Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) on johtava kuolinsyy miehillä. Tällä hetkellä arvioidaan, että inflammatoriset vasteet liittyvät 15-20% kaikista kuolemista syöpä maailmassa. Eturauhassyövän hallitsevat johtuvia komplikaatioita etäpesäke luuhun jossa kasvainsolut ovat vuorovaikutuksessa luun mikroympäristön heikentäen tasapaino luun muodostumista ja hajoamista. Kuitenkin molekyyli luonne vuorovaikutusta ei ole täysin ymmärretty. Hemioksigenaasi-1 (HO-1) ehkäisee hapettumista ja tulehdusta. Aiemmat tutkimukset laboratoriossamme osoitti, että HO-1 on osallisena PCa, mikä osoittaa, että endogeeninen HO-1 estää luun peräisin eturauhasen syöpäsolujen lisääntymistä, invaasiota ja muuttoliike ja vähentää kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä

in vivo

. Tavoitteena työ oli analysoida vaikutuksia HO-1 moduloitu PCa soluja osteoblasteihin leviämisen

in vitro

ja luunmuodostusyksikköjä

in vivo

. Käyttämällä yhdessä viljelemisen järjestelmä PC3-soluja, joilla on primaarinen hiirillä osteoblasteihin (hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona), olemme osoittaneet, että HO-1 farmakologinen induktio (hemiiniä hoito) kumosi väheneminen PMOS leviämisen aiheuttama PCa solujen ja vähentynyt ilmentyminen osteoklastien moduloivan tekijät osteoblastien . Ei havaittu muutoksia geenien mukana osteoblastien erilaistumista. Kuitenkin yhdessä viljelemisen Hemiinin esikäsitellyt PC3-solut (PC3 Hem) PMOS herätti oksidatiivisen tilan ja aktivoidaan FoxO signalointia osteoblastien. Prosenttiosuuden aktiivisen osteoblastien positiivisia HO-1 kasvoi calvarias eksplantaatteja viljeltiin yhdessä PC3 Hem soluja. Nuclear HO-1 ekspressiota havaittiin kasvaimia tuottamat in vivo luun injektio HO-1 vakaa transfektoiduissa PC3 (PC3HO-1) solujen reisiluu on

SCID

hiirillä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HO-1 on mahdollista muuttaa luun mikroympäristössä vaikuttavat PCa luun etäpesäkkeitä.

Citation: Ferrando M, Wan X, Meiss R, Yang J, De Siervi A, Navone N, et al . (2013) hemioksigenaasi-1 (HO-1) Expression eturauhassyöpäsoluissa moduloi Oksidatiivinen Response luusoluissa. PLoS ONE 8 (11): e80315. doi: 10,1371 /journal.pone.0080315

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 29., 2013 Hyväksytty: 06 lokakuu 2013; Julkaistu 4 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Ferrando et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahoja yliopiston Buenos Aires, Argentiina, UBACyT (20020100100179) ja ANPCYT (PICT Raíces 2010-0431). M. F. piti apurahoja CONICET ja UICC Kansainvälinen Cancer Technology Transfer Fellowship. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Luuetäpesäkkeiden hallitsevat kliinistä kuvaa edenneen eturauhassyövän (PCA) ja vastaavat useimpien kuolleisuus ja sairastuvuus. Luuetäpesäkkeiden voi olla joko osteolyyttisiä (luuta resorboiva) tai osteoblastic (luu tuottaa) fenotyyppi. Eturauhassyövän tyypillisesti tuottaa osteoblastic vaurioita luun, vaikka osteolyyttinen komponentti on aina läsnä.

On ehdotettu, että tulehduksen kasvattaa eturauhasen kasvaimien syntyyn [1]. Sytokiinit, kemokiinit ja matriksimetalloproteinaasien ovat osa proinflammatoristen verkon, joka edistää maligni kehittyminen [2]. Todellakin, proinflammatorisia erittämät tekijät PCa ja luun soluja ja sen jälkeen vapautuu tekijöiden orgaanisen matriisin luuhun, välittävät paracrine /autokriinisellä vuorovaikutusta PCa solujen, osteoblastien ja osteoklastien, jotka viime kädessä päättää luun fenotyyppi ja etenemisen PCa [3 , 4].

Oksidatiivinen stressi on luonnollinen seuraus tulehduksellisten prosessien ja toimii modulaattorin funktion mineralisoidusta kudosten [5]. Se vaikuttaa luun muodostumista estämällä osteoblastien erilaistuminen ja apoptoosin edistämiseksi [6]. Nämä vaikutukset välittyvät osittain reaktiivisen hapen (ROS) syntyy yhteydessä oksidatiivisen stressin. Solut kielteiset vaikutukset ROS aktivoimalla eri puolustusmekanismit, kuten induktio vapaiden radikaalien huuhteluilman entsyymit, kuten mangaani superoksididismutaasi (MnSOD), katalaasi, ja myös DNA: n korjaukseen geenejä. Tämä vastaus edellyttää aktivointi perheen arjen tekijöitä tunnetaan forkhead transkriptio laatikko O (FoxO) [7], joka vuorovaikutuksessa β-kateniinin vähentää oksidatiivista stressiä ja edistää osteoblastien eloonjääminen [6].

hemioksigenaasi 1 (HO-1), nopeutta rajoittava entsyymi hemin hajoamista, osoitettiin antaa solusuojaus vastaan ​​oksidatiivista stressiä ja tulehdusta useissa eläinmalleissa [8]. Aiemmat raportit meidän laboratorio dokumentoitu ensimmäisen kerran ydinvoiman ilmentymistä HO-1 ihmisen ensisijainen eturauhasen karsinoomien [9]. Olemme myös dokumentoitu, että HO-1 estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion

in vitro

ja heikentää PCa kasvaimen kasvua

in vivo

[10]. Lisäksi olemme aiemmin määritettyyn avainrooli HO-1: n modulaattori angiogeenisen kytkimen eturauhasen syövän synnyn [11]. Lisäksi osoitimme, osoittaa, että anti-angiogeeninen toiminta HO-1 välittävät tukahduttamisen tumatekijä kappa-kevyen ketjun-tehostaja aktivoitujen B-solujen (NF-KB) signalointireitin [11]. Viime aikoina olemme raportoitu uusi toiminto HO-1 PCA. Olemme osoittaneet, että HO-1 moduloi alaspäin AR transkriptionaalisen aktiivisuuden häiritsemällä STST3 signalointi ja toimitti näyttöä sen roolin jälkeen Hemi hajoaminen [12].

Tutkimukset Tässä esitetyt suoritettiin käyttäen luun johdettu osteolyytti- PCa solulinja (PC3), joka on osoitettu estävän osteoblastien proliferaation

in vitro

in rinnakkaisviljelmätilanteessa järjestelmä primaarista hiiren osteoblasteihin (hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona) [13]. Tässä tutkimuksessa ilmoittavat tiedot, jotka tukevat uusia toimia HO-1 välisessä vuorovaikutuksessa PCa solujen ja luuta. Huomasimme, että HO-1 induktio in PC3-soluissa palautti leviämisen osteoblastien, joka estyi yhdessä viljelemisen aikana vanhempien PC3-solujen. Meidän tutkimukset osoittavat, että nämä vaikutukset välittyvät aktivoitumisen FoxO signaloinnin osteoblasteissa. PC3-solut yli-ilmentävät HO-1 (PC3HO-1) kasvaa luun hiirten kasvaimia kanssa tumaanohjaussignaali HO-1 havaitaan immunohistokemiallisesti. Nämä tulokset osoittavat, että HO-1 on tärkeä rooli etenemistä PCA luun. Parempi ymmärrys molekyylitason mekanismeista vuorovaikutusta PCa solujen ja luun mikroympäristön voi auttaa tunnistamaan uusia kohteita farmakologinen väliintulo tässä sairaudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja vasta-aineet

eturauhassyövän solulinja PC3 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja viljellään rutiininomaisesti RPMI 1640 (Invitrogen, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). PC3 vakaa transfektoidut solut (PC3HO-1 ja PC3βgal) tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. Hiiren myoblasti solulinja C2C12 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja viljeltiin DMEM matalan glukoosin (Invitrogen, CA, USA), jossa oli 10% FBS: ää. Primaariviljelmät hiirillä osteoblasteihin (hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona) perustettiin menettelyllä julkaistu aiemmin [13], ja saatiin calvaria vastasyntyneen CD1-hiirille tapettiin 4 päivää syntymän jälkeen. Eristetyt solut maljattiin α-MEM (Invitrogen, CA, USA) plus 10% FBS: ssa 48 tuntia. PMOS sitten myöhemmin trypsinoitiin ja maljattiin uudelleen viljelymaljoilla suorittaa kokeita. Vasta-aineet: anti-HO-1 oli peräisin Stressgen Biotechnologies, Corp. (San Diego, CA, USA), anti-β-kateniinin oli BD Transduction Laboratories ™ (CA, USA), anti-β-aktiini oli peräisin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA), anti-sykliini B1, anti-sykliini A, anti-sykliini D1, anti-p21, anti-β-tubuliinia, anti-hiiri-anti-kaniini-vasta-aineet olivat Santa Cruz Biotechnology Inc. ( CA, USA) ja Alexa Fluor® 594-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen Invitrogen (CA, USA).

Hemiini esikäsittely Eturauhassyövän soluja ja yhdessä viljelemisen järjestelmä

vuonna vitro

bicompartment kulttuuri järjestelmää käytettiin mallina luun etäpesäkkeiden PCA aikaisemmin kuvatulla hieman muutettu [13]. Lyhyesti, päivänä 0 PC3-soluja ympättiin (10.500 solua /cm

2) soluvilj insertit (0,4 mm huokosten; Falcon /Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) ja päivänä 1 he olivat käsitelty hemiiniä (80 uM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), indusoi tehokkaasti HO-1 (PC3 Hem). Kontrollit saivat tuoretta alustaa. PMOS myös ympättiin päivänä 1 kudosviljelymaljoilla (7300 solua /cm

2). Päivänä 2 insertit sisältävät PC3-soluja (pre-käsitellyn tai hemiinillä) pestiin perusteellisesti PBS: llä. Sitten insertit laitettiin kudosviljelmän maljoille, jotka sisälsivät PMOS niin, että kaksi eri solutyyppejä jaettu viljelyväliaineeseen, mutta eivät olleet fyysisessä kosketuksessa. Co-viljely PC3-solujen PMOS suoritettiin α-MEM plus 2% FBS: ää 24 tunnin ajan. Päivänä 3, solut kerättiin ja eri parametrien analysoitiin. Kontrollina kukin solutyyppi (PC3-solut esikäsiteltiin tai hemiinillä-ja PMOS) kasvatettiin yksin. Co-viljelmiä C2C12 solujen ja PC3 tehtiin samoissa olosuhteissa kuin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona ja PC3-soluissa. Viljelmät tehty kolmena kappaleena ja kussakin kokeessa tutkittiin kolme kertaa.

Mitogeeninen määritys

leviämisen ja DNA-synteesi arvioitiin lisäämällä [

3H] -tymidiinin (Amersham Biosciencies) viimeisellä 3 h yhteistyön kulttuurin ja inkorporaatio mitattiin kuten muualla on kuvattu [14].

RNA: n eristys ja RT-qPCR (käänteistranskriptio kvantitatiivinen PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA syntetisoitiin RevertAid RT (Fermentas) ja monistettiin reaaliaikaisen PCR-monistuksen Taq DNA Polimerase (Fermentas). Alukkeet suunniteltiin käyttäen Beacon Designer 5 ja testattu UCSC Genome Browser Home URL. PCR suoritettiin DNA Engine Opticon (MJ Research). Ihmisen alukesekvenssit annettiin seuraavasti: ACTB 5′-AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC-3’ja 5′-CATACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′; HO-1 5′-GAGTGTAAGGACCCATCGGA-3’ja 5′-GCCAGCAACAAAGTGCAAG-3′; PTHrP 5′-GTCTCAGCCGCCGCCTCAA-3’ja 5′-GGAAGAATCGTCGCCGTAAA-3′; uPA 5′-GAGATCACTGGCTTTGGAAAA-3’ja 5′-CCAGCTCACAATTCCAGTCA-3′; TGF-β1 5′-TACCTGAACCCGTGTTGCTC-3’ja 5′-GCGAAAGCCCTCAATTTCCC-3′. Hiiren alukesekvenssit annettiin seuraavasti: ACTB 5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3’ja 5′-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3′; Runx-2 5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3’ja 5′-AGGCATTTCGGAGCTCGGCG-3′; ALP 5′-AACCCAGACACAAGCATTCC-3’ja 5′-GAGACATTTTCCCGTTCACC-3′; Col1a1 5′-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT-3’ja 5′-GCAGCTGACTTCAGGGATGT-3′; Col1a2 5′-GCAGGTTCACCTACTCTGTCCT-3’ja 5′-CTTGCCCCATTCATTTGTCT-3′; OCN 5′-GCAGCTTGGTGCACACCTAG-3’ja 5′-GGAGCTGCTGTGACATCCATAC-3′; RANKL 5′-TGATTCATGTAGGAGAATTAAACAGG-3’ja 5′-GATGTGCTGTGATCCAACGA-3′; OPG 5′-GAAGGGCGCTACCTTGAGAT-3 ’ja 5′-GCAAACTGTATTTCGCTCTGG-3′; CSF-1 5′-CAACAGCTTTGCTAAGTGCTCTA-3’ja 5′-CACTGCTAGGGGTGGCTTTA-3′; OPN 5′-CTTTCACTCCAATCGTCCCTA-3’ja 5′-GCTCTCTTTGGAATGCTCAAGT-3′; CCL2 5′-TGCTACTCATTAACCAGCAAGAT-3’ja 5′-TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA-3′; IL-6 5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAGTT-3’ja 5′-GAAGTAGGGAAGGCCGTGG-3′; MnSOD 5′-CCACACATTAACGCGCAGATC-3’ja 5′-TAACATCTCCCTT GGCCAGAGC-3′; katalaasi 5′-TTGCTGAAGTTGAACAGATGG-3’ja 5′-ATCACGCTGGTAGTTGGC-3’.

Western blot-analyysi

western blotting, 50 ug proteiinia erotettiin 12% Tris-glysiini polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Biorad PowerPac Basic). Erityiset proteiinit kemiluminesenssilla (Amersham) kuten aiemmin on kuvattu [10].

Plasmidit, transfektiot ja lusiferaasireportterigeenin määritys

TOP-flash reportterigeenirakenteen sisältää neljä konsensus TCF sitoutumiskohtia, minimaalinen Fos sitoutumiskohdan ja lusiferaasireport- käytettiin [15]. FOP-flash rakentaa, jossa on mutatoitunut TCF-sitoutumiskohta käytettiin negatiivisena kontrollina. Reportteri plasmidi, joka sisältää 6 kappaletta DAF-16 perheen proteiineihin sitoutumisen elementti (FoxO-luc) on pGL3-perus tulikärpäsen lusiferaasi vektori minimaalinen TATA [16] oli ystävällisesti B. Burgering, University Medical Center, Utrecht, Alankomaat . Lusiferaasireportteri- konstruktit vietiin C2C12-solujen lyhytaikaisella transfektiolla käyttäen 8 ug PEI ja 4 ug plasmidia. 6 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja C2C12 olivat viljeltiin yhdessä PC3-solut esikäsiteltiin tai hemiinillä tai kasvanut vain 24 tuntia. C2C12 Sitten solut kerättiin talteen ja hajotettiin 40 ul: Vakaa Glo Luciferase System (Promega, Madison, WI, USA). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin luminometrillä (Glomax Multi Detection System, Promega). Positiivisena kontrollina TCF sitoutumiskohtien aktivointi PMOS käsiteltiin LiCl: 10 mM: ssa 24 tuntia ja FoxO-luc aktivointi, solut altistettiin H

2O

2 100 uM 24 tuntia. Jokainen transfektio tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa. Data normalisoitiin proteiinin kokonaismäärän määritettiin Bradfordin määrityksellä.

arviointi reaktiivisten hapen lajien virtaussytometrialla

jälkeen yhdessä viljelemisen, PMOS pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 10 uM 2 ’, 7’- dikloori- diasetaatti (CM2-DCFHDA; Invitrogen-Molecular Probes

TM) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut tripsined ja suspendoitiin uudelleen PBS: llä. Tasot H

2DCFDA mitattiin virtauksen citometry FITC kanavalla.

Cell cycle

Kun co-kulttuuri PMOS kiinnitettiin ja värjättiin propidiumjodidilla (PI), ja analysoitiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), kuten aiemmin on kuvattu [17].

Immunofluoresenssi

hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona oli viljeltiin yh- kuten aiemmin on kuvattu, mutta ympätty coverslip. Immunofluoresenssikokeisiin analyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Laaja kenttä mikroskopia suoritettiin käyttäen Olympus IX71 mikroskoopilla vesiupotukseen tavoite (UPLSAPO 60XW 1,2 AN, Olympus). Kuvat on otettu kameralla Hamammatsu Orca-ER käyttämällä ohjelmistoa Andor IQ ja käsiteltiin esitettäväksi kanssa ImageJ (https://rsb.info.nih.gov, National Institutes of Health).

immunohistokemiallinen analyysit

immunohistokemiallinen tekniikka suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9,10]. Kvantitatiivista analyysiä, kokonaismäärä osteoblastien vähintään 6 kenttää laskettiin ja prosenttiosuus osteoblastien positiivinen immunoreaktiivisuus tutkituissa geenin laskettiin.

Organ kulttuuri

Calvaria 4 päivän ikäisten CD1 hiiren pentua olivat valmisteveroja, halkaistuna ja laitettiin BGJ väliaineessa (Sigma Aldrich), joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinin soluviljelyinsertissä joka keskeyttää luun elin välinen ilmapiiri ja keskisuurten optimaalisen CO

2 vaihtoon. Puolet kunkin calvaria oli viljeltiin yhdessä PC3-solut esikäsiteltiin hemiinin ja toinen puoli, jossa PC3 käsittelemättömät solut. Muut calvarias sijoitettiin BGJ alustassa, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia ja käytettiin kontrolleina. Muut puolikkaat insuliinia 20 ug /ml käytettiin positiivisena kontrollina luun muodostumista. Vastaavat PC3 kulttuurin ja keskipitkällä vaihdettiin joka 2. päivä ja koe lopetettiin lopussa 7 päivää. Tuohon aikaan calvaria puolikkaat on vahvistettu, kalkittomat, parafiiniin upotettu, leikattiin, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla tai immunohistokemiallisia stainned ja analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [13].

In vivo

eturauhasen syöpä intrabone malli

Kaikki eläinkokeet suoritettiin standardin mukaan eläinten hoito ja hyväksyi Institutional animal Care ja käyttää

komitea University of Texas MD Anderson Cancer Center. PC3HO-1 tai PC3βgal solut injektoitiin reisi- ja SCID-uroshiirissä (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [13]. 3 x 10

5 PCa-solua per hiiri injektoitiin 28 gaugen neulaa distaalisten päiden oikea reisiluu 6- 8 viikon ikäisiä ehjä SCID-uroshiirissä (n = 7 ryhmää kohden) mukaiset menettelyt kuvattu toisaalla. Luun muodostuminen määritettiin X-ray-analyysillä. Lopussa kokeen, hiiret lopetettiin katkaisemalla kaula anestesian jälkeen isofluraanilla (toimitetaan avaami- * pudottamalla *), minkä jälkeen niiden takajalat poistettiin ja lihaskudoksen leikeltiin luiden sekä injektoidun ja ohjaus takajalkoihin hiirille, joilla on reisiluun ksenograftit. Dissekoiduissa luut sitten käsitelty histologisia.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset esitetään keskiarvona ± SD 3 erillistä itsenäistä koetta, ellei toisin mainita. Studentin t-testiä käytettiin selvittää tilastollisesti merkitsevä kynnysarvon

P

0,05 (*),

P

0,01 (**) ja

P

0,05, vastaavasti) (kuvio 1 A B ). Huomattavasti, yhdessä viljelemisen PMOS kanssa PC3 Hem palautettu osteoblastien proliferaatiota tasolle löytyy hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvaa yksin (kuvio 1 A B), korostaa entisestään pro-homeostatic roolia HO-1. Induktion HO-1 ilmentymisen PC3-soluissa vahvistettiin mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 1).

Kokeet tehtiin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvanut pelkästään (PMO), viljeltiin yhdessä PC3 (PMO PC3) tai PC3 esikäsitelty hemiini (PMO PC3 Hem). V: Solulisääntyminen mitattiin

3H-tymidiinin sisäänottoa hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona jälkeen 24 kulttuuriin. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina PMOS monokulttuurin asetettu 100%. B: hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona solujen määrä. C: Western blot-analyysi suoritettiin käyttäen anti-sykliini B1, A, ja D1 ja anti-p21

WAF1 /CIP1 vasta-aineita. Numerot alla bändejä osoittaa määritysrajan normalisoitu p-Tubulin-ja PMOS yksin. Yksi edustaja vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta (Merkittävä ero, *

P

0,05; ei ole merkittävää eroa, NS).

analyysit proteiinien mukana solusyklin sääntelyä immunoblottauksella vuonna hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona jälkeen rinnakkaisviljelemällä PC3 Hem kasvoi tasojen sykliini A, sykliini B ja sykliini D1, joiden samanaikainen väheneminen p21

WAF1 /CIP1 ilmaisu verrattuna hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvanut yhteistyössä kulttuuri kanssa PC3 ohjaus soluja (kuvio 1 C). Lisäksi virtaussytometria-analyysi PMOS jälkeen yhdessä viljelemisen kanssa PC3 Hem osoittanut merkittävää lisääntyi G2 /M kertyminen verrattuna hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona yhdessä viljelemisen kanssa PC3 kontrollisoluja (

P

0,05) (tuloksia ei ole esitetty) . Kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että HO-1 ilmentymisen PCA soluissa indusoi solusyklin etenemisen hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona, palauttaa kasvu PMOS yksin. On syytä huomauttaa, että määrä PC3-solujen ei muuttunut eri yhteistyössä viljelyolosuhteissa määritettiin (tuloksia ei ole esitetty).

HO-1 ilmentymisen PC3-soluissa ei muuta vaikutusta kasvaimen solujen osteoblastien erilaistuminen

Transcript tasot eri osteoblastien geenien arvioitiin RT-qPCR. Ilmaus osteoblastien erityisten transkriptiotekijä Runx-2, varhaisen differentiaatiomarkkeri (alkalinen fosfataasi, ALP), myöhään erilaistumisen merkkiaineiden mukana kollageenikoliitissa matriksin (I-tyyppisen kollageenin ja tyypin II kollageeni) ja ei-kollageenista matriksin (osteokalsiini , OCN) analysoitiin. Olemme havainneet, että Runx-2 ekspressio lisääntyi hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona viljeltiin yhdessä PC3 Hem (130%,

P

0,05) (kuvio 2 A), mutta eroja ei havaittu taso ALP, kollageenin tyyppi I ja II hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvaa yksin tai yhdessä viljelemisen kanssa PC3 Hem tai PC3 säätökennoja (kuva 2 BD). OCN tasot olivat merkittävästi vähentyneet hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona viljeltiin yhdessä PC3 Hem tai PC3 valvonta (81% ja 68%,

P

0,01, vastaavasti) (kuvio 2 E). Suostumuksella aikaisempien raporttien [13,19,20] PMOS viljeltiin yhdessä PC3-solujen näytteillä väheneminen calcified matriisissa muodostuminen arvioitiin von Kossa värjäys verrattuna PMOS kasvaa yksinään (kuvio 2). Mitään muutoksia havaittiin calcified matriisiin kun hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona olivat viljeltiin yhdessä PC3 Hem (kuva 2). Nämä tulokset osoittavat, että PC3-eritetyn tekijät, on raportoitu olevan vastuussa inhibition osteoblastien erilaistumisen [13], ei muuteta, kun HO-1-ilmennys indusoituu kasvainsoluja.

Kokeet tehtiin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvanut pelkästään (PMO), viljeltiin yhdessä PC3 (PMO PC3) tai PC3 esikäsitellä hemiini (PMO PC3 Hem). Kokonais-RNA uutettiin ja Runx-2 (A), ALP (B), kollageenin tyypin I (C), tyypin II kollageenia (D) ja OCN (E) mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. Data normalisoitiin p-aktiini ja ilmaistiin kertaiseksi induktio suhteessa hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona. Yksi edustaja vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta (Merkittävä ero, *

P

0,05; **

P

0,01).

HO -1 ilmentyminen PC3-soluissa laski tasot osteoklastien muokkaava tekijöitä osteoblastien

reseptorin aktivaattori ydin- tekijän kappa-B-ligandi (RANKL) ja Osteoprotegerin (OPG) tuotetaan osteoblastic /stroomasoluihin. RANKL on osoitettu aktivoivan kypsä osteoklasteiksi ja välittäjänä osteoklastigeneesin. OPG toimii valereseptori varten RANKL [21]. Yhdessä viljelemisen PMOS ja PC3 Hem tuotettujen solujen kasvua RANKL ja lasku OPG transkriptipitoisuuksissa osteoblastien; sama tulos havaittiin jälkeen yhdessä viljelemisen PMOS kanssa PC3 säätökennoja (kuva 3 A B).

Kokeet tehtiin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvanut pelkästään (PMO), viljeltiin yhdessä PC3 (PMO PC3) tai jossa PC3 esikäsitellyt hemiini (PMO PC3 Hem). Kokonais-RNA uutettiin ja RANKL (A), OPG (B), CSF-1 (C), OPN (D), CCL2 (E) ja IL-6 (F) mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. Data normalisoitiin p-aktiini ja ilmaistiin kertaiseksi induktio suhteessa hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona. Yksi edustaja vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta (Merkittävä ero, *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,01; 53%,

P

0,001 ja 52%,

P

0,05, vastaavasti). Mitään eroja ei havaittu IL-6 tasoa (kuva 3 C-F).

PCa solut ilmentävät myös geenejä epäsuorasti koskee osteoklastien modulaatio. Siksi päätimme tutkia ilmentymistä PC3-soluissa lisäkilpirauhashormonin liittyvä peptidi (PTHrP), urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) ja transformoivan kasvutekijä beeta-1 (TGF-β1) RT-qPCR ja toiminnan matriisi- 9 (MMP-9) zymografian. Mitään eroja ei havaittu transkriptien tasot valitun geenin tai aktiivisuutta MMP-9 (kuvio 4), mikä osoittaa, että nämä geenit osallisena osteoklastien modulaatio ei muuteta PC3-soluissa koeolosuhteissa joko esikäsitellään tai hemiinillä viljely yksin tai yhdessä viljelemisen.

PC3-soluja esikäsiteltiin hemiiniä (80 uM, 24 h, mustat pylväät) tai ei (kontrolli, valkoiset pylväät) ja viljeltiin yh- vai ei PMOS. Kokonais-RNA uutettiin ja PTHrP (A), uPA (B) ja TGF-β1 (C) mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. Data normalisoitiin p-aktiini ja ilmaistiin kertaiseksi induktio suhteessa PC3. Gelatiinitsymografialla tehtiin arvioimaan MMP-9 toimintaa ilmastointi mediaa PC3 kasvaneet yksin (PC3), esikäsitelty hemiini (PC3 Hem) ja hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvanut yksinään (PMO) ja viljeltiin yhdessä PC3 esikäsitelty tai hemiinillä ( PMO PC3 Hem ja VNK PC3, vastaavasti). Kirkas kvantitoitiin käyttäen ImageJ 1.37.v ohjelmistoa (NIH) ja normalisoitiin kokonaisproteiinin. Yksi edustaja vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta (NS: ei ole merkittävää eroa, RV: suhteellisia arvoja).

alkaminen osteoblastien oksidatiivisen tilan rinnakkaisviljelemällä Hemiinin esikäsitellyt PC3-solujen

Aiemmat raportit osoittavat, että oksidatiivisen stressin johtaa laski osteoblastien lukumäärä ja luun muodostumisnopeus [22]. Sen tutkimiseksi, onko PCa solut indusoivat oksidatiivista stressiä osteoblastien, käytimme yhdessä viljelemisen järjestelmä analysoida ilmentymistä antioksidantti muuniresponssigeeneinä (MnSOD, katalaasi ja HO-1). Yhdessä viljelemisen PMOS kanssa PC3 Hem tai PC3 valvonta lisäsi transkriptipitoisuuksissa MnSOD (134% ja 206%,

P

0,05, vastaavasti) ja katalaasia (95% ja 35%,

P

0,05, vastaavasti) in hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona (kuva 5 A B). Mielenkiintoista on, että HO-1-proteiinin ilmentyminen osteoblasteissa viljeltiin yhdessä PC3 Hem tai PC3 kontrolleihin indusoituu voimakkaasti verrattuna hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvaa yksin (kuvio 5 C). Määrittää oksidatiivisen stressiä, sukupolven ROS mitattiin virtaussytometrialla seuranta H

2DCFDA hapettumista. Merkittävästi lisääntynyt tasot ROS havaittiin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona viljeltiin yhdessä PC3 Hem verrattuna hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvaa yksinään (15%,

P

0,01) (kuvio 5 D). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että aiheuttama HO-1 ilmentymisen PC3-soluissa releases liukeneva johtavia tekijöitä oksidatiivista stressiä hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona. Tämä puolestaan ​​aiheuttaa antioksidantin vastaus todennäköisesti suosii osteoblastien lisääntymistä [6].

Kokeet tehtiin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvanut pelkästään (PMO), viljeltiin yhdessä PC3 (PMO PC3) tai PC3 esikäsitelty hemiini ( PMO PC3 Hem). Kokonais-RNA uutettiin ja MnSOD (A) ja katalaasin (B) mRNA-tasot analysoitiin RT-qPCR. Data normalisoitiin p-aktiini ja ilmaistiin kertaiseksi induktio suhteessa hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona. HO-1-proteiini tasot (C) määritettiin Western blot -analyysillä. Numerot alla bändejä osoittaa määritysrajan normalisoitu p-aktiini-ja PMOS yksin. ROS tasoilla (D) määritettiin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona inkuboitiin CM2-DCFHDA ja mitataan virtauksen citometry FITC kanavalla (Merkittävä ero, *

P

0,05; **

P

0.01).

HO-1 ilmentymisen PC3-soluissa aktivoituu FoxO signalointi C2C12 soluissa

Jotta voitaisiin tunnistaa signalointipolkujen aktivoidaan oksidatiivista stressiä osteoblastien, analysoimme β-kateniinin /Foxo akselilla. Vaikka kanoninen Wnt /β-kateniinin reitti on keskeinen rooli säätelyssä osteoblastien erilaistumista ja luun muodostumista, on hyvin tunnettua, että liukoinen β-kateniinin vuorovaikutuksessa FoxO transkriptiotekijöiden vasteena oksidatiivisen stressin [6]. Tämän tutkimiseksi signalointireitille käytimme reportterikonstruktio kuusi FoxO vastaus elementtejä. Johtuen vaikeudesta transfektoimaan hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona, käytimme sitomatta mesenkymaalisten solulinja, C2C12, joka kykenee erilaistumaan osteoblastien linjan [23]. Yhdessä viljelemisen C2C12-solujen kanssa PC3 Hem stimuloi vahvasti aktiivisuutta reportterigeenin (kuvio 6). Positiivisena kontrollina C2C12 viljelmät altistettiin H

2O

2 (100 uM) (kuvio 6). Tulokset Tässä hahmoteltu viittaavat siihen, että liukoinen tekijät tuottama PC3 Hem aiheuttaa FoxO signalointia osteoblastien.

Ylähavas. Kokeet tehtiin C2C12 kasvanut pelkästään (C2C12), viljeltiin yhdessä PC3 (C2C12 PC3) tai PC3 esikäsitelty hemiini (C2C12 PC3 Hem). V: solut transfektoitiin FoxO reportterigeenirakenteen (FoxO-luc). H

2O

2 käytettiin positiivisena kontrollina. B: Solut transfektoitiin TCF reportterigeenikonstruktilla (TOP-salama) tai sen negatiivinen kontrolli (FOP-salama). LiCl-oli positiivinen kontrolli. Kuusi tuntia transfektion jälkeen C2C12-soluja viljeltiin yh- ja 24 jälkeen yhdessä viljelemisen C2C12-solut hajotetaan ja lusiferaasiaktiivisuus määritys tehtiin. Data normalisoitiin proteiinin arvoihin. Yksi edustaja vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta (Merkittävä ero, *

P

0,05). Alempi paneeli. C: p-kateniinin solun jakautuminen visualisoitiin immunofluoresenssivärjäyksen (punainen) PMOS kasvatettu yksinään (PMO), viljeltiin yhdessä PC3 (PMO PC3) tai PC3 esikäsitellä hemiini (PMO PC3 Hem). Tuma leimattiin käyttäen Hoescht tahra (vihreä). Yhdistämisen edustaa päällekkäisiä kuvia. Edustava kuva kunkin ryhmän näytetään. Mitta-asteikko: 30 um.

Wnt kanoninen polku, β-kateniinin aktivaatio johtaa vakauttamiseen proteiinin translokaation tumaan, missä se vaikuttaa TCF (T-solu tekijä, HMG laatikko) ja aktivoi kohdegeenien transkription [24]. On ehdotettu, että Foxo ohjata β-kateniinin päässä Wnt kanoninen polku [6]. Sen arvioimiseksi, onko Wnt kanonisen väylän hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona on muuttunut sen jälkeen, kun yhdessä viljelemisen PCA soluja, tutkimme β-kateniinin solunosasijaintia ja TCF aktivoinnin hankehallinnoinnista vastaavien elinten luona kasvaa yksin tai yhdessä viljelemisen kanssa PC3 Hem ja PC3 ohjaus soluja. Kuvat osoittivat kuviossa 6 C osoittavat, että β-kateniinin sijaitsee sekä tumassa ja sytoplasmassa kaikissa analysoitiin olosuhteissa. Arvioida aktivoinnin β-kateniinin /TCF-reitin käytimme reportterigeenin. Olemme yhteistyössä viljellyt PC3-soluissa esikäsitellyt tai hemiinillä kanssa C2C12 soluja, jotka oli transfektoitu TCF reportterigeenikonstruktilla (TOP-salama) [15]. C2C12-soluja käsiteltiin LiCl (20 mM), käytettiin positiivisena kontrollina ja FOP-flash toimittaja aktiivisuus negatiivisena kontrollina. Mitään eroja TCF reportteri aktiivisuutta havaittiin, kun C2C12-soluja kasvatettiin yksin tai viljeltiin yhdessä PC3 Hem tai PC3-kontrollisolut (kuvio 6 B).

Bone explant yhdessä viljelemisen kanssa PC3-solujen indusoi HO-1 ilmentymisen

Jos haluat pidentää näitä tuloksia, käytimme luu elinviljelyssä määrityksessä. PC3 Hem tai PC3-ohjaus soluja viljeltiin yhdessä hiiren pääkallon eksplantaatteja. Histologinen analyysi ei osoittanut mitään eroja luun muodostumista, kun calvarias kasvatettiin yksin (kontrolli) tai co-viljelmässä (kuvio 7-C). Käyttäen immunohistokemia tekniikkaa seuraavan kerran tutkia ilmentymistä HO-1.