobuliinit ovat erittäin monimutkaisia ​​molekyylejä, joilla on suuri vaihtelu niiden aminohapposekvenssin. Mahdollisia monimuotoisuus immunoglobuliinien arviolta välillä 10

13 ja 10

50 ja siksi toteamukseen samankaltaisia ​​tai jopa identtisiä sekvenssejä eri yksilöillä sattumalta on teoriassa erittäin epätodennäköistä. [14], [15] Kuitenkin tutkimukset eri tutkimusryhmät ovat viime aikoina osoittaneet, että vaikka tämä teoreettinen pieni mahdollisuus on samanlaiset vasta yksilöiden, on mahdollista tunnistaa samanlaisia ​​tai identtisiä sekvenssejä. [16] – [19] tekemää tutkimusta meille osoittivat, että PNS (paraneoplastic neurologisia oireyhtymä) potilailla identtisiä mutatoidun ensisijainen aminohapposekvenssit komplementaarisuuden määräävät alueet (CDR: t) ovat olemassa. Nämä CDR ovat spesifisiä tunnettujen onconeural antigeenejä, kuten HUD ja Yo PNS potilailla, ja mielenkiintoisinta jaettiin eri PNS potilaiden [20].

Tämän tutkimuksen tavoitteena on löytää todisteita siitä, että spesifinen vasta peptidejä jaetaan keuhkosyöpäpotilaita toisin keuhkosyöpä vapaa yksilöitä. Koska keuhkosyöpä on heterogeeninen sairaus ja vaihtelevuutta vasta-aineen se voi olla haaste havaita samanlaisia ​​kasvaimeen liittyviä vasta-aineita seerumista. Olemme kokeellisesti testata hypoteesia, että erityistä erittäin vaihtelevia alueita vasta-aineen, mukaan lukien komplementaarisuuden määräävät alueet (CDR: t) voidaan jakaa keuhkosyöpäpotilaita. Meidän kokeellinen lähestymistapa tarkistaa tämä hypoteesi perustuu sekvensoimalla vasta-peptidejä massaspektrometrialla. Mittaaminen seerumista massaspektrometrin saattaa olla liian monimutkainen, koska korkea vaihtelevuus kuten edellä mainittiin. Puhdistava IgG Fab seerumista vähentää monimutkaisuutta näyte keuhkosyöpä potilas ja antaa mahdollisuuden keskittyä puhtaan vasta-jakeet.

Materiaalit ja menetelmät

Etiikka ja oikeudellisten hyväksyntä

NELSON tutkimus hyväksyttiin Alankomaiden Health neuvosto, terveys- ja Medical Ethical valiokuntien kaikkien osallistuvien keskusten (kliininen tutkimus numero ISRCTN63545820). Kaikki osallistujat Tämän tutkimuksen edellyttäen kirjallinen lupa käyttöön niiden seeruminäytteistä. Luovuttaja Vertailunäytteen käytetään tässä tutkimuksessa edellyttäen kirjallinen suostumus käyttää hänen /hänen seerumin tieteellisiin tarkoituksiin ohjeiden mukaan Blood Bank Sanquin, Rotterdam, Alankomaat.

NELSON Trial

Nelson (hollantilais-belgialaisen keuhkosyövän seulonta tutkimus) tutkimus on aloitettu rekrytointi vuonna 2003 lähettämällä kyselylomakkeen 548489 miehillä ja naisilla 50-75-vuotiaita. Osallistujat piti olla nykyisiä tai entisiä tupakoitsijoita vähintään 25 vuotta, tupakointi vähintään 15 savuketta päivässä tai tupakointia vähintään 30 vuotta, tupakointi vähintään 10 savuketta päivässä. Vuodesta 548489 miehillä ja naisilla 15822 osallistujaa sisällytettiin tutkimuksessa. Nämä osallistujat satunnaistettiin näytön tai kontrolliryhmään. Seulonta varsi saivat CT seulonta vuosina 1,2 ja 4. ohjausvarsi saanut seulonta (tavanomainen hoito). Osallistujat positiivisen testituloksen saatettiin pulmonologist. Jos diagnoosi keuhkosyöpä perustettiin potilasta hoidettiin ja lähti seulonta. Osallistujille määräämättömäksi testitulos tehtiin seurannan scan kolme kuukautta myöhemmin. Jos negatiivinen testitulos saatiin toisen kierroksen CT oli määrä 12 kuukautta myöhemmin [5], [21].

Tutkimus Väestö

Tätä tutkimusta varten valitsimme 44 keuhkosyöpä tapaukset ja 49 tarkastukset (Täydennyskuvio S1) päässä NELSON keuhkosyövän seulonta tutkimuksessa. [5], [21] tapauksissa löytö asetettu, NELSON 1, vain alkuvaiheen (I ja II) levyepiteelisyöpä (n = 4) tai adenokarsinoomat (n = 21), valittiin. Ne huolellisesti sovitettu valvonnan iän, sukupuolen, tupakoinnin tila, kesto ja määrä poltettujen savukkeiden päivässä, keuhkoahtaumatauti (COPD) tila, asbestille altistumisen ja sivuston verinäytteiden ottoa (Täydentävä taulukko S1). Valintakriteerit tapauksia Nelson 2 (validointi) asettaa (n = 19) olivat samanlaisia, paitsi että kaikki ei-pienisoluista histologian ja taudin vaiheet annettiin (Täydentävä taulukko S1) riitauttaakseen tulokset tietojenkeruuvaiheessa . Tarkoituksella kliiniset ominaisuudet verrokeilla ovat erilaisia ​​kanssa NELSON 1 sarja suhteen tupakoinnin ja keuhkoahtaumatauti. Siksi tämä NELSON 2 sarja ei vastaa kanssa NELSON 1 sarja. Käyttämällä validointi vedostulostus (NELSON 2) valitaan tällä tavalla, luotettavuutta menetelmää voidaan määrittää.

Seerumi kerättiin sekä NELSON 1 ja NELSON 2 saatu lähtötilanteesta TT seulonta (ensimmäinen kierros) .

IgG Fab puhdistus ja NanoLC Orbitrap MS Analyysit

Ennen kaikkia näytteidenvalmistusmenettelyitä, kaikki näytteet sokaisi ja avain unblinding otettiin klo tietokantaan koordinaattori NELSON oikeudenkäyntiä. IgG-Fab puhdistus ja nano-LC Orbitrap MS-analyysit suoritettiin menetelmän mukaisesti edellä on kuvattu. [22] laajempia kuvaus Viittaamme täydentävä Methods S1. Lyhyesti, IgG eristettiin seerumista ja sulatettu Fab- ja Fc (kuvio 1). Fab-osa eristettiin pilkottu seoksesta SDS-PAGE. Fab sisältävä geeli bändejä leikattiin irti ja tryptisiin pilkottu. Tyhjä, geeli, joka ei ollut täynnä proteiinia leikattiin ja käsiteltiin kuten irrotettiin Fab taajuusalueiden tausta arviointiin.

Tässä virtaus-kartoittaa eri vaiheet Fab puhdistus, Fab mittaus- ja data-analyysi on esitetty. Keltaisella Fab puhdistus on esitetty, sinisellä Massaspektrometriasta mittaus, vihreä data-analyysi ja vaaleanpunainen tilastollisen analyysin.

LCMS mittaukset suoritettiin Ultimate 3000 nano LC-järjestelmä (Thermo Fisher Scientific /Dionex, Amsterdam, Alankomaat) online kytketty hybridi lineaarista ioniloukku /Orbitrap MS (LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Saksa). 4 ui pilkottu Fab ladattiin järjestelmään. Lisätietoja asetuksista ja ratkaisuja viittaamme täydentävillä menetelmillä S1 ja aiemmin julkaistun työn. [22] Kaikki näytteet satunnaistettiin ennen mittausta ja mitattiin erissä 11 näytettä, myös vertailunäytteen. Viittaus näytettä käytettiin laadunvalvonta kullekin mittaaminen ja analysointi vaihe. Tyhjä näyte ajettiin alussa ja lopussa mittauksen määrittämiseksi tausta ja olemassaolon siirrettyjen kromatografian aikana.

Data Analyysit

Raw tiedostoja ladattiin ohjelmiston Progenesis ( Kuva 1) (versio 3.1; Nonlineair Dynamics Ltd, New Castle, UK) ja prosessit kuten aiemmin on kuvattu. [22] lisäksi teimme Progenesis mittaamiseen, kun sen sijaan havaitsemaan ominaisuuksia (peptidi massat (m /z)) kaikissa näytteet samaan aikaan ohjelmistossa, ominaisuus havaitseminen suoritettiin yksilöllisesti näytettä kohti. Ominaisuudet poimitaan siten oli sovitettu Progenesis tuloksen sisältävän taulukon kaikki näytteet, joiden massa sallitaan 5 ppm. Tämä oli etu, koska usein ominaisuuksia esiintyy alhainen intensiteettiä yhdessä näytteessä ja myöhemmin vastapainoksi Progenesis kaikissa muissa näytteissä. Tämä johtaa virheisiin liittyvä tausta jos otetaan kunkin massaspektri huomioon. Tämän suhteellisen pienen säädön se takaa, että ominaisuus on ilmaista tarkemmin koko näytteitä. Hankkima data tätä lähestymistapaa suodatettiin käyttäen samoja oletusasetuksia. [22] Erillinen Datamatriisin jokaisen tapauksen ja ohjaus syntyi koostuu kaikista ominaisuuksista vastaavien raaka runsautta ja retentioaika. Synnyttäminen suuri Datamatriisin joka sisältää kaikki tapaukset ja hallintalaitteet näistä erillisiä tietoja matriiseja, etsimme massat erillisestä tietojen matriisien per tapaus tai valvonnan täydellisiä tietoja matriisi tuotetaan standardin Progenesis analyysit. Jokaisen massa oli täytettävä kolme kriteeriä: 1) m /z (± 5 ppm), 2) retentioaika (± 1 min) ja 3) identtiset maksutta. Jos massa täyttänyt nämä kolme kriteeriä raaka runsaussuuntaukseen täydellinen matriisi (tuottamat yleinen menettely [22] valmistajan suosittelema) käytettiin. Jos massa ei täytä näitä kriteereitä nolla syntyi raaka runsaus.

MS /MS-spektrit uutettu raaka tiedostoja ja muuntaa Mascot yhteensopivia tiedostoja käyttäen uutetta-MSN (osa Xcalibur version 2.0. 7, Thermo Fisher Scientific Inc.). Mascot (versio 3.2.01; Matrix Science Inc., London, UK) käytettiin suorittamaan tietokantahakuihin vastaan ​​ihmisen alaryhmä NCBInr tietokannan (versio 11 maaliskuu

th, 2009; Homo sapiens lajin rajoitus; 222066 sekvenssit) on uutettu MS /MS-tiedot (kuvio 1). Database (NCBInr) riippuvainen peptidin tunnistamista ja

de novo

sekvensoinnin tulokset (ohjelmistot PEAKS, Versio 5.2, bioinformatiikan Solutions Inc., Waterloo, Kanada) on myös sisällytetty Progenesis säädetty matriisi. Jos asetuksia käytetään tietokantahakua ja

de novo

sekvensointi puhumme aiemmin julkaistun työn ja menetelmiä S1. [22]

de novo

sekvenssit toistaiseksi ei tiedetä tietokannasta, huiput ohjelmisto tunnistaa leusiinilla isobaarinen aminohappoja leusiini ja isoleusiini. Tietokanta riippuvainen peptidin tunnistamisen tuloksia tai

de novo

sekvensoinnin tulokset sisällytettiin matriisiin perustuu korkeimpaan peptidin identiteetti pistemäärä (Data S1, Data S2 ja Data S3). Kaikki peptidin sekvenssit tapausten ja kontrollien tunnistetaan Mascot tai PEAKS myöhemmin kohdistettu tietokantoja, jotka sisältävät V, D, J tai C-alueen ituradan sekvenssejä, jotka ovat peräisin IMGT tietokannasta (IMGT, kansainvälinen Immunogenetics tietojärjestelmä http: //www.imgt. org) käyttäen BLAST-algoritmi (kuvio 1). [23] peptidit riittävän ottelu (bitscore ≥12.5 ja kohdistus pisteet ≥70%) V-alueen tietokanta siirrettiin kantaa immunoglobuliinimolekyylin vaihtelevalla CDR pituudet (Data S1, data S2 ja data S3).

Raaka tiedostoja viitteen näytteitä kustakin datajoukon otettiin erikseen ladattu ohjelmisto Progenesis ja sen jälkeen standardi menettelyjä, kuten edellä mainittiin. Määrittämään osuus vaihtelua vertailunäytteen mittaukset suoritetaan eri ajankohtina, mediaani r-neliöt laskettiin kullekin näytteelle. Jokainen näyte verrattuna kaikkiin muihin vertailunäytteet mitataan että aineisto ja mediaani r-aukio laskettiin kullekin näytteelle. Vertailu perustui raaka runsaasti kunkin ominaisuuden. Tämä tehtiin erikseen kumpikin riippumaton aineistoja, NELSON 1 ja NELSON 2 (taulukko S2a ja S2b).

osuuden määrittämiseksi vaihtelun (kuvio 1) näytteiden välillä (tapaukset ja kontrollit) kahden erillisen aineistot samat laskelmat suoritettiin kuten edellä on kuvattu kussakin tapauksessa ja kontrollinäyte. Tämä analyysi tehtiin erikseen kahden aineistoja (taulukko S2C ja S2D). Perustuen jakamisesta mediaani r-ruutua jokaisen näytteen, päätimme asettaa raja-R-neliön 0,70. Tapaukset ja valvonta, joka saadaan mediaani r-neliö alle 0,70 jätettiin aineisto ja edelleen analyysejä. Laskelmat suoritettiin käyttäen Microsoft Excel 2007

Tilastollinen analyysi

Kaksi itsenäistä aineistoja on käytetty, NELSON 1 ja NELSON 2. Ensimmäinen askel tilastollisessa analyysissä koostui testaus normaaliuden käyttäen skewness ja huipukkuus jakelu ominaisuudet voimakkuudesta raaka runsaasti ominaisuuksia [24].

Myöhemmin yhden muuttujan analyysi tehtiin, soveltamalla joko pariton t-testi (parametrinen) tai Mann-Whitneyn U-testiä ( ei-parametrinen) havaita merkittäviä eroja raaka runsaasti tapausten ja kontrollien välillä on NELSON 1 sarja. [25] merkitystä raja asetettiin 0,05 (kaksipuolinen). Kaikki tunnistetut ominaisuudet, jotka olivat huomattavasti erilaisia ​​käytettiin valittaessa ominaisuuksien erottaa keuhkosyöpäpotilaiden kontrolleihin.

Toiseksi käytetään Monimuuttuja-analyysissä vain merkittävästi tunnistettu ominaisuuksia, jotka oli ≥2 laukeaa MS-spektrit. Käytimme Monimuuttuja-analyysissä ominaisuuksista täyttävät nämä kriteerit, joiden (logistinen) vaiheittainen regressiomallin (y = a

1 × 1 + a

2 x 2 + a

3 × 3 … .a

nx

n + c) yhdessä kanoninen lineaarinen erotteluanalyysi (taulukko S3a). [26], [27] Tämä johti yhdistelmän ominaisuuksia suurella herkkyydellä ja spesifisyyden Nelson 1 aineisto. Tämä yhdistelmä ominaisuuksia testattiin sitten Nelson 2 aineisto käyttäen samoja menetelmiä kuin edellä on kuvattu. [26], [27] On huomattava, että Nelson 2 aineisto oli välttämätöntä optimoida kertoimien malliyhtälöön järjestyksessä (taulukko S3b ) optimoida herkkyyden ja spesifisyyden Nelson 2 aineisto.

jotta satunnaista virhe vaikutus mallinnus, me todentaa tilastollista taustaa yhdistelmän ominaisuuksia permutoitu aineisto. Taustalla arviointi koostui saman työnkulun kuin käytettiin pienoismallit, paitsi että alussa asioiden jakamisesta ja valvonnasta NELSON 1 oli permutoituina (kuva S2). Tämä permutaatio suoritettiin kaksitoista kertaa ja saadut tulokset testattiin merkitystä vastaan ​​mallin toteutumaan z-testi (yksipuolinen; p 0,05). Koska malli rakennuksen tietojen perusteella siten kuin NELSON 1, jonka jälkeen validointi tämä malli tehtiin käyttämällä tietoja NELSON 2, sama lähestymistapa otettiin jokaisen yksittäisen permutaatio. Myös täällä, huomaa, että Nelson 2 aineisto kertoimien malliyhtälöön optimoitiin.

Kaikki analyysit pienoismallit, validointi ja tausta arviointi tehtiin käyttäen STATA, versio 12 (StataCorp, Texas, USA). Koko tutkimuksen, käyttäen kaksipuolista testaus (lukuun ottamatta yksipuolista testaus Z-arvot), p-arvot 0,05 tai pienempi katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Tilastolliset analyysit tietojen taulukossa S1 kertyi SPSS (IBM SPSS Statistics 20). Aika syövän syntyi laskemalla väli verinäytteen ottoa ja diagnoosi tapauskohtaisesti.

Tulokset

Kliininen Ominaisuudet tutkimuspopulaation

ei ollut merkitsevää eroa kliiniset ominaisuudet tapausten välillä ja valvonnan NELSON 1 sarja (taulukko S1). Vuonna NELSON 2 sarja, nykyinen tai entinen tupakoitsija ja keuhkoahtaumataudin tila erosivat merkittävästi tapausten ja kontrollien välillä (taulukko S1). 72% ja 84% tapauksista on NELSON 1 sarja, ja NELSON 2 sarja, vastaavasti, välinen aika verinäytteen ottoa ja keuhkosyövän diagnoosi oli välillä 0-1,5 vuotta. Mediaani seuranta kesto jälkeen verinäytteitä oli vertailupopulaatiossa 1925 päivää (vaihteluväli 1075-2086 päivä) ja 1861 päivää (vaihteluväli 347-2135) on NELSON 1 sarja ja NELSON 2 sarja, vastaavasti. Mikään valvonnan kehittynyt keuhkosyöpä aikana seuranta-ajan.

Tekniset vaihtelu

aikana massaspektrometrian mittaukset biologisten näytteiden mittasimme vertailunäytteen eri ajankohtina. R-neliö-arvot laskettiin runsaus tunnistettujen proteiinien kussakin referenssimittausmenetelmien näyttää teknisiä toistettavuutta. Pienin r-RMS-arvo havaittiin eri mittauksissa vaihteli 0,84 ja 0,93 (kuva 2).

Vertailunäyteliuos mitattiin eri ajankohtina aikana mittauksen NELSON 1 vedostulostus. Toisinto Vertailunäytteen (x-akseli) verrattiin toisiinsa rinnakkaisia ​​näyte perustuu raaka runsaasti kunkin ominaisuuden. R-neliön arvo laskettiin. Jokainen piste edustaa r-neliö (y-akseli) arvo vertailun kyseisen rinnakkaisten toisen jäljitellä. Kunkin toistavat keskimääräinen r-neliö ja keskihajonta (SD) on esitetty.

Suoritimme saman r neliön laskenta 5 random biologisten näytteiden otettujen NELSON 1 joukko, joka mitattiin kahdessa eri LC-pylväät (sama erä) eri ajankohtina. Teknisen toistettavuus kussakin sarakkeessa johti alimpaan r-neliö arvot vaihtelevat +0,75-+0,93, mutta tekninen toistettavuus viidestä biologisten näytteiden mitatut kaksi riippumatonta samankaltaisia ​​saraketta oli pienempi. Kahden itsenäisen samanlainen saraketta mediaani r-neliö 0,52 havaittiin. Kuviossa 3 välinen korrelaatio kunkin näytteen ja sarakkeiden välillä on esitetty.

dendrogrammissa osoittaa korrelaatio viisi eri biologisista näytteistä mitattiin kahdella eri saraketta samasta erästä, sarake 1 ja 2 sarakkeessa (y-akseli). Y-akselilla viisi eri näytteissä on esitetty. Näyte 1-5 mitataan sarakkeessa 1 ja 6-10 mitataan sarakkeessa 2. Näyte 1 ja 6 ovat samasta yksilöstä. Tämä koskee myös näytteen 2 ja 7, 3 ja 8, 4 ja 9, ja 5 ja 10. x-akselilla euklidista etäisyyttä kunkin näytteen on esitetty. Vahva korrelaatio per sarake löytyy.

Kuvassa 4A retentioajat on esitetty peptidejä tunnistettu suuri luottamus (Mascot pisteet 60) on vertailunäytteiden mitattuna samanaikaisesti sekä NELSON 1 ja NELSON 2. Tämä kuvio osoittaa, että pylväs suorituskyky oli verrattavissa kahden eri LC sarakkeet seuraaville runsaasti peptidien (r-neliö 0,996). Lisäksi runsauksien havaittu näiden peptidin myös korreloivat hyvin (kuvio 4B, r-neliö 0,995). Tämä viittaa siihen, että sekä kromatografia ja massaspektrometria suoritettiin nimellisesti ainakin peptidejä tunnistetaan suuri luottamus suhteellisen korkea runsautta. Täten tekninen muutos näemme ensisijaisesti johtuu peptidien alemmilla runsaus, lähempänä toteamisrajoja (kuva S3).

vertailunäytteiden jotka mitataan sekä NELSON 1 ja NELSON 2 vertasimme peptidejä, jotka olivat tunnistetaan suuri luottamus jonka Mascot haun pistemäärällä yli 60 kummassakin. Tämän peptidien osajoukon, vertasimme retentioaikojen havaittiin Nelson 1 ja Nelson 2 (A) ja myös niiden runsaus (B). Näiden parametrien havaitsimme r-neliö arvot 0,996 ja 0,995, tässä järjestyksessä.

Arvio biologisen vaihtelun suoritettiin ja johti mediaani r-neliön 0,43. Tämä tulos oli paljon pienempi kuin alin r-neliö (0,84) havaittiin tekninen vaihtelua. Siksi biologinen vaihtelu on suurempi kuin tekninen vaihtelu.

Nämä tulokset osoittavat, että tekninen muutos olisi otettava huomioon ja säätö tarvitaan vertailun itsenäisesti mitattuna näytesarjan jälkeen NELSON 1 ja NELSON 2 aineisto oli mitataan kahdella eri sarakkeita eri ajankohtina. Voit voittaa tämän teknisen muutoksen, haimme useita suodattimia tiedot ennen voisimme aloittaa analysointi kuvatun Material Menetelmät jaksossa.

Näiden tietojen suoritimme erillinen yhden muuttujan analyysi kaikki peptidit löytyy tapausten ja kontrollien erillisestä NELSON 1 ja NELSON 2 keräämiseen. Pystyimme havaita 49 peptidejä, jotka olivat merkittävästi erilaiset tapausten ja kontrollien välillä on NELSON 1 aineisto. Nämä peptidit, yhtä poikkeusta lukuun ottamatta, eivät osoittaneet tätä eroa NELSON 2 aineisto. Ei ollut mitään suuntausta (r-neliö 0,004) in p-arvot kahdelle aineistoja. Siksi testaus yksimuuttujaisesti tällä tavalla ei joko ollut oikea analyysi strategia tai prosessi syntyy satunnaisesti valituista ominaisuuksista (mahdollisuus). Siksi merkittävä peptidien NELSON 1 analysoitiin seuraava askel Monimuuttuja tavalla.

Vasta Peptide Model

optimaalinen yhdistelmä 12 peptidien tunnistettiin monimuuttujastatistiik käytetään NELSON 1 setti (discovery set). Tämä yhdistelmä peptidien voisi erottaa keuhkosyöpäpotilaita kontrollien kanssa herkkyys ja spesifisyys 96% ja 100%: lla. Tämä vasta-aine peptidi malli pystyi havaitsemaan keuhkosyöpä 373 päivää keskimäärin (vaihteluväli 39-1193 päivää) ennen diagnoosi määritettiin. Kuviossa 5 osoitetaan, että yhdistelmä 12 peptidien pystyi erottamaan tapauksissa kontrolleihin. 12 peptidit vastasi 1 järjestyksessä päällekkäin CDR2 alueen 1 sekvenssi päällekkäisiä CDR3 alueella, 7 sekvenssit päällekkäisiä Framework 1 alueen ja 3 sekvenssit päällekkäin puitteiden 3 alueen mukaan IMGT tietokantaan (taulukko 1).

raaka runsaus täytetään-in malliyhtälöä (y = a

1 × 1 + a

2 x 2 + a

3 × 3 … .a

nx

n + c ) kyseisen näytteen asetettu. Y-akselin (mielivaltaisina yksikköinä) luvut tuottamat yhtälö esitetään.

Me tehdään ulkopuolinen validointi Nelson 2 (validointi) asetettu. Kun käytetään samaa 12 peptidi mallia tähän asettaa, tapausten ja kontrollien voitu enää erottaa. Kuitenkin samoilla peptideillä mutta sen jälkeen uudelleen optimoinnin mallin kertoimia, havaitsimme herkkyys ja spesifisyys 84% ​​ja 90%, vastaavasti. Koska kertoimet yhtälön säädetään jouduimme tarkistaa mahdollisuus overfitting tietojen. Näin ollen tausta arviointi suoritettiin joka kuvataan myöhemmin. Sisällä NELSON 2 validointi asettaa yhdistelmä peptidien pystyi havaitsemaan keuhkosyöpä 281 päivää keskimäärin (vaihteluväli 54-777 päivää) ennen diagnoosi keuhkosyöpään.

Vertasimme raaka runsaudesta 12 peptidien välillä kaksi NELSON aineistot. Havaitsimme, että keskimääräinen raaka runsaasti viisi peptidejä oli suurempi tapauksissa verrattuna keskimääräiseen runsaasti ohjausobjektit NELSON 1 aineisto. Nämä tiedot olivat yhdenmukaisia ​​havainnot NELSON 2 aineisto (taulukko S4). Muut seitsemän peptidit oli korkeampi keskimääräinen raaka runsautta ohjaimiin NELSON 1 aineisto verrattuna runsautta tapauksissa tämän aineisto. Vain yksi näistä seitsemästä peptidejä, tämä ero voitaisiin vahvistettu NELSON 2 aineisto (taulukko S4).

Taustaa arviointi Vasta Peptide Model

Lisäksi toteamukseen optimaalinen yhdistelmä peptidien, jotka merkittävästi erottaa tapauksissa kontrolleista, tausta-analyysi suoritettiin. Koska kertoimet yhtälön mallin säädettiin jokaiselle aineisto me todentaa tulokset panos on satunnaisessa datan ja siten mahdollisuus löytää vastaava malli sattumalta. Sama työnkulku sovellettiin pienoismallit paitsi että alussa työnkulun tapauksista ja hallintalaitteet Nelson 1 oli permutoituina sattumanvaraisesti (kuva S2). Discovery suoritettiin 12 kertaa permutoiduista NELSON 1 aineistoja, joka kerta 12 eri peptidejä osoittaa alimman p-arvo (p 0,05) NELSON 1 setti kyseiselle permutaatio. Validointi näiden mallien suoritettiin NELSON 2. suorituskyky monimuuttuja mallin permutoiduista löytö sarjaa (NELSON 1) on esitetty kuviossa 6A (siniset pisteet) jos herkkyys on piirretty spesifisyyttä. Vastaava valtaa validointi sarjaa (NELSON 2) on esitetty kuviossa 6B (siniset pisteet). Siten jokainen piste kuvassa 6A (sininen piste) vastaa pisteen (sininen piste) kuviossa 6B. Myös suorituskyky löytynyt varsinaista aineistoja, joissa vasta-peptidi malli havaittiin on piirretty (punainen piste). Voidaan havaita, että monimuuttuja sopiva päässä permutoiduista aineistot tuottaa kohtuullinen malleja jopa permutoitu tietoja löytö set.

kaksitoista kertaa permutaatio (tausta) suoritettiin NELSON 1 ja NELSON 2 aineisto. Herkkyys ja vasta-peptidin mallin näkyvät punaisella. Taustaa arviointi: A) Kaksitoista permutaatio ajojen näytetään vastaavien herkkyys ja spesifisyys NELSON 1 aineisto (sininen). Sama 12 peptidejä löytyi taustalla arvioinnissa NELSON 1 testattiin NELSON 2. B) 12 kulkee näkyvät vastaavaan herkkyys ja spesifisyys NELSON 2 aineisto (sininen). Huomaa, koska jotkut tulokset tausta analyysin esiintyi useammin kuin kerran, satunnaisluvun väliltä -1 ja 1 lisättiin jokaiseen herkkyyden ja spesifisyyden määrä varmistaa kutakin analyysiä (sininen piste) näkyy kuvassa.

kuitenkin erityisesti validointi aineistoja, todellinen data (vasta peptidi malli) suoritettu merkitsevästi parempi (p 0,05) kuin permutoiduista aineistoja, mikä viittaa siihen, että immunoglobuliini peptidit sataman liittyvää tietoa taudin potilaan tilasta. Siten tulokset saimme eivät johdu artefakti tietojenkäsittelyn.

CT Screening Tulos Nelson 1 ja NELSON 2 Dataset

Kuvassa 7A ja 7B seulonta tulokset perustason CT tarkistuksia on esitetty Nelson 1 ja NELSON 2 setti, vastaavasti. Mukaan seulonta protokollan NELSON oikeudenkäyntiä, toista CT suoritettiin seuraavat määräämättömän seulonnan tulos, noin 3 kuukautta myöhemmin.

CT tulokset A) NELSON 1 ja B) NELSON 2 näyte asetetaan ovat esitetty klo verinäytteiden ottoa (Baseline). Myös CT tulokset esitetään n seurannan CT kuluttua noin kolme kuukautta (Follow-up). Yhden asian Nelson 1 sarja no seuranta CT tulos oli saatavilla. Viimeinen rivi edustaa positiivisten, määrittelemätön ja negatiiviset CT tulokset lähtötilanteessa myös seurannan tulokset.

Havaitsimme, että 68% tapauksista oli positiivinen seulonta tuloksen sekä NELSON 1 ja NELSON 2 sarja 3 ensimmäisen kuukauden seulontaohjelman, muut keuhkosyövässä diagnosoitiin johonkin toiseen toista CT 3 kuukauden kuluttua tai toisella seulonta kierros. Sen jälkeen keskimäärin 367 päivää (vaihteluväli 39-1193 päivää) Nelson 1 ja 269 päivää (vaihteluväli 54-777 päivää) Nelson 2, seulonta tulos oli positiivinen, eli epäillä keuhkosyövän ja tuloksena kliinisen työn-tehdyllä pulmonologist