Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Aikaisempi tutkimus on osoittanut vähentänyt ekspressiotasot let-7 keuhkokasvaimia. Mutta tiedetään vain vähän ekspressiota tai mekanismeja anna-7a eturauhassyövässä. Tässä tutkimuksessa käytimme in vitro ja in vivo lähestymistapoja tutkia E2F2 ja CCND2 ovat kohdistu suoraa let-7a, ja jos anna-7a toimii tuumorisuppressori eturauhassyövän alaspäin säätäminen E2F2 ja CCND2.

Menetelmät /Principal

havainnot Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että alentuneesta let-7a ovat läsnä resektoitiin eturauhassyöpänäytteissä ja eturauhassyövän solulinjoissa. Solujen lisääntyminen estyi PC3-soluissa ja LNCaP transfektion jälkeen let-7a. Solusyklin analyysi osoitti, että let-7a aiheuttama solukierron pysähtymisen G1 /S-vaiheessa. Dual-lusiferaasireportteri määrityksessä osoitti, että 3’UTR E2F2 ja CCND2 olivat suoraan sidottu let-7a ja western blotting-analyysi ilmoitti lisäksi let-7a alassäädetty ilmaus E2F2 ja CCND2. Meidän ksenograftimalleja eturauhassyövän vahvisti kykyä let-7a estämään eturauhasen kasvaimen kehittymisen in vivo.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä havainnot auttavat purkaa anti-proliferatiivista mekanismeja let-7a eturauhassyövässä. Anna-7a voi olla myös uusia terapeuttisia ehdokas eturauhassyövän antanut kyvyn aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja estävät solujen kasvua, erityisesti hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä.

Citation: Dong Q, Meng P, Wang T Qin W, Qin W, Wang F, et ai. (2010) MicroRNA Anna-7a Estää leviämisen ihmisen eturauhassyöpäsolujen

In vitro

ja

In vivo

mukaan kohdistaminen E2F2 ja CCND2. PLoS ONE 5 (4): e10147. doi: 10,1371 /journal.pone.0010147

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 9. maaliskuuta, 2010 Hyväksytty: 23 maaliskuu 2010; Julkaistu: 14 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Dong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Basic Research Program of China, 2009CB521705; ja Nature Science Foundation of China, 30672097. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä, ei-koodaavaa pieni RNA: t 20-25 nukleotidin pituisia [1], joka on tärkeä säätelevä rooli kautta ilmainen sitoutumisen 3’alueet (UTR) kohde- geenejä. Sitoutuminen johtaa hajoamisen kohde-mRNA: ta ja estämällä translaation [2]. Monet miRNA liittyvät syöpään, ja ovat mukana solujen kehittymisessä, erilaistuminen, proliferaatio, ja solukuolemaa [3]. Monet raportit ovat osoittaneet, että miRNA voi olla hyötyä syövän diagnosoinnissa ja hoidossa [4]. let-7 oli ensimmäinen tunnistettu

Caenorhabditis elegans

[5]. Se on lähes mahdoton havaita, että alkion kehitysvaiheessa, mutta muuttuu runsaampaa myöhemmissä kehitysvaiheissa [6]. Aiempi tutkimus on osoittanut vähentänyt ekspressiotasot let-7 keuhkokasvaimia verrattuna normaaliin keuhkokudoksessa. let-7 hidastavat solujen lisääntymistä alas- säätelemällä onkogeenien RAS /c-MYC ja HMGA-2: n translaation tasolla [7], [8]. Sama kasvain tukahduttava toiminnot on myös raportoitu päästää-7 paksusuolensyöpä [9].

In silico

analysoi mahdollisten let-7a tavoitteet (www.targetscan.org andwww.microrna .org) paljastavat, että sekä E2F2 ja CCND2 ovat mahdollisia tavoitteita let-7a. E2F2 ja CCND2 ovat solusyklin sääntelyviranomaisten ja poikkeava ilmentyminen niistä voivat aiheuttaa epänormaalia solujen lisääntymistä. Alustavien kokeiden mukaan proteiini tasot sekä E2F2 ja CCND2 ovat säädellään ylöspäin PC3 eturauhassyöpäsolulinja. Tiedetään vain vähän ekspressiota tai mekanismeja anna-7a eturauhassyövässä. Tässä tutkimuksessa käytimme

in vitro

ja

in vivo

lähestymistapoja tutkia E2F2 ja CCND2 ovat kohdistu suoraa let-7a, ja jos anna-7a toimii tuumorisuppressorina eturauhasen syöpäsairauden alaspäin säätäminen E2F2 ja CCND2.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki näytteet saatiin potilailta, jotka allekirjoittivat tietoisen suostumuksen hyväksymisestä käyttöä kudoksiin tutkimukseen tarkoituksiin käytön jälkeen. Klinikka patologinen tekijät 26 potilasta olivat osoitti taulukossa S1. Käyttö ihmisen kudosten tässä tutkimuksessa hyväksyi Institutional Review Board neljännen Military Medical University ja oli mukaisesti ohjeiden (nro 2008039085). Kaikki kokeet, joissa käytetään eläimiä mukaisesti toteutettiin eläinsuojelulaissa ja hyväksymiä Animal Care ja käyttö komitean neljännen Military Medical University. (Hyväksyntänumero 200804052353).

Soluviljely ja kudoksen keräys

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa LNCap, DU145, PC3, ja PrEC (eturauhasen epiteelisolut) ja ihmisen alkion munuaissoluja HEK293A saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Soluja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan vasikan seerumia ja penisilliiniä (100 U /ml). Viljelmiä ylläpidettiin atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2 (Forma Scientific). Kaksikymmentäkuusi tuoreeltaan resektoitiin eturauhassyövän yksilöitä ja niiden vieressä ei-tuumori- näytteet kerättiin Department of Urology in Xi’jing sairaalassa. Näytteet jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja pidettiin siellä käyttöön asti.

Plasmidi rakentaminen ja solujen transfektio

Anna-7a monistettiin ja puhdistettiin miRNA eristäminen (Invitrogen, Carlsbad, CA) mukaan valmistajan protokollaa. PCR-alukkeet let-7a olivat:

5′-GAATTCTCACACAGGAAACCAGGA-3 ’

(eteenpäin) ja

5′-CTGCAGTCAGGCATTTAAGTGACCG-3′

(reverse). Anna-7a PCR-tuotteet kloonattiin

Eco

RI /

Pst

I-kloonauskohta, joka pcDNA3 plasmidi, joka sisältää vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) muodostamaan plasmidi pcDNA3-let-7a-GFP . Cell transfektio suoritettiin lipofektamiinin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Lyhyesti, PC3-solut maljattiin kuusi kuoppalevyille ja kasvatettiin ilman antibiootteja 70-90% konfluenssiin. Kukin kuoppa sai 6 ui lipofektamiinia reagenssia, joka sisälsi 3 ug plasmidi-DNA. Kolme kuoppiin pcDNA3-let-7a-GFP-plasmidi, kun taas muuhun kuoppaan laitettiin tyhjän vektorin, pcDNA3-GFP. G418 (400 ug /ml) lisättiin soluihin 24 h transfektion jälkeen. Sekoitus seulottiin ja viljeltiin vielä 4 viikkoa. PC3-soluja, jotka on transfektoitu let-7a nimettiin PC3-let-7a-GFP, negatiivisen kontrollin (solut, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla), joka oli nimetty PC3-GFP. PC3-solut transfektoitiin myös 30 nM synteettistä let-7a (jäljittelee), ja synteettiset negatiivinen kontrolli miRNA (NC). Lopuksi synteettinen let-7a-estäjän sekvenssin ja synteettiset anna-7a-estäjän negatiivinen kontrolli (NC estäjä). Sekvenssit synteettisiä HSA-let-7a, negatiivinen kontrolli, HSA-let-7a estäjä ja inhibiittoripastojen negatiivinen kontrolli oli osoitti teksti S1.

Yhteensä RNA ja reaaliaikaisen RT-PCR

sillä let-7a, Total RNA uutettiin näytteistä käyttämällä miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA syntetisoitiin käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin TaqMan MicroRNA Assay Kit (Applied Biosystems). Aluke for let-7a oli

5′-GAGGTAGTAGGTTGTATA-3 ’.

For E2F2 ja CCND2 yhteensä RNA ja reaaliaikaisen RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR® vihreämpi ™ Kaksivaiheinen (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR-alukkeet E2F2 olivat:

5′-GAGCTCACTCAGACCCCAAG-3 ’

(eteenpäin) ja

5′-AACAGGCTGAAGCCAAAAGA-3′

(reverse). PCR-alukkeet CCND2 olivat:

5′-AAGAATTCCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA-3 ’

(eteenpäin) ja

5′-GCGGGATATCGACCTGTGAGAATTCGAT-3′

(reverse). Kaikki protokollat ​​suoritettiin valmistajan mukaan protokollia. Ilmentymisen taso let7a normalisoitiin RNU6B. Ilmentymisen taso E2F2 ja CCND2 normalisoitiin GAPDH. Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin käyttäen 7500 reaaliaikaisen RT-PCR System (Applied Biosystems). PCR suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 50 ° C 2 min, 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 50 sykliä 95 ° C: ssa 15 s, ja 60 ° C 1 min. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena.

MTT-määritys

PC3-soluissa ja LNCaP-soluja transfektoitiin joko NC tai anna-7a (jäljittelee), tai NC-inhibiittorin ja let-7a-inhibiittorin maljattiin 96 kuoppaiset levyt 1 x 10

4 solua /kuoppa. Elävät solut mitattiin 1, 2, 3, 4, ja 5 päivää sen jälkeen, kun pinnoitus. Inkubaation jälkeen 3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), solut hajotettiin 150 pl 100%: iin dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja UV-näkyvä absorbanssi luettiin 490 nm: ssä käyttäen 96-kuoppaisen levyn lukijaa. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena.

Soft agar määrityksessä

Lyhyesti, 2 ml 0,5% agaria lisättiin kuhunkin kuoppaan 12-kuoppalevyllä. Erillinen PC3-let-7a-GFP: n ja PC3-GFP-soluja sekoitettiin topagarose suspension (lopullinen konsentraatio 0,3%), ja sitten solut kerrostetaan 0,5% agaroosi pohjakangas. Määrä pesäkkeiden 100 um laskettiin 18 päivän jälkeen. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solusyklianalyysiä

PC3-soluissa ja LNCaP-soluja transfektoitiin joko NC tai anna-7a (jäljittelee), tai NC-estäjän tai anna-7a estäjä kerättiin 72 h transfektion jälkeen, pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 1 ml 70% etanolia. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 4 ° C: ssa etanolissa, solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin 500 ul: propidine jodidia (PI) 30 minuuttia ennen virtaussytometrialla. Populaatiot G0-G1, S ja G2-M vaihe mitattiin virtaussytometrialla (EPICS XL, Coulter, Miami FL) ja analysoitiin käyttämällä Multicycle-DNA Cell Cycle Analysoitu Software. Mittaus suoritettiin kolmena kappaleena.

Dual-lusiferaasireportteri määritys

Sen tutkimiseksi, E2F2 ja CCND2 ilmentyminen säätelee anna-7a, dual-lusiferaasireportteri- määritys suoritettiin. 3′-UTR CCND2 ja E2F2 monistettiin PCR: llä vastaavasti. Monistaminen CCND2 käytetään seuraavia alukkeita:

5′-GAATTCATGAGTTCTTCGTACTGG-3 ’

(eteenpäin) ja

5′-GATATCCCATCATGAT GAGGATAC-3′

(reverse). PCR-tuotteet olivat 398 bp ja sisälsi kaksi sitoutumiskohtaa laverrella-7a. Mutatoidun 3′-UTR CCND2 syntetisoitiin pistemutaatioita tehtiin useita muita emäksiä sitovia kohtia näiden PCR-tuotteita. Monistaminen 3′-UTR E2F2 käytti seuraavaa alukesekvensseissä:

5′-GAATTCCTCTTCGACTCCTACGAC-3 ’

(eteenpäin) ja 5

’ – GATATCTGTGCTTCTT GGTACGTCG-3 ’

(reverse). PCR-tuotteet olivat 415 bp ja sisälsi kaksi sitoutumiskohtia let-7a. Mutatoitunut 3′-UTR E2F2 syntetisoitiin jälkeen useita pistemutaatioita tehtiin sitoutumiskohdista PCR-tuotteet. Jälkeen restriktiodigestion, monistettujen geenien kloonattiin vastaaviin kohtiin rekonstruoidun pGL3 ekspressiovektoriin. PRL-TK-ohjaus ilmentävä Renilla lusiferaasin (Promega) käytettiin normalisoinnin solujen lukumäärän ja transfektion tehokkuutta. Cotransfections synteettistä let-7a-sekvenssin (jäljittelee) ja NC, tai anna-7a-estäjän ja NC-inhibiittori tehtiin myös ihmisalkion munuaissoluissa HEK293A käyttämällä lipofektamiinia 2000 (Invitrogen). Firefly ja Renilla lusiferaasin aktiivisuus määritettiin Pikkagene Dual lusiferaasimäärityssysteamiä (Toyo-B-Net).

Western blotting-analyysi

Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western blotting: hiiren anti-E2F2 ( 1:200 laimennus, Santa Cruz Biotech); Hiiren anti-CDK4 ja hiiren anti-sykliini D2 (1:300 laimennus; BD Biosciences, San Jose, CA); Hiiren anti-k-RAS (1:300 laimennus; Cell Signaling Technology, Beverly, MA); kanin anti-β-aktiini (1:4000 laimennos, Sigma). Kaksikymmentäviisi mikrogrammaa eturauhassyövän yksilöitä ja niiden vieressä ei-tuumori- näytteiden ”proteiini sekä PC3-let-7a-GFP: n ja PC3-GFP-proteiinia ajettiin elektroforeesilla 10% SDS-PAGE minigeeleissä ja siirrettiin Hybond C nitroselluloosakalvoille (Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK). Kun oli inkuboitu primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli, nitroselluloosakalvot pestiin kolme kertaa Tris-pusku- roitu suolaliuos Tween-20 (TBST) ja inkuboitiin sitten fluorecein isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua vuohen anti-hiiri- tai vuohen anti-kani- IgG (1:500 laimennos, Sigma) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty TBST: llä, blotit tehtiin näkyviksi käyttämällä Odyssey Infrared Imaging järjestelmä (LI-COR Bioscience, Lincoln, Nebraska USA). Kukin määritys toistettiin kolme kertaa.

tuumorigeenisyyden

Viisi nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisti ~ 1 x 10

6 PC3-let-7a-GFP tai PC3-GFP-soluja yhdellä sivusto takaisin. Paino kasvain ja paino hiiren mitattiin lopetushetkellä (4 viikkoa injektion jälkeen). Western blottaus suoritettiin tutkimaan, ovatko E2F2 ja CCND2 olivat alassäädetty nude-hiiren ksenograftimallissa. Kasvaimen suspensioita käsiteltiin lyysipuskurilla ja western-blottaus tehtiin menetelmien mukaisesti edellä kuvatulla tavalla.

Tilastollinen analyysi

Erot kunkin ryhmän määritettiin T-testillä tai Mann-Whitney

U

testi käyttäen Statistical SPSS ohjelmistopakettia (SPSS Inc., Chicago) (

p

0,05 pidettiin merkittävänä).

tulokset

Anna-7a alas säädellään resektoitiin eturauhassyöpänäytteissä ja eturauhasen syöpäsolujen

Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että ekspressiotasot let-7a pieneni ~43% vuonna resektoidun ihmisen eturauhassyöpänäytteissä verrattuna viereisiin -cancerous näytteitä. Eturauhassyövän solulinjoissa LNCap ilmaista vain -70% niin anna-7a kuin normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen PrEC. Lisäksi määrä let-7a ilmentymistä PC3-soluissa ja DU-145 oli noin 50%, joka havaittiin PrEC. Nämä tulokset osoittavat, että let-7a on vähentynyt eturauhassyövässä, mukaan lukien androgeenin riippumaton syöpiä PC3 (Fig. 1, *

p

0,05; **

p

0,01) .

Reaaliaikainen RT-PCR osoittavat, että suhteellinen ekspressio let-7a kaksikymmentäkuusi eturauhassyöpänäytteissä ja eturauhassyövän solulinjoissa LNCap, PC3, DU-145 on suurempi kuin niiden vieressä ei-syöpä yksilöitä ja normaalin eturauhasen epiteelisolujen PrEC. Data näytetään prosenttia keskiarvosta signaalien kudoksia ja soluja kolme riippumatonta mittausta. RNU6B mitattiin samanaikaisesti ja käytetään normalisoimaan ekspressiotaso let-7a kussakin kokeessa. Arvot ovat keinoja ja virhepalkit edustavat SEM. (*

p

0,01, **

p

0,01, Mann-Whitney-U-testi).

Anna-7a estää solujen kasvua

in vitro

ja indusoi solusyklin pysähtyminen G0-G1 vaihe

jälkeen transfektion, ilmentymistason let-7a PC3-let-7a-GFP oli -300% suurempi kuin PC3-GFP reaaliaikaisella RT-PCR; Kymmenen-kertainen ekspression let-7a havaittiin PC3 transfektoiduissa soluissa let-7a (matkii) verrattuna niihin, jotka oli transfektoitu NC (Fig. 2A,

p

0,01). Tämä osoitti, että transfektio suoritetaan asianmukaisesti. Pesäkkeenmuodostus analyysi osoitti, että pesäkkeet muodostumista kyky PC3-let-7a-GFP-soluissa on -40% pienempi kuin kontrollisolujen (Fig. 2B,

p

0,01). MTT kasvukäyrät osoitti, että toisesta päivä, selviytymisen let-7a transfektoitujen PC3-soluissa ja LNCaP-solut ovat huomattavasti vähemmän kuin negatiivinen kontrolli, ja selviytyminen let-7a estäjä transfektoitujen PC3-soluissa ja LNCaP-solut ovat huomattavasti enemmän NC inhibiittoripastojen transfektoiduista soluista (Fig. 2C,

p

0,05). Virtaussytometria osoitti, että osuus let-7a transfektoitujen PC3-soluissa ja LNCaP-solut G0-G1 faasi oli -30% (PC3) ja 16% (LNCaP) on suurempi kuin negatiivisen kontrollin, joka järjestää myös -50% ( PC3) ja 20% (LNCaP) väheneminen S-vaiheessa. prosenttiosuus let-7a estäjä transfektoitujen PC3-soluissa ja LNCaP-solut G0-G1 faasi oli ~23% (PC3) ja 19% (LNCaP) on vähemmän kuin NC: n estäjä transfektoitujen solujen, jotka järjestää myös ~ 33% (PC3 ) ja 25% (LNCaP) lisäys S vaiheessa (Fig. 2D, *

p

0,05; **

p

0,01). Nämä tiedot osoittavat, että let-7a estää PC3 lisääntymisen indusoimalla solusyklin pysähtymisen G1 /S-vaiheen.

(A) Suhteellinen ilmentyminen let-7a PC3-soluissa, jotka on transfektoitu pcDNA3-GFP, pcDNA3-kir- 7a-GFP, NC, ja anna-7 (matkii). RNU6B mitattiin samanaikaisesti ja käytetään normalisoimaan ekspressiotaso let-7a kussakin kokeessa. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SEM. (**

p

0,01, Mann-Whitney-

U

testi). (B) PC3-let-7a-GFP: n ja PC3-GFP-soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi pehmeässä agarissa ja inkuboitiin 18 d. Määrä pesäkkeiden 100 pm laskettiin. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SEM. (*

p

0,01, Mann-Whitney-

U

testi). (C) elinkelpoisuus PC3-solujen ja LNCaP-solut, jotka oli transfektoitu let-7a, NC tai anna-7a estäjä, NC estäjä mitattiin MTT-määrityksissä vastaavasti. UV-näkyvä-absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SEM. (*

p

0,05, Parilliset otoksen t-testi). (D) analyysi solusyklin PC3-soluissa, kun transfektoitu NC ja anna-7 (jäljittelee) tai NC estäjä ja anna-7a-estäjä, sekä analyysi solukierron LNCaP-soluissa, kun transfektoitu NC ja anna-7a (matkii ) tai NC estäjä ja anna-7a estäjä. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SEM. (*

p

0,05, **

p

0,01, Mann-Whitney-

U

testi).

Let -7 tavoitteet 3’UTR E2F2 ja CCND2

Kuva 3A esittää sekvenssit 3 ’UTR: t ja E2F2 ja CCND2, jotka edustavat sitoutumiskohdat anna-7a. Vastaavat sekvenssit mutatoidun 3 ’UTR: t ja E2F2 ja CCND2 esitetään samoin. Ei vähennetä lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin HEK293A transfektoiduissa soluissa let-7a (matkii) ja mutatoitu CCND2 tai E2F2. Mutta suurempi kuin 30%: n vähennys lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin villityypin CCND2 ja -50%: n vähennys lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin villityypin E2F2 (Fig. 3B, **

p

0,01). Verrattuna NC-estäjä, ei ole merkittävää eroa lusiferaasiaktiivisuuden, kun HEK293A solut transfektoitiin let-7a-inhibiittori ja villityypin CCND2 tai E2F2 (Fig. 3C). Nämä tulokset tukevat että E2F2 ja CCND2 ovat kohdistu suoraa let-7a ja endogeenisen anna-7a HEK293A ole häiriöitä kokemuksemme.

(A) sitoutumiskohdista E2F2 ja CCND2 varten anna-7a vastaaviin mutatoitunut E2F2 ja CCND2 sekvenssit. (B) Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus ihmisen alkion munuaissoluja HEK293A transfektion jälkeen NC tai anna-7a (matkii) ja sitten myös ko-transfektoitiin PRL-TK-ohjaus vektorin tai pGL3 ekspressiovektori, joka sisältää joko WT-CCND2-3’UTR tai MUT-CCND2-3’UTR tai WT-E2F2-3’UTR tai MUT-E2F2-3’UTR. (C) Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus ihmisen alkion munuaissoluja HEK293A transfektion jälkeen NC-estäjän tai anna-7a-inhibiittori ja ko-transfektoitiin PRL-TK kontrollivektori, tai pGL3-ekspressiovektoriin, joka sisältää joko WT-CCND2-3’UTR tai WT-E2F2-3’UTR. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SEM. (**

p

0,01, Mann-Whitney-

U

testi).

Anna-7a estää ilmentymistä E2F2, CCND2

Reaaliaikainen RT-PCR osoittaa, että mRNA suhteellinen ilmentyminen E2F2 ja CCND2 eturauhassyövässä kudoksissa ja LNCaP, PC3 ja DU-145-solut ovat säädelty verrattuna niiden viereisten ei-syöpä yksilöitä ja PrEC-soluissa (kuvio. 4A, B, *

p

0,05; **

p

0,01). Mutta verrattuna PrEC mRNA ilmaus E2F2 ja CCND2 ovat alassäädetty jälkeen transfektoitu päästää-7a PC3 ja LNCaP-soluissa (kuvio. 4C, D, *

p

0,05; **

p

0,01). Western blotting tulokset eivät osoittaneet mitään muutosta CDK4-proteiinin ilmentymisen välillä eturauhassyöpäkudoksille ja niiden vieressä ei-tuumori- kudoksiin välillä tai PC3-let-7a-GFP-soluissa ja PC3-GFP-soluissa ekspressiotasot E2F2, CCND2 kasvoi eturauhassyöpäkudoksille verrattuna niiden vieressä ei-tuumori- kudoksiin, mutta ekspressiotasot E2F2, CCND2, ja k-ras väheni dramaattisesti PC3-let-7a-GFP-soluissa verrattuna, että PC3-GFP-soluissa (kuvio. 4E). k-ras, joka on aiemmin määritelty molekyylitasolla let-7a [7] käytettiin positiivisena kontrollina näissä kokeissa. Nämä tulokset tukevat että let-7a alaspäin säätäminen mRNA ilmaus E2F2 ja CCND2 ja tukahduttavat proteiini käännöksiä.

(A) Reaaliaikainen RT-PCR osoittavat suhteellisen ilmentymistason E2F2 eturauhassyövässä kudoksissa ja LNCaP, PC3 ja DU-145-soluissa on paljon suurempi kuin niiden vieressä ei-syöpä yksilöitä ja PrEC soluja (*

p

0,05, **

p

0,01 ; Mann-Whitney-

U

testi). (B) Reaaliaikainen RT-PCR osoittavat suhteellisen ilmentymistason CCND2 eturauhassyövässä kudoksissa ja LNCaP, PC3 ja DU-145-soluissa on paljon suurempi kuin niiden vieressä ei-syöpä yksilöitä ja PrEC soluja (*

p

0,05, Mann-Whitney-

U

testi). (C) Reaaliaikainen RT-PCR osoittavat suhteellisen ilmentymistason E2F2 LNCaP ja PC3-soluissa on vähemmän kuin PrEC soluissa jälkeen transfektoitu let-7a (*

p

0,05, **

p

0,01, Mann-Whitney-

U

testi). (D) Reaaliaikainen RT-PCR osoittavat suhteellisen ilmentymistason CCND2 LNCaP ja PC3-soluissa on vähemmän kuin PrEC soluissa jälkeen transfektoitu let-7a (*

p

0,05, Mann-Whitney-

U

testi). Kaikki arvot ovat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SEM. GAPDH mitattiin samanaikaisesti ja käytetään normalisoimaan ekspressiotasoja E2F2 ja CCND2 kussakin kokeessa. (E) Western blotting osoittavat, että mitään muutosta CDK4 ilmaisun välillä eturauhassyöpäkudoksille ja niiden vieressä ei-syöpä yksilöiden välillä tai PC3-let-7a-GFP-solujen ja PC3-GFP-soluissa. Ilmentymistasojen E2F2 ja CCND2 on suurempi eturauhassyöpäkudoksille kuin niiden vieressä ei-syöpä yksilöitä. Sen jälkeen kun oli transfektoitu let-7a ekspressiotasot E2F2, CCND2, ja k-ras väheni dramaattisesti PC3-let-7a-GFP-solujen verrattuna, että PC3-GFP-soluissa. β-aktiini käytettiin lastaus valvonta.

Anna-7a kasvaimen kasvu estyy nude-hiirissä ksenograftimallia

nudehiiriin PC3-let-7a-GFP tai PC3-GFP ksenografteja tapettiin 4 viikkoa siirrostamisen. Kasvaimet leikattiin irti ja mitattiin (Fig. 5A). Western blotting osoitti, että ekspressiotasot E2F2 ja CCND2 väheni dramaattisesti PC3-let-7a-GFP kasvaimissa verrattuna PC3-GFP kasvaimia (kuvio. 5B). Paino PC3-let-7a-GFP kasvaimia oli -80% kevyempi kuin PC3-GFP kasvaimet (Fig. 5C,

p

0,01). Lisäksi suhde kasvaimen paino /kehon paino hiirissä, jotka kantoivat PC3-let-7a-GFP kasvaimia oli vain ~6% suhteen hiirten, joilla PC3-GFP kasvaimia (Fig. 5D,

p

0,01), joka on vahva näyttö, jonka avulla-7a voi estää kasvaimen kasvua

in vivo

.

(A) valokuva leikattiin kasvainten 4 viikkoa implantoinnin jälkeen. Ylärivillä esitetään tuumorit leikattiin injektoitujen hiirien PC3-GFP-soluja. Alemmat ovat tuumorit leikattiin injektoitujen hiirien PC3-let-7a-GFP-soluissa. Hiiriä pistetään PC3-let-7a-GFP-solujen, ei kasvain havaittiin yhdellä hiiren ja yksi hiiri kuoli kaksi päivää injektion jälkeen. (B) VVestern-blottaus osoitti, että ilmentyminen E2F2 ja CCND2 väheni dramaattisesti kasvaimet irrotettiin PC3-let-7a-GFP-kasvain-Bearin hiirissä verrattuna niihin, joilla PC3-GFP kasvaimia. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (C) Kasvaimen painon ja (D) suhde tuumorin paino /kehon paino määritettiin, kun hiiret tapettiin. Arvot ovat keinoja ja virhepalkit edustavat SEM. (**

p

0,01, Mann-Whitney-

U

testi).

Keskustelu

kyvyttömyys solun säätelemään kasvun ja lisääntymisen on ominaispiirre syöpä. Kriittisinä molekyylit solusyklin sääntelyn, E2F proteiinit ovat myötävirtaan kasvutekijää signalointi porrastetusti. Ne vaikuttavat solujen kasvun ja lisääntymisen kautta niiden kyky säädellä geenien solusyklin etenemisen [10], [11]. E2F2 on jäsen E2F perheen transkriptiotekijöiden, ja se on hyvin tunnettu säätelijänä G1-to-S-faasimuutos [12]. Aiemmat raportit osoittavat, että E2F2 on vahva onkogeeninen kapasiteettia ja voivat edistää solusyklin etenemisen. Solulinjat transfektoidaan E2F2 lisääntyvät kaksinkertaisella nopeudella valvonnan solujen [13]. Asianmukaisen etenemistä solusyklin läpi, fosforylaation aktiivisuus sykliiniriippuvaisten kinaasin (Cdk) on olennaisen tärkeää. CCNDs ilmaistaan ​​varhaisessa G1 vaiheessa ja sitovat Cdk4 ja Cdk6 [14]. Aktivointi näiden kinaasien johtaa fosforylaatioon muiden kriittisten solusyklin sääntelyviranomaisten kuten pRb. pRb aktivoi E2Fs ja mahdollistaa S-vaiheen merkintä. Näin ollen poikkeava ilmentymä CCND2 ja E2F2 johtaa epänormaalia solujen lisääntymistä. Yliekspressio CCND2 ilmoitettiin munasarjojen granulose kasvaimet, mahalaukun syöpä ja paksusuolen syöpä [15] – [17]. Samoin, säätelyä E2F2 havaittiin astrosytoomissa eri laadut [18].

miRNA transkription jälkeen säädellä geeniekspressiota sitoutumalla 3’UTR kohde- mRNA: iden. Sidonta johtaa hajoamista kohde-mRNA: iden ja vähentää käännös kohdeproteiinien. miRNA aktiivisuus vaikuttaa myös geenien ilmentymistä, jotka ovat alavirtaan kohdistu suoraa ja voi johtaa muutoksiin maailmanlaajuisen proteiinin ilmentymisen profiilit. Siksi miRNA potentiaalisesti kriittinen rooli etenemisessä ihmisen syövän. Paljon todisteet tukevat että poikkeava ilmentyminen miRNA tapahtuu monentyyppisiä ihmisen syövän, ja eri vaiheissa syövän etenemistä [19], [20]. let-7 on raportoitu toimivan tuumorisuppressori joitakin syöpätyyppejä, kuten keuhko- ja paksusuolen syövän [9], [21] – [23] ja että vähennetään ekspressiotasot let-7 korreloi huonon kliinisen ennusteen [ ,,,0],24].

Vaikka tämä korrelaatio let-7 ilmaisun ja tauti on voimakkainta keuhkokudoksessa, jossa let-7 ilme on korkea, meidän tutkimuksen mukaan anna-7 aiheuttaa solukierron vikoja eturauhassyöpäsolulinja kuin hyvin. Huomasimme, että let-7a ilmentymistaso säätyy alas dramaattisesti eturauhassyövässä kudosten ja solujen linjat. Proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen tasoa E2F2 ja CCND2 ovat alaspäin säädeltyjä PC3 ja LNCaP transfektion jälkeen let-7a. Meidän ksenograftimalleja eturauhassyövän vahvistavat myös meidän

in vitro

tuloksia ja osoittavat, että let-7a on kyky estää eturauhassyövän kehitykseen

in vivo

. Meidän dual-lusiferaasireportteri määritys varmistanut, että E2F2 ja CCND2 ovat kohdistu suoraa let-7a. Myös muita geenejä, jotka liittyvät solusyklin asetus on raportoitu tukahdutettu suoraan tai epäsuorasti antaa-7. Näitä ovat CDC34, joka edistää hajoamista sykliiniriippuvaiset kinaasin (CDK) estäjä 1B ja CCNA2, joka edistää G1-S- ja G2-M-vaiheen siirtymiä [25]. Meidän perustamisesta laajentaa perheen let-7 tavoitteet, ja tunnistaa molekyylitasolla vaikuttavia reittejä syöpä saattaa entisestään paljastaa mekanismeja, joiden avulla-7a estää solujen jakautumista. Vaikka paljon on vielä oppinut roolista anna-7a eturauhassyövässä kasvainten synnyssä, anna-7a antaa meille uuden tavan eturauhassyövän hoidossa kautta sen kyky asiakkuutta solusyklin pysähtymiseen ja vähentää solujen kasvua.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Clinic patologinen tekijät 26 potilasta tällä hetkellä käytössä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0010147.s001

(0,08 MB DOC) -iin Text S1.

sekvenssit synteettistä Hsa-let-7a, negatiivinen kontrolli, Hsa-let-7a estäjä ja estäjä negatiivisen kontrollin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0010147.s002

(0,02 MB DOC)

Kiitokset

Haluamme tunnustaa Lijie Hän erinomaisen editointiavun ja oivaltavaa ehdotuksia.