Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Annexins ovat kalsium ja fosfolipidi sitovia proteiineja, jotka muodostavat evoluution säilytetty monigeeniperheeseen. Huomattavaa näyttöä siitä, että anneksiini A10 (ANXA10) on mukana kasvainten etenemistä, vaikka vähän tiedetään sen roolia ihmisen suun syövän synnyn. Tässä tutkimuksessa tutkimme osallistumista ANXA10 suun levyepiteelisyöpä (OSCC).

Menetelmät /Principal Havainnot

ANXA10 mRNA ja proteiini ilmaisuja arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR ja immunoblottauksella, ja teimme lulisäkasvumäärityksessä ja solusyklin analyysi ANXA10 pudotus soluissa

in vitro

. Olemme arvioineet korrelaatio ANXA10 ilmentymistilanne 100 ensisijainen OSCCs ja kliinis-immunohistokemiallisesti. ANXA10 mRNA ja proteiini ekspressiotasot olivat säädelty kaikissa solu- linjat tutkittiin (n = 7,

p

0,05). ANXA10 Knockdown solut osoittivat, että solujen lisääntymistä väheni inaktivaation solunulkoisen säänneltyjen kinaasin (ERK) (

p

0,05), ja solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa johtui säätely ylöspäin sykliiniriippuvainen estäjät . ANXA10 proteiinin ilmentymisen ensisijainen OSCCs oli myös huomattavasti suurempi kuin normaalissa kollegansa (

p

0,05), ja korkeampi ilmentyminen korreloi kasvaimen koon (

p

= 0,027).

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme esitti ensimmäistä kertaa, että ANXA10 on merkki solujen lisääntymisen in OSCCs. Meidän tulokset viittasivat siihen, että ANXA10 ilmaisu voi tarkoittaa, solujen lisääntymistä ja ANXA10 voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde uusien hoitojen OSCCs.

Citation: Shimizu T, Kasamatsu A, Yamamoto A, Koike K, Ishige S, Takatori H, et al. (2012) anneksiini A10 in Human Oral Cancer: biomarkkeri Kasvaimen kasvun kautta G1 /S Transition mukaan kohdistaminen MAPK signalointireittejä. PLoS ONE 7 (9): e45510. doi: 10,1371 /journal.pone.0045510

Editor: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 21 elokuu 2012; Julkaistu: 17 syyskuu 2012

Copyright: © Shimizu et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Annexins ovat kalsium ja fosfolipidi sitovia proteiineja, jotka muodostavat evoluution säilytetty monigeeniperheeseen. Dysregulation anneksiini perheenjäsenten on raportoitu lukuisissa syövissä ja vaikuttaa malleja solujen käyttäytymistä, kuten leviämisen, invasiivisuus ja syöpään liittyvien signalointireittien, mikä viittaa siihen, että annexins voi tärkeä rooli tuumorien kehittymisessä ja etenemisessä [1] – [10] . Anneksiini A10 (ANXA10), joka on yli-ilmentynyt geeni suun okasolusyöpää (OSCC) -peräisen solu linjat edellisessä microarray data [11], on ollut mukana solujen toiminnan in endosytoosin ja eksosytoosilla; antikoagulanttiaktiivisuus; vuorovaikutus solun tukirangan; erilaistuminen; ja soluproliferaatiota [12], [13]; ja merkitystä maligniteetin Barrettin ruokatorven, mahasyövän ja virtsarakon syöpä [14] – [16].

Leviämisen ihmisen syöpäsoluja on pääasiassa G1 vaiheessa solusyklin. Mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) signa- ovat nousseet merkittäviä toimijoita leviämisen eri syöpäsoluissa [17]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että useat annexins nimenomaan moduloida solunulkoista säännelty kinaasi (ERK) /MAPK signalointiryöpyn ylävirran [18], [19]. ERK aktivointi on keskeinen rooli G1 /S siirtyminen [20], [21]. Jäsenet sykliini

–

riippuvaisen kinaasin (CDK) vuorovaikutuksessa proteiini /kinaasia inhiboiva proteiini (CIP /Kip) perhe sitoutuvat sykliini-CDK-komplekseja ja estävät niiden toiminnan, mikä johtaa G1 solusyklin pidätyksen. Sykliini D1, sykliini E, p21

Kip1, ja p27

Kip1 tasot vaikuttavat useiden signalointireittien myös ERK /MAPK-signalointireitin [22] – [25]. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja, joilla ANXA10 moduloi nämä soluvasteita ei ole täysin selvitetty OSCCs.

tuloksista kertomuksen kattavan analyysin poikkeavasta ilmentymisen ANXA10 in OSCCs että toiminnallisesti ja kliinisesti liittyy kasvaimen etenemiseen .

tulokset

arviointi ANXA10 mRNA ja proteiinin ilmentyminen in OSCC johdettuja solu linjat

ilmentymisen tutkimiseksi asema ANXA10 tunnistettu syöpään liittyvien geenin edellisessä microarray data [11], suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen käänteistranskriptio-PCR: llä (qRT-PCR) ja immunoblot -analyysejä seitsemällä OSCC johdettuja solu linjat ja ihmisen normaalia suun kautta keratinosyyttien (HNOKs). ANXA10 mRNA ja proteiini ilmentymistilanne olivat merkittävästi säädelty kaikissa OSCC solujen linjat verrattuna että HNOKs (kuvio 1A, B *

p

0,05). Expression analyysi osoitti, että sekä transkriptio ja kääntäminen tuotteita tämän molekyylin olivat erittäin ilmaistaan ​​OSCC johdettuja solu linjat.

(A) kvantifiointi

ANXA10

mRNA tasot OSCC johdettuja solu viivoja qRT -PCR analyysi. Merkittävät säätely ylöspäin

ANXA10

mRNA nähdään seitsemän OSCC johdettuja solu linjat verrattuna että HNOKs. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM-arvot kolmesta määritykset (*

p

0,05, Mann-Whitney U-testi). (B) immuuniblottausanalyysi ANXA10 proteiinin OSCC johdettuja solu linjat ja HNOKs. ANXA10 proteiinin ilmentymisen (molekyylipaino, 37 kDa) on ajan säännelty OSCC johdettuja solu linjat verrattuna että HNOKs. Densitometrinen ANXA10 proteiini Aineisto on normalisoitu a-tubuliinin proteiinin tasoja. Arvot ilmaistaan ​​prosentteina HNOKs.

perustaminen ANXA10 Knockdown solujen

Koska ANXA10 ilmaisu oli ajan säännelty OSCC solujen linjat, on oletettu, että ANXA10 saattaisi olla on tärkeä rooli OSCCs. Arvioimaan ANXA10 toiminnot

in vitro

, joka on shRNA koe suoritettiin käyttäen Sa3 ja Ho-1-u-1-soluissa. Ilmauksia ANXA10 mRNA: ta ja proteiinia shANXA10-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi pienempi kuin shMock-transfektoiduissa soluissa (Sa3 ja Ho-1-u-1-johdettu transfektanttisoluilla, kuvio 2A, B *

p

0,05).

(A) qRT-PCR osoittaa ANXA10 mRNA ilmaisun shANXA10-transfektoiduissa soluissa (Sa3- ja Ho-1-u-1-johdettu transfektantit; 2-kloonit kukin) ovat huomattavasti alhaisemmat kuin shMock-transfektoiduissa soluissa (*

p

0,05, Mann-Whitney U-testi). (B) Immunoblottaus analyysi osoittaa, että ANXA10 proteiinin tasot shANXA10-transfektoiduissa soluissa (Sa3- ja Ho-1-u-1-johdettu transfektantit, 2 kloonit kukin) on myös vähentynyt merkittävästi verrattuna, että shMock-transfektoiduissa soluissa.

Functional analyyseistä ANXA10 knockdown solujen

vaikutuksen arvioimiseksi ANXA10 knockdown solu- kasvuun, teimme solujen lisääntymisen määrityksessä. Transfektoitu ANXA10 shRNA (shANXA10) – ja ohjaus- shRNA (shMock) -transfected Solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 elävää solua /kuoppa laskettiin 7 peräkkäisenä päivänä. Oli merkittävä lasku solujen kasvua shANXA10-transfektoituja soluja verrattuna shMock-transfektoidut solut (Sa3 tai Ho-1-u-1-johdettu transfektanttisoluilla, kuvio 3, *

p

0,05 ).

vaikutuksen määrittämiseksi shANXA10 on solujen lisääntymisen, shANXA10- ja shMock-transfektoidut solut ympätään 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

4 elävää solua /kuoppa. Molemmat transfektantit laskettiin 7 peräkkäisenä päivänä. Solu kasvu shANXA10-transfektoiduissa soluissa (Sa3- ja Ho-1-u-1-johdettu transfektantit; 2-kloonit kukin) on merkittävästi estyy verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa 7 päivän jälkeen (168 tuntia). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM arvoja kolmesta määrityksissä. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja shANXA10- ja shMock-transfektoiduissa soluissa (*

p

0,05, U-testi).

Tutkiakseen mahdollisen taustalla mekanismin selittäisi alentunut solujen leviämisen estämistä shANXA10-transfektoituja soluja, arvioimme ERK polkuja, jotka ovat usein säädellään ylöspäin kohdun limakalvon ja muiden syöpien [26] – [29]. Fosforyloidun ERK (lisäansiot) proteiinin vähentynyt merkittävästi shANXA10-transfektoiduissa soluissa verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa (kuva 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ERK signalointireitin on usein heikennetty shANXA10-transfektoiduissa soluissa.

ANXA10 pudotus aiheuttaa alentuneita tasoja fosforyloidun ERK (Perk) verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa (Sa3- ja Ho-1-u -1-johdettu transfektantit, 2-kloonien kunkin); ERK taso on muuttumaton. Densitometrinen Perk /ERK-proteiinin Aineisto on normalisoitu a-tubuliinin proteiinin tasoja.

tutkimiseksi mekanismi solusyklin etenemisen shANXA10-transfektoiduissa soluissa, suoritimme virtaussytometria-analyysin shANXA10-transfektoitujen solujen. Prosenttiosuus G1 vaiheen shANXA10-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi (

p

0,05) korkeampi kuin mock-transfektoiduissa soluissa (kuvio 5A, B). Olemme myös arvioinut ilmentymistaso sykliiniriippuvaisen estäjät (CDKIs: p21

CIP1 ja p27

Kip1), sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4 ja CDK6. Kuten odotettua, kun taas CDKIs kasvoi säädelty merkittävä alas-säätely sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4 ja CDK6 havaittiin shANXA10-transfektoiduissa soluissa (kuvio 5C). Nämä tulokset osoittivat, että alas-säätely ANXA10 esti solujen lisääntymistä pidättämällä G1 vaiheeseen.

tutkimiseksi solusyklin etenemisen, analysoimme virtaussytometristen määritys DNA-pitoisuuden jonka FACScalibur G0-G1, S, ja G2-M vaiheissa. Selvitimme ilmentymistason CDKIs (p21

Cip1and p27

Kip1), sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4 ja CDK6 tunnistaa mekanismia, jolla ANXA10 estää solusyklin etenemisen G1 vaiheessa. (A) Kun synkronointi on G0 /G1 faasissa seerumipuut- virtaussytometrinen analyysi suoritettiin tutkimaan solujen syklin shANXA10- ja shMock-transfektoiduissa soluissa. Prosenttiosuus G1 vaiheen shANXA10-transfektoiduissa soluissa (Sa3- ja Ho-1-u-1-johdettu transfektantit; 2-kloonit kukin) on kasvanut selvästi verrattuna mock-transfektoiduissa soluissa (

p

0,05, Mann-Whitneyn

U

testi). (C) Immunoblottaus analyysi osoittaa ylös-säätely p21

Cip1and p27

Kip1 ja alas-säätely sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4 ja CDK6 että shANXA10-transfektoiduissa soluissa (Sa3- ja Ho-1 -u-1-johdettu transfektantit; 2-kloonit kukin) verrattuna shMock-transfektoiduissa soluissa.

arviointi ANXA10 ilmaisun ensisijainen OSCCs

edustaja immunohistokemia (IHC) tulokset ANXA10 proteiini normaalissa suun kudosten ja ensisijainen OSCC on esitetty kuvassa 6A-D. ANXA10 IHC tulokset sytoplasmassa ensisijaisen OSCCs olivat huomattavasti (kuvio 6E; *

p

0,001) korkeampi kuin normaaleissa kudoksissa, joissa IHC tulokset normaalien suun kudosten ja OSCCs vaihtelivat 27,5-132,4 (mediaani, 93,5) ja 60,5-230,4 (mediaani, 150,6), tässä järjestyksessä. Taulukko 1 esittää korrelaatiot ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia potilaiden OSCC ja asema ANXA10 proteiinin ilmentymisen käyttäen IHC pisteytysjärjestelmä. Niistä kliiniset luokittelut, ANXA10-positiiviset OSCCs korreloivat kasvaimen kokoa (

p

= 0,027), ja TNM vaiheessa OSCCs (

p

= 0,041).

edustavia IHC tulokset ANXA10 proteiinia normaalissa suun kudoksessa (A, B) ja ensisijaisen OSCC (C, D) (A, C) Alkuperäinen suurennos, × 100. Mittaviivat 50 pm. (B, D) Alkuperäinen suurennos, × 400. Mittaviivat 10 um). Vahva ANXA10 immunoreaktiivisuus havaitaan ensisijainen OSCCs; normaali suullinen kudosten näkyvät lähes negatiivinen immunovärjäyksen. (E) tila ANXA10 proteiinin ilmentymisen ensisijaisen OSCCs (n = 100) ja normaali kollegansa. ANXA10 IHC tulokset lasketaan seuraavasti: IHC pisteet = 1 × (lukumäärä heikosti värjäytyneiden solujen alalla) + 2 x (lukumäärä kohtalaisen värjäytyneiden solujen alalla) + 3 × (lukumäärä voimakkaasti värjätään solujen alalla) . ANXA10 IHC pistemäärät normaalia suun kudoksia ja OSCCs vaihtelivat 27,5-132,4 (mediaani, 93,5) ja 60,5-230,4 (mediaani, 150,6), tässä järjestyksessä. ANXA10 proteiinin ekspressiotasot OSCCs ovat huomattavasti (*

p

0,001, Mann-Whitneyn

U

testi) korkeampi kuin normaalissa suun kudoksiin.

keskustelu

nykyisessä tutkimuksessa ANXA10 oli usein yli-ilmennetään OSCC johdettuja solu linjat, ja alassäätöä alensivat soluproliferaatioon inaktivoimalla ERK. Solu-sykli Analyysi osoitti myös, että G1 pidätys tapahtui ANXA10 pudotus soluihin laski CDKI (p21

CIP1 ja p27

Kip1) ilmaisua. Lisäksi ANXA10 oli usein säädellään ylöspäin ensisijainen OSCCs ja korkeamman ANXA10 ilmentyminen liittyi kasvaimen koon (

p

= 0,027). Nämä tulokset osoittivat, että ANXA10 liittyy sääntelyyn solusyklin G1 vaiheessa ja sillä on tärkeä rooli tuumorien etenemistä OSCCs.

Koska suun syövän synnyn ja muut syöpätyyppeihin arvellaan olevan monivaiheinen prosesseja, joihin liittyy etenevä häiriö epiteelisolujen proliferaation, mekanismeja solujen lisääntymistä kasvainsolujen ovat merkittävä koulutusaloittain varten kasvainten hoidossa ja molekyyli- syöpäbiologian [30], [31]. Annexins, kuten ANXA10, on ollut tärkeä rooli tuumorien kehittymisessä ja etenemisessä [14] – [16], [18], [19]. Ei ole kuitenkaan suoraa näyttö on osoittanut, että ANXA10 tarvitaan solujen lisääntymistä. Voit selvittää ANXA10 toiminto on merkitystä OSCC etenemistä, teimme toiminnallinen tutkimukset käyttäen shRNA ja totesi, että tukahduttaminen ANXA10 laski merkittävästi solujen lisääntymisen seurauksena estetty MAPK -signalointireitistä down-regulation of Perk. ERK /MAPK-signalointireitin liittyy monia soluprosesseja, kuten proliferaatiota, erilaistumista, homeostaasin, ja solujen selviytymisen [17], [32]. Aktivointi ERK /MAPK -signalointireitistä edistää epänormaalia solujen kasvua ja tuumorigeneesiä useita kasvaimia. Meidän havainnot osoittivat, että ANXA10 ilmentyminen oli merkitystä fosforylaatioon ERK ja aktivoitumisen ERK /MAPK signalointireitille. ERK /MAPK-reitin on tiukasti kontrolloitua mekanismeilla solunulkoisen signaaleja. Tämä sisältää valvonnan solunsisäisen Ca

2+ pitoisuuksia, mikä mahdollistaa Ca

2+ palvelemaan toisiolähetin [33]. Ca

2 + efektori proteiinit voivat välittää soluvasteiden muutoksiin solunsisäisessä Ca

2+ tasoilla. Annexins, perheen kuten erittäin konservoituneen Ca

2 + -regulated proteiinit, on tunnusomaista niiden kyky sitoa fosfolipidejä Ca

2 + -riippuvaisen tavalla ja useimmat anneksiini toiminnot liittyvät niiden kyky olla vuorovaikutuksessa solukalvoissa säänneltyä kilpailua [12], [13]. Perustuen nämä todisteet yhdistettynä tuloksiin, ehdotamme, että ANXA10 voivat vaikuttaa solunsisäisen Ca

2 + homeostaasiin ja suoraan tai epäsuorasti vuorovaikutuksessa aktivoitumisen ERK /MAPK signalointireittejä.

Lisäksi MAPK signalointi polku, OSCC soluja shANXA10 paljasti solusyklin pysähtymisen G1 vaiheen säätely ylöspäin p21

CIP1 ja p27

Kip1 ja alas-säätely sykliini D1 ja sykliini E kaksi viimeistä ovat myös kriittisiä säätelijöitä G1 etenemistä ja G1-S siirtyminen. Estämällä niiden ilmentyminen estää G1-S siirtymisen solusyklin. Toiminta sykliini-CDK-kompleksit moduloidaan kahdenlaisia ​​CDKIs, CIP /Kip (p21

Cip1and p27

Kip1), joka säätelee solusyklin etenemisen. Jäsenet CIP /Kip perhe sitoutuvat sykliini-CDK-komplekseja ja estävät niiden toiminnan, mikä johtaa G1 solusyklin pidätyksen. Sykliini D1, sykliini E, p21

Kip1, ja p27

Kip1 tasot vaikuttavat useat signalointireittien myös ERK /MAPK -signalointireitistä [25], [34]. Sykliini D1 ja sykliini E ovat usein säädelty ihmisen syövissä [35], [36]. Mekanismi aktivoimalla ERK on tarttumaton fibroblasteissa on raportoitu vaikuttavan sykliini D1 [37]. Muissa raporteissa, aktivointi ERK johtaa ylössäätöä sykliini D1 [38]. CDKIs, p21

Kip1 ja p27

Kip1, ovat usein alassäädetty ihmisen syövissä [39], [40]. Mekanismi ERK sääntelyn p21

Kip1 ja p27

Kip1 jää epäselväksi. ERK voi suoraan fosfory- p21

Kip1 ja p27

Kip1 [41] – [43]. Nämä tiedot osoittivat, että ANXA10 aktivoi MAPK -signalointireitistä fosforyloimalla ERK ja edistää G1 solu- syklin alaspäin säätäminen CDKIs in OSCC etenemiseen.

Toistaiseksi ilmentymisen ANXA10 vuonna OSCC kudoksissa ja sen korrelaatio kliinis- ei ole selvitetty. Tutkimuksessamme vaikka positiivinen määriä ANXA10 alkuvaiheen kasvaimet olivat merkittävästi alhainen, positiivisten kehittyneissä-kasvaimia huomattavasti; Tämä viittaa vahvasti siihen, että ANXA10 voi olla tärkeä rooli syövän etenemiseen. Koska ANXA10 yliekspressio voi ennustaa maligniteetti, potilas jaottelu ANXA10 tila voi tarjota enemmän henkilökohtaista lähestymistapaa ihmisen suun syöpähoidon.

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että ANXA10 yli-ilmentyy usein OSCCs ja että tämä yli-ilmentyminen saattaa olla liittyy kasvaimen etenemisen edistämällä solusyklin etenemisen G1-vaiheessa aktivoimalla ERK /MAPK-signalointireitin, joka johtaa vähentyneeseen ekspressioon CDKIs. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan tutkia vuorovaikutusta ANXA10 ja ERK /MAPK-signalointireitin, nämä tiedot osoittivat, että ANXA10 on tärkeä rooli solujen lisääntymistä ja ilme on todennäköisesti biomarkkereiden etenemisen ja mahdollisen terapeuttinen kohde kehittämiseksi syövän vastaisen huumeiden ensisijainen OSCCs.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi eettinen komitea Graduate School of Medicine, Chiba University (Hyväksymisnumeroa, 236) ja suoritettiin mukaisesti eettisten normien vahvistetut Helsingin julistuksen mukaisesti. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

OSCC solu- linjat ja kudosnäytteiden

Ihmisen OSCC solu- linjat (HSC-2, HSC-3, HSC-4, KON, Ho-1 -u-1, ja Ca9-22) ostettiin Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japani. SA3 luovutti ystävällisesti Dr. S. Fujita at Wakayama Medical University, Wakayama, Japani [44]. Ensisijainen viljeltiin HNOKs toimi normaalit kontrollit [45] – [49]. Kaikki soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa /F-12 HAM (Sigma, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Sigma) ja 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä (Sigma), kostutetussa 5 % CO

2 /ilmakehässä 37 ° C: ssa.

sata paria ensisijaisen OSCC näytteiden ja vastaavassa normaalissa suun epiteelikudoksissa saatiin leikkausten aikana at Chiba University Hospital, Chiba, Japani. Kaikki potilaat säädetty tietoisen suostumuksen käytöstä pöytäkirjan, jossa Institutional Review Board of Chiba University tarkastettu ja hyväksytty. Resektoitua kudokset jaettiin kahteen osaan; yksi jäädytettiin välittömästi ja varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristys, ja toinen kiinnitettiin 20% puskuroidussa formaldehydiliuosta patologista diagnoosia ja IHC. Histopatologista diagnoosia varten kunkin kudoksen suoritettiin Maailman terveysjärjestön kriteerien Department of Pathology, Chiba University Hospital. Kliinis lavastus määritettiin mukaan kasvain-solmu-etäpesäkkeet luokittelu International Union syöpää vastaan. Kaikki OSCC näytteet varmistettiin histologisesti ja tarkistaa sen varmistamiseksi, läsnäolo kasvaimen yli 80% yksilöiden.

Quantitative reaaliaikaisia ​​käänteistranskriptio-PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä Trizol Reagent ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA tuotettiin 5 ug kokonais-RNA käyttäen Ready-To-Go You-Prime First-Strand helmiä (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ja oligo (dT) alukkeen (Hokkaido System Science, Sapporo, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden . qRT-PCR suoritettiin arvioimiseksi eks-

ANXA10

mRNA OSCC johdettuja solu linjat ja HNOKs. Ilmaisu tasot määritettiin käyttämällä alukkeita ja koettimia, jotka oli suunniteltu käyttämällä Universal Probe Kirjasto (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) noudattaen valmistajan suosituksia. Alukesekvenssejä käytetty qRT-PCR olivat:

ANXA10

, eteenpäin 5’GCATCCATTATGGGATTGAAA-3 ’, reverse 5′- CAAAATGTTTTGTGGAGACTATGTG-3’, ja Universal koetin # 24. Kaikki qRT-PCR suoritettiin käyttäen LightCycler® 480 PCR -järjestelmää (Roche). Monistukset aloitettiin 10 minuutin esi-inkubaation 95 ° C: ssa, jota seurasi 45 sykliä, joissa 10 sekuntia 95 ° C: ssa templaatin denaturointi, 30 sekuntia 55 ° C: ssa alukkeen /laajennus ja jäähdytys 30 sekunnin ajan 40 ° C. Otteen määrä

ANXA10

arvioitiin asiaa koskevaa standardia käyrät ja normalisoitiin

glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin

(

GAPDH

) (eteenpäin 5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA -3’cell, käänteinen 5′- GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ’, ja Universal koetin # 60) transkriptin määrä määritetään vastaava näytteistä.

Immunoblottausmääritys analyysi

solut pestiin kahdesti kylmällä fosfaatittomia puskuroitua suolaliuosta (PBS) ja sentrifugoitiin lyhyesti. Solujen pelletit inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuuttia lyysipuskurissa (7 M urea, 2 M tioureaa, 4% paino /tilavuus CHAPS, 10 mM Tris [pH 7,4]) kanssa proteinaasinestäjä cocktail (Roche). Proteiinikonsentraatio mitattiin Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteiini uutteet (20 ug) erotettiin natriumdodekyylisulfaatti polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 4-12% geeli, siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa Blocking Yksi (Nacalai Tesque, Tokio, Japani). Membraanit inkuboitiin kanin anti-ANXA10 polyklonaalista vasta-ainetta (Abnova, Taipei, Taiwan), hiiren anti-

α

tubuliinin monoklonaalista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA USA), hiiren anti-ERK 1/2 monoklonaalinen vasta-aine (R 2+, kohtalainen; ja 3+, voimakas. Solu numerot ja värjäytymisen intensiteetti sitten kerrottiin tuottaa ANXA10 IHC pisteet. Tapauksia, joissa ANXA10 IHC pisteet yli 132,0 (+3 keskihajonta (SD) sijoituksen normaalia kudosta) määriteltiin ANXA10-positiivisia. Poikkesi ± 3 SD sulku, joka tilastollisesti on vain 0,2% mittauksen ja sen odotetaan laskevan tämän alueen ulkopuolella, käytettiin koska se tuskin vaikuttaa satunnainen kokeellinen virhe tuotettu näytteen manipulointi [56]. Kaksi itsenäistä patologia, joista kumpikaan ei ollut tietoa potilaiden kliininen tila, teki nämä tuomiot.

Tilastollinen

merkitys ANXA10 ekspressiotasoja arvioitiin käyttämällä Fisherin testiä tai Mann -Whitney U-testi.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

Kiitokset

Kiitämme Ms Lynda C. Johtosääntö muokkaa tätä käsikirjoituksen.