Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hyaluronaani (HA), joka on yksinkertainen disakkaridiyksikkö, voidaan polymeroida ja pidetään pääkomponentti soluväliaineen, jolla on laaja valikoima biologisia toimintoja. Viime vuosina, HA löydettiin kasvainsolujen pinnalla. Aiempien raporttien, erilaisia ​​HA-sisältö solun pinnalla tuumorisolujen liittyy läheisesti imusolmukemetastaaseja, mutta mekanismit välittäjänä tämän prosessin jäi epäselväksi. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää pinnan sisällön HA kasvainsolujen ja analysoida solujen liiman aiheuttamia muutoksia vuorovaikutuksen HA: n ja sen imusuonten endoteelisolujen reseptorin (Lyve-1). Me seulotaan ja havaittu korkea HA sisältöä HS-578T rintojen soluja ja pieni HA sisältöä MCF-7 rintojen solujen läpi hiukkanen syrjäytymistä, immunofluoresenssilla ja virtaussytometria kokeiluja. Ilmaisu on Lyve-1, lymph-alus erityisiä HA-reseptoria, oli yhdenmukainen aiempien raportti ja parantaa tarttuvuutta HA

high-HS-578T-soluissa COS-7

Lyve-1 (+) kautta HA solun staattista sähköä ja dynaamista yhdensuuntainen levy virtauskammion kokeiluja. MCF-7 rintojen solut sisältävät vain vähän HA pinnalla; kuitenkin, tuloksemme osoittivat vähän adheesiota eroa MCF-7-soluja ja COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, jotka koskevat tarttumista HS-578T-soluja tai MCF-7-solujen SVEC4-10 soluihin. Lisäksi havaitsimme ensimmäistä kertaa, että solun pinnan HA sisällön nopeaan tiedonsiirtoon kasvainsolujen oli rikas, ja me visualisoida ristisilloitukseen HA kaapelin rakenteita, jotka voivat aktivoida Lyve-1 imusuonten endoteelisoluissa, edistää kasvaimen tarttumista. Yhteenvetona, korkea-matala solun pinnan HA sisällöstä kasvainsolujen kautta vuorovaikutus Lyve-1 johtaa tarttuvuuden eroja.

Citation: Du Y, Liu H, hän Y, Liu Y, Yang C, Zhou M , et ai. (2013) vuorovaikutus Lyve-1 Hyaluronaani solun pinnalla voi olla rooli moninaisuuden Adhesion syöpäsoluihin. PLoS ONE 8 (5): e63463. doi: 10,1371 /journal.pone.0063463

Toimittaja: Nikos K. Karamanoun, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 13 tammikuu 2013; Hyväksytty: 03 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 22, 2013

Copyright: © 2013 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Shanghai komitean Science and Technology (No.10411950500), National Natural Science Foundation of China (81071814, 81172027, 81272479) ja Program Shanghai Aihe Chief Scientist (11XD1404000). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Invasion ja etäpesäkkeiden ovat tärkeimmät biologiset ominaisuudet pahanlaatuisia kasvaimia. Kasvainsolun tarttuvuus on tärkeä rooli tuumorin invaasiota ja etäpesäkkeiden, mukaan lukien yhteyden kasvainsolujen kesken sekä kasvainsolujen muiden solutyyppien kanssa. Siirron kasvainsolujen käsittää adheesion ja erottaminen (adheesio depolymerointi). Varhaisessa vaiheessa tuumori-invaasio, yksittäiset tuumorisolut irtoa primaarikasvaimen johtuen tartunta tekijä menetys, joka tuottaa siirto potentiaalia syöpäsoluja. Aikana keskellä vaiheessa invaasio, kasvaimen soluja, jotka siirrettiin kiertojärjestelmään kiinni verisuonten endoteelisolujen ja soluväliaineen. Tämä prosessi liittyy monia adheesiotekijöitä ja erilaiset muut tekijät, jotka edistävät tai erilliset tarttumista kuten soluadheesiomolekyylit (CD44, kadheriinin). Tämä tutkimus pääasiassa käsitellään ongelmia tarttuvuuden, joissa kasvainsoluissa ja imusolmukkeiden endoteelisolujen.

Hyaluronaani (HA) koostuu lineaarisen toistaa disakkaridiyksiköistä, joka koostuu D-glukuronihapon ja N-asetyyliglukosamiinin ja on ensisijainen komponentti soluväliaineen. Fysiologisissa olosuhteissa, HA on etupäässä jaettu sidekudoksen monien muiden proteiinien muodostaa suuri ja monimutkainen verkko, joka ylläpitää tilaa solujen välillä, kuten limakalvon lamina proprian ja ulomman kalvon ympärille verisuonia ihon jakelu [1], [2 ]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että HA vaikuttaa kasvaimen angiogeneesi, etäpesäke ja invasiivisuus. In vivo tutkimuksissa havaittiin, että ennen maahanmuuttoa, solut lisäsivät HA pitoisuus niiden lähtö- sijainti [3], [4]. Lisäksi, HA-havaittiin kasvavan hyökkäyksen reunalla rintasyöpäsoluissa [5], [6] ja solunulkoisessa ympäristössä [7], joka järjestää uudelleen matriisin invasiivisen syöpäsoluja. Suuri määrä kokeelliset tulokset ovat osoittaneet, että aggressiivinen kasvaimet sisältävät runsaasti HA ja että kohonneet HA kiinteiden kasvainten liittyvät huono kasvaimen erilaistumiseen ja vähentää potilaan eloonjäämisaste. Edellinen tutkimuksissa havaittiin, että lisääntynyt HA tuotti ympäröivän fibroblastien stimulaation jälkeen rintasyöpäsoluissa [8]. Kuitenkin, invasiiviset itse kasvainsoluihin voi myös syntetisoivat HA solun pinnalla. Monet tutkimukset keskittyvät korrelaatio määrän HA kasvainsolun pinnalla sen etäpesäkkeiden ja ovat havainneet, että kyky kasvainsolujen siirtää liittyi niiden pinta-HA-pitoisuus [9], [10]. Itano ja työtovereiden [10] ruiskutettiin laskimoon rintojen soluja, jotka tuottavat HA ja mutantti rintojen soluja, joita ei tuota HA nude-hiiriin. He havaitsivat, että mutantti klooneista pienensi merkitsevästi metastaattisen kyvyn verrattuna emosoluilta laskimoon (i.v.) injektio hiirissä. Ilmentävät hiiri hyaluronaanisyntaasia 1 (HAS1) transfektiolla HAS

– soluja puutteellinen hyaluronaanisyntaasia aktiivisuuden pelastettiin Hyaluronaani matriisin muodostumista sekä Hyaluronaani tuotantoa. Keuhkometastaasitestissä jälkeen i.v. injektio HAS1 transfektanteissa talteen myös merkittävästi. Monet raportit ovat vahvistaneet, että HA sisällön kasvainsolun pinnalla liittyi solun siirtonopeus [9], [10], [11]. Erityisesti korkea pinnan HA aiheuttaa syöpäsolujen siirtää nopeasti, ja alhainen HA tasolla aiheuttaa syöpäsolujen siirtää hitaasti.

Olemassa kirjallisuus tukee suhde HA sisältöä kasvain solun pinnalla ja kasvaimen imusuonten etäpesäke. Kuitenkin sääntelyn kasvain tarttuvuus, imusuonten etäpesäke, ja siirtonopeus solupinnan HA edelleen epäselvä. Tutkimukset koskien siirtäminen veren polku osoitti, että kasvainsolut yhdistettynä verisuonen endoteelisolujen pintaan erityinen koostumus edistää kasvainsolujen ja verisuonten endoteelisolun [12], [13]. Lisäksi kasvaimen siirtonopeus ja tarttuvuus nopeudella olivat positiivisesti. Tutkimukset ovat myös havainneet, että CD44, joka on yleisesti ilmaistu endoteelisolujen pinnan HA-reseptoria, vaikuttaa tarttumista kasvainsolujen ja lymfosyytit. Lymphatic etäpesäke kenttä tutkimukset vahvistivat, että korkeat pinnankorkeuseroa HA hiiren melanoomasoluja edistänyt nopea siirto imusolmukkeisiin, ja pieni pinta tasoja HA hiiren melanoomasoluja korreloi hidas etäpesäkkeitä imusolmukkeisiin [9]. Imusuonten endoteelisoluissa on erityinen hyaluronihappoa reseptorin nimeltään imusuonten endoteelisolujen hyaluronihappoa reseptorin 1 (Lyve-1) [14]. Lyve-1 hypoteesi on vaikutus, joka on samanlainen kuin CD44 veren endoteelisoluissa, mikä helpottaa vuorovaikutuksessa kasvainsolujen pinnan HA: ta ja vaikuttaa kasvainsolujen tarttumista. Kuitenkin mekanismi, jolla tuumori solun pinnan HA toimii Lyve-1 vaikuttaa sen tarttuvuuden ja siirto kasvaimen imusuonten etäpesäkkeitä jää epäselväksi.

Tässä tutkimuksessa, biologisen roolin vuorovaikutusta Lyve-1 ja kasvaimen solun pinnan HA syöpäsolujen tarttumista tutkittiin. HS-578T-soluissa, jotka sisältävät suuria HA pinnallaan (HA

high-HS-578T) ja MCF-7-solut, jotka ovat vähän HA pinnalla (HA

matala-MCF-7) valittiin. COS-7-soluissa, jotka on transfektoitu Lyve-1 (COS-7

Lyve-1 (+)) ja SVEC4-10 solujen (a lymph endoteelisolujen kaltainen solulinja) käytettiin mallit tutkia adheesion vaikutuksesta välillä Lyve -1 ja ilmentävien kasvainsolujen korkea tai alhainen HA. HS-578T-soluihin ja MCF-7-soluissa, kuten ylempi solut, itsenäisesti kiinni alikerros COS-7

Lyve-1 (+) soluja ja COS-7-soluissa, jotka on transfektoitu ohjaus pEGFP-N1 -vektoriin (COS-7-

Lyve-1 (-)) mukaisesti lepo- ja. Tulokset osoittivat, että HA, läsnä kasvainsolujen pinnalla, välittämä adheesio kasvainsolujen COS-7

Lyve-1 (+) soluja ja COS-7

Lyve-1 (-) solut. HA

high-HS-578T rintasyövän soluja oli enemmän sitoutumista COS-7

Lyve-1 (+) kuin COS-7

Lyve-1 (-) solut kautta vuorovaikutusta HA ja imusuonten endoteelisolujen soluspesifisen hyaluronihappoa reseptorin Lyve-1. Lisäksi MCF-7-rintasyöpäsolut, joilta puuttuu solun pinnan HA periaatteessa voi kiinni läpi HA ja Lyve-1 sitoutumista. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös koskevat tarttumista HS-578T-solut tai MCF-7-solujen SVEC4-10 soluihin.

Tulokset

visualisointi Perisellulaarinen Matrix muodostaminen 6 Human Breast Cancer Cells

HA sisältö rintasyöpäsoluissa eroaa huomattavasti; Näin ollen, HA pinnalla visualisoitiin käyttämällä hiukkasia syrjäytymisen määrityksessä. Tässä määrityksessä selvä vyöhyke HS-578T ja MDA-MB-231-solut ja kiinteä punasolujen havaittiin (Fig. 1A, c). Lisäksi, 5 min sen jälkeen, kun Streptomyces hyaluronidaasia lisättiin viljelymaljaan, HA kerrosta oli hajonnut, jolloin punasolut yhteyttä HS-578T ja MDA-MB-231-soluja suoraan (Fig. 1A b, d). Lisäksi nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien työhön [15]. Tuloksemme osoittivat, että MDA-MB-435S, MDA-MB-468, MCF-7, ja SK-BR-3-soluissa, joilla on vähäiset mahdollisuudet HA tuotantoa, ei kuulu kiinteän punasolujen (Fig. 1A e, g , I, k), ja melkein mitään muutosta ei havaittu sen jälkeen kun hyaluronidaasia (Fig. 1A f, h, j, l). Määrällisesti matriisi paksuus, ääriviivat matriisit ja solujen rajojen välillä 10 yksittäistä solua jäljittää. Kerrospaksuus piirrettiin kullekin solulinjan kanssa ja ilman Streptomyces hyaluronidaasia hoitoa (Fig. 1 B). Keskimääräinen suhde kutakin ehto on ilmaistu rekki. Yhdenmukaiset niiden tulosten kanssa hiukkasen ulkopuolelle kokeessa, immunofluoresenssilla (Fig. 1 C) ja virtaussytometria (Fig. 1 D) kokeet samalla tavalla osoittanut, että HA-sisältö solun pinnalla HS-578T ja MDA-MB-231-soluja oli rikas, ja muut neljä soluilla oli pieni pinta-HA-pitoisuus.

(A) visualisointi ja morfometristä analyysiä HA matriiseja suoritettiin käyttäen partikkelin syrjäytymisen määritys ennen ja lisäyksen jälkeen HA-spesifisten Streptomyces hyaluronidaasia. Selkeä vyöhyke oli ilmeinen välillä HS-578T, MDA-MB-231-solujen ja punasolujen (a, c); noin 5 min kuluttua Streptomyces hyaluronidaasia lisättiin soluihin, HA kerrosta hajosivat, jolloin punasolujen yhteyttä HS-578T ja MDA-MB-231-soluja (b, d). Mitään eroa ennen (e, g, i, k) ja sen jälkeen (f, h, j, I) lisäämällä Streptomyces hyaluronidaasia ja MDA-MB-435S, MDA-MB-468, MCF-7, ja SK-BR- 3-soluissa ei havaittu. (B) Pinnan HA retentio määrällisesti suhteena matriisin alueen solun alueella. Yksittäiset rintasyöpäsoluissa jäljitettiin käyttäen Image Pro Plus 6 rajan kirkas vyöhyke laskea matriisin alueella ja solun kehä laskea solun alueella. Coat /solualue suhteet piirretään jakelu, jossa keskiarvo edustaa rekki. (C) immuunijärjestelmän solujen fluoresenssin kokeessa käytettiin havaitsemaan solun pinnan HA. Suhteellinen kirkkaus edustaa HA sisällön solun pinnalla. Voimakas valo oli visualisoida HS-578T ja MDA-MB-231-solujen; valossa neljän muun solutyyppejä oli periaatteessa havaittavissa. (D) HA-pitoisuus arvioitiin myös FACS-analyysillä. Edustaja histogrammit on esitetty solut värjättiin biotinyloidulla HABP ja Alexa 488-leimattua avidiinia HA käsittelemättömissä soluissa (punainen) tai käsiteltyjä soluja Streptomyces hyaluronidaasilla (sininen). Ohjaus solut värjättiin vain Alexa 488 avidiinia (musta).

Breast Cancer Cells HA

high-HS-578T ja HA

matala-MCF-7 Noudata Differently Under Static Edellytykset

Kuten aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, staattinen tartunta kokeilu käytetään usein testata tartuntaa eroa eri molekyylien ja solujen. Tutkia ero kasvainsolun kiinnittyminen COS-7-soluissa se vuorovaikuttaa pinnan HA ja Lyve-1, sitova määritys suoritettiin. Oikea ilmentyminen Lyve-1 COS-7-soluissa vahvistettiin edellisessä tutkimuksessa [16]. HA

high-HS-578T ja HA

low-MCF-7-solut leimattiin DAPI levitettiin COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (- solut) tarkkailla paikallaan noudattamista. Tulokset osoittavat, että monet HS-578T-solut kiin- paikallaan COS-7

Lyve-1 (+) solujen, koska runsaasti HA-molekyylien pinnalla, ja solujen lukumäärä, jotka kiinni pienentää, kun ne vuorovaikutuksessa COS 7

Lyve-1 (-) solut (Fig. 2A, a, b, 2B, e). Aiemmat tutkimukset käyttämällä Streptomyces hyaluronidase ennen sitoutumismääritys osoittivat, että HA osallistuu kasvaimen tartunta [16]. Tämän mukaisesti havainnon, MCF-7-solut, joilla on alhainen pinnan HA sisältöä, ei osoittanut mitään eroa sitoutuminen COS-7

Lyve-1 (+) soluja ja COS-7

Lyve-1 (-) solut (Fig. 2A, c, d, 2B, f). SVEC4-10 solut todennettu imusol- endoteelisolujen-solulinjaa [17], ja ne ovat erilaiset COS-7-soluissa; Näin ollen, testasimme myös tartunta HS-578T-soluihin ja MCF-7-solujen SVEC4-10 soluja, jotka oli todennettu imusol- endoteelisolujen-solulinjaa. Tulokset osoittavat, että sen jälkeen, estää vuorovaikutuksen Lyve-1 ja HA, lievää laskua havaittiin välinen adheesio HS-578T-solujen ja SVEC4-10 solut (Fig. 2C, g-i, 2D, m). Mitään eroa ei havaittu MCF-7-soluissa ja SVEC4-10 solut (Fig. 2C, j-l, 2D, n). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että ero huomattava, että siirtämistä imusuonten ilmentävien kasvainsolujen korkea ja matala HA voi johtua erottuva tarttuvuus Lyve-1 imusolmukkeiden endoteelisoluissa.

(A) kiinni HS- 578T ja MCF-7-solut näkyvät siniset aloilla (a-d). DAPI-leimattua HS-578T-solut olivat kiinnittyneet yksisolukerroksena COS-7

Lyve-1 (+) solujen verrattuna COS-7

Lyve-1 (-). MCF-7 -solut kiinnittyivät vastaavasti sekä COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut. (B) määrälliset arvioinnit HS-578T ja MCF-7-solujen kiinnittymistä yksikerroksista COS-7-solut on esitetty, ja kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmen kuopan tyypillisestä kokeesta ja ne ilmaistaan ​​kertaiseen kasvuun verrattuna COS-7-soluissa, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla pEGFP-N1. * P 0,05 versus osoittaa transfek- pEGFP-N1 vektorisäätö COS-7-soluissa. (C) liimattu HS-578T ja MCF-7-solut näkyvät sinisinä aloilla (g-l). DAPI-leimattua HS-578T-solut olivat kiinnittyneet yksisolukerroksena SVEC4-10 solujen ennen ja jälkeen estää kanssa Lyve-1-vasta-aine, isotyypin vasta-ainetta. (D) kvantitatiivinen arviointeja datan HS-578T ja MCF-7 soluadheesiota annetun yksisolukerroksen SVEC4-10 solujen näkyvät, ja kukin määritys suoritettiin kolmena kappaleena. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmen kuopan tyypillisestä kokeesta ja ne ilmaistaan ​​kertaisesti alentunut suhteessa SVEC4-10 soluihin ilman hoitoa. * P 0,05 versus SVEC4-10 soluja ilman hoitoa.

Breast Cancer Cells HS-578T ja MCF-7 Differentially Noudata alla virtauksen olosuhteiden

Kasvainsolulinja pidätyksen ja muodostumista vakaa liima vuorovaikutukset kasvainsolujen ja endoteelisolujen ovat ratkaisevia askeleita metastaattisen prosessin. Saada lisää tietoa sitovat ominaisuudet rintasyövän solujen COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut, samanlainen tartunta kokeet kuin edellä on kuvattu, suoritettiin käyttäen rinnakkainen levy virtauskammion alle leikkausjännitys olosuhteissa. Diat COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut pantiin yhdensuuntaisten levyjen virtauskammion, ja HS-578T tai MCF-7-solut perfusoitiin fysiologisissa leikkausjännitys. Kuten on esitetty kuviossa. 3 (A, a, b, B, e), joka on samanlainen lisääntynyt tarttuvuus HS-578T-soluissa COS-7

Lyve-1 (+) kuin COS-7

Lyve-1 (-) solut havaittiin matalan virtauksen olosuhteissa (0.1dyn /cm

2); kuitenkin, MCF-7-soluissa edelleen samalla tavalla kiinni sekä COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut (Fig. 3A, c, d, 3B, f) . Tuloksemme osoittivat myös, että sen jälkeen, estää vuorovaikutuksen Lyve-1 ja HA, välinen adheesio HS-578T-solujen ja SVEC4-10 solujen väheni hieman matalan virtauksen olosuhteissa (0,1 dyn /cm

2), kuten on esitetty kuviossa. 3 (C, g-i, D, m). Ei ilmeisten erojen MCF-7-soluissa ja SVEC4-10 solut (ennen ja jälkeen esto) havaittiin (Fig. 3C, j-l, 3D, n).

(A) määrä HS-578T ja MCF-7-solut kiin- COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) soluja 0,1 dyn /cm

2 alhainen leikkausjännitys arvioitiin laskemalla 5 satunnainen näkymät fluoresenssimikroskooppiin kuvia. Noudatetaan HS-578T ja MCF-7-solut näkyvät siniset aloilla (a-d). (B) määrälliset arvioinnit edustavan datan HS-578T ja MCF-7-solujen kiinnittymistä yksikerroksista COS-7-solut on esitetty, ja kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmen kuopan tyypillisestä kokeesta ja ne ilmaistaan ​​kertainen lisäys kontrolliin verrattuna pEGFP-N1 vektori transfektoitiin COS-7-soluissa. * P 0,05 verrattuna osoitti transfektoidut pEGFP-N1 vektorisäätö COS-7-soluissa. (C) määrä HS-578T ja MCF-7-solut kiin- SVEC4-10 soluihin ennen ja jälkeen esto kanssa Lyve-1-vasta-aine, isotyypin vasta-alle 0,1 dyn /cm

2 alhaisen leikkausjännityksen arvioitiin laskemalla 5 random näkymät fluoresenssimikroskooppia kuvia (g-l). (D) kvantitatiivinen arviointeja datan HS-578T ja MCF-7 soluadheesiota annetun yksisolukerroksen SVEC4-10 solujen näkyvät. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kolmen kuopan tyypillisestä kokeesta ja ne ilmaistaan ​​kertaisesti alentunut suhteessa SVEC4-10 soluihin ilman hoitoa. * P 0,05 versus SVEC4-10 soluja ilman hoitoa.

tarttuvuus HS-578T ja MCF-7-soluissa COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut erikseen tehtiin eri voimakkuuksilla leikkausjännitys, ja muutokset määrä liima-soluja mitattiin. HS-578T-solujen annettiin sitoutua Lyve-1-transfektoiduissa ja kontrollisolujen 0,1 dyn /cm

2 2 minuuttia ja altistettiin lisäämällä leikkausjännitys jopa 13,54 dyn /cm

2 (Fig. 4A, B, a). HS-578T-solujen korkean HA pitoisuus pysyi sitoutuneena COS-7

Lyve-1 (+) Yksisolukerros seinällä leikkausjännitys tasoja jopa 5,4 dyn /cm

2 ja alkoivat vapautetaan 13,54 dyn /cm

2. Määrä HS-578T soluadheesiota COS-7

Lyve-1 (+) solujen verrattuna COS-7

Lyve-1 (-) solut oli edelleen korkeampi eikä ilmeisesti muuttaa ennen leikkausjännityksen saavutti 13,54 dyn /cm

2. Ei merkittäviä eroja liikkuvan käyttäytymistä MCF-7-soluissa COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) soluja havaittiin (Fig. 4A, B, b) . Kuitenkin tartunta HS-578T-solujen SVEC4-10 solut (ennen ja jälkeen esto) poikkesi tarttuvuus COS-7-soluissa. Merkittävä väheneminen tarttumista tapahtui vuosina HS-578T-solujen ja SVEC4-10 soluja, jotka olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin IgG

2A Isotyyppikontrollit vasta-aine, kun leikkausjännitys oli 2,7 dyn /cm

2 (Fig. 4C; D c). Lisäksi, ei ole merkittäviä eroja liikkuvan käyttäytymistä MCF-7-solujen SVEC4-10 soluja havaittiin (Fig. 4C, D, d).

HS-578T ja MCF-7-solut perfusoitiin yli COS- 7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut seinällä leikkausjännitysten 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 tai 13,54 dyn /cm

2 2 min. (A) määrä tarttuvien solujen samalla alalla näkyy sininen aloilla. (B) Tulokset on esitetty solujen suhteellisen määrän HS-578T-soluja (a) ja MCF-7-solut (b) jää COS-7

Lyve-1 (+) (punainen viiva) ja COS-7-

Lyve-1 (-) (sininen viiva) soluja. HS-578T ja MCF-7-solut perfusoitiin yli yksisolukerroksena SVEC4-10 solujen ennen ja jälkeen estää kanssa Lyve-1-vasta-aine, isotyypin vasta-aineen seinän leikkausjännityksiä 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 tai 13,54 dyn /cm

2 2 min. (C) määrä tarttuvien solujen samalla alalla näkyy sininen aloilla. (D) tulokset on esitetty solujen suhteellisen määrän HS-578T-soluja (c) ja MCF-7-solut (d) vangiksi SVEC4-10 soluja salvattiin Lyve-1 (sininen viiva), SVEC4-10 solut blokataan isotyyppikontrolli (punainen viiva) ja SVEC4-10 soluihin ilman hoitoa (musta viiva). Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD solujen määrä sidottu. Tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta.

Korkean HA-ilmaiseminen Syöpäsolut Form Hyaluronaani Kaapeli Structures

HA kaapelit voivat olla sama kyky aktivoida Lyve-1 niiden kykyä aktivoida CD44 in vivo [18], ja tuloksemme sekä havainnot aiempien raportit osoittivat, että jotkut kasvain pinnat sisältävät runsaasti HA. Se oli kuitenkin epäselvää HA pinnalla kasvainsolujen kehittyä kaapeli rakenteisiin ja osansa aktivoimisessa Lyve-1. Tämän vuoksi yritimme käyttää immunofluoresenssilla havaita HA kaapelit kasvainsolujen pinnalla. Kunnes kasvaimen solut saavuttivat 100% konfluenssiin, biotinyloitu HABP lisättiin soluihin havaitsemaan HA jakeluun. Tulokset osoittivat, että rintasyövän soluja HS-578T ja BT-549, keuhkosyöpä 95-D-soluissa, kohdunkaulan karsinooma HeLa-solut, paksusuolen syöpä RKO soluja, ja keuhkojen A549-solujen kaikilla sisältää korkeita HA ja kehittää kaapeli rakenteita (kuvio . 5), jotka on aiemmin raportoitu esiintyvän HK2 soluissa. Käytön jälkeen Streptomyces hyaluronidaasia hajottamaan HA kasvaimen pinnalla, HA kaapelit HK2 soluja katosi (Fig. 5). Samoin HA kaapelit muut solut olivat myös poistettiin Streptomyces hyaluronidaasia pilkkomalla (tuloksia ei ole esitetty). HA kaapeleita ei myöskään havaittu MCF-7-soluissa, jotka on alhainen pinta-HA.

yksisolukerros soluja kasvatettiin, kun läsnä on 10% (v /v) FCS ennen kiinnitystä metanolilla ja havaitsemiseen HA lisäämällä bHABP. Leikkeitä kuvantaa käänteinen fluoresenssimikroskopialla (× 20 tavoite). HA kaapelit on korostettu valkoisilla nuolilla. Alkuperäinen suurennus × 20. Streptomyces hyaluronidaasia lisättiin soluihin ennen kiinnitystä. HA-kaapelit hajosivat ilman havaitsemista.

Keskustelu

Tämä tutkimus on osoittanut, että HA-välitteisen mekanismi säätelemällä tarttumista kasvainsolujen imusolut endoteelisoluissa. Merkittävä ero havaittiin tarttumista rintasyövän solulinjan HS-578T, joka ilmentää suuria määriä HA, jossa COS-7

Lyve-1 (+) solujen kanssa; sen sijaan, COS-7

Lyve-1 (-) solut, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla pEGFP-N1, eivät osoittaneet tämän muutoksen mukaisesti sekä staattisia että virtauksen olosuhteissa. MCF-7-soluja, joista puuttuu HA pinnallaan kiinni samalla tavalla COS-7

Lyve-1 (+) soluihin, kuten COS-7

Lyve-1 (-) solut. Hieman muutos havaittiin myös tarttumista HS-578T-solujen SVEC4-10 soluihin ennen ja lisäyksen jälkeen estävän vasta-aineen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että HA kasvaimen pinnalla voi osallistua rintasyövän tuumorimetastaasissa vaikuttamalla sitomalla Lyve-1 lymph aluksen endoteelisoluihin.

Early etäpesäke imusolmukkeisiin on usein komplikaatio ihmisen rintasyöpä. Aiempien raporttien, me seulotaan HA 6 tyyppisiä rintasyöpä solujen, erittäin metastaattinen solulinjat HS-578T [19], [20] ja MDA-MB-231 [21], [22], [23] kohtalaisen metastaattinen solulinjat MDA-MB-435S [21], [23], ja MDA-MB-468 [24], [25], ja vähän tai ei metastaattinen MCF-7 [23], [25], [ ,,,0],26] ja SK-BR-3 [19], [27] kautta klassisen hiukkasen syrjäytymistä kokeessa in immunofluoresenssilla kokeilu, ja virtaussytometrinen analyysi. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [28], huomasimme, että HS-578T ja MDA-MB-231-solujen sisältää korkeita HA pinnallaan, kun HA tasoja pinnalla MDA-MB-435S, MDA-MB-468, MCF -7, ja SK-BR-3-soluja tuskin havaittiin. HA kasvaimen pinnalla on osoitettu liittyvän kasvaimen imusolmukkeiden etäpesäke; Siksi me pohdittava miten HA läsnä kasvaimen pinnalla osallistuu tähän prosessiin. Edelleen tutkia biologisen toiminnan HA kasvaimen imusuonten etäpesäkkeitä, päätimme korkean HA-ilmentävien solujen HS-578T ja vähän HA-ilmentävät MCF-7-solujen tutkia HA fl uences kapasiteetin kasvainsolujen kiinni COS-7

Lyve-1 (+) solujen ja SVEC4-10 soluja.

Lyve-1, joka on solun pinnan reseptori HA lymfaattiseen endoteeliin, on osoitettu korreloivan korkean taajuuden alueellisten imusolmukkeiden etäpesäkkeiden [29], [30]. Tutkijat muista laboratorioista ovat osoittaneet, että peritumoraalista imusuonten tietyntyyppisissä kohdunkaulan sisältävät kasvain emboli koristeltu hyaluronaania onteloon, ja he ehdottivat, että kasvaimen solut tyhjennys lymphatics voivat sitoa HA, aiheuttaen vuorovaikutus astian seinämän kautta CD44 /HA /Lyve-1 vuorovaikutusta [31]. Suoraan tutkia, onko Lyve-1-HA vuorovaikutus vaikuttaa kasvaimen imusolmukkeiden etäpesäkkeiden, tutkimme liima kyky kasvainsolujen (eri HA sisältö) Lyve-1-positiivisia soluja. Meidän staattista sähköä määrityksessä osoitti, että Lyve-1 parantaa tarttumista HS-578T-soluissa COS-7-solujen kautta, hyaluronaani, joka on aikaisemmin raportoitu [16]. Kuitenkin myös alhainen HA pitoisuus kasvainsoluissa tuottaa vuorovaikutus Lyve-1 läpi muita tekijöitä vaikuttaa kasvain soluadheesion on vielä epäselvä. Olemme myös suorittaa staattisen kitkakertoimen kokeilla MCF-7-soluja ja COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-) solut. Esillä oleva tutkimus osoitti, että Lyve-1 ei lisännyt tarttuvuutta MCF-7-soluja, joista puuttuu HA niiden pinnalla COS-7-soluissa. Lisäksi, jotta paras malli tarttumista kasvainsolujen imusolut endoteelisolujen, käytimme SVEC4-10 solujen toistaa tarttumista. Vain hieman pienemmät jälkeen havaittiin käyttäen estävää vasta-ainetta, joka voi aiheuttaa rajoitettu vuorovaikutus HA ja Lyve-1 SVEC4-10 soluissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että eri HA kasvainsolujen vaikuttaa niiden etäpesäkkeitä lymfajärjestelmään. Korkeat HA tasoilla HS-578T-solut edistävät sitoutumisen Lyve-1 ja tarttuvuus, ja solut voidaan jopa vedetyksi imunestejärjestelmän.

Liikkuvan vuorovaikutus on edellytys sukupolven korkean lujuus molekyylien välisiä sidoksia ja hyvä pysyvyys [32]. Stabiilisuuden määrittämiseksi liima vuorovaikutuksia, hydrodynaaminen in vitro virtauskammion kokeissa käytetään usein [33], [34]. Esillä olevassa tutkimuksessa, tutkia vaikutus virtaus tarttuvuutta HA

high-HS-578T-solujen ja HA

matala-MCF-7-solujen COS-7

Lyve-1 (+) ja COS-7

Lyve-1 (-), solut altistettiin kasvaa progressiivisesti nesteen leikkausjännitys. Tulokset osoittivat, että HA vuorovaikutus Lyve-1 oli kohtalaisen voimakas välittämisessä tarttumisen olosuhteissa fysiologisen leikkausjännityksiä 2,7 dyn /cm

2. Luja liitos määriteltiin solujen kyky vastustaa irtoaminen seinään leikkausjännitys 10 dyn /cm

2, kuten aiemmin on raportoitu [33]; Näin ollen, numerot kiinnittynyt HS-578T-solujen vähentynyt stressi nousi 13,54 dyn /cm

2, mutta ne olivat edelleen osittain sitoutunut COS-7

Lyve-1 (+) solujen verrattuna COS-7-

Lyve-1 (-) solut. Lisäksi tulokset osoittivat, että HA: n vuorovaikutus Lyve-1 SVEC4-10 soluja heikko verrattuna vuorovaikutusta COS-7-soluissa, koska määrä kiinnittynyt HS-578T-solut ilmeisesti laskenut alle fysiologisen leikkausjännitys 2,7 dyn /cm

2. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HA edistää suhteellisen heikko ja ohimeneviä adheesio kasvainsolujen imusolut endoteelisoluja olemalla vuorovaikutuksessa Lyve-1, joka voi myös ehdottaa niiden roolit kasvainsoluissa liikkuvan pitkin endoteelin alla lymph flow. Kontrollina, HA

low-MCF-7-solut altistettiin myös COS-7-soluissa ja SVEC4-10 soluja, mutta ei merkittäviä muutoksia tarttumista käyttäytymistä MCF-7-soluissa sekä solujen havaittiin tahansa leikkausnopeudella voima.

Teettämä Jackson PO [35] osoitti, että Lyve-1 oli toiminnallisesti ”vaiennettu” soluun sifisistä ja että HA-proteiini kompleksit kuten HA kaapelit voivat olla sama kyky aktivoida Lyve -1 se pystyy aktivoimaan CD44 in vivo [36], [37], [38]. Ensimmäistä kertaa, nykyinen tutkimus antaa näyttöä jakeluun ja morfologia HA kasvainten solujen pinnalla. Meidän tutkimuksessa todettiin, että HA kaapelit olemassa joitakin kasvainsolujen pintoja ja että HA ylitetään kaapeleita solun pinnalla kasvaimet voivat aktivoida Lyve-1. Kuitenkin, joka perustuu julkaisemat tulokset Jung San Huang, HA stimuloi supistuminen ER verkon imusuonten endoteelisolujen Lyve-1-riippuvaisella tavalla [39], ja uskotaan, että HA sitoutuu Lyve-1 imusolmukkeiden endoteelisolujen soluja, jotka oli kanssa tuloksemme. Nämä ristiriidat voivat johtua eri havaitsemismenetelmät tutkimuksissa käytetty. Kuitenkin HA pinnalla kasvainsolujen voivat vaikuttaa kasvain tarttuvuus läpi vuorovaikutus Lyve-1 löytyy imusuonten endoteelisoluissa.

Yhteenvetona tulokset antavat meille mahdollisuuden ymmärtää paremmin taustalla olevaa mekanismia sääntelyä HA kasvainsolun pinnat ja adheesiota syöpäsoluja. HA kasvainsoluihin välittää niiden tarttuvuus kautta imusuonten endoteelisolujen HA reseptori Lyve-1. Tartuntalujuus riippuu määrästä HA läsnä tuumorisoluissa; kuitenkin, tämä mekanismi on merkitystä vain alussa prosessin, ja monet kysymykset jäävät epäselviksi. Esimerkiksi, ei tiedetä, onko kasvain solun pinnan HA liittyy HA synteettinen entsyymi, HA hajoamista entsyymin tai muita molekyylejä. Lisäksi on epäselvää, HA kaapelit aktivoida Lyve-1 imusuonten. Edelleen työtä tällä alalla on käynnissä laboratoriossamme.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja tarvikkeet

Biotinylated HABP (hyaluronaani sitova proteiini, HABP) ostettiin Merck (Darmstadt , Saksa). TRITC avidiinia saatiin Boster (Wuhan, Kiina). Alexa Fluor® 488-konjugoitu streptavidiini hankittiin Life Technologies (Carlsbad, USA). Hiiren Lyve-1-vasta-aineen ja rotta IgG

2A Isotyyppikontrollit ostettiin R & D systems (Minneapolis, USA). DMEM, RPMI-1640, L-15 ja F-12k hankittiin Gibco (Tukholma, Ruotsi). Naudan sikiön seerumia (FBS) saatiin Hyclone (Lanzhou, Kiina).