Krooninen sairaus

tiivistelmä

L-asparaginaasi, jolla on matala gluta- on ollut keskeinen terapeuttisena aineena hoidettaessa akuuttia lymphpoblastic leukemia (A.L.L). Esillä olevassa tutkimuksessa, solunulkoisen L-asparaginaasi, joilla on alhainen gluta- aktiivisuutta, joka on tuotettu

Bacillus licheniformis

puhdistettiin homogeeniseksi. Proteiini todettiin olevan homotetrameerinä 134,8 kDa monomeeristen koko 33,7 kD ja hyvin erityinen sen luonnollisen substraatin

ts.

L-asparagiinia. Aktiivisuus puhdistettua L-asparaginaasi parannettu läsnä kationien kuten Na

+ ja K

+, kun taas se oli kohtalaisen esti läsnäollessa kaksiarvoiset kationit ja tioliryhmän Estoreagenssien. Puhdistettua entsyymiä oli mahdollisimman aktiivinen yli pH-alueella 6,0-10,0 ja lämpötila 40 ° C, ja entsyymi oli stabiili enintään pH: ssa 9,0 ja 20 ° C: ssa. CD-spektrit L-asparaginaasi ennusti entsyymi koostuvan 63,05% α- Helix ja 3,29% β-levyt sen alkuperäisessä muodossa T

222 58 ° C. Fluoresenssispektroskopia osoitti proteiinin olevan vakaa vaikka läsnä yli 3 M GdHCl. Kineettiset parametrit K

m, V

max ja k

kissa puhdistettua entsyymiä löydettiin 1,4 x 10

-5 M, 4,03 IU ja 2,68 x 10

3 s

– 1, vastaavasti. Puhdistettu L-asparaginaasi oli sytotoksinen vaikutus eri syöpä solulinjoja

eli.

Jurkat klooni E6-1, MCF-7 ja K-562 IC

50 0,22 IU, 0,78 IU ja 0,153 IU vastaavasti . Kuitenkin entsyymi ei ollut myrkyllinen vaikutus ihmisen erytrosyyttien ja CHO-solulinjat vuoksi olisi pidettävä mahdollisena edelleen farmaseuttiseen käyttöön, kuten syöpälääkkeen.

Citation: Mahajan RV, Kumar V, Rajendran V, Saran S, Ghosh PC, Saxena RK (2014) puhdistus ja karakterisointi Novel ja Tukeva L-asparaginaasi ottaa Low-gluta- Activity päässä

Bacillus licheniformis: In vitro

Evaluation of Anti-syöpä Properties. PLoS ONE 9 (6): e99037. doi: 10,1371 /journal.pone.0099037

Editor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2014; Hyväksytty: 09 toukokuu 2014; Julkaistu: 06 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Mahajan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tekijä Richi V. Mahajan ansiosta neuvoston tieteellisen ja teollisen tutkimuksen (CSIR), New Delhi, yhdessäoloon tukea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, kulut kokeilu laitteiden ja kemikaalien, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

kyvyttömyys leukemiasolujen syntetisoida omaa L-asparagiinia on tehnyt entsyymi L-asparaginaasi keskeinen osa kemoterapian hoidossa akuutti lymfaattinen leukemia (ALL) [1] [2]. Tämä entsyymi hydrolysoi L-asparagiini tulee L-asparagiinihappo ja ammoniakkia verisuonisto, jolloin leukemiasolujen vailla olennaisia ​​eksogeenisen L-asparagiinia, mikä johtaa proteiinisynteesin inhibitio ja apoptoosin [3] – [5], mikä tekee tämän entsyymin voimakas anti-syöpä agentti.

nykyinen kaupallinen tarjonta L-asparaginaasi on pääasiassa johdettu

E. coli

ja

Erwinia chrysanthemi

mutta lääke näistä lähteistä ovat vahvasti immunogeenisiä siten neutraloivat terapeuttista vaikutusta ja aiheuttaa oireita yli 50% syöpätapauksista [6]. Myös monet tutkimukset ovat havainneet kasvu potilaiden määrä kliinisen resistenssin markkina lääke [6] – [8]. Kaupallinen L-asparaginaasi havaittiin

in vitro

vastustusta solut, joilla on uusiutunut A.L.L [9]. Toinen ongelma liittyy kaupallisten L-asparaginases on sen alhainen substraattispesifisyys ja korkea gluta- aktiivisuus, joka voi aiheuttaa maksan toimintahäiriöitä, haimatulehdus, leukopenia, neurologiset kouristukset, ja hyytyminen poikkeavuudet johtavat kallonsisäinen veritulpan tai verenvuoto [10]. Siksi on olemassa tarve uusille ja vankka L-asparaginases peräisin GRAS (

yleisesti turvallisina

) mikro-organismeja, mikä on parantanut vakautta, alempi gluta- aktiivisuus suurella alustaan ​​affiniteetilla, alhainen K

m arvo ja riittävä puoli -Life fysiologisissa olosuhteissa niin, että se voi voittaa edellä mainitut haasteet nykyisessä tilanteessa.

näin ollen, esillä olevassa tutkimuksessa on kohdistettu puhdistamiseksi L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM-8 (maaperä Eristä), joka on vahvistettu olevan uusi L-asparaginaasi ja on arvioitu sen biofysikaalisiin ja biokemialliset ominaisuudet ja sen mahdollisuuksia syöpälääke vastaan ​​eri ihmisen syövän solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto:

verinäytteet nykyisessä työssä saatiin Rotary veri Blank, New Delhi lahjana ja nämä verinäytteet ovat kaupallisesti saatavilla Rotary veripankin tutkimustarkoituksiin. Eettinen komitea hyväksyntä ei ole välttämätöntä saamiseksi ihmisverta tutkimustarkoituksiin. Olemme käyttäneet ihmisverta tutkimustarkoituksiin saatu Rotary veripankin ja julkaistiin samana aiemmin [11].

2.1 Kemikaalit

Kemikaalit käytetään entsyymin puhdistus (kromatografisen matriisit) ja luonnehdinta hankittiin Sigma Aldrich. Nesslerin reagenssi hankittiin Fluka (Buchs, Sveitsi). L-asparagiini hankittiin Spectrochem (Intia). Kaikkien käytettävien kemikaalien tuotannossa olivat analyyttistä laatua ja ostettiin Hi-Media (Intia). Kemikaalit ja käytettäviä merkkiaineita natiivi ja SDS-PAGE saatiin BioRad.

2.2 L-asparaginaasi Production

L-asparaginaasi tuotanto

Bacillus licheniformis

RAM-8 (maaeristettä ; tunnistettu perusteella 16 s RNA ja 500 emäsparin analyysi, Midi-labs, USA) suoritettiin optimoitu muutettu Czapek Dox väliaineessa [12]: Na

2HPO

4, 6 g /l; KH

2PO

4, 2 g /l; NaCl, 0,5 g /l; L-asparagiini, 20 g /l; glyseroli, 2 g /l; MgSO

4.7H

20, 0,2 g /l; CaCl

2,2H

2O, 0,005 g /l. Pullot, jotka sisältävät tuotanto väliainetta (50 ml 250 ml: n pullossa), ympättiin 2% ymppi (v /v) (O.D. 2,0). Inkubointi suoritettiin 37 ° C: ssa 200 rpm 24 tuntia. Entsyymi tuotanto oli solunulkoinen ja entsyymin aktiivisuus määritettiin käyttämällä viljelmän suodoksesta. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja keskimääräiset arvot standardipoikkeamaa (SD) laskettiin.

2,3 entsyymianalyysi

määritys entsyymin suoritettiin kohti nesslerization menettely antaa Shirfrin

et al

. [13], käyttäen 189 mM L-asparagiini substraattina tai toisin mainita, 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 8,6) ja lukemalla absorbanssi 436 nm: ssä. Ammoniumsulfaattiliuosta käytettiin valmistuksessa standardikäyrää. Yksi kansainvälinen yksikkö (IU) asparaginaasiaktiivisuuden määritellään se määrä entsyymiä tarvitaan vapauttamaan yksi umol ammoniakkia per ml minuutissa pH: ssa 8,6 37 ° C: ssa.

2,4 Enzyme Purification

2.4.1 Ultrasuodatus.

solun fermentointiliemi ultrasuodatettiin membraanin patruuna 30 kDa: n poistamiseksi alemman proteiinien ja keskittää haluttua proteiinia. Retentaatin ja permeaatin kerättiin ultrasuodatuksen jälkeen analysoitiin L-asparaginaasiaktiivisuuden ja proteiinipitoisuus käyttäen Bradfordin menetelmällä [14].

2.4.2 Asetoni sademäärä.

Jäähdytetty asetonilla (-20 ° C) oli lisätään konsentroitiin liemi jatkuvasti sekoittaen 4 ° C: ssa gradientilla pitoisuus 20-80%, proteiinien saostamiseksi. Fraktiot, jotka osoittavat maksimi aktiivisuutta sentrifugoitiin ilmakuivattiin ja liuotettiin pieneen määrään 50 mM Tris-HCl (pH 8,6) ja dialysoitiin samaa puskuria vastaan, jolloin saadaan konsentroitu proteiini.

2.4.3 DEAE-selluloosan avulla.

konsentroitu entsyymi pantiin dietyyliaminoetyyli selluloosaa (DEAE selluloosa) (4 x 60 cm), joka oli tasapainotettu 50 mM Tris-HCI: ää (pH-8,6). Pylväs pestiin 2 tilavuudella lähtöpuskuria ja proteiini eluoitiin lineaarisella NaCI-gradientilla (0-0,5 M), joka valmistettiin fosfaattipuskurissa, pH-7,4 nopeudella 60 ml tunnissa. Jakeet osoittavat L-asparaginaasiaktiivisuuden yhdistettiin yhteen dialysoitiin 50 mM Tris-HCL (pH-8,6) ja väkevöitiin Työtason proteiinia keskitin 4 ° C: ssa.

2.4.4 geelisuodatus.

konsentroitu entsyymi lisättiin päälle Sephadex G-100-pylvästä (4 x 60), cm, joka oli tasapainotettu 50 mM Tris-HCl (pH-8,6), ja eluoitiin samalla puskurilla virtausnopeudella 0,5 ml per minuutti. Jakeet osoittavat L-asparaginaasiaktiivisuuden yhdistettiin ja dialysoitiin samaa puskuria ja lyofilisoitiin penkki alkuun lyofilisaattoria. Homogeenisuus Proteiinin tarkastettiin SDS ja natiivi-PAGE.

2.5 karakterisointi Puhdistettu L-asparaginaasi

2.5.1 määritys molekyylipaino.

Puhdistettu L- asparaginaasi levitettiin ja Sephacryl ™ S-200 korkean resoluution pylvääseen (Pharmacia, 16/60), joka oli tasapainotettu 50 mM tris-HCl (pH-8,6) ja eluoitiin virtausnopeudella 0,5 ml minuuttia kohden [15]. Standardi molekulaarinen merkkiaine proteiinit pylvääseen ja eluutiotilavuus (V

e) kunkin markkerin proteiinia ja huokostilavuus (V

o) kolonnin kirjattiin. Molekyylimassa proteiinin määritettiin semi-log kuvaajan piirtämällä V

e /V

O X-akselilla ja logaritmi molekyylipainon Y-akselilla.

2.5.2 pH: n vaikutus sekä lämpötilan aktiivisuutta ja stabiilisuutta entsyymin.

aktiivisuus L-asparaginaasi arvioitiin eri pH-arvoissa ja lämpötila. Optimaalinen pH-L-asparaginaasi aktiivisuus määritettiin pH-alueella on 4 10. pH-stabiilisuus tutkimuksissa entsyymivalmisteita inkuboitiin pH: ssa 4-10 ja 24 h 4 ° C: ssa ja jäljelle jäänyt aktiivisuus määritettiin määritysolosuhteissa ( pH 8,6, 50 mM). Optimaalinen lämpötila-alue entsyymin aktiivisuus määritettiin suorittamalla entsyymin määritys eri lämpötiloissa, jotka vaihtelevat 25-65 ° C. Lisäksi lämpöstabiilisuus entsyymiä määritettiin inkuboimalla lyofilisoitu entsyymiä eri lämpötiloissa

nimittäin

-20 ° C: ssa, 4 ° C, 10 ° C, 30 ° C ja 60 ° C: ssa 30 päivää.

2.5.3 Substraattispesifisyys.

entsyymivaikutuksia arvioitiin eri amidien substraatteina,

eli.

L-asparagiinia, D-asparagiini, L-glutamiini, D-glutamiini, L -aspartaamihappo, D-asparagiinihappo, L-glutamiinihappo, L-ornitiini ja urea, pitoisuuksina 10 mM, vastaavasti. Tuloksia esiteltiin prosentuaalisesti suhteellisen aktiivisuuden.

2.5.4 Vaikutus erilaisten metalli-ionien, seerumin komponentteja ja estäjien entsyymiaktiivisuuden.

Effect eri epäorgaanisten ionien entsyymin aktiivisuus määritettiin esi-inkuboimalla entsyymiä eri suoloja konsentraatio 100 mM: ssa 6 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Myös vaikutus seerumin, seerumin komponentit ja inhibiittorit (sulfhydryyli- ja seriini), määritettiin inkuboimalla entsyymiä efektori konsentraatio 10 mM: ssa 6 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Tuloksia esiteltiin prosentuaalisesti suhteellisen aktiivisuuden.

2.5.5 Kinetiikassa.

V

max,

K

m

,

k

kissa, ja

k

cat /

K

m

määritettiin 25 ° C: ssa käyttäen L-asparagiinia substraattina on pitoisuuksina, jotka ovat 2-20 mM kanssa jatkuvasti entsyymin pitoisuus on 1 mg /ml. Alkuperäinen vaihtuvuus kymmenellä eri pitoisuuksilla alustan laskettiin, ja tyyppi eston ja Michaelis-Menten parametrit määritettiin Lineaweaver-Burk tontteja yhtälöstä johdettu lineaarisen regressioanalyysin käyrä.

k

kissa arvo laskettiin käyttämällä yhtälöä

k

cat =

V

max /[E], jossa [E ] on entsyymin konsentraatio määrityksessä. k

kissa ja spesifisyys vakiot (k

cat /K

m) on laskettu yhden aktiivisen kohden 33,7 kD alayksikköä kuten on kuvannut Kumar

et al

. [16].

2.5.6 Sirkulaaridikroismispektrejä.

CD-spektrit rekisteröitiin JASCO J-815-spektropolarimetrillä (JASCO Corporation, Hachioji-shi, Tokio, Japani) käytetään lieriömäistä kvartsikennoon polku pituus 1 mm ja 1 cm, vastaavasti, pitkälle ja läheltä piti UV-alueella. Muutokset toisen ja kolmannen asteen proteiinin rakenne seurattiin kaukana ja lähellä -UV välisellä alueella 190-260 nm ja 260-320 nm. Kolme peräkkäistä spektrin skannaukset laskettiin keskiarvo ja korjataan vähentämällä vastaavat aihioita ja alistettiin melun vähentämiseen. Kehittymässä siirtyminen kuvio puhdistettiin L-asparaginaasi seurattiin UV: CD-spektroskopia, jossa muutokset signaalin intensiteetti 222 nm piirrettiin vastaan ​​lämpötilan funktiona.

2.5.7 Fluoresenssispektroskopia.

Fluoresenssimittaukset suoritettiin käyttäen Eclipse Cary Varian UV-Vis-spektrofluorometrillä (Varian, Inc: Hansen Way, Palo Alto, CA, USA) on kiinnitetty Peltier lämpötilan säädin. Eksitaatioaallonpituudella 280 nm ja eksitaatio raon 5 nm ja emissio-raon 5 nm ja käytettiin fluoresenssi rekisteröitiin 300 nm: sta 400 nm. Kehittymässä kuvio ja vakautta proteiinin määritettiin käyttäen 0-6 M guanidiini-HCl: a (GdHCl), kuten on kuvattu Bansal

et ai.

, [17]. Fluoresenssin intensiteetin piirrettiin toiminnan taajuusalue F

400 nm kuin lähtötilanteessa.

2.5.8 N-terminaalin sekvensointi L-asparaginaasi.

Jotta vahvistamiseksi proteiinin identiteetti, proteiinin vastaavien näytteiden molekyylimassa on 33,7 kDa SDS-PAGE blotattiin polyvinyylifluoridista (PVDF) kalvo (Sigma-Aldrich, USA) ja sille suoritettiin N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritys käyttäen automaattista proteiinia sekvensseri PPSQ31A (Shimadzu, Japani).

2,6 Anti-kasvain soveltaminen L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

2.6.1 Solut ja soluviljelmä olosuhteissa.

Syöpää ehkäisevät ominaisuudet puhdistettua L-asparaginaasi arvioitiin eri ihmisen kasvainsolulinjoihin

eli.

Jurkat klooni E6-1, MCF-7 ja K-562 (hankittu väärennöskeskukset, Pune). Jurkat-solut ja K-562, kasvatettiin suspensiona RPMI-1640-elatusaineessa ja MCF-7 kasvatettiin DMEM, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää (Sigma), penisilliiniä (100 ug /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml ). Soluja ylläpidettiin täysin kostutetussa ilmakehässä, 95% huoneilman ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

2.6.2 Solujen elävyys mittaus.

Antiproliferatiivistä vaikutus L-asparaginaasi mitattiin kolorimetrisellä määrityksellä, joka mittaa vähentäminen keltaista 3- (4,5-dimethythiazol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) mitokondrion sukkinaattidehydrogenaasi liukenemattomaan, värillinen ( tumma violetti) formatsaanituotetta joka liuotetaan orgaaniseen liuottimeen ja mitattiin spektrofotometrisesti. Lyhyesti, solut maljattiin solutiheyteen 1 x 10

4 solua /hyvin tasapohjainen 96-Well standardin mikrotiitterilevyillä. Puhdistetun L-asparginaasista (100 IU /mg) tehtiin laimennossarja epätäydellinen väliaineessa ja lisättiin soluviljelmiin lopullisessa konsentraatiossa 0,75-25 ug /ml. Kun oli inkuboitu 24 tunnin ajan, lisättiin 20 ui MTT pitoisuudessa 5 mg /ml fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS, pH 7,4) lisättiin kuhunkin kuoppaan. 4 tunnin kuluttua inkuboinnin levyjä sentrifugoitiin 2000 rpm: llä 10 minuutin ajan, minkä jälkeen levyt nopeasti ylösalaisin lujalla pyyhkäisemällä kasvualustan poistamiseksi. Liuottamiseksi formatsaanisakka saostumat lisäämällä 150 ui 1:01 sekoitus etanolin ja DMSO: iin lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin edelleen 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Absorbanssi määritettiin sitten spektrofotometrisesti mikrolevynlukijalla Tecan ääretön 200 pro, on testi aallonpituudella 550 nm ja viite 620 nm.

2.6.3

In vitro

hemolyysin testi.

puhdistettu L-asparaginaasi testattiin in vitro hemolyysin inkuboimalla kasvavia konsentraatioita entsyymin (6,25 100 ug), hepariinilla ihmisen kokoverta (saatu Rotary veri Bank, New Delhi) fosfaattipuskurissa ( pH 7,2) 24 tunnin ajan, kuten on kuvattu Lubran [18]. Reaktio lopetettiin lisäämällä 2,5% glutaraldehydiä 24 tunnin inkuboinnin ja sitten sentrifugoitiin. Supernatantti luettiin 540 nm vastaan ​​negatiivinen kontrolli eli näyte ilman entsyymiä. Valmistelu ihmisverta kahdesti tislattua vettä, käsiteltiin positiivisena kontrollina.

Tulokset

3.1 puhdistaminen L-asparaginaasi ja Molecular Mass määrittäminen

vaiheittainen puhdistus L- asparaginaasi alkaen

Bacillus licheniformis

RAM-8 on esitetty taulukossa 1 ja kuvassa 1a. Sarjan kromatografiavaiheiden olivat erittäin tehokkaita ja antoi yleinen puhdistus 33-kertaiseksi. Lopullinen proteiinipitoisuus puhdistettua L-asparaginaasi oli 15,25 mg, jossa tuotto 32,95%. Spesifinen aktiivisuus puhdistettiin entsyymi oli 697,09 IU /mg proteiinia. Proteiini todettiin molekyylikoon 134,8 kDa (kuvio 1 b), kuten määritetään geelisuodatuskromatografialla ja monomeerinen koko 33,7 kDa varmistettiin SDS-PAGE: lla. Teoreettinen IEF entsyymin laskettiin olevan 5,48.

3,2 pH: n vaikutus ja Lämpötila Toiminta ja Stability of L-asparaginaasi

Puhdistettu L-asparaginaasi maasta

Bacillus licheniformis

RAM-8 oli aktiivinen laajalla pH-alueella 6-11 mahdollisimman aktiivisuus pH: ssa 9 (kuva 2a). On ilmeistä kuviosta 2c, että puhdistettua entsyymiä on aktiivinen lämpötila-alueella 30-50 ° C, ja se osoitti jyrkkä kunnon aktiivisuuden yli 60 ° C: ssa. Myös entsyymi oli maksimaalisesti stabiili pH-alueella 7,0-9,0 yli 24 tunnin aikana (kuva 2b). Paras lämpötila entsyymin varastointia havaittiin olevan -20 ° C: seen, jossa se oli vielä stabiileja 30 päivää pitää (kuvio 2d).

100% aktiivisuus vastaa 140 U entsyymiä. Virhepalkit edustavat SD kolmesta kokeesta.

3,3 vaikutus metalli-ionien, seerumin komponentit ja inhibiittorien L-asparaginaasi Activity

On ilmeistä kuviosta 3a, että entsyymin aktiivisuus parantaa huomattavasti läsnäollessa eniten yksiarvoisten kationien ja oli maksimaalinen läsnäollessa Na

+, K

+ ja Mg

++. Kuitenkin muut kaksiarvoiset kationit oli haitallinen vaikutus entsyymiaktiivisuuden. Entsyymi säilytti yli 80% aktiivisuudesta, kun läsnä seriiniproteaasiestäjien eli. PMSF PBA siten osoittaa, että se ei ole seriini hydrolaasi. Oli lasku 60% aktiivisuus L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM-8: n läsnä ollessa sulfhydryyli estäjiä. Lisäksi, dissosioidaan aineita urean ja EDTA inhiboi 70% (kuvio 3b).

100% aktiivisuus vastaa 140 U entsyymiä. Virhepalkit edustavat SD kolmesta kokeesta.

Kuitenkin puhdistettiin L-asparaginaasi oli vahvaa fysiologisessa pH: ssa ja lämpötilassa, mutta entsyymin aktiivisuus vähenee noin 40%, kun puhdistettua L-asparaginaasi inkuboitiin ihmisen seerumi ja sen osat vastaavasti alle

in vitro

edellytykset 48 tunnin jossa on yksityiskohtainen arviointi se on saatu, että laktaatti, oxylate ja pyruvaatti näytteillä yli 70% eston (kuvio 3c).

3.4 Alustan spesifisyys

puhdistettu L-asparaginaasi oli korkea spesifisyys vastaan ​​sen luonnollisen substraatin eli L-asparagiinia. Kuitenkin alle 10% ja 1% aktiivisuus D-asparagiini ja L-glutamiinia, vastaavasti havaittiin (kuvio 3d). Mitään muuta alustan todettiin vuorovaikutuksessa entsyymin sen puhtaassa muodossa.

3.5 Kinetiikassa

Lineweaver Burk juoni kuviossa 4 päättelee, että K

m ja V

max puhdistettua L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM 8 käyttäen L-asparagiinia substraattina oli 1,4 x 10

-5 M ja 4,03 IU, vastaavasti ja liikevaihdon määrä (K

kissa) entsyymiä oli määritettiin olevan 2,68 x 10

3 s

-1. (K

cat /K

m) entsyymin havaittiin olevan 1,503 x 10

6 M

-1s

-1.

K

m = 1,4 × 10

-5 MV

max = 4,03 IU /ug.

3,6 Ympyrädikroismi

CD kirjo puhdistettua L-asparaginaasi antoi negatiivisen elipticities 208 ja 222 nm: n (kuvio 5a). K2D analyysi pitkälle UV CD-spektri 240-200 nm ennustettu apha spiraali olevan 63,05% ja beeta-levy on 3,29% ja T

m proteiinia havaittiin olevan 58 ° C, joka lausuu syy jyrkkä kunnollinen aktiivisuudessa, kun entsyymi testattiin yli 60 ° C: ssa (kuvio 5b). Lähellä UV-CD-spektrit proteiinin antoi negatiivisen elipticities alueella 260-290, kuten on esitetty kuviossa 5c.

c). Lähi-UV-CD-spektrit puhdistettua L-asparaginaasi 1,0 mg /ml 0,1 M Tris-HCI: ää (pH-8,4).

3,7 Fluoresenssi Spectroscopy

puhdistettu L-asparaginaasi-proteiinia osoitti maksimi fluoresenssia 323 nm: ssä sen alkuperäisessä muodossa ilman GdHCl kuitenkin siirtyminen 352 nm havaittiin, kun 6 M GdnCl lisättiin näin todetaan sen täydellinen suoristumista kuten esitetään kuviossa 6. suurempi fluoresenssi havaittiin proteiini sen avattuna kylmässä tilassa.

nm (eksitaatioaallonpituus: 292 nm) ja piirtyy siirtymiä L-asparaginaasi 0 M, 3 M ja 6 M guanidiini HCI.

3.8 N-terminaalin sekvensointi L-asparaginaasi

proteiininäytteet vastaava molekyylimassa 33,7 kD SDS-PAGE blotattiin polyvinyylifluoridista (PVDF) kalvo (Sigma-Aldrich, USA) ja alistettiin N-terminaalisen aminohapon happosekvenssi määritys käyttäen automaattista proteiinisekvenaattoria PPSQ21A (Shimadzu, Japani). Sekvenssin ensimmäisten 15 N-terminaalista aminohappotähdettä havaittiin olevan DNKKVEAATGGTQAG joka osoitti suurta vaihtelua kanssa tunnettuja ja raportoituja proteiinin sekvenssin L-asparaginaasi.

3,8 Anti-proliferatiivinen vaikutus L-asparaginaasi

anti-proliferatiivista aktiivisuutta L-asparaginaasi seurattiin kolmea erilaista ihmisen tuumorisolulinjoja eli. Jurkat klooni E6-1, MCF-7 ja K-562. IC

50 puhdistettua L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM-8 todettiin erittäin tehokkaita vastaan ​​leukemiasolulinjoilla eli. Jurkat klooni E6-1 solulinjojen ja K-562 solulinjoissa IC

50 0,22 IU ja 0,15 IU, vastaavasti (kuvio 7). Rintasyöpä MCF-7 osoitti myös kasvun hidastumista vastaan ​​nousevien pitoisuuksien ja osoittivat IC

50 0,78 IU.

3,9

In vitro

Hemolyysitesti varten testaus Drug myrkyllisyyttä

L-asparaginaasi inkuboitiin heparinisoidusta verestä, ei havaittu edes pitoisuus on 100 ug /ml (kuvio 8). Myös lääke ei ollut estävää vaikutusta testin solulinjassa kiinanhamsterin munasarja (CHO) siten lääke voidaan katsoa turvalliseksi edelleen

in vivo

arvioinneissa.

V: negatiivinen ohjaus (ilman L-asparaginaasi); B: positiivinen kontrolli (kaksinkertainen tislattua vettä); C: 100 ug /ml; D: 50 ug /ml; E: 25 ug /ml; F: 12,5 ug /ml; G: 6,25 ug /ml L-asparaginaasi.

Keskustelu

puhdistaminen L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM-8 saavutettiin käyttämällä ultra- suodatus, 80% asetonia, DEAE selluloosa ja Sephadex G-100 geelisuodatus, vastaavasti. L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM-8 puhdistettiin ilmeiseen homogeeniseksi puhdistamisen kertainen 30,17 ja saanto 32,95%, kun spesifinen aktiivisuus entsyymin nousi 23,10 IU /mg 697,09 IU /mg. Proteiini oli molekyylipaino 134,8 kDa, mutta monomeerinen koko 33,7 kDa näin voisi olla mahdollista homotetrameerinä. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa edellisen raportit siitä, että bakteeri L-asparaginaasi on homotetrameerinä [19] – [21]. Teoreettinen IEF entsyymin laskettiin olevan 5,48, lähellä, että L-asparaginaasi on

E. coli

(IEF 5), mutta erilainen kuin

Erwinia

(IEF 8,7) [16], [22]. Puhdistettu L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM-8 oli toiminnallisesti vakaa ja aktiivinen laajalla pH-alueella ja lämpötilan, ja näytti optimaalinen aktiivisuus fysiologisissa olosuhteissa. Näin ollen tämä L-asparaginaasi oli vakaampi verrattuna L-asparaginaasi päässä

E. coli

ja

Erwinia

[16], [22] – [23]. Useimmat yksiarvoisten kationien, Mg

++ ja seerumin sokerit parantaa entsyymiaktiivisuuden, samalla kun entsyymin aktiivisuus vähenee, kun läsnä on muita kahdenarvoisia kationeja ja seerumin orgaaniset hapot. Tässä suhteessa, entsyymi oli samanlainen kuin

Erwinia

L-asparaginaasi [24]. Inhiboivaa vaikutusta kaksiarvoisten kationien kuten Ca

++ ja seerumin orgaanisia happoja voidaan voittaa loukkuun entsyymin liposomeihin, jotka voivat peittää estävää vaikutusta. Entsyymi loukkuun voi lisäksi pidentää puoliintumisaikaa plasmassa ja vähentää immunogeenisyyttä, edistämään terapeuttinen tehokkuus verrattuna vapaan entsyymin [25]. Aktiivisuus L-asparaginaasi laski merkittävästi 60%: n läsnä ollessa sulfhydryyli-inhibiittorit, jotka voivat johtua oleva vapaa -SH-ryhmien aktiivisissa kohdissa entsyymin [26]. Entsyymi havaittiin olevan erittäin spesifinen sen luonnollisen substraatin L-asparagiinia, jossa on vähemmän kuin 1% gluta- toimintaa. Kuitenkin

E. coli

L-asparaginaasi liittyy merkittävä gluta- toimintaa [2]. On todettu, että haitallisia vaikutuksia kohdataan kun glutamiini on tyhjentynyt alle kriittisen tason, vähentää synteesi useiden tärkeiden proteiinien

eli

. albumiini, insuliini, fibrinogeenin ja proteiini-C [10], [25]. Alempi gluta- aktiivisuus lisää myös L-asparagiinia ehtyminen [25]. Puhdistettua entsyymiä on K

m-arvo 1,4 x 10

-5 M, joka on pienempi kuin L-asparaginaasi on

Erwinia

(3,0 x 10

-3 M) [27] ja

E. coli

(3,5 x 10

-3 M) [28] ja siten parempaa alustan affiniteetti, vaikka alempi K

m-arvo 7,4 x 10

-6 M saatiin tapauksessa L- asparaginaasi alkaen

Vibrio succinogenes

[28]. CD-spektri puhdistettua L-asparaginaasi oli negatiivinen elipticities 208 ja 222 nm, jotka ovat tyypillisiä spektrien saatu seka-alfa /beeta-proteiinin tyyppiä, [29]. Lähellä UV-CD-spektrit proteiinin antoi negatiivisen elipticities alueella 260-290, jotka voivat johtua läsnäolo aromaattinen aminohappo sivuketjuja fenyylialaniinin, tyrosiinin ja tryptofaanin ja antamalla CD-spektrit, joka on ominaista natiivi kompakti taitettu proteiinin rakenne [29]. Oli asteittaista siirtymistä 323 nm 352 nm λ

em pitoisuuden lisääminen GdHCl 1-6 M, mutta siirtyminen oli merkittävä vasta kun pitoisuus GdHCl korotettiin yli 3 M. Samanlaisia ​​on raportoitu kyseessä hypertermofiilistä asparaginaasi tuotetun mutatoitunut

Pyroccocus furiosus

by Bansal,

et ai

vuonna 2011 [17]. Sekvenssin ensimmäisten 15 N-terminaalista aminohappoa, osoittivat laajaa vaihtelua kanssa tunnettuja ja raportoituja proteiinin sekvenssin L-asparaginaasi, mutta konservoitunut sekvenssi ATGGT kirjattiin [16] siten joten tämä L-asparaginaasi-proteiini on uusi jotka voivat liittävät sen vankka ominaisuudet ja alhainen gluta- aktiivisuus. Puhdistettu L-asparaginaasi päässä

Bacillus licheniformis

RAM-8 todettiin olevan erittäin tehokas syövän solulinjoissa, Jurkat klooni E6-1, MCF-7 ja K-562, jossa IC

50 kirjattiin alueella alle 1 IU /ml. Kuitenkin kaupallinen L-asparaginaasi päässä

Erwinia

on raportoitu olevan IC

50 7,5-10,0 IU /ml ja että

E. coli

on IC

50 1,0 IU /ml samanlaisesta solulinjoissa [30]. Tämän osalta tämä, L-asparaginaasi voidaan katsoa voimakkaampi ja tehokas keino kemoterapiassa kasvainten verrattuna esillä olevan kaupallisissa valmisteissa. Myös tämä L-asparaginaasi oli myrkytön normaaleja CHO-solulinjassa ja ihmisen erytrosyyttien. Noin 15-20%: lla potilaista hoidettiin

E. coli

-johdannainen asparaginaasi kehittää yliherkkyys ja myrkyllisyys huumeiden [31] joten tämä L-asparaginaasi saattaisi olla parempi ehdokas fysiologisissa olosuhteissa.

Johtopäätökset

L-asparaginaasi alkaen

Bacillus licheniformis

RAM-8 oli puhdistettu ilmi homogeenisuuden ja sen havaittiin olevan homotetrameerinä jolla on molekyyli- koko 134,8 kDa. Tämä L-asparaginaasi on aktiivinen ja stabiili laajalla lämpötila-alueella ja pH: n ja sille erityinen sen luonnollisen substraatin

ts.

L-asparagiinia. Biofysikaalinen luonnehdinta päätteli sen olevan vankka rakenne α /β sekoitettu proteiinia. N-terminaalinen sekvenssi tämän proteiinin ei täsmää tunnettuja ja raportoituja L-asparaginaasi-sekvenssi siis proteiini on uusi. Tämä L-asparaginaasi osoitti anticancerous vaikutus vastaan ​​Jurkat klooni E6-1, K-562 ja MCF-7 solulinjat ja myrkyttömiä vaikutus vastaan ​​heparinisoidusta verestä tai CHO testi solulinjassa.

Kiitokset

Tekijät kiitos tohtori TP Singh laitos biofysiikan, AIIMS varten infrastruktuuritukea N-terminaalin sekvensointi. Tekijät kiitos Rotary veripankki, New Delhi toimittamiseksi ihmisverta tutkimuksen tarkoitukseen kuin lahja.