Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sidekudosmuodostussolujen kasvaimen mikroympäristössä ovat keskeinen syövän etenemiseen ja saattavat olla lupaava kohde syövän hoidossa. Insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 7 (IGFBP7) tunnetaan tuumorisuppressori peräsuolen syöpä (CRC). Tässä tutkimuksessa selvitettiin induktiivinen mekanismi IGFBP7 ilmaisun fibroblastien supernatantissa CRC solulinjasta, SW620. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen IGFBP7 oli säädelty vahvistavasti fibroblastien hoidetuilla SW620 supernatantti ja eksogeenisen TGF-β1. IGFBP7 aiheuttama SW620 supernatantti tai TGF-β1 osittain inhiboi TGF-β1 spesifistä vasta-ainetta AF ja TGF-β1-reseptorin antagonisti SB431542. Wnt signalointia kohdistetun geenit, c-Myc, CCND1 ja proteiinit Dvl2 /3, olivat kaikki säädellään ylöspäin fibroblasteissa ilmentävät korkeita IGFBP7 ja ylössäätöä voitiin estää sekä Wnt signalointia antagonisti Dickkopf-1 ( DKK1) ja TGF-β1-reseptorin antagonisti SB431542. Lopuksi CRC solut edistävät korkea ilmentymistä IGFBP7 fibroblasteissa, todennäköisesti läpi myötäsääntelyä TGF-β ja Wnt signalointia on Smad2 /3-Dvl2 /3 riippuvaisella tavalla. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että fibroblastit voisi olla uusi terapeuttinen kohde kasvaimen hoidossa.

Citation: Rao C, Lin SL, Ruan WJ, Wen H, Wu DJ, Deng H (2014) Korkea ilmentäminen IGFBP7 fibroblasteissa indusoima peräsuolen syövän solujen Co-säätelemä TGF-β ja Wnt signalointia Smad2 /3-Dvl2 /3-riippuvaisella tavalla. PLoS ONE 9 (1): e85340. doi: 10,1371 /journal.pone.0085340

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 07 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 04 joulukuu 2013; Julkaistu: 10 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Rao et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Natural Science Foundation of Zhejiang (LY12H16027), National Natural Science Foundation of China (30870971) ja Major ohjelmaansa National Natural Science Foundation of China (81090420, 81090421). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi pahanlaatuisia kasvaimia uhkaa ihmisen selviytymisen maailmanlaajuisesti, sijoitus kolmas kaikista pahanlaatuisia kasvaimia [1]. Invaasio ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen ovat tärkein kuolinsyy. Useimmissa tutkimuksissa on keskitytty itse kasvain, mutta tärkeä rooli microenvironment kasvaimen etenemistä on myös tullut tunnustettava.

kasvain voidaan ajatella haava, joka ei parane, sen eteneminen ja metastaasit ei määritellä pelkästään syöpäsoluja, mutta myös kasvain strooman [2]. Mikro-etäpesäkkeitä muodostavat kauan ennen kuin kasvain voidaan diagnosoida, ja kasvaimen strooman vuorovaikutuksen tärkeä rooli aikana syövän etenemiseen. Fibroblastit ovat yksi solun tärkeitä komponentteja kasvaimen strooman, jossa ne aina saada aktivoitu fenotyyppi [3]. Aivan kuten fibroosia, fibroblasteissa kasvaimissa pysyvät sitkeästi aktivoitu; ne erittävät ja moduloivat solunulkoisen matriisin (ECM) stroomassa, joka on tärkeä rooli aikana kasvaimen etenemistä [3] – [5].

IGFBP7 on erittyvä proteiini, jonka tiedetään olevan tuumorisuppressori rintojen , aivot, paksusuoli, keuhko, maksa ja haiman syövät [6] – [11]. Se on solu-liima glykoproteiinin -30 kD [12]. In vivo, erilaisia ​​ekspressiomalleja IGFBP7 löytyy eri kasvaintyypeissä. IGFBP7 ilmentyminen on alhainen glioblastooma, keuhkosyöpä, haimasyöpä ja maksasyövän [6], [9], [10], [13], kun taas sekä lisätä ja vähentää ilmentymistä IGFBP7 on raportoitu rinta- ja eturauhassyöpää [14] – [17]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että rooli IGFBP7 kasvainsoluissa on monimutkainen, joskin tutkimuksia IGFBP7 kasvainsoluissa stroomasoluilla itse ovat harvinaisia. Eräässä raportissa, IGFBP7 havaittiin edistää angiogeneesiä endoteelisolujen [18], vaikka täsmällinen rooli IGFBP7 fibroblasteissa on vielä tuntematon.

aikana kasvaimen stroomavuorovaikutuksiin, fibroblasteja voi vaikuttaa paracrine signaloinnin tuottamat syöpäsoluja. Näistä signaloinneista, TGF-β uskotaan olevan tehokkain yksi. TGF-β-aktivoituneiden fibroblastien luoda tärkeä pro-invaasion ja pro-angiogeneesiä kapealla kasvainten kehittymiseen [19] – [21]. On raportoitu, että TGF-β signalointi toimii pääasiassa Smad reittejä [22]. Kun aktivointi, TGF-β-ligandi sitoutuu TGF-β-reseptorin I /II (TβRI /II), ja fosforyloidun TβRI rekrytoi ja fosforyloi reseptorin säädelty Smad: ien (R-Smad: ien). TβRII-Alk 5 kompleksi aktivoi Smad2 /3, kun taas TβRII-ALK1 kompleksi aktivoi Smad1 /5/8. Aktivoinnin jälkeen R-Smad: ien fosforyloivat ja muoto komplekseja Smad4, ja siirtyä tumaan säädellä transkription toimintaa [23].

Lisäksi TGF-β signalointi, Wnt signalointia myös tärkeä rooli CRC kehittämisessä . Raportit ovat osoittaneet, että ~90% CRC tapauksista johtuu mutaatioista Wnt-signalointireitin [24]. Kun kanoninen Wnt aktivointi, Wnt ligandit sitoutuvat Frizzled reseptoreihin ja LRP (low-density lipoprotein reseptoriin liittyvä proteiini) edistää fosforylaatiota LRP on DVL riippuvaisella tavalla [25], [26]. Sitten p-LRP rekrytoi Axins hajoamisessa kompleksin solukalvoon, auttaa β-kateniinin paeta hajoamista. Kertynyt β-kateniinin siirtyy sytoplasmasta tumaan ja muodostaa transkription aktivointi kompleksin TCF /LEF. TCF /LEF-β-kateniinin ydinvoimalassa aktivoi transkription Wnt signalointia kohdegeenien, kuten c-Myc, CCND1, FGF20, DKK1 ja WISP1, jotka säätelevät solujen lisääntymistä ja erilaistumista [26] – [29].

tässä tutkimuksessa käytimme supernatantti SW620, CRC-solulinja, joka on johdettu metastaattinen kasvain on paksu- ja peräsuolen syöpä, ja helf joka on yksi kanoninen fibroblastisolulinjat. Se, että sekä SW620 ja helf ovat IGFBP7 negatiivisia solulinjoja tekee tulkinnan havainnoistamme enemmän yksiselitteinen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tarkastella ekspressiokuviota IGFBP7 fibroblasteissa ja mekanismi sen takana.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssi ja vasta

TGF-β1 rekombinanttiproteiini hankittiin PeproTech, USA. AF (TGF-β1 neutraloiva vasta-aine) ja DKK1 rekombinanttiproteiinin ostettiin R Kanin anti-β-aktiini-vasta, Santa Cruz, Yhdysvallat. Toissijainen vasta-aineita Odyssey hankittiin Li-COR, USA.

Soluviljelmät

fibroblastien (helf) ja CRC SW620 olivat molemmat viljeltiin RPMI1640 (Gibco, USA) täydennettynä penisilliini streptomysiini Solution (100 U /ml penisilliiniä, 0,1 mg /ml streptomysiiniä, Gibco, USA), 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, 50% supernatanttia CRC SW620. Viljelyväliaine vaihdettiin päivittäin 3 päivää, sillä molemmissa solulinjoissa. Kaikki solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä.

valmistaminen SW620 supernatanttia

CRC SW620 levytettiin dosviljelypulloihin (8 x 10

5 solua) RPMI1640 täydennettynä penisilliini-streptomysiini Solution (kuten edellä), ja 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Gibco, USA). Kaikki solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. Supernatantti (SW620-S) kerättiin sen jälkeen 2 päivää, suodatetaan 0,22 um: n suodattimen (Millipore, Irlanti) ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Cell hoidon

fibroblasteja kasvatettiin dosviljelypulloihin pestiin PBS: lla kahdesti sitten korvattu RPMI1640 yksinään tai 50% RPMI1640 täydennetty 50% tuoretta SW620-S, eri pitoisuutta yhdistelmä-TGF-β1 proteiinin kanssa tai ilman AF, SB431542 eri aikoja; hoidot olivat päivitetään joka 3 päivä, ja ilmentyminen IGFBP7 havaittiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: ää, RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä.

Quantitative real-time PCR (Q-PCR) ja RT-PCR-

Kokonais-RNA käsiteltyä tai käsittelemätöntä fibroblastien uutettiin TRIzol Reagent (Invitrogen, USA) ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen Superscript II käänteiskopioijaentsyymiä (TaKaRa, Japani). Q-PCR-reaktiot suoritettiin SYBR Esiseos Ex Taq (TaKaRa, Japani) ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Alukkeita käytettiin Q-PCR oli suunniteltu mukaan GeneBank (taulukko S1). Q-PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 10 sekuntia denaturaatio 95 ° C: ssa, 5 sekuntia denaturaatio 95 ° C: ssa, 30 sekuntia hehkutus pidennys 60 ° C: ssa 40 sykliä. Fluoresenssi havaittiin lopussa kunkin vaiheen. Transkriptio IGFBP7 normalisoitiin transkriptio taso taloudenhoito geeni GAPDH. RT-PCR-reaktiot suoritettiin Taq (TaKaRa, Japani). RT-PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 5 minuuttia denaturaatiota 94 ° C: ssa, 30 sekuntia denaturointi 94 ° C: ssa, 30 sekunnin annealing-vaihe 59 ° C: ssa, 30 sekunnin pidennyksen 72 ° C: ssa 30 syklin ajan, 5 minuuttia laajentaminen 72 ° C. Transkriptio IGFBP7 normalisoitiin transkriptio taso taloudenhoito GAPDH.

Western blot-analyysi

Fibroblasteja hajotettiin RIPA puskuriin. Solulysaatit sentrifugoitiin 1,33 x 10

5 rpm: ssa 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, ja proteiinipitoisuus supernatantissa mitattiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä. 50 ug kokonais-proteiinin uute ladattiin 10% SDS-PAGE-geelillä ja tämän jälkeen proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle (BIO-RAD, USA). Membraani blokattiin kuoritun maidon 5% TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% v /v Tween-20) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin primäärisen vasta-aineen (1:1000) yön yli 4 ° C: ssa. Kun oli pesty TBST: llä 3 kertaa, blotit kanssa sekundaarisen vasta-aineen (1:5000) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. β-aktiini käytettiin normalisoimaan proteiinin määrä lisätyn näytteen. Immunoblotit skannattiin Odyssey (LI-COR, USA). Semikvantitatiivinen arviointi nauhojen suoritettiin densitometrisellä analyysin kanssa ImageJ ohjelmisto.

Immunofluoresenssimikroskopia

Solut coverslip kiinnitettiin kylmässä asetonissa 10 minuutin ajan. Peitelaseja soluja sitten pestiin PBS: llä 3 kertaa 5 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, sitten läpäiseviksi 0,05% Triton X-100: ssa 20 minuuttia ja blokattiin 10% normaalia seerumia 30 minuuttia. Soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennettu PBS: ään yön yli 4 ° C: ssa. Peitelasit pestiin PBS ennen 1 tunnin inkubaation sekundaarisiin vasta-aineilla ja 20 minuuttia DAPI (1: 5000; Invitrogen). Kuvat otettiin ottanut Zeiss LSM510 -konfokaalimikroskoopilla.

Tietojen analysointi

Tulokset ilmaistiin keskiarvo ± SEM 3 kokeen. Paritonta t-testiä käytettiin yhden vertailuja ryhmien yhtä varianssi ja normaalijakaumaa. Varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Newman-Keuls posttest käytettiin vertaamaan useita tietoja kustakin ryhmästä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Prism-ohjelmiston (GraphPad, USA).

P

-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

korkea IGFBP7 ilmentyminen fibroblasteissa indusoituu SW620-S

Koska kasvain- vaimennin rooli IGFBP7 CRC solulinjoissa [30] ja voimakasta ilmentymistä invasiivista edessä CRC kasvaimia (julkaisemattomat tulokset), esillä oleva havainnot osoittavat, että SW620-S indusoi IGFBP7 ilmentyminen fibroblasteissa, inkuboinnin jälkeen fibroblastien läsnä ollessa SW620-S eri pituisia aikoja. Tulokset paljastivat, että SW620-S oleellisesti sääteli tasolle IGFBP7, verrattuna kontrolliryhmään. Fibroblastit alttiiksi SW620-S osoitti ajasta riippuvainen säätely IGFBP7 mRNA: ta (kuvio 1A ja 1 B). Lisäksi, korkea IGFBP7 ekspressiota havaittiin myös fibroblastien käsitelty supernatantti kaksi muuta CRC-solulinjat HT29 ja Lovo (kuvio 1C ja 1D, kuviossa S1).

. B. IGFBP7 mRNA: n ilmentymisen määritettiin RT-PCR: llä (A) ja Q-PCR: llä (B) fibroblasteissa alttiina SW620-S 0, 2, 4 ja 6 päivää vastaavasti. C. D. IGFBP7 mRNA: n ilmentymisen määritettiin RT-PCR: llä fibroblasteissa alttiina HT29-S (C) ja Lovo-S (D) 0, 2, 4 ja 6 päivää. MRNA taso normalisoitiin että GAPDH samassa solussa uutteet. *

P

0,05 välillä SW620-S-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmän (0 päivä).

TGF-β1 in SW620-S indusoi IGFBP7 ilmentyminen fibroblasteissa

Edellinen tutkimus erittämät tekijät CRC solulinjoja ovat osoittaneet, että syöpäsolut erittävät TGF-β1 aikana kasvaimen stroomavuorovaikutuksiin [31]. Olettaen että IGFBP7 induktio johtui TGF-β1, fibroblasteja altistettiin 5 ng /ml eksogeenisen TGF-β1; he osoittivat ajasta riippuva nousu IGFBP7 mRNA: ta (kuvio 2A ja 2B). Lisäksi fibroblastit alttiiksi eri pitoisuuksia eksogeenistä TGF-β1 alueella 5 ng /ml 20 ng /ml 6 päivää osoitti annoksesta riippuvaista kasvua IGFBP7 mRNA: ta (kuvio 2C ja 2D). Tiedot osoittivat, että ilmentyminen IGFBP7 ei ole riippuvainen ainoastaan ​​aikaa, mutta myös pitoisuus TGF-β.

. B. IGFBP7 mRNA: n ilmentymisen määritettiin RT-PCR: llä (A) ja Q-PCR: llä (B) fibroblasteissa alttiina RPMI1640 tai 5 ng /ml TGF-β1 0, 2, 4 ja 6 päivää. C. D. IGFBP7 mRNA: n ekspression fibroblasteissa altistuu 0, 5, 10 ja 20 ng /ml TGF-β1 ja 6 päivää määritettiin RT-PCR: llä (C) ja Q-PCR: ää (D). EF Fibroblasteja käsiteltiin SW620-S tai 5 ng /ml TGF-β1: n läsnä ollessa 0, 20, 200 ng /ml AF 6 päivää, IGFBP7 mRNA fibroblasteissa havaittiin RT-PCR: llä (E) ja Q-PCR (F). MRNA taso normalisoitiin että GAPDH samassa solussa uutteet. *

P

0,05 välillä SW620-S /TGF-β1-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmään.

+

P

0,05 välillä SW620-S-käsitelty fibroblastien kanssa tai ilman 20 ng /ml AF.

++

P

0,05 välillä SW620-S-käsitelty fibroblastien kanssa tai ilman 200 ng /ml AF.

#

P

0,05 välillä TGF-β1-käsitelty fibroblastien kanssa tai ilman 20 ng /ml AF.

##

P

0,05 välillä TGF-β1-käsitelty fibroblastien kanssa tai ilman 200 ng /ml AF.

Jos haluat varmistaa, että TGF-β1 oli proteiinin eritetty CRC-solujen vastaava IGFBP7 induktio, käytimme immunodepletion kanssa TGF-β1-spesifistä vasta-ainetta (20 ng /ml AF) poistamiseksi TGF-β1 päässä SW620-S. Tämä immunodepleted SW620-S ei onnistunut indusoimaan IGFBP7 fibroblasteissa (kuvio 2E). Fibroblasteja käsiteltiin SW620-S: n tai TGF-β1: n läsnä ollessa AF osittain esti IGFBP7 aiheuttama SW620-S: n tai TGF-β1 yksin, mikä osoitti, että TGF-β1 oli tärkein, mutta ei ainoa, tekijä, joka indusoi IGFBP7 ( Kuva 2F).

korkea IGFBP7 ilmentyminen fibroblasteissa on pääasiassa TGF-β /Alk 5 /Smad2 signalointireitin

TGF-β signalointia TβRII-Alk 5 kompleksi fosforyloi Smad2 /3. Sen määrittämiseksi, onko induktio IGFBP7 oli kautta Smad2-riippuvaisen signaloinnin, SB431542 (selektiivinen antagonisti TGF-β /Alk 5 /Smad2 signalointi) lisättiin fibroblastien. Fibroblasteissa altistuvat SW620-S tai eksogeenisen TGF-β1 10pM SB431542, The IGFBP7 induktio oli osittain estetty (kuvio 3C ja 3D). Korkea ekspressio P-Smad2 havaittiin fibroblasteissa käsiteltiin SW620-S eri pituisia aikoja. Tämä säätely ylöspäin P-Smad2 oli aikariippuvainen huippuunsa päivänä 6 (kuvio 3B). Tasot p-Smad2 (kuvio 3E) ja TβRII (kuvio 3A) kasvoi SW620-S tai eksogeenisen TGF-β1 laskivat normaalille tasolle SB431542, mikä osoitti, että tämä ajan asetus oli kautta TβRII-Alk 5-Smad2 /3-reitin.

. Ilmentyminen TβRII havaittiin Western blot. B. Fibroblasteja altistettiin SW620-S 0, 2, 4 ja 6 päivää, ja p-Smad2 havaittiin Western blot. Proteiinin tasot normalisoitiin että β-aktiini samassa solussa uutteet. CD. Fibroblasteja altistettiin SW620-S: n tai TGF-β1: n läsnä ollessa 10 uM SB431542 ja 6 päivää, ja IGFBP7 mRNA: n ekspressio havaittiin RT-PCR: llä (C) ja Q-PCR: ää (D). MRNA taso normalisoitiin että GAPDH samassa solussa uutteet. E. Fibroblasteja altistettiin SW620-S: n tai TGF-β1 10 uM SB431542 ja 6 päivää, ja ilmaus Smad2, p-Smad2 (E) havaittiin Western blot. Proteiinin tasot normalisoitiin että β-aktiini samassa solussa uutteet.

*

P

0,05 välillä SW620-S /TGF-β1-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmään.

+

P

0,05 välillä SW620-S-käsitelty fibroblastien kanssa tai ilman SB431542,

#

P

0,05 välillä TGF-β1-käsitelty fibroblastien kanssa tai ilman SB431542.

IGFBP7 ylössäätöä fibroblasteissa on osittain aktivoitumisen kautta kanoninen Wnt-signalointireitin

Koska Wnt-signalointireitin säätelee aktivointi fibroblasteissa, ryhdyimme onko Wnt varsinkin kanoninen Wnt-signalointireitin, oli toinen säädin. Fibroblasteja käsiteltiin SW620-S osoitti korkea ilmentyminen c-Myc ja CCND1, loppupään kohdegeenien Wnt signalointia, joka aika-riippuvaisella tavalla. Kanoninen Wnt signalointia proteiini β-kateniinin havaittiin Western blot (kuvio S2A) lisättiin ja aktivoidaan, kuten on esitetty immunofluorence mikroskoopilla (kuva S2B), joka osoitti, että kanoninen Wnt signalointia aikana aktivoitiin IGFBP7 ylössäätöä (kuvio 4A ja 4B).

. B. Fibroblasteja käsiteltiin SW620-S 0, 2, 4 ja 6 päivää, ja mRNA: n ilmentymisen Wnt signaloinnin kohdegeenien c-Myc (A) ja CCND1 (B) mRNA: n ekspressio määritettiin Q-PCR: llä. C-E. Fibroblasteja käsiteltiin SW620-S: n läsnä ollessa 50 ng /ml DKK1 (Wnt-antagonisti) ja 6 päivää, ja IGFBP7 mRNA: n ekspressio havaittiin RT-PCR: llä (C) ja Q-PCR: ää (D). MRNA: n ilmentyminen on normalisoida, että GAPDH samassa solussa uutteet. Wnt-signalointi proteiini Dvl3 havaittiin fibroblasteissa Western blot (E). Proteiinin ekspressio normalisoitiin kuin β-aktiini samassa solussa uutetta. *

P

0,05 välillä SW620-S-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmään. **

P

0,05 välillä DKK1 saaneilla fibroblasteja ja kontrolliryhmään.

+

P

0,05 välillä SW620-S-käsitelty fibroblastien kanssa tai ilman DKK1.

on osoittanut, että Wnt signalointia aktivoitiin, me sitten tutki suhdetta aktivointi ja korkeasta ilmentymisestä IGFBP7. DKKs erittyy glykoproteiineja, joiden tiedetään antagonisoida kanoninen Wnt signalointia [32]. Kun fibroblasteja käsiteltiin DKK1, korkean ilmentymisen IGFBP7 aiheuttama SW620-S oli osittain inhiboitu (kuvio 4C ja 4D). Wnt signalointia proteiinien Dvl2 /3 havaittiin Western blot inhiboi DKK1 (kuvio 4E), mikä viittaa siihen, että säätely ylöspäin IGFBP7 oli tiiviisti kanoninen Wnt signalointireitille. Siksi tekijöistä korkeasta ilmentymisestä IGFBP7 voi olla TGF-β1 ja Wnt-ligandien, kuten Wnt3a joka aktivoi TGF-β ja Wnt-signalointireitin.

TGF-β ja Wnt kanonisen signalointireitin yhteistyötä säätelyssä korkean ilmentymisen IGFBP7 fibroblasteissa

selkeyttämiseksi suhdetta TGF-β ja Wnt-signalointireitin, käsittelimme fibroblastien TGF-β1, ja totesi, että se myös kasvatti taso c-Myc , CCND1 ja DKK1; Lisäksi tämä ylössäätöä osittain inhiboi SB431542 (kuva 5A-5C). Nämä tulokset havaittiin proteiinitasolla, kuten Dvls proteiinit ovat positiivisia välittäjiä Wnt signaloinnin sijaitsee alavirtaan Frizzled-reseptorien ja ylävirtaan β-kateniinin. Dvl3 oli ajan säätelee TGF-β1 käsittely (kuvio 5D), mikä osoittaa, että Wnt signalointia aikana aktivoitiin vuorovaikutusta ja tämä muutos purettiin TGF-β antagonisti SB431542, mikä viittaa siihen, että TGF-β aktivaatiota, Wnt signalointia oli myös aktivoitu. Siksi havaittu, että on olemassa uusi cross-talk välillä Wnt ja TGF-β signalointia, joka oli Dvl2 /3-Smad2 /3-riippuvia.

A-D. Fibroblasteja altistettiin SW620-S: n tai TGF-β1: n läsnä ollessa 10 uM SB431542 ja 6 päivää, ja mRNA: n ilmentymisen Wnt signaalin kohdegeenien c-Myc (A), CCND1 (B) ja DKK1 (C) arvioitiin Q-PCR: llä. mRNA: n ekspressio on normalisoida, että GAPDH samassa solussa uutteet. Ilmentyminen Dvl3 havaittiin Western blot (D). Proteiinin ekspressio normalisoitiin kuin β-aktiini samassa solussa uutetta. *

P

0,05 välillä SW620-S-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmään. **

P

0,05 välillä TGF-β1-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmään.

+

P

0,05 välillä SW620-S-käsitelty fibroblastien tai ilman SB431542.

#

P

0,05 välillä TGF-β1-käsitelty fibroblastien tai ilman SB431542. E. Malli korkean ilmentymisen IGFBP7 indusoi kasvainsolun-fibroblastien vuorovaikutuksia. F. TGF-β-signaalin aktivoinnin ajan säätelee Smad2 /3 ja Dvl2 /3, mukana säätely ylöspäin Wnt kohdegeenien c-Myc, CCND1 ja DKK1, niin että IGFBP7 on yli-ilmentynyt.

keskustelu

Nämä kokeet ovat osoittaneet, että supernatantti SW620 solulinja (SW620-S) aiheuttama IGFBP7 fibroblasteissa pääasiassa yhteissääntelyyn TGF-β /Alk 5 /Smad2 signalointi ja kanonisen Wnt signalointia . Tämä on ensimmäinen todiste taustalla oleva mekanismi korkea IGFBP7 ilmentyminen fibroblasteissa aikana kasvaimen stroomavuorovaikutuksiin. Meidän hypoteesi on, että IGFBP7 on yksi alavirran kohdegeenien TGF-β /Smad2 ja kanoninen Wnt signalointia, vaikka tarkka sijainti IGFBP7 vielä lisätutkimuksia.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että CRC-solut aiheuttama korkea ilmaus IGFBP7 (kuvio 5E). Koska IGFBP7 on tuumorisuppressori, useimmat tutkimus IGFBP7 on keskittynyt itse kasvainsoluihin. Eräässä ksenograftimallissa, esimerkiksi yli-ilmentymisen IGFBP7 inhiboivat melanooman [33]. Miksi sitten kasvain solut erittävät tekijöitä, jotka aiheuttavat IGFBP7 mikä puolestaan ​​estää oman kasvun? Tämä voi olla seurausta vastus fibroblastien kasvainsoluihin. Mikä merkitys korkean ilmentymisen IGFBP7 fibroblasteissa? Tällä hetkellä tämä on vaikea arvioida, koska on vain vähän tutkimusta roolista IGFBP7 kasvaimen strooman. IGFBP7 havaittiin voimakkaasti ilmaistu alusten gliooman [34]; se voi olla vuorovaikutuksessa soluväliaineen proteiinin indusoimaan tartunta- ja endoteelisolujen migraation [35], [36]. Kynä ja työtovereiden myös, että IGFBP7 endoteelisolujen voi aiheuttaa angiogeneesiä [18]. Toiset havaittu, että IGFBP7 todennäköisesti osallistuu aktivointi ja fibroblastien [37]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että IGFBP7 tuumorisoluissa in strooman voi olla täysin eri roolin IGFBP7 vuonna stroomasoluissa kasvaimia. Meidän julkaisemattomia tiedot osoittivat, että IGFBP7 voi korreloi aktivoitumisen fibroblastien, mutta niiden yksityiskohtainen merkitystä sen voimakasta ilmentymistä fibroblasteissa on vielä tuntematon ja vaatii lisätutkimuksia.

tulokset osoittivat, että IGFBP7 ilmentyminen fibroblasteissa liittyy läheisesti TGF-β erittämä CRC-solut. Myös ilmaus IGFBP7 ei ole vain ajasta riippuvainen, mutta myös annosriippuvaista suhteessa TGF-β. Vasta-aineen ja inhibiittorin TGF-β vahvisti tämän tuloksen. On raportoitu, että TGF-β signalointia on myös säädellä ilmentymistä IGFBP7 aivojen endoteelisoluissa [18], joka on edelleen esimerkki strooman solujen osaston. Ja me tiedämme, TGF-β /Smad3 signalointi on pidetty tuumorisuppressorigeenin aikana kasvaimen etenemisen, koska TGF-β-indusoidun CDKN1A (P16) ja CDKN2B (P15) ilmentyminen korreloi kasvaimen inhibitiota [38]. Kuitenkin muut tutkimus toteaa, että CTGF ja PAI-1, alavirran kohdegeeni TGF-β /Smad3 signalointi, korreloi on korkea riski etäpesäke rintasyövän [39]. Se ehdottaa TGF-β /Smad3 voi käänteisesti edistää hyökkäyksen ja muuttoliikkeen myöhäisessä vaiheessa kasvaimen muodostumisen [40], [41]. Siksi me spekuloida, että TGF-β erittämä syöpäsoluja edistämällä IGFBP7 ilmentyminen fibroblasteissa voi vähentää tuumorisuppressorigeenin rooli fibroblastien kasvainkudoksessa.

suhde IGFBP7 ja Wnt signalointia ei ole tutkittu, ja tutkimuksemme on ensimmäinen osoittaa, että Wnt signalointi voi säätelemään IGFBP7 fibroblasteissa. On raportoitu, että Wnt /β-kateniinin signalointi säätelee erilaistumista fibroblasteissa, mikä viittaa siihen, että Wnt /β-kateniinin signalointi on tärkeä säätelijä fibroblastin fenotyypin [42]. Tämä viittaa siihen, että Wnt signalointi voi vaikuttaa IGFBP7 välittämällä erilaistumista tilan fibroblasteissa.

Wnt signaloinnin tiedetään aktivoituu, kun fibroblastien aktivoidaan TGF-β [43]. Täällä huomasimme, että Wnt signalointia aktivoidaan IGFBP7 induktion fibroblasteissa TGF-β. On outoa, että lukuun ottamatta C-Myc ja CCND1, ilmaus DKK1 oli myös ajan säätelee TGF-β. Tiedämme, että DKK1 on kanoninen antagonisti Wnt signalointia. Nämä julkaistut havainnot ovat siten ristiriidassa tuloksemme. Silti, lisäksi meidän pitäisi huomata, että DKK1 on myös kohdegeenin Wnt signalointia [28]. Tämä voi olla negatiivinen palaute mekanismi näiden kahden signalointireittejä. Nämä kaksi signaalia voivat tehdä yhteistyötä aikana IGFBP7 induktion fibroblasteissa. Sen suhteen, miten ne toimivat yhteistyössä: huomasimme, että ne yhdistetään Smad2 /Dvl3. On olemassa useita selityksiä välisen vuorovaikutuksen näiden kahden signalointireittejä. Yksi tila vuorovaikutuksen Wnt /β-kateniinin ja TGF-β /Smad: ien signaalien vuorovaikutusta Smad: ien ja β-kateniinin /TCF4 [44]. Toinen tila voi tapahtua Wnt5a indusoi muodostumista Mark2 /Dvl3 /Smad4 kompleksin [45]. Vielä toinen tila voi olla Wnt3a edistää syöpään liittyvän fibroblastien kaltainen fenotyyppi fibroblasteissa, osittain kautta TGF-β /Smad2 aktivaatiota, jonka β-kateniinin-riippuvaisen mekanismin [46], mikä osoittaa, että Wnt: n ja TGF-β signalointi on linkitetty by Smad. Meidän tulokset, fibroblasteissa, aktivointi Wnt aiheuttama TGF-β oli todennäköisimmin kautta lisäävä säätely Smad ja Dvl3. Yhteenvetona toteamme, että Dvl3 voi olla uusi piste rajat talk välillä TGF-β ja Wnt signalointireitteihin fibroblasteissa. Smad2 /3 ja Dvl2 /3 voivat muodostaa jonkinlaisen yhdiste, joka voisi yhdistää TGF-β ja Wnt signalointia (kuvio 5F). On raportoitu, että TGF-β ja Wnt signalointia yhdessä säätelevät määrittämiseksi mesenkymaalisten solukohtaloiden maitorauhasen soluissa, mukaan lukien syöpäsairauden kantasoluja. Siksi näiden kahden signalointipolkujen voi olla mekanismi takana joitakin ehtoja, kuten fibroottisten sairauksien [47] – [49].

Tiedämme, että paracrine molekyylejä erittämiä CRC solujen aikana kasvain stroomavuorovaikutuksiin sisältävät TGF -β, Wnt ja jotkut muut tekijät, ja että ne voivat muuttaa viereisen fibroblasteissa. Tiedämme myös, että fibroblastit kasvainten strooman vastaavat synteesissä MMP ja kollageenin kuituja. MMP avulla kasvainsolujen tunkeutuvat tyvikalvon, kun taas kollageeni kuidut tarjoavat kasvainsolujen kätevä fyysinen kasvualusta, jonka yli siirtää [50]. Siksi fibroblastien kasvaimen strooman on kutsuttu ”Distant hyökkääjät ja migrators” [51].

Kaikkiaan kasvain-strooman vuorovaikutus on monimutkainen prosessi. Tämän prosessin aikana, kasvaimen solut voivat erittää tekijöitä muuttamaan erilaistumista normaalien fibroblastien, ja muuttui fibroblastien vastineeksi erittää vaikuttavia tekijöitä etenemistä kasvaimen invaasion ja muuttoliike. Olemme esittäneet -tutkimus osoittaa mekanismi, miten IGFBP7 voi olla mukana tässä vuorovaikutuksessa, ja tämä vuorovaikutus korostaen osallistuminen kasvain strooman fibroblastien, voisivat muodostaa painopiste uusi terapeuttinen lähestymistapa hallintaan syöpä.

tukeminen Information

Kuva S1.

HT29-S ja Lovo-S aiheuttaa korkeaa ilmentymisen IGFBP7 fibroblasteissa. Semi-kvantitatiivinen analyysi IGFBP7 mRNA: n ekspression taso määritettiin RT-PCR: llä fibroblasteissa alttiina HT29-S (A) ja Lovo-S (B) 0, 2, 4 ja 6 päivää. MRNA taso normalisoitiin että GAPDH samassa solussa uutteet. *

P

0,05 välillä HT29-S /Lovo-S-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmän (0 päivä).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0085340.s001

(TIF)

Kuva S2.

β-kateniinin aktivoidaan aikana säätely ylöspäin IGFBP7 fibroblasteissa. A. Fibroblasteja käsiteltiin SW620-S tai TGF-β 6 päivää ja ilmentymistä Wnt signalointia proteiini β-kateniinin havaittiin fibroblasteissa Western blot. Proteiinin ekspressio normalisoitiin kuin β-aktiini samassa solussa uutetta. *

P

0,05 välillä TGF-β1-käsiteltyjen fibroblasteja ja kontrolliryhmään. B. Fibroblasteja käsiteltiin SW620-S: n tai TGF-β varten 6 päivää ja β-kateniinin (punainen) ja DAPI (sininen) havaittiin fibroblasteissa immunofluoresenssimikroskopialla (alkuperäinen suurennos x 1000).

Doi: 10,1371 /journal .pone.0085340.s002

(TIF) B Taulukko S1.

Q-PCR Primers.

doi: 10,1371 /journal.pone.0085340.s003

(DOC) B

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Brian Eyden (Manchester) ja Englanti kieli muokkausta, edistää keskustelua ja tarkistaminen käsikirjoituksen. Kiitämme professori Mao-De Lai ja laboratorio jäsenten apua ja neuvoja koko tämän työn.